專利名稱：含黃酮醇的食品增補(bǔ)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明尤其涉及某些組合物，它們的應(yīng)用，并涉及供人消費(fèi)、含該組合物的食品增補(bǔ)劑和飲料。
人們認(rèn)為，在法國對葡萄酒的高消耗量是冠心病(CHD)死亡率低的重要飲食因素，并至少部分地被當(dāng)成為稱作“法國奇異現(xiàn)象”的該現(xiàn)象提供可能的解釋(Renaud & De Lorgeril 1992)，雖然對飽和脂肪的攝取量高，但與其他大多數(shù)國家相比法國是例外，因為法國CHD死亡率低。
較多的文獻(xiàn)提出了紅葡萄酒在預(yù)防冠心病(CHD)方面的確定的有益效果。流行病資料表明，葡萄酒所起的防護(hù)作用優(yōu)于其它含酒精飲料(如啤酒和烈性酒)，說明葡萄酒中非酒精含量的因素有助于該效果(St Leger等，1979；Renaud & De Lorgeril 1992)。在丹麥哥本哈根的一項預(yù)期研究中，在對死亡率的12年隨訪之后對13285人估測了各種參數(shù)(包括酒精攝取量，吸煙習(xí)慣和體重指數(shù))。表明了少量至適量攝取葡萄酒(但不是啤酒或烈性酒)與心血管病和腦血管病及其它病因的低死亡率有關(guān)(Gronbaek等，1995)。這些結(jié)果證實了美國以前報道的結(jié)果(Klatsky &Armstrong，1993)。
越來越多的證據(jù)表明，包括低密度脂蛋白(LDL)的氧化的脂質(zhì)過氧化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在動脈粥樣硬化和CHD的形成中起重要促進(jìn)作用(Steinberg，1993)。
Frankel等(柳葉刀(Lancet)1993，341，454-457)研究了稀釋的脫醇紅葡萄酒抑制體外人LDL的氧化的能力，發(fā)現(xiàn)該葡萄酒是很有效的抗氧化劑。作者們認(rèn)為日常消費(fèi)紅葡萄酒可能“減少脂蛋白的氧化和減少血栓形成現(xiàn)象”。但是，作者們承認(rèn)“如果我們要進(jìn)一步估測紅葡萄酒中抗氧化劑化合物在減少CHD方面的潛在作用，我們就要更多地了解葡萄酒類黃酮的藥物動力學(xué)以及葡萄酒酚類的吸收和代謝…”。
類黃酮屬于被稱為多酚(PP)的一類物質(zhì)，稱為多酚是因為它們含兩個或多個酚基。多酚大量存在于紅葡萄酒中，包括大量多種分子量的不同化學(xué)物質(zhì)。葡萄和葡萄酒的主要多酚成分及其濃度由Shahidi & Nazck(1995)描述于“食品酚類來源，化學(xué)，效果和應(yīng)用”(Technomic Publishing Co.。Lancaster Pa，USA)p.136-146中。有如下幾類多酚類黃酮(該術(shù)語一般常用于指多酚，但在歐洲更經(jīng)常僅指黃酮)，黃烷醇，原花色素(還稱為原兒茶精、原花色素苷、矢車菊苷配質(zhì)和單寧酸)以及花色素苷。
黃酮是這樣的化合物，即具有圖2中所示的基本結(jié)構(gòu)，其中兩個苯環(huán)(A和B)與含一個羰基的雜環(huán)六元環(huán)C連接。環(huán)B可連接在2號位(如圖所示)而得黃酮或者連接在3號位而得異黃酮?？稍谖恢?、5、7和3′、4′、5′發(fā)生羥基化而得被稱為黃酮醇的化合物。黃酮醇的典型實例有槲皮素(在位置3、5、7、3′、4′上羥基化)，山萘酚(在位置3、5、7、4′上羥基化)，以及楊梅樹皮素(在位置3、5、7、3′、4′、5′上羥基化)。它們可作為糖苷配基或者作為O-糖苷(例如D-葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖等)天然存在。還發(fā)現(xiàn)了其它取代形式如甲基化、硫酸化和丙二?；?br> 黃烷醇具有圖3中所示的基本結(jié)構(gòu)。兩種最常見的黃烷醇是兒茶精(在位置5、7、3′、4′上有羥基)及其立體異構(gòu)體表兒茶精?？捎脳斔?圖4所示)使這些羥基酯化。原花色素是兒茶精和/或表兒茶精的聚合物，可含多達(dá)8個或更多個單元。
花色素苷是有色物質(zhì)，其基本結(jié)構(gòu)示于圖5。有時將它們稱為花色素。典型實例有花青素(在位置3、5、7、3′、4′上羥基化)，飛燕草苷元(在位置3、5、7、3′、4′、5′上羥基化)和花葵素(在位置3、5、7、3′上羥基化)。這些羥基通常被糖基化和/或甲氧基化(例如錦葵苷元在3′、5′上)。
在通稱“多酚”中包括二羥基或三羥基苯甲酸和植物抗毒素，它的典型實例是白藜蘆醇(示于圖6中)。
應(yīng)用最廣的測定LDL氧化的方法是應(yīng)用過渡金屬銅(特別是Cu2+離子)作催化劑以加速內(nèi)源性脂質(zhì)氫過氧化物的氧化。存在于LDL中的抗氧化劑，尤其是α生育酚，使該氧化過程延遲而產(chǎn)生所謂的延滯期。該過程可輕易用UV分光光度計跟蹤，因為氧化反應(yīng)產(chǎn)生共軛二烯，可在234nm處連續(xù)監(jiān)測該共軛二烯(Esterbauer等，1989)。為了在貯存期間保護(hù)LDL以防氧化，加入EDTA以絡(luò)合銅和其它痕量元素。該過量的EDTA干擾銅催化的氧化作用?？稍谔砑鱼~離子之前通過透析該LDL制劑而除去EDTA，或者可加入過量的銅離子以補(bǔ)償那些與EDTA絡(luò)合的銅離子。
Frankel等于1995年(農(nóng)學(xué)和食品化學(xué)雜志(J.Agricult.and FoodChemistry)43，890-894)也報道了有點類似于Frankel等(柳葉刀，1993，前面引用的)報道的體外實驗結(jié)果。該公開的作者注意到解釋體外數(shù)據(jù)的困難。例如“雖然酚類化合物具有相類的化學(xué)性質(zhì)，但它們的還原能力不是它們的抗氧化活性的很準(zhǔn)確預(yù)測因子。在LDL氧化分析和關(guān)于抗氧化活性的其它試驗中，該體系一般是異相體系，于是物理性能如LDL的親油性、溶解性以及在水相和脂質(zhì)相之間的分配在測定抗氧化活性中就會變得很重要”。
確實，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得從體外結(jié)論外推到活體內(nèi)情況通常是不合適的。例如，讀者可參考McLoone等(1995營養(yǎng)學(xué)會會報，54，摘要168A)的公開內(nèi)容，它指出雖然化合物黃體素在體外可能抑制LDL氧化，但給人志愿者的膳食補(bǔ)充黃體素達(dá)2周(它使血漿中黃體素含量增加6倍)對LDL氧化無作用。
進(jìn)行了一些活體內(nèi)試驗以研究紅葡萄酒可能的健康益處。Fuhrman等(1995，美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志，61，549-554)發(fā)現(xiàn)了“存在于紅葡萄酒中但不存在于白葡萄酒中的某些酚類物質(zhì)，被吸收后結(jié)合到血漿LDL上，并可能賦與紅葡萄酒抗氧化性能”，于是，按他們的話說，首次闡述了“消費(fèi)紅葡萄酒抑制了LDL經(jīng)歷脂質(zhì)過氧化的傾向”，而且這樣可減小動脈粥樣硬化。但是，Sharpe等的研究，該研究的結(jié)果幾乎與Fuhrman等的同時發(fā)表(醫(yī)學(xué)季刊(Q.J.Med.)1995，88，101-108)，發(fā)現(xiàn)了消費(fèi)紅葡萄酒和白葡萄酒都“對于總的膽固醇，甘油三酯，HDL或抗氧化狀況的量度，包括LDL對氧化的敏感性”無任何效果。
De Rijke等也研究了該問題，進(jìn)行了隨機(jī)的雙盲試驗。他們于1996年報道了他們的結(jié)果(美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志，63，329-334)，闡述了“該研究結(jié)果并未表明消費(fèi)紅葡萄酒對LDL氧化的有益效果”。
總之，有一些報道說在體外分析中稀紅葡萄酒能抑制LDL氧化，但這些結(jié)果未必能推廣到活體內(nèi)的情況。此外，關(guān)于通過消費(fèi)紅葡萄酒抑制LDL氧化的活體內(nèi)論據(jù)至多是相互矛盾的，沒有明確的證據(jù)表明消費(fèi)紅葡萄酒對LDL氧化有任何效果。
現(xiàn)在可從市場獲得一些組合物，該組合物是從葡萄酒或葡萄副產(chǎn)品制備的，它們可能含多酚(雖然有些組合物中的含量相當(dāng)?shù)?。其中有法國Paradox膠囊(可得自Arkopharma)。法國Paradox膠囊是通過從葡萄榨渣(葡萄酒發(fā)酵后余下的葡萄皮廢渣)制備提取物而制作的。存在于葡萄皮中的多數(shù)多酚是醇溶性的，所以能被提取入發(fā)酵葡萄酒中。因此，法國Paradox膠囊實際上具有相當(dāng)?shù)偷亩喾雍俊?其它可商購的組合物包括含花色素苷的粉末(可得自Sefcal)，它是從葡萄皮提取物制作的，被用作食品著色劑，還有從葡萄籽制作的含原花色素的組合物(“Endotelon”)。)即使法國Paradox膠囊含大量的多酚，但尚不清楚經(jīng)口消費(fèi)這種合成的多酚組合物是否會產(chǎn)生與據(jù)說的消費(fèi)紅葡萄酒而產(chǎn)生的相同的療效。例如，Glodberg(1995，臨床化學(xué)，41，14-16)解釋了葡萄酒的乙醇含量保持多酚溶于葡萄酒和人腸中，這樣多酚才可被吸收。合成的、不含乙醇的多酚粉末可能完全無效，因為該多酚于腸內(nèi)溶解不足(不存在乙醇時)不足以被吸收。此外，在血流中可能吸收不完全以致對LDL不能產(chǎn)生任何抗氧化效果-可能需要該多酚與LDL部分緊密結(jié)合。
認(rèn)識到很多疾病是由自由基氧化機(jī)制引起或激發(fā)的，例如癌、內(nèi)障、糖尿病等。認(rèn)為抗氧化性營養(yǎng)物(如維生素E、維生素C和其它物質(zhì))可防止很多器官和組織中的自由基氧化。所以，吸收多酚(它們是有效的抗氧化劑)很可能對一般的自由基/氧化疾病有效果，于是，多酚的應(yīng)用可能比治療或預(yù)防冠心病廣泛得多。
然而，CHD是西方死亡率和發(fā)病率的主要原因之一，因此特別引人關(guān)注。該病的病理主要包括兩步過程，即先出現(xiàn)動脈粥樣硬化斑，然后在斑上形成血栓(凝塊)(該過程稱為血栓形成)，它可引起動脈閉塞，其結(jié)果可能是心肌梗塞(MI)和猝死。由血栓形成引起的其它疾病有中風(fēng)和靜脈血栓形成。形成血栓的初始階段是血小板的聚集，它再將凝固因子釋放入血液，導(dǎo)致產(chǎn)生血纖蛋白凝塊。一旦形成血液凝塊，它們可通過稱為血纖維蛋白溶解作用的過程而被除去，該過程實際上是溶解血凝塊和使血纖維蛋白降解為降解產(chǎn)物。因此，至少有兩種可防止血栓形成的方法-抑制血小板的聚集，或增強(qiáng)血纖維蛋白溶解作用。
異常的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖可能在下列疾病中促使形成梗阻性損傷冠心病，動脈粥樣硬化，再狹窄，中風(fēng)以及腸和子宮的平滑肌瘤，子宮平滑肌瘤或纖維瘤。
多年來已知TGF-β是最有效的細(xì)胞生長抑制劑之一(Massague，1990)，并且有些作者已發(fā)現(xiàn)TGF-β抑制VSMC增殖(Assolian，1986；Bjorkerud，1991；Owens，1988；Kirschenlohr，1993)。人VSMC產(chǎn)生呈潛伏、非活性形式的TGF-β，它被絲氨酸蛋白質(zhì)纖溶酶通過蛋白酶解而活化，該絲氨酸蛋白質(zhì)纖溶酶本身又是通過一類纖溶酶原激活劑(PAs)[例如組織纖溶酶原激活劑(tPA)]而得自纖溶酶原(Lyons，1990)。據(jù)稱總血漿TGF-β的增加在抑制VSMC的生長中有效，因為該潛伏形式被纖溶酶轉(zhuǎn)化成活性形式。
一些作者們提出了估測TGF-β的血漿含量的方法，并探索可刺激呈潛伏形式和活性形式的TGF-β的產(chǎn)生的藥物化合物。在US5,545,569(Grainger等)中要求保護(hù)一種體外測定化合物的效果的方法，該化合物可增大TGF-β的血漿含量和應(yīng)用其中所述技術(shù)刺激它的產(chǎn)生。WO94/26303(Grainger等)描述了一種方法，該方法通過施用有效量TGF-β激活劑或產(chǎn)生刺激物而維持或增大哺乳動物有病的或損傷的血管中血管腔直徑。化合物Tamoxifen(反式-2[4(二苯基-1-丁?；?butanyl))苯氧基]-二甲基乙胺)被聲稱是有效的，因為它刺激TGF-β的產(chǎn)生，并增大活性TGF-β與潛伏TGF-β的比率。表現(xiàn)出活性的另一化合物是阿司匹林(Grainger等，1995)，它可增大正常人中總的TGF-β和活性血清TGF-β，但只增大冠心病患者中總的TGF-β。
血小板聚集的增加還與CHD的流行(Elwood等，1991)和CHD的發(fā)作率(Thaulou等，1991)明顯相關(guān)。應(yīng)用血小板集合度計便利地研究血小板聚集，其中將得自血液的新鮮血小板懸浮液與可引起聚集的興奮劑接觸。很多興奮劑都可以用，但最典型的是花生四烯酸、ADP、膠原和凝血酶。從最大聚集(％)的測定可以研究可通過經(jīng)口給予或注射施用給受試驗者的血小板聚集抑制劑的效果。防止血小板聚集的最有效物質(zhì)之一是阿司匹林，它抑制環(huán)加氧酶活性和血栓烷的形成，血栓烷是血栓形成的必需因子(Moncada & Vane，1979)。阿司匹林還預(yù)防CHD、中風(fēng)和猝死(Hennekens等，1988)。
血纖維蛋白溶解系統(tǒng)構(gòu)成通過激活劑和抑制劑密切調(diào)節(jié)的胞外蛋白水解反應(yīng)的級聯(lián)。該酶組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)將纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶，它反過來溶解血纖蛋白凝塊。t-PA是在內(nèi)皮細(xì)胞中合成的一種糖蛋白，它被吸附到血纖蛋白上以便被激活。纖溶酶原激活抑制劑(PAI)-1是絲氨酸蛋白酶抑制劑，起t-PA的特異性抑制劑的作用。PAI-1以三種形式存在活性的、潛伏的和作為無活性復(fù)合體。它是在內(nèi)皮細(xì)胞、肝和血小板中合成的。
在循環(huán)中，大部分tPA(95％)與PAI-1復(fù)合。很少的tPA和PAI-1呈游離(活性)形式。認(rèn)為降低的血纖維蛋白溶解活性是由于PAI-1含量或活性增大的緣故，它導(dǎo)致由tPA將纖溶酶原變成纖溶酶的活化作用降低。這很重要，因為報道的關(guān)于降低的血纖維蛋白溶解活性與CHD(Mehta等，1987)和MI之間的關(guān)系。主要由于血漿PAI-1的升高而引起的血纖維蛋白溶解作用減弱常見于血栓形成性疾病中。在Northwick Park HeartStudy(一項關(guān)于中年人(進(jìn)入40～54歲)的預(yù)期流行病研究)中，Meade等(1987)報道說，血纖維蛋白溶解活性的降低是將來CHD的主要獨立危險因素。對患有心絞痛或以前的心肌梗死的患者的橫切片研究一致表明，與對比組相比患者血纖維蛋白溶解活性的降低(Hamsten等，1985和1986；Johnson，1984；Paramo等，1985；Aznar等，1986；Francis，1988；和Olofson等，1989)。已證實MI患者的PAI-1濃度高于對比組(Hamsten等，1987)。
由于血小板聚集和血纖維蛋白溶解作用在血栓形成中的作用，可應(yīng)用減少血小板聚集和/或增大血纖維蛋白溶解作用的方法作為治療一般的血栓形成性疾病(尤其是CHD)的方法。
本發(fā)明的第一方面提供了適合人消費(fèi)、植物衍生的含黃酮醇的干組合物，其中該組合物中植物衍生的物質(zhì)的至少25％包括多酚。
作為解釋，植物衍生的組合物可包括植物或其部分(例如塊莖、果實)的提取物，它可用某種方式(例如通過發(fā)酵)加工。所以，植物衍生的組合物包括植物或其部分的水提取物或有機(jī)溶劑提取物，果汁和從植物或果汁生產(chǎn)的發(fā)酵液(例如葡萄酒)，或者得自前述任一種的組合物。在生產(chǎn)組合物期間，通常加工(物理法和/或化學(xué)法)植物原料而從植物中提取多酚，這樣增大并富集組合物的多酚含量。
有利的是，該組合物可能是這樣的，即植物衍生的物質(zhì)包括至少35％多酚，或更優(yōu)選至少45％多酚。
該組合物可能全部或基本上由植物衍生的物質(zhì)組成，從該物質(zhì)獲得該組合物的黃酮醇含量。該組合物也可包括其它物質(zhì)，例如常用于配制供人消費(fèi)的組合物的調(diào)味劑、賦形劑、載體等。
組合物中“植物衍生的物質(zhì)”指組合物的這部分物質(zhì)，即得自與組合物的黃酮醇含量相同的來源。該組合物還可包括得自植物的其它成分(例如淀粉或調(diào)味劑)，但這些物質(zhì)如果不得自與組合物的黃酮醇含量相同的來源就不能認(rèn)為是“植物衍生的物質(zhì)”。
優(yōu)選地該組合物是這樣的，即黃酮醇含量占該組合物的總植物衍生的多酚含量的至少0.5％(w/w)，優(yōu)選至少1％，更優(yōu)選至少2％。
還優(yōu)選整體上組合物的黃酮醇含量是至少0.01％(w/w)，更優(yōu)選至少0.1％，最優(yōu)選至少1％。
本發(fā)明第二個方面提供了植物衍生的含黃酮醇的干組合物，它包括至少0.01％(w/w)黃酮醇，更優(yōu)選至少0.1％，最優(yōu)選至少1％。
上述定義的組合物在10～20℃的溫度范圍內(nèi)和常壓(760mmHg)下通常是固體。該組合物可以是粒子(例如粉化或?；?，或者可被加工成膠囊、片劑等。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，通過一些判據(jù)來衡量，本發(fā)明的組合物在被受試驗的人經(jīng)口消費(fèi)后可有效抑制血漿LDL的氧化。這樣，如通過Esterbauer等的方法(1989，自由基研究通訊，6，67-75)測定的那樣，經(jīng)口消費(fèi)該組合物可有效延長氧化分離的血漿LDL的延滯期。簡言之，在此方法中，將通過超速離心從受試驗者的血漿分離的LDL透析以除去EDTA，再將銅離子(5μM)加至LDL(存在量為50mg/L)中。通常的二烯形成前的滯后時間約為50～60分。給受試驗者施用本發(fā)明的組合物應(yīng)使滯后時間延長優(yōu)選至少2分鐘(或者約4％或更多)。最優(yōu)選在5～25分鐘(或者約10～50％)的范圍內(nèi)。此外，該組合物(在經(jīng)口消費(fèi)之后)可有效減少受試驗的人血漿中脂質(zhì)過氧化物的量(由下文所述的Gorog等(1994)的方法估測的)。
該組合物便利地包括得自下列物質(zhì)的多酚(包括黃酮醇)，即葡萄(整顆的葡萄或其部分，如皮或汁)，葡萄酒(尤其是紅葡萄酒，它包括比白葡萄酒高得多的多酚濃度)，或是葡萄酒釀造過程中的副產(chǎn)物和/或廢產(chǎn)物，如葡萄榨渣(即提取葡萄汁后的壓碎葡萄殘渣)或葡萄渣(初始發(fā)酵后殘余的廢固體物)。然而，多酚(如黃酮醇)存在于廣泛的天然物質(zhì)中，其中很多包含比紅葡萄酒更高的黃酮醇含量，所以可能提供更合適的黃酮醇來源。這樣的物質(zhì)實例包括一般的水果，例如蘋果(如優(yōu)花皮品種(var.“Gravensteiner”)，尤其是蘋果皮；梨(如var.“Williams Christs”)；圓椒(如var.“Yolo wonder”)；紅醋栗；黑茶藨子(由于含較多的黃酮醇而特別優(yōu)選)；檸檬；櫻桃；大果越桔；醋栗；番茄；橄欖；以及一般的蔬菜，包括四季蘿卜(如var.“Saxa treib”)；球莖甘藍(lán)(如var.“Primavera”)；辣根；馬鈴薯；蔥和蘆筍。
在一個具體實施方案中，該組合物得自紅葡萄酒，它包括葡萄酒中存在的幾乎所有多酚化合物的典型組成分布(雖然組合物中未必存在，但通常存在相當(dāng)量的葡萄酒中的代表性物質(zhì)，該組合物是從該葡萄酒制備的)。這種組合物可被稱為“總的多酚儲備”。
多酚可通過吸附到層析樹脂柱上而便利地得自紅葡萄酒或其它含多酚的液體，應(yīng)用40～50％乙醇洗脫液或其它合適的有機(jī)溶劑(例如甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二亞甲基氯和氯仿-它們可呈水溶液形式)從層析柱洗脫富含多酚的級分(一般在洗滌步驟之后洗脫)。該有機(jī)溶劑優(yōu)選是較為揮發(fā)性的(即在760mmHg壓力下的沸點為30～85℃)，于是易被除去，留下包括多酚的大體上是干的(即少于10％w/w H2O)固體組合物。這種方法可被成功地用于從紅葡萄酒獲得總的多酚儲備。
多酚還可通過溶劑提取(應(yīng)用與葡萄酒或其它液體不溶混的合適的有機(jī)溶劑)得自紅葡萄酒或其它含多酚的液體。多酚也可通過溶劑提取(一般用有機(jī)溶劑如乙醇或乙酸乙酯提取)得自含多酚的固體-然后通過過濾或離心可將固體與溶劑分離。再蒸發(fā)溶劑可余下大體上干的包括多酚的固體組合物。
在優(yōu)選的實施方案中，該組合物作為食品增補(bǔ)劑提供。它可以是在制備食料期間作為另一種組分添加的物質(zhì)，或者可以是單獨的物質(zhì)供個體消費(fèi)(例如作為片劑或膠囊)，在消費(fèi)前基本上與其它食品組分分開(即不與之混合)(不過，該片劑或膠囊當(dāng)然也可與食物一起攝取)。因此，本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括一種制品，尤其是一種食料，它包括本發(fā)明的組合物。該組合物也可作為固體給出，通過與生理上可接受的稀釋劑(如乳、水或其它含水液體)混合而制成飲料。
給予受試驗者的組合物劑量取決于該物質(zhì)的活性程度，但將為10mg～10g/天。至于得自紅葡萄酒的總多酚儲備，優(yōu)選的劑量是0.1～4.0g/天，更優(yōu)選1～2g/天，相當(dāng)于每天0.5～1升紅葡萄酒。黃酮醇的優(yōu)選劑量應(yīng)在0.1～1000mg/天的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.5～500mg/天的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在1～250mg/天的范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將能了解得自葡萄酒、葡萄或葡萄酒副產(chǎn)物的多酚的制備，并能進(jìn)一步分離而得具有更濃縮的活性的組合物。這可通過下列方法實現(xiàn)，即柱層析、溶劑提取、配有半透膜的分子篩、或者常用于食品工業(yè)中的其它方法。優(yōu)點在于，活性物質(zhì)的重量更小，而且該增補(bǔ)劑的顏色和味道有益地得到改善。
本發(fā)明的組合物可按常規(guī)食品增補(bǔ)劑實踐操作或藥劑實踐操作應(yīng)用該活性多酚劑制備?？杀粦?yīng)用的稀釋劑、賦形劑或載體等是制劑領(lǐng)域中熟知的，任何具體食物療法所選擇的形式將取決于給定的環(huán)境和配方設(shè)計師的選擇。通常，劑量將取決于組合物中多酚的濃度，以及所述多酚化合物的特性。
此外，該組合物可包括任意數(shù)量的其它組分，例如食品工業(yè)和/或藥劑工業(yè)中常用的那些。這樣的組分包括營養(yǎng)物(尤其是痕量元素和維生素)，抗氧化劑，治療性物質(zhì)(尤其是對預(yù)防和/或治療CHD有療效的那些物質(zhì)，特別是阿司匹林)，調(diào)味劑，以及甜味劑(尤其是人造甜味劑，例如天冬甜素等)。
上述組分的實例包括下列物質(zhì)類胡蘿卜素，例如黃體素、番茄紅素、或α-胡蘿卜素和/或β-胡蘿卜素；抗氧化營養(yǎng)物或抗炎劑，例如維生素A、維生素C、維生素E(α-生育酚和其它活性生育酚)，葉酸，硒，銅，鋅，錳，泛醌(輔酶Q10)，水楊酸，2，3-二羥基苯甲酸，以及2，5-二羥基苯甲酸。
抗氧化劑(例如類胡蘿卜素和維生素E)在胃腸道中通過氧化作用被部分地消耗。通過將這些化合物包括于本發(fā)明的組合物中，相信該過程被抑制了，于是更多的抗氧化劑被吸收了。包括α-生育酚和/或阿司匹林的組合物的應(yīng)用是特別優(yōu)選的，因為相信這種混合物在多酚的存在下給出協(xié)同效果。
該組合物的這些另外組分典型的合適日劑量(因而它們可被包括于該組合物中使得正常消費(fèi)該組合物將給出合適的劑量)如下黃體素2～50mg，例如適宜地7.5mgβ-胡蘿卜素 2～20mg，例如適宜地5mg維生素A 400～600RE，例如適宜地500RE維生素C 75～250mg，例如適宜地100mg葉酸 0.1～1.0mg，例如適宜地0.2mg硒80～120μg，例如適宜地90μg銅2～4mg，例如適宜地3mg鋅10～20mg，例如適宜地15mg輔酶Q10 10～200mg，例如適宜地30mg阿司匹林10～150mg，例如適宜地150mg于是，在一個實施方案中，該組合物呈膠囊形式，每個膠囊含500mg多酚組合物，建議每天攝取1～4顆膠囊。另一推薦形式是作為無酒精飲料，當(dāng)溶于加香和甜化了的水(靜水或汽水)時，或者溶于果汁(如葡萄、蘋果或橙等)時，該飲料提供有效劑量的多酚。
盡管考慮到一些原因(例如社會的、宗教的和經(jīng)濟(jì)的)也許優(yōu)選提供包括本發(fā)明的組合物的無酒精飲料，這種飲料可用酒精(例如用伏特加、金酒、威士忌酒)加度而得根據(jù)消費(fèi)者口味所需的5～15％酒精含量。
其它推薦的形式是作為乳制品(例如乳和酸牛奶)、蜜餞、以及想作為食物增補(bǔ)劑或替代物的療效食品中的食品成分。上述實例只是闡述性的，不能被認(rèn)為是以任何方式進(jìn)行限定。
所以，本發(fā)明的第三個方面提供了抑制受試驗的人中血漿LDL的氧化的方法；該方法包括制備本發(fā)明的第一方面或第二方面的組合物；并且給受試驗者施用該組合物。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，不但經(jīng)口消費(fèi)本發(fā)明的組合物的確抑制血漿LDL的氧化，該組合物還將具有刺激活體內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β的效果。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了，經(jīng)口消費(fèi)本發(fā)明的組合物將抑制血小板聚集和/或刺激血纖維蛋白溶解作用，于是降低個體的血栓形成傾向，它有助于預(yù)防和/或治療血栓形成疾病，例如CHD、中風(fēng)。尤其，發(fā)現(xiàn)消費(fèi)該組合物可增大血漿中的tPA活性水平(如通過分析方法如下文所述的“Chromolize”分析法[可得自Biopool，瑞典l方便地測定的)，它的作用是增大受試驗者中血纖維蛋白溶解作用的凈速度。
因此，本發(fā)明的第四個方面提供了刺激受試驗的人中產(chǎn)生TGF-β的方法，該方法包括制備本發(fā)明第一方面或第二方面的組合物；并且給受試驗者施用該組合物。
本發(fā)明的第五個方面提供了抑制受試驗的人中血小板聚集和/或刺激血纖維蛋白溶解作用的方法，該方法包括制備本發(fā)明第一方面或第二方面的組合物；并且給受試驗者施用該組合物。
本發(fā)明的第六個方面提供了前面定義的本發(fā)明第一方面或第二方面的組合物的應(yīng)用，即用于制備供受試驗的人經(jīng)口消費(fèi)的藥劑以抑制受試驗者中血漿LDL的氧化。
本發(fā)明的第七個方面提供了前面定義的本發(fā)明第一方面或第二方面的組合物的應(yīng)用，即用于制備供受試驗的人經(jīng)口消費(fèi)的藥劑以刺激受試驗者中TGF-β的產(chǎn)生。
本發(fā)明的第八個方面提供了前面定義的本發(fā)明第一方面或第二方面的組合物的應(yīng)用，即用于制備供受試驗的人經(jīng)口消費(fèi)的藥劑以抑制受試驗者中的血小板聚集和/或刺激血纖維蛋白溶解作用(尤其通過增大受試驗的人血漿中tPA活性水平)。
本發(fā)明第一方面或第二方面的組合物通常將賦與消費(fèi)該組合物的受試驗者上述所有性能。因此，本發(fā)明還提供了制備藥劑的方法，該藥劑供受試驗的人經(jīng)口消費(fèi)，為的是在受試驗者中產(chǎn)生如下一種或多種作用抑制血漿LDL的氧化；抑制血小板聚集；刺激血纖維蛋白溶解作用；以及刺激TGF-β的產(chǎn)生；該方法包括制備本發(fā)明第一方面或第二方面的組合物；如果必要的話，將該組合物與生理上可接受的賦形劑或載體混合；并且配制該組合物的單元劑量。制備這些藥劑的合適方法是相關(guān)領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的。
如前所述，具有該效果的藥劑可呈食品增補(bǔ)劑或食品成分的形式，且應(yīng)適用于預(yù)防或治療冠心病。如前所述，該藥劑的合適劑量將取決于組合物中多酚的濃度和特性，并取決于待治療的受試驗者病況的嚴(yán)重性。不過，一般原則是，該劑量應(yīng)優(yōu)選足以給出與每天消費(fèi)至少一杯葡萄酒所提供的相同的多酚消費(fèi)量(大約相當(dāng)于0.25g的紅葡萄酒總多酚儲備)，但更優(yōu)選每天約0.5～1.0L紅葡萄酒的相當(dāng)量(即約1.0～2.0g總的葡萄酒多酚)。
下面將通過闡述性實施例并參照附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中

圖1示出LDL氧化對時間(分鐘)的圖；圖2是黃酮的核心結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是黃酮醇的核心結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是棓酸的結(jié)構(gòu)示意圖5是花色素苷的核心結(jié)構(gòu)示意圖；以及圖6是白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)示意圖。
實施例1從紅葡萄酒制備多酚粉末過濾約2,000升紅葡萄酒(法國1993“赤霞珠”)以除去沉積物，在75～80℃和300毫巴的壓力下真空蒸餾1分鐘，然后冷卻，在55℃的真空下濃縮，再通過致冷作用迅速冷卻到25℃。使?jié)饪s了的葡萄酒通過一個裝填有65升Diaion HP-20樹脂的柱(直徑55cm，約2米高)。用250升蒸餾水洗滌該柱，再用約250升50％醇在150分鐘左右的時間內(nèi)將多酚洗脫。在該時間之后，由Folin-Ciocalteu法(Singleton & Rossi(1965)描述的)測知洗脫液不含多酚。然后在真空蒸餾下將洗脫液濃縮至35％干物質(zhì)，接著在氮氣中噴霧干燥而得約2kg濕含量為3～4％的粉末。
該多酚粉末是呈深紅色的優(yōu)良食品成分，當(dāng)溶于水或酒精水溶液時十分可口，喝一口的味覺類似于紅葡萄酒的口感。建議的日劑量是1～2g/天。
下面將該多酚粉末的典型組成與紅葡萄酒的多酚含量進(jìn)行比較。與紅葡萄酒相比，該多酚粉末含按比例比其它多酚更多的原花色素苷，但基本上保持較豐富的各種多酚。
紅葡萄酒與多酚粉末的組成紅葡萄酒紅葡萄酒棓酸當(dāng)量多酚粉末mg/L mg/g％ ％羥基肉桂酸1651518 3兒茶素2001738 6黃酮醇20 2 14 2花色素苷 2001770 11原花色素 55049480 77-- --總計 1135 620實施例2應(yīng)用葡萄酒多酚進(jìn)行志愿者研究以便測定紅葡萄酒和白葡萄酒和多酚制劑在健康志愿者中的抗氧化活性。受實驗者和方法26名健康男性(年齡35～65歲，非吸煙者，消費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)的UK飲食)參加了不公開的保密研究。在該研究兩周前，志愿者們停止了葡萄酒消費(fèi)。在研究期間要求所有這些志愿者保持他們的正常飲食和生活方式。將志愿者分組，這些組消費(fèi)表1中所示量的下列葡萄酒或茶制品和膳食達(dá)2周。紅葡萄酒是“赤霞珠”(1993)，白葡萄酒得自法國的Narbonne區(qū)。研究期間提供的酒是在實驗期間只允許飲用的酒。此外，給相同的受實驗者提供從研究中應(yīng)用的同批紅葡萄酒制備的多酚粉末。該粉末在-20℃下貯存(PP1)，并于1996年6月配制新鮮樣品(PP2)。該研究始于1995年9月初并持續(xù)了約一年。各組試驗物質(zhì)1)“赤霞珠”紅葡萄酒(375ml)，含1.8g/L多酚2)法國普通白葡萄酒(375ml)，含0.2g/L多酚3)紅葡萄酒pp粉(從與組1給出相同的葡萄酒制備的)，2顆明膠膠囊中含1g4)在溶液中含1g紅葡萄酒多酚(見下面)的白葡萄酒5)伏特加酒和檸檬汁飲料(10％v/v酒精)，400ml/天6)50mg/天花色素苷，以飲料形式給出的葡萄皮提取物(Sefcal，St Juliende Peyrolas，法國)7)以膠囊形式(每天3顆)給出的紅葡萄酒渣(法國ParadoxTM，Arkopharma，Nice，法國)，每顆膠囊包括250mg渣8)葡萄籽原花色素，作為EndotelonTM膠囊，(Sanofi-Winthrop，法國)(每天3顆)，每顆膠囊包括150mg原花色素9)綠茶提取物(PolyphenonTM，Mitsui Norin，F(xiàn)ujieda，日本)，每天3顆膠囊，每顆膠囊包括100mg下列茶兒茶精1.6％棓兒茶酸，19.3％
表棓兒茶素，6.4％表兒茶素，59.1％表棓兒茶素棓酸酯和13.7％棓酸表兒茶酸酯在晚飯12小時后，在葡萄酒制品消費(fèi)期之前和之后，將血樣抽入K3EDTA(1mmol/L)。在4℃和在2000xg下將樣品離心15分鐘而得血漿。應(yīng)用帶有TLA 100.4轉(zhuǎn)子的Beckman試驗室臺上用Optima TLX型儀器(Beckman，Palo Alto，CA)通過密度梯度超速離心分離LDL，即將溴化鈉加入血漿至密度為1.3g/ml，在1.006g/ml密度下的溶液中分層。在4℃和在100,000RPM下旋轉(zhuǎn)20分鐘。移取橙/黃色LDL帶，在4℃下、使用1.154和1.063g/ml密度的溶液在100,000RPM下旋轉(zhuǎn)30分鐘。
取出可見的LDL層，應(yīng)用透析盒(Pierce Slide-A-Lyzer，PerstorpBiotec Company，USA)在4℃下對含2μM EDTA的10mM磷酸鹽緩沖鹽水透析一小時，然后對10mM磷酸鹽緩沖鹽水透析一夜。
通過Singleton和Rossi(1965)的方法測定血漿中和LDL級分中的總的多酚。簡要地說，通過取125μl血漿或400μl LDL再用水配成500μl來測定血漿和LDL中總的多酚。將該混合物加入2.5ml Folin試劑(稀釋成1∶10)和2.0ml碳酸鈉(75g/L)。充分混合后在室溫下將該溶液保溫2.5小時，然后在2,500rpm下離心8分鐘。在765nm處測定上清液的光密度。將棓酸用作標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行對比。
應(yīng)用含Bioquant試劑(Merck，Darmstadt，德國)的試劑盒通過Bradford法(Bradford，1976)測定蛋白質(zhì)。
應(yīng)用兩種獨立的方法測定抗氧化活性。
1)LDL的銅氧化在37℃下將脂蛋白(50mg LDL蛋白/L)在硫酸銅(5mM)的存在下保溫5小時。通過測定234nm處吸光度的增大連續(xù)監(jiān)測共軛二烯的形成，并按Esterbauer等(1989)的方法測定二烯形成前的滯后時間。圖1示出了共軛二烯形成(由234nm處的吸光度測定的)對時間(以分鐘表示)的圖。繪出了在試驗開始時(O)和2周后所取樣品的典型曲線。通過將曲線圖的線性部分向下外推至x軸(如虛線所示)而測定了延滯期。優(yōu)選地，消費(fèi)本發(fā)明的組合物將導(dǎo)致延滯期時間增加2分鐘或更長。
2)血漿脂質(zhì)過氧化物所有的血漿脂質(zhì)和脂蛋白都是應(yīng)用PHM-L-liposorb(Calbiochem-Novabiochem UK)選擇性地除去的。在2ml棕色微型離心管內(nèi)，將干的PHM-L-liposorb(20mg)懸浮于含10mM檸檬酸鈉的0.25ml 150mM氯化鈉中，攪拌該內(nèi)含物，使之平衡5分鐘。然后將血漿(0.5ml)或鹽水(空白)加入該liposorb懸浮液，攪拌后將離心管置于旋轉(zhuǎn)式混合器上達(dá)15分鐘。在離心(12,000xg達(dá)1分鐘)后棄去上清液，用1.5ml鹽水將liposorb凝膠洗滌兩次，接著攪拌并離心。將洗滌了的liposorb凝膠懸浮于1.5ml膽固醇氧化酶-碘化物試劑(BDH-Merck)中，置于旋轉(zhuǎn)式混合器上攪拌60分鐘。在室溫下離心(12,000xg達(dá)3分鐘)后，在分光光度計中405nm處測定清亮的上清液對鹽水空白的光密度，(Gorog等，1994)。
優(yōu)選地，消費(fèi)本發(fā)明的組合物將導(dǎo)致血漿脂質(zhì)過氧化物濃度降低至少0.1μmol/g蛋白質(zhì)。
結(jié)果比較了處理前和處理后所得的值。表1歸納了表2～6中詳細(xì)給出的結(jié)果。如表1中所示，由上述試驗1和2測知，那些含大量葡萄酒多酚的制品(紅葡萄酒，PP1，PP2，白葡萄酒+PP1)表現(xiàn)出血漿和LDL中多酚的增加以及LDL中抗氧化活性的增大。
兩種多酚粉末(PP1，PP2)給出與等效量紅葡萄酒所給出的相同數(shù)量級的結(jié)果。
白葡萄酒、花色素苷粉末(SefcalTM，葡萄皮的提取物，用作食品著色劑)、紅葡萄酒渣、法國ParadoxTM膠囊(Akropharma)或EndotelonTM(Sanofi-Winthrop，得自葡萄籽的原花色素制劑)都沒有效果，含兒茶精及其酯的綠茶提取物(PolyphenonTM)也沒有效果。
活性多酚制劑含紅葡萄酒的所有多酚儲備，所以小心地加工該制劑以防多酚的氧化。此外已證實，接受紅葡萄酒或者得自紅葡萄酒或葡萄皮的多酚粉末的受試驗者中血漿和分離的LDL的多酚含量升高了。
為了確證該制劑的抗氧化活性，應(yīng)用了第二種分析法，其中用吸附樹脂處理血漿以除去脂質(zhì)和脂蛋白，再測定樹脂中的脂質(zhì)過氧化物含量。在給予紅葡萄酒或多酚制劑的受試驗者中脂質(zhì)過氧化物的含量降低了。又一次地，該多酚粉末效果的大小相當(dāng)于制備該粉末的紅葡萄酒的量。
這些試驗決定性地表明，在攝取紅葡萄酒之后多酚被吸收了，并出現(xiàn)于血漿和LDL中，而且從葡萄酒分離的多酚可具有相似的效果。此外，被吸收的多酚具有很強(qiáng)的抗氧化活性。多酚的作用方式可能有幾種。它們主要能螯合金屬離子(如銅和鐵)，該金屬離子促進(jìn)活體內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物。這些螯合離子是無活性的助氧化劑。多酚由于高羥基含量，包括已知可螯合金屬離子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所以破壞它們的催化性能。
另一作用可能是作為犧牲性物質(zhì)，它先于LDL被氧化，如α-生育酚就是這樣。然而本發(fā)明不限于任一種具體作用方式。
為了研究在銅催化劑氧化之前從制劑中除去EDTA的重要性，應(yīng)用存在和不存在EDTA時的透析法并應(yīng)用樹脂柱法作了比較。當(dāng)將EDTA加入透析液時，由紅葡萄酒多酚粉末產(chǎn)生的滯后時間的延長未出現(xiàn)或顯著減短了。不存在EDTA時的透析與柱法給出類似的結(jié)果。以前的作者們(deRijke等，1996)沒能獲得紅葡萄酒對志愿者的效果，這可能解釋為他們用于銅催化的氧化的制劑中存在EDTA的緣故。
表1.研究葡萄酒多酚時志愿者的結(jié)果總結(jié)多酚抗氧化劑 活性LDL血漿制No. 血漿LDL 銅方法 脂質(zhì)過氧化物紅葡萄酒 9 + + + +白葡萄酒 9 - - - -PP1粉末 9 + + + +PP2粉末 6 + + + +白葡萄酒+PP1 6 + + + +含酒精的飲料 6 - - - -花色素苷 5 - - - -紅葡萄酒渣6 - - - ND葡萄籽原花色素 6 - - - -綠茶提取物7 - - - ND+＝正效果-＝無效果ND＝未做表2.葡萄酒和葡萄酒制品對血漿的效果，多酚mg/g蛋白質(zhì)±(S.D.)制品No O2周P值成對t檢驗紅葡萄酒 9 16.2±5.6 22.6±2.7 0.008白葡萄酒 9 18.95.0 20.3±1.4 0.450PP1 9 21.0±2.9 26.9±5.3 0.009PP2 6 24.51.4 26.0±1.8 0.070白葡萄酒+PP1 6 17.6±4.0 22.6±1.7 0.020含酒精飲料6 23.9±1.0 24.0±1.2 0.860花色素苷 5 19.2±6.4 21.4±3.1 0.580紅葡萄酒渣6 22.6±0.7 23.4±1.2 0.158葡萄籽6 20.4±6.7 21.3±70.380原花色素綠茶提取物7 21.3±1.2 22.1±1.6 0.295表3.葡萄酒和葡萄酒制品對LDL的效果，多酚(mg/g蛋白質(zhì)±S.D.)制品 NoO 2周 P值成對t檢驗紅葡萄酒 9 34.0±6.2 42.3±8.1 0.001白葡萄酒 9 39.3±6.1 38.5±10.0 0.820PP1 9 37.0±4.6 47.6±6.2 0.002PP2 6 35.5±5.1 46.0±10.0 0.006白葡萄酒+PP1 6 33.5±6.3 54.2±21.0 0.040含酒精飲料6 39.4±4.5 43.7±1.6 0.084花色素苷 5 40.0±5.6 36.2±6.0 0.520紅葡萄酒渣6 41.7±3.6 38.4±3.4 0.063葡萄籽6 38.2±4.8 40.2±3.7 0.240原花色素綠茶提取物7 36.9±6.2 37.3±5.3 0.840表4.葡萄酒和葡萄酒制品對血漿的效果，脂質(zhì)過氧化物(μmol/g蛋白質(zhì)(±S.D.)制品 No O2周 P值成對t檢驗紅葡萄酒 9 2.13±0.70 1.54±0.480.056白葡萄酒 9 1.73±0.55 2.15±0.660.158PP1 9 1.90±0.52 1.37±0.380.051PP2 6 1.88±0.24 1.51±0.210.018白葡萄酒+PP1 6 1.70±0.51 1.19±0.190.040含酒精飲料6 1.60±0.25 1.50±0.400.460花色素苷 5 3.04±0.73 2.93±0.560.260紅葡萄酒渣6未做葡萄籽6 1.69±0.13 1.47±0.460.289原花色素綠茶提取物7未做表5.葡萄酒和葡萄酒制品對銅氧化LDL的影響以分鐘表示的平均滯后時間(±S.D.)制品 No O 2周 P值成對檢驗紅葡萄酒 9 51.6±7.6 69.3±18.30.008白葡萄酒 9 63.8±18.5 63.6±9.9 0.950PP1 9 51.7±5.6 65.9±12.80.006PP2 6 60.0±9.2 73.7±11.00.001白葡萄酒+PP1 6 54.8±2.6 66.5±5.2 0.007含酒精飲料6 54.0±4.6 56.6±4.2 0.140花色素苷 5 53.0±4.4 51.5±3.110.650紅葡萄酒渣6 62.0±2.7 60.3±5.2 0.500葡萄籽6 69.5±24.0 62.8±5.4 0.499原花色素綠茶提取物7 66.2±4.4 59.3±5.4 0.629結(jié)論1克葡萄酒多酚粉末的抗氧化活性等效于半瓶紅葡萄酒。日劑量1～2g多酚粉末將具有對冠心病可能的預(yù)防活性。其它制品(例如用于食品工業(yè)作為著色劑的葡萄皮提取物、原花色素制劑、法國Paradox膠囊以及含兒茶精及其酯的綠茶提取物)都無活性。實施例3通過簡單摻和以及常規(guī)包膠囊法從下列成分制備了膠囊。
mg葡萄酒多酚粉末 500硬脂酸 25硬脂酸鎂 50微晶纖維素 25
---600mg每天在用膳時或用膳后服用2～4顆膠囊。實施例4通過簡單的摻和以及常規(guī)包膠囊法從下列成分制備了膠囊。
mg葡萄酒多酚粉末 400α生育酚150葉酸0.2mg(稀釋成1∶50) 10卵磷脂 20蜂蠟20----600mg每天在用膳時至少應(yīng)服用3顆膠囊。實施例5將1克葡萄酒多酚粉末加入以商品名“Cambridge Diet”(Cambridge Health Plan Ltd，Norwich，UK)零售的、每天可提供405千卡的干粉配方膳食組合物(42g蛋白質(zhì)，43g碳水化合物和8g脂肪，推薦每日營養(yǎng)需要量的維生素和礦物質(zhì))。一天的供應(yīng)(3餐/天)供攝食的多酚等效于0.5L紅葡萄酒/天。實施例6將0.5g得自紅葡萄酒的總多酚儲備加入250ml含草莓調(diào)味劑和甜味劑的普通酸牛奶。該紅色多酚物質(zhì)增強(qiáng)酸牛奶的外觀，并提供有益于健康的非?？煽诘氖沉?。實施例7如下配方是作為待與水混合的粉末提供的無酒精飲料的配方。
一水合葡萄糖 300g檸檬酸 32g檸檬酸三鈉 5g葡萄柚調(diào)味劑 6g檸檬調(diào)味劑 1.4g橙調(diào)味劑 1.4g天冬甜素 1g總葡萄酒多酚儲備(如實施例1)21g將53g粉末溶于1升水。一份250ml提供0.75g活性多酚。實施例8下列配方是作為瓶裝立即可飲的混合物提供的含酒精飲料。
脫氣營養(yǎng)水 450ml伏特加酒 50ml總葡萄酒多酚(如實施例1) 1g將多酚溶于清淡(脫氣的)營養(yǎng)混合物，然后在壓力下充二氧化碳?xì)怏w得到充氣飲料。將450ml的等份分配入瓶內(nèi)，添加伏特加酒，再用螺旋蓋將瓶密封。實施例9在30℃下于工業(yè)用混合器中將約2000kg白葡萄渣與2500L蒸餾水充分?jǐn)嚢?小時。然后從混合器取出該混合物并置于槽內(nèi)使之沉降2小時，再抽出上清液并過濾得清亮液體。接著應(yīng)用與實施例1相同的方法使多酚吸附在樹脂上，應(yīng)用相似量Diaion HP-20樹脂和洗脫溶劑。
在濃縮該酒精水溶液至35％干物質(zhì)時，出現(xiàn)重約600g的紅色固體。將該物質(zhì)溶于10％含水酒精后噴霧干燥得不溶于水但溶于含水酒精的固體。然后在氮氣中將殘余溶液噴霧干燥而得1.4kg紅色物質(zhì)，它含約50％多酚。該物質(zhì)的組合物類似于實施例1中所得的組合物。
該方法的缺點是，在樹脂上吸附之前獲得提取物的操作更難并且費(fèi)時。雖然產(chǎn)率小，但能廉價獲得葡萄皮就具有商用優(yōu)勢。
將該粉狀飲料沖調(diào)后按實施例2中描述的方案給5位志愿者服用2周。銅催化的LDL氧化分析中的結(jié)果如下之前 78.8±7.2分2周后 93.0±9.4分改變量14.2±4.8分(p值0.003)所得結(jié)論是，從葡萄皮(此處是白葡萄)提取的提取物即葡萄渣被口服2周時是有效的抗氧化劑。實施例10通過超速離心分離血漿LDL(得自實施例2中描述的同組志愿者)，按實施例2中所述那樣對磷酸鹽緩沖液透析。通過Singleton & Rossi(1965)的方法分析含多酚物質(zhì)的多酚含量。在37℃下將血漿LDL(0.05μg LDL于1.0ml中)與100μl硫酸銅溶液(最終濃度為5μM)一起保溫，如實施例2中所述那樣通過銅催化的二烯分析法測定滯后時間。通過在添加硫酸銅之前將4μg多酚物質(zhì)加到1ml LDL中測定含多酚的物質(zhì)在體外延長滯后時間的能力。測試的物質(zhì)如下1)“赤霞珠”紅葡萄酒2)法國普通白葡萄酒3)如實施例1中所述那樣制備的紅葡萄酒多酚4)如實施例2中所述的SefcalTM花色素苷5)如實施例2中所述的EndotelonTM原花色素6)如實施例2中所述的法國Paradox膠囊(紅葡萄酒渣)7)如實施例2中所述的PolyphenonTM(綠茶兒茶精)下表7中將經(jīng)口消費(fèi)試驗物質(zhì)達(dá)2周后所得的活體內(nèi)結(jié)果與體外結(jié)果作了比較。體外結(jié)果是4次測定的平均值。以4μg/ml的量添加的所有物質(zhì)滯后時間都增大了。觀測到的效果大小順序為多酚粉末＝花色素苷＞綠茶兒茶精＞葡萄籽原花色素＞紅葡萄酒＞白葡萄酒＞紅葡萄酒渣。
口服這些物質(zhì)后，按實施例2中所述那樣分離和測試LDL，只有紅葡萄酒和紅葡萄酒多酚使滯后時間延長，所有其它含多酚的物質(zhì)都無活性。這清楚地表明，不能從體外結(jié)果預(yù)測物質(zhì)的活體內(nèi)效果。這些物質(zhì)中大多數(shù)缺乏活體內(nèi)活性可能是由于它們?nèi)狈ψ阅c的吸收，或者不能被結(jié)合入LDL。表6.在銅-二烯分析法中，比較體外和活體內(nèi)含多酚的物質(zhì)體外活體內(nèi)物質(zhì) 滯后時間的增加 滯后時間的增加多酚含量 分鐘 ％ 效果**多酚攝 分鐘 ％ 效果入量/天紅葡萄酒1.8g/L26 100 ++ 675 17.8 100++白葡萄酒0.2g/L22 85+ 75-0.22 -1 -多酚粉末*450mg/g 65 230 +++ 450 14.2 80 ++紅葡萄酒500mg/g 66 255 +++ 500 -1.5 -8 -花色素苷葡萄籽 425mg/g 50 190 +++ 750 -6.7 -38-原花色素苷紅葡萄酒渣 210mg/g 18 70+ 156 -1.7 -10-綠茶兒茶精 960mg/g 75 290 +++ 300 -6.8 -38-*以膠囊形式**觀測的效果-+小，++適中，+++大，-無。實施例11將實施例2的20名前述志愿者分成組(A和B)，各組為6～9名受試驗者，給予下列物質(zhì)達(dá)2周A)含1g總的紅葡萄酒多酚的黑茶藨子調(diào)味的飲料(330ml)，該飲料與可商購的粉末(糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、天冬甜素、合成調(diào)味劑；CambridgeManufacturing Co Ltd，Corby，UK)混合，就在消費(fèi)前往其中加入水；或者B)如前述制備的含紅葡萄酒多酚粉末的膠囊，以2g紅葡萄酒多酚/天的劑量。
將這些制品等分，在午餐和晚餐后服用。
如實施例2中所述那樣獲得血漿樣品再在超速離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)而得LDL。
應(yīng)用了如下三種在氧化之前處理LDL的方法。
a)最后透析，未用EDTA利用透析盒(Pierce Slide-A-Lyzer Perstorp Biotec Company，USA)在4℃下用含2μM EDTA的10mM磷酸鹽緩沖鹽水將LDL透析1小時，然后用10mM磷酸鹽緩沖鹽水透析一夜。
b)用EDTA連續(xù)透析取出LDL如上述那樣在4℃下透析，只是整個透析過程用含10μM EDTA的10mM磷酸鹽緩沖鹽水。
c)柱處理使LDL通過一個EcNo-pac 10DG脫鹽柱(Bio-Rad Labs，UK)。用處理過的10mM PBS[chelex-100樹脂(Bio-Rad，UK)，5g/L PBS混合后潷析]將該柱洗滌兩次。然后在柱上裝填600μL LDL，應(yīng)用Ismatec IPCPeristaltic泵(Ismatec，Weston Super Mare，UK)用3ml PBS緩沖液在0.6ml/分的流速下洗脫。
然后進(jìn)行銅催化的過氧化，如實施例2中那樣測定滯后時間。結(jié)果示于表7中。
以飲料(1g/天)或膠囊(2g/天)形式消費(fèi)紅葡萄酒多酚使滯后時間(當(dāng)最后的透析液中省去EDTA時)分別增大30％和21％，通過柱法處理使滯后時間分別增大12％和22％。在透析液中加入EDTA消除了1g/天紅葡萄酒多酚的效果，且使2g/天時的滯后時間只增加7％。表7.應(yīng)用不同方法使LDL脫鹽的銅催化過氧化中滯后時間(分)增補(bǔ)劑 No 透析 透析 未透析無EDTA 有EDTA 柱葡萄酒多酚飲料(1g/天)6基礎(chǔ)60.0±5.3 64.3±3.854.2±4.62周后 77.7±8.4 64.5±3.960.6±4.7平均值的差 17.7±3.1 0.3±0.1 6.4±0.1P值 0.02 0.9 0.005膠囊(2g/天)6基礎(chǔ)62.7±2.5 67.7±3.654.0±2.22周后 75.8±2.8 72.2±3.165.8±2.2平均值的差 13.2±0.3 4.5±0.5 11.8±0.1P值 0.004 0.02 0.003本發(fā)明的另一個目的是提供一種活性多酚制劑(便利地得自葡萄、葡萄酒或葡萄酒副產(chǎn)物)，該制劑用于治療冠心病和與平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)的其它疾病，例如動脈粥樣硬化、再狹窄、中風(fēng)以及腸和子宮的瘤形成、子宮平滑肌瘤或纖維瘤。
本發(fā)明人已意外地發(fā)現(xiàn)，可制備一種多酚組合物(例如從紅葡萄酒制備)，當(dāng)該組合物給受試驗的人口服時將會刺激總的、活性TGF-β-的產(chǎn)生。
已證明了當(dāng)紅葡萄酒或者得自紅葡萄酒、以粉末或飲料形式提供的多酚制劑給人口服后，使血漿總的、活性TGF-β-1增高。含少量多酚的白葡萄酒則無活性。
多酚制劑的劑量取決于該物質(zhì)的活性度，但應(yīng)是10mg～10g/天。至于得自葡萄酒的總多酚儲備，優(yōu)選的劑量是0.1～4g/天，更優(yōu)選是1～2g/天，等效于0.5～1升紅葡萄酒/天。實施例12讓受試驗的人口服紅葡萄酒、白葡萄酒和得自紅葡萄酒、呈粉末或飲料形式的多酚制劑(如前面實施例1中所述)，研究了它們對血漿TGF-β的效果。
要求健康志愿者(30名年齡為35～65歲的男性)停止葡萄酒消費(fèi)達(dá)2周。給他們提供375ml紅葡萄酒或白葡萄酒或者作為膠囊或作為于330ml水中的調(diào)味飲料的1g紅葡萄酒多酚總儲備(從前述相同的“赤霞珠”葡萄酒制備的)。每天飯后消費(fèi)每種增補(bǔ)劑2次達(dá)2周。
處理后將血液樣品抽入K3EDTA(1mmol/L)，離心而得血漿，分析前在-70℃下貯存。通過Singleton和Rossi(1965)的方法測定總血漿多酚。應(yīng)用兩種不同的多克隆抗體(下述方法1&2)通過免疫測定法測定總的TGF-β-1。
方法1通過R&D系統(tǒng)(Abingdon，Oxford，UK)提供的Quantikine人TGF-β免疫測定試劑盒測定總的(潛伏的+活性的)TGF-β。該分析法應(yīng)用了定量夾心式免疫測定技術(shù)。TGF-β可溶性受體II型結(jié)合了已預(yù)涂在微量滴定板上的TGF-β-1。將標(biāo)準(zhǔn)物和樣品吸移入孔中，任何存在的TGF-β-1都被固定了的受體結(jié)合。在洗去任何未結(jié)合的物質(zhì)后，將TGF-β-1特異性的酶聯(lián)多克隆抗體加到孔內(nèi)，將在第一次保溫期間固定化的TGF-β-1夾在中間。在洗滌以除去未結(jié)合的抗體酶試劑之后將底物溶液加到孔內(nèi)與酶產(chǎn)生顏色。顯示的顏色強(qiáng)度與存在的TGF-β-1呈比例。
在進(jìn)行分析前，通過添加乙酸和脲，保溫10分鐘，然后用氫氧化鈉/HEPES溶液中和而將潛伏的TGF-β變成活性形式。該方法估測(潛伏的+活性的)TGF-β-1。這樣進(jìn)行TGF-β的活化在0.1ml血漿中加入0.1ml2.5N乙酸/10M脲，充分混合后在室溫下保溫10分鐘。往該溶液中加入0.1ml 2.7N NaOH/1M HEPES以中和樣品，再充分混合。在分析前用該試劑盒廠商提供的校準(zhǔn)稀血清RD6M將活化了的血漿樣品稀釋10倍。
分析過程如下將200μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)物加到微量滴定板的各孔內(nèi)。然后用粘性塑料膠條覆蓋該板，在室溫下保溫3小時。再對每個孔抽氣，接著用400μl洗滌緩沖液將孔洗滌3次。往每個孔中加入200μl TGF-β1綴合物，又用新膠條將板覆蓋，在室溫下保溫110分鐘。再對孔抽氣，用400μl洗滌緩沖液洗滌3次。往孔中加入200μl底物溶液，在室溫下將該板保溫20分鐘。然后往每個孔中加入50μl 2N H2SO4溶液，在450nm處測定光密度。
方法2應(yīng)用與上面基本相同的方法，只是在估測前未活化TGF-β，并應(yīng)用BDA-19抗體(R&D systems，Abingdon，Oxford，UK)代替TGF-β-1的多克隆抗體。該方法估測了TGF-β-1的一個活性形式。
優(yōu)選地，消費(fèi)本發(fā)明的組合物將使受試驗者的TGF-β1含量增大至少1.5ng/ml(由方法1判斷的)或者至少0.5ng/ml(由方法2判斷的)。
結(jié)果如表8中所示，紅葡萄酒引起血漿多酚增加了，但白葡萄酒卻沒有，多酚膠囊和飲料也引起增加。通過兩種方法都觀測到紅葡萄酒、多酚膠囊和飲料都引起TGF-β-1的增加，但白葡萄酒卻沒有。這表明紅葡萄酒多酚既使TGF-β-1的總量(潛伏量+活性量)，也使TGF-β-1的活性形式的量增多了。總結(jié)出葡萄酒多酚使總的TGF-β-1增加，并能抑制VSMC增殖。表8.葡萄酒和紅葡萄酒多酚對血漿多酚的效果以及由兩種不同分析方法測定的對總TGF-β的效果
平均值±sem本發(fā)明人另外還意外地發(fā)現(xiàn)了，可制備這樣一種多酚組合物(例如從紅葡萄酒制備)，當(dāng)將它給受試驗的人口服后，它將抑制血小板聚集和刺激血纖維蛋白溶解作用。
尤其證實了，當(dāng)將得自紅葡萄酒的多酚制劑給人口服時，如果應(yīng)用花生四烯酸、ADP、膠原或凝血酶作為興奮劑，則使血小板聚集減少。此外，消費(fèi)多酚制劑引起受試驗者血漿的tPA活性增大。
多酚制劑的劑量取決于該物質(zhì)的活性度，但應(yīng)是10mg～10g/天。如果該組合物包括得自紅葡萄酒的總酚儲備，則優(yōu)選的劑量應(yīng)是0.1～4.0g/天，更優(yōu)選為1～2g/天，它等效于0.5～1.0升紅葡萄酒/天。實施例13如前述(前面的實施例1)那樣制備紅葡萄酒多酚組合物。
給12名年齡在35～65歲的健康男性的膳食每天補(bǔ)充2g紅葡萄酒多酚(如實施例2中所述)或阿司匹林(75mg)達(dá)兩周。如下述那樣采集禁食時的檸檬酸鹽血樣作為基礎(chǔ)，并在開始試驗后4小時和2周時將血樣抽入含0.11M檸檬酸鹽(與血樣的比為1∶9v/v)的注射器血樣取自肘前靜脈，讓受試驗者處于橫臥位(采用最小的停滯)。將血樣在250g下離心10分鐘而制備富含血小板的血漿(PRP)。取出大部分PRP，再將殘余血樣在2500g下離心15分鐘而制備血小板缺乏的血漿(PPP)。用細(xì)胞計數(shù)器(Minos STX，ABX Ltd，Montpellier，法國)測定PRP中的血小板濃度。棄去血小板數(shù)在150000～350000/μl范圍外的樣品。在開始聚集研究之前讓PRP靜置至少30分鐘。取血樣和血小板聚集之間的時間決不長于3小時。
用PAP-4C集合度計(BioData，Alpha Laboratories，Southampton，UK)測定了新配制的血小板的血小板聚集。將200μl PRP樣品加入硅烷化的小池，在37℃下保溫3分鐘。加入20μl興奮劑(下列興奮劑之一455μg/ml的花生四烯酸；1.8μmol/L ADP；得自BioData的43μg/ml的膠原；0.11U/ml的凝血酶，得自Sigma，Poole，Dorset，UK；所有這些濃度都是聚集混合物中的最終濃度)誘導(dǎo)聚集。在37℃、1,000rpm下將血小板懸浮液攪拌5分鐘。在該時間內(nèi)測定最大聚集量(基礎(chǔ)值的百分比)。該值是血小板聚集潛力的尺度。對消費(fèi)試驗物質(zhì)之前和之后抽取的樣品進(jìn)行對比時，該值減小則表示抗聚集響應(yīng)。通過成對t檢驗估測了統(tǒng)計顯著性。
如表9中所示，紅葡萄酒多酚粉末迅速或緩慢地抑制血小板聚集。這些效果類似于但小于用阿司匹林(75mg/天)時觀測到的效果，凝血酶則例外。尤其，多酚對花生四烯酸誘導(dǎo)的聚集的效果表明了對血小板環(huán)加氧酶活性的抑制作用。這些結(jié)果表明，紅葡萄酒多酚具有阿司匹林那樣的效果，不過對凝血酶誘導(dǎo)的聚集有另外的抑制效果。
表9給予紅葡萄酒多酚或阿司匹林的志愿者中最大血小板聚集(％)，平均值(SEM)最大血小板聚集量(％)紅葡萄酒多酚a(12)+阿司匹林b(7)+興奮劑基礎(chǔ) 4小時 2周 基礎(chǔ)4小時 2周花生四烯酸82.3(1.1)78.7(0.8)*79.0(0.8)**69.2(10.1) 28.6(11.2)*12.6(1.9)**(455μg/ml)ADP(1.8μmol/L) 42.4(3.4)37.6(3.3)38.7(2.9)39.2(4.2) 31.5(3.7) 31.3(2.6)*膠原(43μg/mL)54.2(8.8)59.2(8.0)47.3(9.2)**67.5(5.1) 24.6(5.0)***21.8(4.7)***凝血酶22.0(1.7)17.4(1.8)**16.2(2.2)*15.5(2.8) 13.9(4.5) 12.2(2.0)(0.11U/mL)*P＜0.05；**P＜0.01***P＜0.001(與基礎(chǔ)的差異)+受試驗者a2g/天b75mg/天應(yīng)用了相同的試驗以研究受試驗者中PAI-1和tPA活性的水平。血樣取自肘前靜脈，讓受試驗者處于橫臥位(采用最小的停滯)，將血樣抽入含0.5M檸檬酸鹽(pH4.3)(StabilyteTM，與血樣的比為1∶9v/v)的注射器。在4℃下將血樣在2,500g下離心15分鐘而制備血漿，立即在-70℃下冷凍。
在分析當(dāng)天將受試驗者的所有3個樣品(基礎(chǔ)、4小時和2周)在37℃下迅速融化。應(yīng)用可商購的生物功能免疫吸著測定法試劑盒(ChromolizeTM，得自Biopool，Umea，瑞典)測定tPA活性。將樣品或標(biāo)準(zhǔn)物(100μl)加到各個孔中。將該微量滴定板在板搖動器中保溫20分鐘，然后棄去孔中內(nèi)含物，將孔洗滌4次。接著在各孔中加入50μl底物溶液，再加入50μl纖溶酶原試劑，又將該板保溫90分鐘。最后，往各孔中加入50μl1.7M冰乙酸溶液，混合15秒鐘。測定405nm處的吸光度，從線性校正曲線讀取樣品中的tPA活性。通過兩尾(two-tailed)成對t檢驗來估測每次處理時，在基礎(chǔ)值、4小時值和2周值之間差異顯著性。結(jié)果示于表10中。
酶tPA構(gòu)成血纖維蛋白溶解途徑中的重要蛋白質(zhì)，并且認(rèn)為它的活性在血纖維蛋白溶解系統(tǒng)中起主要作用。tPA的生理作用是將纖溶酶原活化成纖溶酶，它將血纖蛋白降解成可溶性血纖蛋白降解產(chǎn)物。在tPA的分析中，特異性抑制劑PAI-1通常大為過量地存在，且必須防止其猝滅tPA活性。這可通過應(yīng)用StabilyteTM血液采集管防備，它使樣品適度酸化。
因為已知PAI-1值易在晝夜間變化，所以進(jìn)行了另一次試驗，其中應(yīng)用水作為安慰劑代替紅葡萄酒多酚對相同的受試驗者進(jìn)行了研究。結(jié)果示于表11中。
表10用紅葡萄酒多酚(2g/天)增補(bǔ)后的PAI-1和tPA。
平均值±SEMN 基礎(chǔ) 4小時 2周PAI-1抗原(ng/ml) 6 18.8±3.6 8.6±1.0*17.0±3.4tPA活性(IU/ml)10 0.62±0.161.61±0.30**0.71±0.20*P＜0.05**P＜0.01(與基礎(chǔ)的差異)
表114小時后2g紅葡萄酒多酚與水的比較PAI-I抗原(ng/ml)(n＝11)劑量 水 紅葡萄酒多酚(2g)時間 0小時 4小時 0小時 4小時平均值21.9 10.6 20.3 9.5SD12.7 4.29.03.1SEM 3.81.32.70.9P值 0.00610.0007tPA活性(IU/ml)(n＝9)劑量 水 紅葡萄酒多酚(2g)時間 0小時 4小時 0小時 4小時平均值0.82l 1.221 0.566 1.511SD0.693 0.605 0.492 0.934SEM 0.231 0.202 0.164 0.311P值 0.19680.01364小時后紅葡萄酒多酚(2g/天)引起PAI-1的顯著減小，這與tPA活性的顯著增大有關(guān)(表10)。在2周的處理后，禁食一夜后未見到變化。但是，如表11中所示，口服水后，4小時后PAI-1抗原濃度降低了，表明在消費(fèi)多酚粉末后觀測到的對PAI-1抗原濃度的影響只是由于晝夜變化的緣故。然而服用水未明顯增大tPA活性，但是紅葡萄酒多酚粉末使tPA活性增大2.7倍。總結(jié)出紅葡萄酒多酚在刺激血纖維蛋白溶解中通過增大tPA活性而產(chǎn)生有益效果，但對PAI-1抗原濃度無效果。tPA促進(jìn)從纖溶酶原形成纖溶酶，纖溶酶將TGF-β的潛伏形式轉(zhuǎn)化成它的活性形式，TGF-β的活性形式再抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的生長，這種生長促成動脈粥樣硬化斑的生長。
優(yōu)選地，消費(fèi)本發(fā)明的組合物將引起最大血小板聚集量減小至少2％(如通過上述方法測定的)和/或tPA活性增大至少0.75IU/ml(如通過上述方法測定的)。
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權(quán)利要求
1.適合人消費(fèi)、植物衍生的含黃酮醇的干組合物，其中該組合物中植物衍生的物質(zhì)的至少25％包括多酚。
2.權(quán)利要求1的組合物，它包括至少0.01％w/w黃酮醇。
3.適合人消費(fèi)、植物衍生的含黃酮醇的干組合物，它包括至少0.01％(w/w)黃酮醇。
4.前述權(quán)利要求任一項的組合物，其中該黃酮醇含量至少是0.1％(w/w)。
5.前述權(quán)利要求任一項的組合物，其中該黃酮醇含量至少是1％(w/w)。
6.前述權(quán)利要求任一項的組合物，其中該黃酮醇含量包括該組合物總的植物衍生的多酚含量的至少0.5％。
7.前述權(quán)利要求任一項的組合物，其中該黃酮醇含量包括該組合物總的植物衍生的多酚含量的至少1.0％。
8.前述權(quán)利要求任一項的組合物，其中該黃酮醇含量包括該組合物總的植物衍生的多酚含量的至少2％。
9.前述權(quán)利要求任一項的組合物，它包括紅葡萄酒的總多酚儲備。
10.前述權(quán)利要求任一項的組合物，它包括賦形劑、稀釋劑或載體。
11.前述權(quán)利要求任一項的組合物，它包括一種或多種選自下組的物質(zhì)營養(yǎng)物、抗氧化劑、治療物質(zhì)(尤其是那些對于預(yù)防和/或治療CHD有療效的物質(zhì))、調(diào)味劑和甜味劑。
12.前述權(quán)利要求任一項的組合物，它包括一種或多種選自下組的物質(zhì)黃體素、番茄紅素、α-或β-胡蘿卜素、維生素A、維生素C、維生素E(α-生育酚和其它活性生育酚)、葉酸、硒、銅、鋅、錳、泛醌(輔酶Q10)、水楊酸、2，3-二羥基苯甲酸、2，5-二羥基苯甲酸和阿司匹林。
13.前述權(quán)利要求任一項的組合物，它以單元劑量形式包裝。
14.前述權(quán)利要求任一項的組合物，它呈片劑、膠囊或丸劑的形式。
15.通過將前述權(quán)利要求任一項的組合物與生理上可接受的液體混合而調(diào)制的飲料。
16.調(diào)制飲料的方法，它包括將權(quán)利要求1～14任一項的組合物與生理上可接受的液體混合。
17.權(quán)利要求15的飲料，或權(quán)利要求16的方法，其中該生理上可接受的液體包括水、水溶液、醇溶液、果汁、乳或酸牛奶。
18.抑制受試驗的人血漿LDL的氧化的方法，該方法包括制備權(quán)利要求1～14任一項的組合物，或權(quán)利要求15的飲料；并且給受試驗者服用該組合物或飲料。
19.刺激受試驗的人產(chǎn)生TGF-β的方法，該方法包括制備權(quán)利要求1～14任一項的組合物，或權(quán)利要求15的飲料；并且給受試驗者服用該組合物或飲料。
20.對受試驗的人抑制血小板聚集和/或刺激血纖維蛋白溶解的方法，該方法包括制備權(quán)利要求1～14任一項的組合物，或權(quán)利要求15的飲料；并且給受試驗者服用該組合物或飲料。
21.權(quán)利要求1～14任一項的組合物的應(yīng)用，即用于制備供受試驗的人消費(fèi)的藥劑以抑制受試驗者血漿LDL的氧化。
22.權(quán)利要求1～14任一項的組合物的應(yīng)用，即用于制備供受試驗的人消費(fèi)的藥劑以刺激受試驗者中受試驗的人產(chǎn)生TGF-β。
23.權(quán)利要求1～14任一項的組合物的應(yīng)用，即用于制備供受試驗的人消費(fèi)的藥劑以在受試驗者中抑制血小板聚集和/或刺激血纖維蛋白溶解。
24.制備一種藥劑的方法，該藥劑供受試驗的人經(jīng)口消費(fèi)以便在受試驗者中產(chǎn)生如下一個或多個效果抑制血漿LDL的氧化；抑制血小板聚集；刺激血纖維蛋白溶解；以及刺激TGF-β的產(chǎn)生；該方法包括制備權(quán)利要求1～14任一項的組合物；并且制備該組合物的單元劑量。
25.一種制品，尤其是一種食料，它包括權(quán)利要求1～14任一項的組合物。
全文摘要
公開了適合人消費(fèi)、植物衍生的含黃酮醇的干組合物,其中該組合物中植物衍生的物質(zhì)的至少25%包括多酚,還公開了該組合物的應(yīng)用。
文檔編號A61P7/02GK1230875SQ9719808
公開日1999年10月6日 申請日期1997年9月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月20日
發(fā)明者A·N·霍華德, S·V·尼迪卡, J·拉普特－威廉斯, N·R·威廉斯 申請人:霍華德基金會