專利名稱：睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體的制作方法
1、引言本發(fā)明涉及睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體(CNTER)，并提供了CNTF受體編碼核酸以及氨基酸序列。本發(fā)明也涉及(ⅰ)為檢測CNTF活性的檢測系統(tǒng);(ⅱ)為研究CNTF的生理學(xué)作用的試驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng);(ⅲ)為鑒定CNTF相關(guān)的神經(jīng)狀態(tài)的診斷技術(shù);(ⅳ)為處理CNTF相關(guān)的神經(jīng)狀態(tài)的治療技術(shù);以及(ⅴ)為鑒別與CNTFR同源分子的方法。
2、發(fā)明背景2.1.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子(CNTF)是一種特定地為胚胎雞睫狀節(jié)神經(jīng)元體外存活所需的蛋白質(zhì)(Manthorpe et al.，1980，J.Neurochem.34∶69-75)。該睫狀神經(jīng)節(jié)解剖學(xué)上位于視覺神經(jīng)的側(cè)直肌和鞘之間的眶腔范圍內(nèi);它容納來自支配睫狀肌和瞳孔括約肌的動眼神經(jīng)的副交感神經(jīng)纖維。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，睫狀節(jié)神經(jīng)元屬于呈現(xiàn)確定細(xì)胞死亡周期的神經(jīng)元群體。在雞睫狀神經(jīng)節(jié)中，已觀察到胚胎期8天(E8)時存在的半數(shù)神經(jīng)元在E14之前死亡(Landmesser and Pilar，1974，J.Phy-siol.241∶737-749)。在這一相同的時間周期內(nèi)，睫狀節(jié)神經(jīng)元正與其靶組織，即眼的睫狀體和脈絡(luò)膜形成接連。Landmesser和Pilar(1974，J.Physiol.241∶751-736)觀察到，在細(xì)胞死亡周期之前去除一眼，導(dǎo)致在同側(cè)神經(jīng)節(jié)中睫狀節(jié)神經(jīng)元的完全損失。相反地，Narayanan和Narayanan(1978，J.Embryol.Ex.Morphol.44∶53-70)觀察到，通過植入一補充的眼原基從而增加可得到的靶組織的量，可以減少睫狀節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。這些結(jié)果與作用于睫狀節(jié)神經(jīng)元的靶衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的存在是一致的。
在培養(yǎng)時，已發(fā)現(xiàn)，睫狀神經(jīng)節(jié)(CG)神經(jīng)元為了存活需要一個因子或多個因子。已在下述情況下鑒定了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的活性在雞肌肉細(xì)胞條件培養(yǎng)基中(Helfand et al.，1976，Dev.Biol.50∶541-547;Helfand et al.，1978，Exp.Cell Res.113∶39-45;Bennett and Nurcome，1979，Brain Res.173∶543-548;Nishi and Berg，1979，Nature 277∶232-234;Varon et al.，1979，Brain Res.173∶29-45)，在肌肉提取物中(McLennan and Hendry，1978，Neu-rosci.Lett.10∶269-273)，在雞胚胎提取物中(Varon et al.，1979，Brain Res.173∶29-45;Tuttle et al.，1980，Brain Res.183∶161-180)，以及在由心臟細(xì)胞調(diào)整的培養(yǎng)基中(為了討論，也可參閱Adler et al.，1979，Science 204∶1434-1436以及Barbin et al.，1984，J.Neurochem.43∶1468-1478)。
Adler等人(1979，Science 204∶1434-1436)使用了一種基于CG神經(jīng)元的微井培養(yǎng)物的測試系統(tǒng)以證明在CG神經(jīng)元神經(jīng)支配的眼內(nèi)靶組織中發(fā)現(xiàn)了非常豐富的CNTF源。在十二天胚胎中存在的8000營養(yǎng)單位(TU)范圍中，發(fā)現(xiàn)了2500TU存在于眼組織中;活性看來局限在含有睫狀體和脈絡(luò)膜的部分。
其后，Barbin等人(1984，J.Neurochem.43∶1468-1478)報導(dǎo)了由雞胚胎眼組織中富集CNTF的方法。也發(fā)現(xiàn)了CNTF活性是與非CG組織，包括大鼠坐骨神經(jīng)相關(guān)的(Williams et al.，1984，Int.J.Develop.Neurosci.218∶460-470)。Manthrope等人(1986，Brain Res.367∶282-286)報導(dǎo)了使用一種類似于由雞眼中分離CNTF活性所用的分離工序由成年的大鼠坐骨神經(jīng)提取物中部分提純哺乳動物CNTF活性。另外，Watters和Hendry(1987，J.Neurochem.49∶705-713)公開了一種使用肝素-親和性色譜法在非變性條件下由牛心組織中將CNTF活性富集約20000倍的方法。也鑒定了損傷的腦組織中的CNTF活性(Manthorpe et al.，1983，Brain Res.267∶47-56;Nieto-Sampedro et al.，1983，J.Neurosci.3∶2219-2229)。
Carnow等人(1985，J.Neurosci.5∶1965-1971)和Rudge等人(1987，Develop.Brain Res.32∶103-110)公開了由組織提取物的Western印跡鑒定類CNTF活性并隨后通過用CG神經(jīng)元在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)硝化纖維條鑒定含有CNTF活性的蛋白質(zhì)帶以及使用活性染料鑒定細(xì)胞存活區(qū)的方法。使用這一方法，Carnow等人(1985，J.Neurosci.5∶1965-1971)觀察到，成年大鼠坐骨神經(jīng)和腦衍生的CNTF活性與雞CNTF(20.4kD)相比看上去呈現(xiàn)出不同的尺寸(24kD)。
近來，CNTF已在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中被克隆和合成，正如Sendtner等人在申請?zhí)枮?7/570 651，名稱為“Ciliary Neurotrophic Factor”，申請日為1990年8月20日的美國專利申請中所描述的，在此將之全部加入作為參考。使用重組體探針，成年大鼠組織中的CNTF-mRNA的尺寸似乎是約1.2kb。大鼠腦CNTF被克隆并被發(fā)現(xiàn)由具有77bp的短5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)和600bp開放讀碼的mRNA所編碼，預(yù)示了一種約200個氨基酸的蛋白質(zhì)(Stockli et al.，1989，Nature 342∶920-923)。人體CNTF也被克隆并定序(Sendtner等人的美國專利申請申請?zhí)枮?7/570651，名稱為“Ci-liary Neurotrophic Factor”，申請日為1990年8月20日);其編碼序列基本上相應(yīng)于其大鼠的序列被保存，而未編碼序列保存較少。
2.2.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子的機能性質(zhì)一系列生理效應(yīng)已被認(rèn)為是由于CNTF引起的。如上所述，CNTF最初被說成是作為支持E8雞睫狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元-一種副交感神經(jīng)系統(tǒng)的組分-存活的活性。對已知含有CNTF活性制劑的其它生物性質(zhì)描述如下Saadat等人(1989，J.Cell.Biol.108∶1807-1816)觀察到大鼠坐骨神經(jīng)CNTF的最高程度提純的制劑誘導(dǎo)了培養(yǎng)物中大鼠交感神經(jīng)的膽堿能分化。還有，Hoffman(1988，J.Neurochem.51∶109-113)發(fā)現(xiàn)了由雞眼衍生物的CNTF活性提高了視網(wǎng)膜單分子層培養(yǎng)物中膽堿-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的水平。
Hughes等人(1988，Nature 335∶70-73)研究了由產(chǎn)期鼠視覺神經(jīng)和腦衍生的培養(yǎng)物中兩性潛勢膠質(zhì)先祖細(xì)胞的群體;已經(jīng)顯示出這些先祖細(xì)胞首先使產(chǎn)生少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并且隨后產(chǎn)生2型星形細(xì)胞。在所采用的培養(yǎng)條件下，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化看來是由一個少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞2型星形細(xì)胞(0-2A)的先祖細(xì)胞直接形成的，而2型星形細(xì)胞的分化看來需要存在一種類似于或等同于CNTF的誘導(dǎo)蛋白質(zhì)(也可參見Anderson，1989，Trends Neurosci.12∶83-85)。
Heymanns和Unsicker(1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.4∶7758-7762)觀察到，成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞提取物的高速上清液產(chǎn)生類似于與來自雞眼或大鼠坐骨神經(jīng)的CNTF活性相關(guān)的那些效應(yīng);表明了與CNTF類似但不等同(就分子量而言)的蛋白質(zhì)的存在。
Ebendal(1987，J.Neurosci.Res.17∶19-24)研究了多種大鼠和雞組織中的類CNTF活性。他觀察到在相當(dāng)廣范圍的大鼠中的類CNTF活性，但在雞組織中未觀察到;發(fā)現(xiàn)了鼠肝、脾T細(xì)胞和下頜腺細(xì)胞與低水平的CG存活啟動活性有關(guān)，而心臟、腦、和骨骼肌肉組織與較高存活啟動活性有關(guān)。在所試驗的組織中，觀察到最高的類CNTF活性與鼠腎有關(guān)。
盡管上述研究已表明，許多組織和細(xì)胞提取物含有支持也響應(yīng)CNTF的神經(jīng)元種群存活的活性(即它們支持在組織培養(yǎng)生物檢定中E8雞睫狀節(jié)神經(jīng)元的存活)，但不能認(rèn)為單個或等同的蛋白質(zhì)是可響應(yīng)這些活性的。如成纖維細(xì)胞生長因子(FGFG)這一家系所示(Dionne et al.，1990，EMBO J.9∶2685-2692)，例如，一系列不同的多肽或蛋白質(zhì)在單獨生理學(xué)檢定中具有相同的生理學(xué)活性。
最初發(fā)現(xiàn)了雞眼和大鼠坐骨神經(jīng)CNTF的神經(jīng)元特異性與響應(yīng)NGF的神經(jīng)元群體有某些重疊。盡管觀察到了CNTF與NGF具有某些重疊的神經(jīng)元特性，但在研究發(fā)育的神經(jīng)元群體中CNTF和NGF的作用時，它們之間的區(qū)別特征變得最為明顯(Skaper and Varon，1986，Brain Res.389∶39-46)。除了在發(fā)育時它們的不同作用外，也可以根據(jù)分子量、等電點、不能被NGF抗體失活以及根據(jù)CNTF支持CGF神經(jīng)元體外存活的能力將CNTF與NGF區(qū)分開(Barbin et al.，1984，J.Neurochem.43∶1468-1478)。Lin等人(1989，Science 246∶1023-1026)已經(jīng)報導(dǎo)了CNTF沒有與任何現(xiàn)有技術(shù)報導(dǎo)過的蛋白質(zhì)同源的序列。Sendtner等人(申請?zhí)枮?7/570 651，名稱為“Ciliary Neuro-trophic Factor”，申請日為1990年8月20日的美國專利申請)觀察到重組體CNTF啟動中背部和腹部脊髓神經(jīng)元的存活，還有提純的大鼠坐骨神經(jīng)CNTF看來防止了新生大鼠損傷的面神經(jīng)(第七腦神經(jīng))中運動神經(jīng)元的細(xì)胞死亡(Sendtner et al.，1990，Nature 345∶440-441)。
使用重組體DNA技術(shù)，CNTF的克隆與表達(dá)導(dǎo)致了一系列CNTF活性的發(fā)現(xiàn)。
2.3.生長因子受體一系列作為引起結(jié)合和響應(yīng)蛋白質(zhì)因子媒介的受體在近幾年內(nèi)已被表征和分子克隆，包括胰島素、血小板衍生的生長因子、表皮生長因子及其相關(guān)物、成纖維細(xì)胞生長因子、和各種白細(xì)胞間素以及造血生長因子的受體。最近的資料顯示了，某些受體可與多種(相關(guān)的)生長因子結(jié)合，而在其它場合，相同的因子可作用在多種(相關(guān)的)受體上(例如Lupu et al.，1990，Science 249∶1552-1555;Dionne et al.，1990，EMBO J.9∶2685-2692;Miki et al.，1991，Science 251∶72-75)。大多數(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)因子的受體可廣泛地被表征為具有對特定地結(jié)合因子可響應(yīng)的胞外部分，跨越細(xì)胞膜的橫跨膜區(qū)域，和胞內(nèi)區(qū)域，該區(qū)域在蛋白質(zhì)因子結(jié)合到受體的胞外部分上時經(jīng)常包含在起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中。有意義的是，盡管許多受體是由單一多肽鏈組成，但其他受體顯然需要(至少)二個獨立亞單位以便結(jié)合到其具有高親合性的因子上并在結(jié)合后可以機能響應(yīng)(例如Hempstead et al.，1989，Science 243∶373-375;Hibi et al.，1990，Cell 63∶1149-1157)。給定受體的胞外和胞內(nèi)部分經(jīng)常與其它受體相應(yīng)區(qū)域都具有共同的結(jié)構(gòu)主題(motif)，表示了不同受體之間的進化和機能關(guān)系。這些關(guān)系經(jīng)常是相當(dāng)遠(yuǎn)的并可能完全地反映某種普通區(qū)域結(jié)構(gòu)的重復(fù)使用。例如，多種結(jié)合獨立的因子的不同受體利用其胞外部分中的“免疫球蛋白”區(qū)域，而其他受體利用其因子結(jié)合區(qū)域中的“細(xì)胞活素受體”區(qū)域(例如Akira et al.，1990，The FASEB J.4∶2860-2867)。大量具有不同胞外結(jié)合區(qū)域(該區(qū)域從而結(jié)合了不同因子)的受體含有為在響應(yīng)因子結(jié)合中所活化的酪氨酸特性蛋白質(zhì)激酶編碼的相關(guān)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(例如，Ullrich and Schlessinger，1990，Cell 61∶203-212)。因子結(jié)合使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程“活化”的機理是難于理解的，甚至在受體酪氨酸激酶的場合下也是如此。在其他受體中胞內(nèi)區(qū)域編碼未知機能的區(qū)域或者結(jié)合組分與未知機能的第二種蛋白質(zhì)相聯(lián)(例如Hibi et al.，1990，Cell 63∶1149-1157)，這樣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化甚至更難理解。
3、發(fā)明概述本發(fā)明涉及CNTF受體(CNTFR)基因和蛋白質(zhì)。它部分地基于在轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中人體CNTFR基因及其表達(dá)的克隆和特征化。
本發(fā)明提供了編碼CNTFR的核酸序列以及由此衍生的片段。本發(fā)明還提供了基本上提純的CNTFR蛋白質(zhì)，以及其肽片段。
本發(fā)明的另一方面是，可以利用CNTFR探針，包括核酸以及抗體探針，鑒別CNTFR相關(guān)的分子。例如，本發(fā)明提供了這樣的分子，它們與CNTFR形成復(fù)合體并從而參與CNTFR機能。另一個例子是，本發(fā)明提供了受體分子，它們與CNTFR在抗原上是同源的或交叉反應(yīng)性的，但不相同。這些特定的實施方案是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，CNTFR與其他生理學(xué)上相關(guān)分子具有同源現(xiàn)象，包括特別應(yīng)提到的是IL-6受體，但還有PDGF受體、CSF-1受體、促乳素受體、IL-2和IL-4受體、GM-CSF粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群體刺激因子受體、妊娠特異α1-β糖蛋白、以及癌胚抗原-種腫瘤標(biāo)志。
本發(fā)明還提供了檢測CNTF活性的分析系統(tǒng)，包括表達(dá)高水平CNTFR，并從而對甚至極低濃度的CNTF或類CNTF分子都非常敏感的細(xì)胞。
此外，本發(fā)明提供了為研究CNTF生理學(xué)作用的試驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)。這些系統(tǒng)包括動物模型，比如(ⅰ)暴露在循環(huán)CNTFR肽中的動物，這些肽和細(xì)胞受體爭奪CNTF結(jié)合并從而造成CNTF缺失的狀態(tài)，(ⅱ)用CNTFR免疫的動物，(ⅲ)表達(dá)高水平CNTFR并從而對CNTF過敏的轉(zhuǎn)基因動物;以及(ⅳ)使用干細(xì)胞技術(shù)衍生的動物，其中內(nèi)生CNTFR基因是由基因組缺失的胚胎。
在本發(fā)明的再一個實施方案中，可以使用CNTFR探針鑒別響應(yīng)正?；蚧疾顟B(tài)CNTF的細(xì)胞和組織。例如，患有CNTF相關(guān)紊亂的病人可以呈現(xiàn)出CNTFR表達(dá)的異常性。
此外，本發(fā)明的CNTFR基團和蛋白質(zhì)可以在治療上使用。例如，但不作為限定，可以使用循環(huán)CNTFR減少中心神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)域中CNTF的水平。另一方面，重組體CNTFR基因可以被插入到得益于提高對CNTF靈敏度的組織中，如遭受肌萎縮側(cè)胞壁增厚病人中的運動神經(jīng)元。
4.


圖1.A.使用標(biāo)記配位體結(jié)合方法表達(dá)克隆的示意圖。B.二次碘化抗體試驗表明了，與用原生cDNA庫轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的比較，許多COS細(xì)胞被用一輪淘盤分析(panning)后得到的DNA轉(zhuǎn)染(在轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞的60mm平皿上進行放射自顯影照相;每個黑斑表示表達(dá)CNTF結(jié)合位點的單個轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞)。C.如(B)所述的相同檢驗，但COS細(xì)胞是用非CNTFR編碼質(zhì)粒(負(fù)克隆)或CNTFR編碼質(zhì)粒(正克隆)轉(zhuǎn)染的。示出的僅是每個平皿的小部分。D.用(C)的負(fù)克隆或正克隆轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)分析的結(jié)果。
圖2.CNTFR編碼cDNA的核酸序列(SEQ ID NO1)和導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3.顯示類免疫球蛋白區(qū)域和類細(xì)胞活素受體區(qū)域的同源性的人體CNTFR的排列。左邊的數(shù)字表示由第一甲硫氨酸開始的氨基酸數(shù)目。等同的殘基和保留的替代物用方框標(biāo)記。插入間隙以達(dá)到最大同源。IL-6＝白細(xì)胞間素6;CEA＝癌胚抗原，PDGF＝血小板衍生的生長因子，CSF-1＝集落刺激因子1;α1-β GD＝α1β糖蛋白，PRL＝促乳素，EPO＝促紅細(xì)胞生成素;IL-2＝白細(xì)胞間素2;IL-4＝白細(xì)胞間素4，GM-CSF＝粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
圖4.CNTFR和其他相關(guān)受體之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系。人體IL-6受體和CNTFR具有一個融合在所提出的因子結(jié)合區(qū)域末端上的免疫球蛋白區(qū)域。一個短酸鏈(之字形線)連接球狀免疫球蛋白和所提出的因子結(jié)合區(qū)域。如本文中所討論的，所提出的類似于gp130的蛋白質(zhì)顯示出與CNTFR聯(lián)接。HuGRHR-人體激素受體;RbPRLR-免促乳素受體;MoEPOR-小鼠促紅細(xì)胞生成素受體;HuIL2Rβ-人體白細(xì)胞間素-2受體β-鏈;HuIL6R-人體白細(xì)胞間素6受體;HuCNTFR-人體睫狀衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體;C-半胱氨酸;X-未知氨基酸;W-色氨酸;S-絲氨酸;F-苯丙氨酸。
圖5.CNTFR訊息的組織定位。如8.1.節(jié)所述由大鼠的指定組織中制得RNA。如8.1.節(jié)所述由在pCMX中含有這些基團的表達(dá)構(gòu)成物中衍生的CNTFR的DNA片段。組織小腦(CD);后腦(HB);中腦(MB);丘腦(TH/HYP);紋狀體(STRI);海馬B(HIP B);海馬A(HIP A);皮層(CORT);嗅球(OLF);成年腦(ADBR);皮膚(SK);心臟(HRT);肌肉(MUS);肺(LUNG);腸(INT);腎(KID);肝(LIV);脾(SPL);胸腺(THY);E17肝(E17LIV)。
圖6.含有hCNTF-R基團插入物的pCMX。在共同待批申請中pCMX的構(gòu)成。
圖7.骨骼肌肉中CNTF受體表達(dá)的Northern印跡分析。在每一行中試驗10μg總RNA。行1，小鼠成肌細(xì)胞系C2C12mb;行2，小鼠管狀肌細(xì)胞系C2C12mt;行3，大鼠管狀肌細(xì)胞系C2C12mt;行4，大鼠管狀肌細(xì)胞系L6mt;行5，大鼠比目魚肌;行6，大鼠趾長伸(EDL)肌;行7，除神經(jīng)支配的骨骼肌;行8，提純的人體管狀肌;行9，骨骼肌(這一RNA試樣被降解);行10，成年大鼠小腦;行11，假手術(shù)比目魚肌;行12，72小時除神經(jīng)支配的大鼠比目魚肌;行13，假手術(shù)的EDL肌;行14，72小時除神經(jīng)支配的EDL肌。
圖8.經(jīng)受外科神經(jīng)切除術(shù)的右后肢的解剖圖。
圖9.UNOP＝來自動物組1(表Ⅳ)未手術(shù)的比目魚肌;實心條表示右側(cè)以及點畫條表示左側(cè);NONE＝來自動物組2的損傷的(除神經(jīng)支配的，右側(cè))和對照(假手術(shù)的)比目魚肌而沒有經(jīng)過任何注射液;ALB＝來自動物組6用PBS/BSA(SC)處理的損傷的(右側(cè))和對照(左側(cè))比目魚肌;CNTF＝來自動物組5用CNTF/BSA(SC)處理的損傷的(右側(cè))和對照(左側(cè))比目魚肌。實心條損傷的;點畫條對照。
5.發(fā)明的詳細(xì)描述為了清楚地描述本發(fā)明，但不是作為限定，本發(fā)明的詳細(xì)說明將分為如下幾部分(ⅰ)克隆CNTF受體;
(ⅱ)核酸編碼CNTF受體;
(ⅲ)CNTFR肽;
(ⅳ)CNTF受體的表達(dá);
(ⅴ)鑒別與CNTF受體相關(guān)的分子;以及(ⅵ)本發(fā)明的應(yīng)用。
5.1.克隆睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體本發(fā)明能夠通過提供一種選擇表達(dá)CNTFR的靶細(xì)胞的方法克隆CNTF受體(CNTFR)。通過提供一種富集CNTFR編碼序列的手段，本發(fā)明能夠提純CNTFR蛋白質(zhì)和直接克隆CNTFR編碼DNA。
例如，可以選擇含有CNTFR的靶細(xì)胞，以及CNTFR蛋白質(zhì)可以使用本專業(yè)領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的提純受體分子的方法提純。例如，但不是作為限定，如下述5、6.3節(jié)所述CNTF或附著在可檢測的分子上的CNTF(CNTF/標(biāo)記)，可以可逆地交聯(lián)在靶細(xì)胞上，其中標(biāo)記可以是放射性標(biāo)記、抗原定子、或抗體，這里僅舉幾例;并且可以將連接來自所述靶細(xì)胞蛋白質(zhì)的細(xì)胞膜進行提純。這些提純方法可以包括SDS-PAGE，緊接著檢測凝膠中CNTF或CNTF/標(biāo)記的位置;例如，可以使用放射性標(biāo)記的CNTF，并且交聯(lián)到其受體上，可以在凝膠中通過放射自顯影照相被觀察到。另一方面，可以在Western印跡技術(shù)中使用抗CNTF或抗標(biāo)記抗體以鑒定在這些凝膠中的CNTF/受體復(fù)合體的位置?？梢岳贸醪侥z電泳法分離足夠量的蛋白質(zhì)以實現(xiàn)受體的肽片段的氨基酸定序或使能夠制備可用以提純靶細(xì)胞提取物中CNTFR分子的抗CNTFR抗體。由提純的CNTFR得到的氨基酸序列可用于設(shè)計簡并低核苷酸探針，這些探針可被用于鑒定CNTFR編碼克隆基因組DNA庫或較佳的是克隆入一個由CNTFR產(chǎn)生的靶細(xì)胞構(gòu)成的cDNA庫的核酸。
另一方面，CNTFR可以通過扣除雜交方法被克隆，其中mRNA可以由表達(dá)CNTFR的靶細(xì)胞制備，并且然后可以通過使mRNA(或由其制得的cDNA)與由不能表達(dá)CNTFR的細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞衍生的mRNA或cDNA雜交扣除非CNTFR編碼序列?？鄢笫Ｓ嗟暮怂峥扇菀椎馗患贑NTFR編碼序列中。
較佳的是，由CNTFR的內(nèi)源表達(dá)和/或由如上所述討論的扣除技術(shù)，從富集在CNTFR編碼序列中的靶細(xì)胞制得的核酸也可以被用于表達(dá)克隆技術(shù)中以直接克隆CNTFR。例如，但不是作為限定，可以制備來自表達(dá)CNTFR的靶細(xì)胞的總基因組DNA并隨后將其轉(zhuǎn)染入不能表達(dá)CNTFR并較佳的是由靶細(xì)胞物種中不同物種所衍生的細(xì)胞系中(例如，來自人體CNTFR編碼細(xì)胞的DNA可以被轉(zhuǎn)染入小鼠細(xì)胞，如一種L細(xì)胞中)。盡管較少數(shù)量的轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以表達(dá)CNTFR，但這些細(xì)胞可通過如下文5、6.3.節(jié)所述的叢生(rosetting)技術(shù)或免疫熒光技術(shù)被鑒定并可以通過例如本專業(yè)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員公知的熒光激活細(xì)胞分類術(shù)或利用抗體偶聯(lián)磁珠或淘盤分析(panning)技術(shù)分離?？梢酝ㄟ^由轉(zhuǎn)染子制備基因組庫，然后分離并繁殖這些既含有與CNTFR氨基酸序列一致的序列，又含有與物種特定基因元素同源序列的克隆，從而由受體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)染子中克隆CNTFR編碼DNA;例如，可以通過在整個人體基因組中以高頻率分布的Alu重復(fù)序列鑒定人體DNA。例如，但不是作為限定，可以選擇繁殖含有編碼CNTFR并表達(dá)人體CNTFR的轉(zhuǎn)染的人體DNA的培養(yǎng)的非人體細(xì)胞，然后可以利用由這些細(xì)胞制得的基因組DNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的非人體細(xì)胞，并可以選擇CNTFR表達(dá)細(xì)胞。這一工藝可以重復(fù);其目的是用每一轉(zhuǎn)染步驟以減少在CNTFR編碼細(xì)胞中存在的人體DNA的量。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)染的表達(dá)細(xì)胞的人體CNTFR的基因組DNA被克隆以產(chǎn)生信息庫時，在已進行重復(fù)轉(zhuǎn)染時包括人體DNA(已被鑒定，例如通過對明顯的人體序列元素篩選)的克隆更可能含有CNTFR編碼序列。
來自CNTFR表達(dá)細(xì)胞素或組織源的RNA或由這一來源得到的cDNA表達(dá)庫可以通過直接注射以集合物形式被引入爪蟾屬(Xenopus)卵母細(xì)胞中;用編碼CNTFR的集合物注射的卵母細(xì)胞可通過對機能響應(yīng)的檢測(例如離子流)被鑒定，機能響應(yīng)可通過將這些卵母細(xì)胞暴露在CNTF中，或者另一種方法是通過檢測在這些注入的卵母細(xì)胞表面上存在的CNTF結(jié)合位點而被誘導(dǎo)。重復(fù)地將確定的集合物分成越來越小的集合物可導(dǎo)致鑒定編碼CNTFR的個體克隆。
另一方面，cDNA表達(dá)庫可以由載有靶細(xì)胞的CNTFR衍生并隨后被用于瞬時表達(dá)檢測中。在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，所述的表達(dá)庫可以結(jié)合SV40復(fù)制源并使用COS細(xì)胞進行瞬時表達(dá)檢測?？梢匀缟纤鰴z定CNTFR表達(dá)轉(zhuǎn)染子，并可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法恢復(fù)CNTFR編碼DNA。然后可以使用如對核酸編碼CNTF所述的方法繁殖編碼CNTFR的核酸序列和/或?qū)⑵溆糜诒磉_(dá)系統(tǒng)中，如Sendtner等人在申請?zhí)枮?7/570 651，名稱為“Ciliary Neurotrophic Factor”，申請日為1990年8月20日的美國專利申請中所描述的。
在下文6.節(jié)(見圖1)舉例說明的本發(fā)明的一個特定實施方案中，可以如下述進行CNTFR的表達(dá)克隆?？梢杂杀磉_(dá)CNTFR如SH-SY5Y的細(xì)胞系或組織制備cDNA庫，以使cDNA被插入表達(dá)載體中。然后可使用例如DEAE/氯喹轉(zhuǎn)染操作技術(shù)將這一庫轉(zhuǎn)染入合適的細(xì)胞系中，比如COS M5細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后幾天，可以將這些細(xì)胞從其培養(yǎng)皿中分離并使其進行Aruffo/Seed淘盤分析(panning)步驟(Seed and Aruffo，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84∶365-3369)，同時有如下的改變(ⅰ)可以首先用標(biāo)記的CNTF(例如CNTF真菌(myc))在將這些細(xì)胞在冰上培養(yǎng)約30分鐘，通過磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)/2%Ficoll離心分離以除去過量配位體，然后用抗標(biāo)記抗體(例如抗真菌抗體9E10)在冰上培養(yǎng)約30分鐘，而不是用抗受體抗體培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
(ⅱ)然后可以將這些細(xì)胞通過PBS/2%Ficoll離心分離并隨后在涂有能識別抗標(biāo)記抗體的抗體(例如，如果抗標(biāo)記抗體是9E10，則為抗小鼠抗體)的平板上“淘盤分析(panned)”。
然后，在從平板上洗去未粘附細(xì)胞后，可以由粘附細(xì)胞制得Hirt上清液，并可以在有約10-20μg tRNA存在下沉淀質(zhì)粒DNA。然后可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括但不限于，電穿孔將得到的質(zhì)粒DNA引入合適的細(xì)菌(例如DH10 B細(xì)菌)中。然后由轉(zhuǎn)化的細(xì)菌生長的培養(yǎng)物可用于制備另一輪真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和淘盤洗選的質(zhì)粒DNA。在第二次轉(zhuǎn)染、淘盤洗選和質(zhì)粒DNA制備及轉(zhuǎn)化后，可以在選擇性培養(yǎng)基上平皿培養(yǎng)出細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，可收集個體菌落并用于制備質(zhì)粒DNA，由一系列這些克隆制得的DNA可分別用于COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染。另一方面，在測試個體菌落之前可能需要更多輪次的富集?？赏ㄟ^一系列技術(shù)，包括但不限于，使用放射性活化標(biāo)記或熒光標(biāo)記指示劑抗體的直接粘合試驗可以鑒定生成的表達(dá)CNTF結(jié)合位點的COS細(xì)胞。一個CNTFR編碼核酸的例子被包括在圖6的pCMX-hCNTFR(Ⅰ2)中，它被保藏在NRRL，保藏號為B-18789，并由Davis和Yan-copoulos公開在申請?zhí)枮椋Q為“Mammalin Expres-sion Vector”的美國專利申請中。然后可通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的限制性片段繪圖和核酸定序分析用這一方法鑒別的克隆。然后可以利用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)使用CNTFR編碼cDNA片段以鑒定含有例如來自基因組DNA庫的CNTFR基因的基因組DNA序列。
一旦得到后，可以利用現(xiàn)有技術(shù)中任何已知的方法克隆或亞克隆CNTFR基因?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的大量載體-宿主系統(tǒng)。可能的載體包括，但不限于，粘粒、質(zhì)?；蜃儺惖牟《?，但該載體系統(tǒng)必須與使用的宿主細(xì)胞是可親和的。這些載體包括，但不限于，噬菌體比如λ衍生物，或質(zhì)粒如pBR322、pUC、或Blue script (Stratagene)質(zhì)粒衍生物，可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔等將重組體分子引入宿主細(xì)胞。
可以將CNTFR基因插入能用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染合適的宿主細(xì)胞的克隆載體內(nèi)，以使產(chǎn)生許多拷貝基因序列。這可以通過將DNA片段連接在具有補充粘性末端的克隆載體中而實現(xiàn)。然而，如果在克隆載體中不存在用于把DNA分為片段的補充的限制性位點，則DNA分子的末端可以在酶活性上被修飾。它證明了將限制性核酸內(nèi)切酶分裂位點結(jié)合到用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的低核苷酸引物上以促進插入到載體中這一優(yōu)點。另一方面，可通過將核苷酸序列(銜接物)連接到DNA末端上制得所需的任何位點;這些連接銜接物可以包含特定的化學(xué)合成的低核苷酸編碼的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列。在一可選擇的方法中，可以通過均聚譜尾而修飾分裂的載體和CNTFR基因。
在特定的實施方案中，含有結(jié)合一種分離的CNTFR基因、cDNA、或合成的DNA序列的重組體DNA分子的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生多個拷貝基因。因而，通過生長轉(zhuǎn)化體，從轉(zhuǎn)化體中分離重組體DNA分子，以及必要時從分離的重組體DNA中收回插入的基因，可以大量得到該基因。
5.2.核酸編碼睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體利用上文詳述的以及下文6.節(jié)的實施例中的方法，測定了以下核酸序列，并推導(dǎo)了相應(yīng)的氨基酸序列。圖2中描繪了人體CNTFR的序列(SEQ ID NO1)。按照本發(fā)明可以使用這一序列，其機能等價物，或長度至少為6個核苷酸的這一序列的片段。此外，本發(fā)明涉及由豬、羊、貓科動物、鳥類、馬、或犬以及靈長類來源和任何存在CNTF活性的物種中分離出的CNTFR基因。含有CNTFR序列的可雜交部分的亞序列可以用于例如在核酸雜交檢測、Southern和Northern印跡分析等中。
例如，圖2(SEQ ID NO1)中描繪的核酸序列可以通過提供編碼機能上等價分子序列的突變，如取代、附加或缺失而改變。按照本發(fā)明，一種分子如果具有結(jié)合CNTF的能力，則該分子與具有圖2(SEQ ID NO1)所描繪序列的分子比較是機能上等價或活性的，但它不必結(jié)合具有與天然CNTFR相似的親合力的CNTF。由于核苷酸編碼序列的退化，在本發(fā)明的實踐中可以使用編碼基本上如圖2(SEQ ID NO2)中所描繪的相同氨基酸序列的其他DNA序列。這些序列包括，但不限于含有全部或部分圖2(SEQ ID NO2)中所描繪的CNTFR基因的核苷酸序列，該基因是通過取代在序列范圍內(nèi)編碼機能上等價的氨基酸殘基的不同密碼子而被改變的，因而產(chǎn)生不活動變化。
此外，可以巧妙地設(shè)計本發(fā)明的重組體CNTFR編碼核酸序列，以使修飾CNTFR的加工和表達(dá)。例如，但不是作為限定，CNTFR基因可與啟動子序列和/或核蛋白體結(jié)合位點結(jié)合，或者可以在CNTFR編碼序列上游插入信號序列以使分泌CNTFR并由此促進收獲或生物利用率。
此外，給定的CNTFR可在體外或體內(nèi)突變以建立和/或破壞轉(zhuǎn)譯、起動、和/或終止序列，或者在編碼范圍內(nèi)建立變異體和/或形成新的限制性核酸內(nèi)切酶位點或破壞預(yù)先存在的位點，以促進體外進一步修飾?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于，體外定位點誘變(Hutchinson et al.，1978，J.Biol.Chem.253∶6551)，使用TAB 銜接物(Pharmacia)等。
5.3.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體肽本發(fā)明還提供具有上述圖2(SEQ ID NO2)中的氨基酸序列的CNTFR蛋白質(zhì)、片段及其衍生物或其機能等價物以及提供與這種蛋白質(zhì)同源的蛋白質(zhì)(這種同源性至少為約30%)。本發(fā)明還提供包含至少6個氨基酸、包含一種抗原定子、或功能上是活性的CNTFR蛋白質(zhì)的片段或衍生物。具有圖2(SEQ ID NO2)所描繪的氨基酸序列的CNTFR蛋白質(zhì)分子量約為42kd。
本發(fā)明的CNTFR蛋白質(zhì)、或片段或其衍生物包括，但不限于，作為原始氨基酸序列含有全部或部分基本上如圖2所描繪的氨基酸序列的物質(zhì)，包括其中用機能上等價的氨基酸殘基取代序列內(nèi)的殘基導(dǎo)致不活動變化的變更序列。例如，序列范圍內(nèi)的一種或多種氨基酸殘基被作為機能等價物的另一種類似極性的氨基酸所取代，導(dǎo)致不活動變更?？梢杂善渌被崴鶎兕惖某蓡T中選擇序列范圍內(nèi)的氨基酸的取代物。例如，非極性(疏水)的氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬胺酸和谷氨酸胺。正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括例如通過磷酸化、糖基化、交聯(lián)、?；?、蛋白水解分裂、鍵合在一種抗體分子、膜分子或其他配位體上，在轉(zhuǎn)譯期間或之后分別地修飾的CNTFR蛋白質(zhì)或片段或其衍生物(Ferguson et al.，1988，Ann.Rev.Biochem.57∶285-320)。
本發(fā)明的CNTFR肽可以通過重組體核酸表達(dá)技術(shù)或通過利用標(biāo)準(zhǔn)肽的合成技術(shù)化學(xué)合成而制得。
5.4.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體的表達(dá)為了表達(dá)重組體CNTFR，對CNTFR蛋白質(zhì)編碼的核苷酸序列，或其一部分可以被插入合適的表達(dá)載體中，即一種含有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯該插入蛋白質(zhì)編碼序列的必要元素的載體。必要的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯信號也可由天然CNTFR基因和/或其側(cè)面區(qū)域提供。可以使用多種宿主-載體系統(tǒng)以表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。這些系統(tǒng)包括，但不限于，感染病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒)的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng);感染病毒(例如桿狀病毒)的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng);微生物、如含有酵母載體的酵母、或用噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。這些載體的表達(dá)元素在其強度及特異性方面不同。根據(jù)所用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用任-系列合適的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯元件。
在本發(fā)明的一個較佳具體實施方案中，CNTFR基因可以包含在保藏在NRRL中、指定的保藏號為No.B-18790的pCMX表達(dá)載體中。
可以使用為將DNA片段插入載體中的上述任何方法以構(gòu)成含有由轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制信號和蛋白質(zhì)編碼序列組成的嵌合基因的表達(dá)載體。這些方法可包括體外重組體DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組(基因重組)。編碼CNTFR蛋白質(zhì)或肽片段的核酸序列的表達(dá)可以由第二種核酸序列調(diào)節(jié)以使CNTFR蛋白質(zhì)或肽在用重組體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中被表達(dá)。例如，可以由現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何啟動子/強化因子控制CNTFR的表達(dá)?？梢杂糜诳刂艭NTFR表達(dá)的啟動子包括，但不限于，SV40早期啟動子區(qū)域(Bernoist and Cham-bon，1981，Nature 290∶304-310)、CMV啟動子、在勞氏肉瘤病毒的3′末端復(fù)制中所含的啟動子(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78∶144-1445)，金屬硫堇基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster et al.，1982，Nature 296∶39-42);原核表達(dá)載體，如β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75∶3727-3731)，或tac啟動子(DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶21-25)，還可參見“Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American，1980，242∶74-94;來自酵母或其他真菌的啟動子，如Ga14啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油酸激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子、以及以下呈現(xiàn)組織特異并用于轉(zhuǎn)基因動物的動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺泡細(xì)胞中活性的彈性蛋白酶Ⅰ基因控制區(qū)(Swift et al.，1984，Cell 38639-646;Ornitz et al.，1986 Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50∶399-409;MacDonald，1987，Hepa-tology 7∶425-515);在胰β細(xì)胞中活性的胰島素基因控制區(qū)(Hana-han，1985，Nature 315∶115-122)，在淋巴樣細(xì)胞中活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl et al.，1984，Cell 38∶647-658;Adames et al.，1985，Nature 318∶533-538;Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶1436-1444)，在睪丸、胸、淋巴樣和肥大細(xì)胞中活性的小鼠乳汁病毒控制區(qū)(Leder et al.，1986，Cell 45∶485-495)，在肝臟中活性的清蛋白基因控制區(qū)(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1∶268-276)，在肝臟中活性的α-胎兒球蛋白基因控制區(qū)(Krumlanf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.5∶1639-1648;Hammer et al.，1987，Science 235∶53-58);在肝臟中活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1∶161-171)，在髓樣體細(xì)胞中活性的β-珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram et al.，1985，Nature 315∶338-340;Kollias et al.，1986 Cell 46∶89-94)，在腦的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead et al.，1987，Cell 48∶703-712);在骨骼肌中活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature 314∶283-286)，以及在下丘腦中活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason et al.，1986，Science 234∶1372-1378)。
含有CNTFR基因插入體的表達(dá)載體可用三個普通方法鑒定
(a)DNA-DNA雜交，(b)“標(biāo)記”基因官能的存在或缺失，以及(c)插入序列的表達(dá)。首先，插入到表達(dá)載體中的異源基因的存在可通過使用含有與插入的CNTFR基同源序列的探針進行DNA-DNA雜交來探測。第二步，重組載體/宿主體系可依據(jù)由于把異源基因插入到載體中而引起的某些“標(biāo)記”基因官能(例如胸苷激酶活性抗生素抗性、轉(zhuǎn)型表型、在桿狀病毒中閉合體(occlusion body)的形成等)的存在或缺失進行鑒定和選擇。例如，如果把CNTFR基因插入到載體的標(biāo)記基因序列內(nèi)部，含有CNTFR插入體的重組體可用標(biāo)記基因官能的缺失來鑒定。第三步，重組體表達(dá)載體可通過分析由重組體表達(dá)的異源基因產(chǎn)物進行鑒定。這種分析可以例如通過使受體連接到CNTF上或者直接識別CNTFR的抗體上而依據(jù)于例如CNTFR基因產(chǎn)物的物理或官能性質(zhì)。
在另一實施方案中，不能正常表達(dá)CNTFR的細(xì)胞可以用重組CNTFR編碼的核酸轉(zhuǎn)染然后通過把轉(zhuǎn)染子暴露在CNTFR下并且隨后測定cAMP水平的增加來測定官能CNTFR的表達(dá)。
一旦一個特定的重組DNA分子被鑒定和分離，就可使用本領(lǐng)域已知的幾種方法使之繁殖。一旦建立起一個適當(dāng)?shù)乃拗黧w系和生長條件，重組表達(dá)載體就可以大量地繁殖和制備。如前所述，可以使用的表達(dá)載體包括下列載體或其衍生物人或動物病毒，比如牛痘病毒或腺病毒;昆蟲病毒，比如桿狀病毒;酵母載體;噬菌體載體(例如λ)，以及質(zhì)粒和粘粒DNA載體，這里僅舉幾例，并不限于這些。
此外，可以選擇一種宿主細(xì)胞株以便調(diào)整插入序列的表達(dá)或以希望的具體方式修飾并加工基因產(chǎn)物。從某些特定啟動子的表達(dá)可以在某些誘導(dǎo)物的存在下得以提高;從而遺傳基因化的CNTFR蛋白質(zhì)的表達(dá)可以被控制。而且，不同宿主細(xì)胞有其特定和具體的機理進行蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)譯后的加工和修飾(例如糖基化、分裂)。τ以選擇合適的細(xì)胞系或宿主體系以保證對被表達(dá)的異種蛋白質(zhì)進行所希望的修飾和加工。例如，可以使用在細(xì)菌體系中的表達(dá)以生產(chǎn)未糖基化的核心蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在酵母中的表達(dá)可用于生產(chǎn)糖基化的產(chǎn)物。在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)可用于保證異種CNTFR蛋白質(zhì)的“天然”糖基化。而且，不同的載體/宿主表達(dá)體系可以使加工反應(yīng)比如蛋白水解分裂進行到不同的程度。
一旦一種表達(dá)CNTFR基因的重組體被鑒定，就應(yīng)進行基因產(chǎn)物的分析。這可通過基于產(chǎn)物的物理或官能性質(zhì)的分析來實現(xiàn)。
一旦CNTFR蛋白質(zhì)被鑒定，就可利用下述標(biāo)準(zhǔn)方法將之分離和純化，這些標(biāo)準(zhǔn)方法包括色譜法(例如離子交換、親和性、以及分級柱色譜法)、離心法、差示溶解度法或任何其他純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法。特別是，CNTFR蛋白質(zhì)可以通過連接到一含有連接到一個固定支撐上的CNTF的親和柱而進行分離。
還制備了與DNA或RNA序列編碼的CNTFR或其官能活性部分互補的核酸序列。一種特定情況是，可以合成反意低核苷酸，它與至少一部分CNTFR mRNA是互補的。
5.5.與睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體有關(guān)的分子的鑒定已經(jīng)定義了多個受體因子體系，其中同一因子能夠連接到多個受體上(如上文所述)。對CNTF情況也是如此，本發(fā)明可以通過與用于獲得這里描述的CNTFR相同的步驟來鑒定任何其它的CNTFR受體，但用于制備cDNA表達(dá)庫的RNA源除外?？梢赃x擇能夠容易地表達(dá)不同CNTF受體的源;可以在對CNTFR沒有作用的CNTF連接存在下對源進行評估(從CNTFR序列產(chǎn)生的基因探針和抗體試劑可用于把在細(xì)胞系或組織源中造成CNTF連接的蛋白質(zhì)與在此描述的CNTF進行比較)。此外，因為已知受體連接到多于一個的相關(guān)因子上(如上文所述)，CNTFR的鑒定也應(yīng)能夠鑒定任何其它連接到該受體上的天然配位體。
本發(fā)明的另一方面是，CNTFR序列可用于鑒定與CNTFR相關(guān)的分子。CNTFR含有與多種其它受體所共有的主題。CNTFR的細(xì)胞外部分既在其N末端含有一個“免疫球蛋白”域又含有一個“細(xì)胞活素受體”區(qū)域，二者由一短的絞合區(qū)分開。盡管許多受體同源于“免疫球蛋白”或“細(xì)胞活素受體”，但是僅僅有一種受體-IL-6受體-與CNTFR具有相同的這些域的特定排列。因此IL-6受體是與CNTFR最相關(guān)的蛋白質(zhì)。令人感興趣的是，IL-6受體有一個非常短的胞質(zhì)內(nèi)域，這與CNTFR也是類似的，這種胞質(zhì)內(nèi)域明顯地對起動IL-6連接響應(yīng)是不必要的(Hibi et al.，1990，Cell 63∶1149-1157)。最近，IL-6受體的一種新型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體，稱為gp130，被分子克隆。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)體本身并不連接IL-6，但是它確實為IL-6受體賦予高親和力連接，并且需要它來轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-6信號(Hibi et al.，1990，Cell 63∶1149-1157)。CNTFR的克隆表明它與IL-6受體具有共同的重要特征，這些特征在其它已知受體中沒有發(fā)現(xiàn)，從而定義了受體的一個新家系。如本發(fā)明所定義的，該受體家系中前兩個成員的同源性可經(jīng)如下方法用于鑒定其它相關(guān)受體，即利用DNA或者相應(yīng)于同源區(qū)的抗體探針，或者同時使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和相應(yīng)于氨基酸同源性的共有區(qū)的簡并低核苷酸(例如 Maisonpierre et al.，1990，Science 247∶1146-1451)。本發(fā)明也可用于測試CNTFR是否使用與IL-6受體相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體，或者它是否使用相關(guān)的分子。最后，CNTFR相關(guān)的受體的鑒定有助于與這些受體連接的新型配位體的鑒定。
按照本發(fā)明，通過用相應(yīng)于如圖2(SEQ ID No1)所示的或者從蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)或者從核酸序列衍生出的CNTFR序列的低核苷酸篩選DNA庫(包括基因組DNA或者更好地是cDNA)，以便為上述家系的新成員編碼的克隆可以被鑒定。通過降低雜交的嚴(yán)格性，可以使對該家系中略有差別的成員的鑒定機會增加。也希望使用基本上與已定序的該家系中成員所共有的序列;這些高度保存區(qū)在鑒定該家系中其它成員時是特別有用的。庫的篩選可以通過使用例如Benton和Davis(1977，Science 196∶180)或者Grunstein和Hogness(1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72∶3961-3965)的雜交技術(shù)來進行。然后對用雜交鑒定的克隆可進一步分析，并且新成員可以按照本領(lǐng)域熟知的方法通過限制性片段繪圖(mapping)和定序技術(shù)進行鑒定。
希望使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)(Saiki et al.，1985，Science 230∶1350-1354)來鑒定CNTFR總家系中的其它成員。例如，相應(yīng)于已知CNTFR序列的有意和反意引物可用在PCR中，較佳地是使用cDNA作為模板。希望制備這些引物以便使之包括限制性酶分裂位點，這些分裂位點可促進把PCR的產(chǎn)物插入到適當(dāng)?shù)妮d體中然后對新成員可以選擇所得到的克隆。這種選擇可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來實現(xiàn)，包括用相應(yīng)于已知序列的探針的雜交分析。例如，如上所述，可以使表示一種特征化的CNTFR蛋白質(zhì)的不同區(qū)的一系列探針在低嚴(yán)格性下被雜交到載有來自由PCR產(chǎn)生的克隆的雙層過濾器上。觀察到，各種克隆可以雜交某些探針但不能雜交其他探針。家系中新成員也可以通過增加雜交條件的嚴(yán)格性而被鑒定，其中與從已知成員中衍生出的探針不同的新成員在高嚴(yán)格性下會雜交得不太強烈。另外，家系中新成員可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過限制性繪圖或者定序分析以揭示限制性圖或者序列相對于已知成員的差別來鑒定。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了與CNTFR形成配合物從而參與CNTFR官能的分子。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過序列分析，CNTFR并不顯示出具有胞質(zhì)區(qū)域;事實上，它可以通過GPI鍵糖基磷脂酰肌醇結(jié)合到一薄膜上(在Ferguson et al.，1988，Ann.Rev.Biochem.57∶285-320中進行了描述)。這表明至少一種其它分子與CNTFR形成了群叢而通過細(xì)胞膜參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這樣一種分子可以是例如伴隨IL-6R一起發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，比如GP130(Taga et al.，1989，Cell 58∶573-581);從CNTFR和IL-6受體之間的同源性來看這種情況是特別可能的。與CNTFR在細(xì)胞膜上形成群叢的分子可用任何本領(lǐng)域已知的方法進行分離和鑒定，包括化學(xué)交聯(lián)、與抗CNTFR抗體共沉淀、或者使用CNTF/標(biāo)記、和/或使用蛋白質(zhì)或類脂提純技術(shù)，但并不限于這些方法。
此外，本發(fā)明提供了除CNTF之外的可與CNTFR連接的分子。這些分子定義為與CNTF競爭CNTFR連接的分子，包括其它常規(guī)配位體，這些分子包括肽、肽衍生物和非肽(例如類肽)化合物5.6.本發(fā)明的用途5.6.1.測定系統(tǒng)本發(fā)明提供了測定系統(tǒng)，在其中可通過測量在響應(yīng)于CNTF的表達(dá)本發(fā)明CNTF分子的細(xì)胞或細(xì)胞系中對CNTF的生理響應(yīng)來檢測由于暴露于肽或非肽化合物中而產(chǎn)生的CNTF活性或類似于CNTF活性的活性。生理響應(yīng)包括CNTF的任何生理效應(yīng)，包括上面2.2節(jié)所述的、及某些核酸序列的轉(zhuǎn)錄活化(例如啟動子/增強子以及結(jié)構(gòu)基因)、與CNTF相關(guān)的加工、轉(zhuǎn)譯、或者磷?；?、響應(yīng)于直接地或間接地由CNTF誘導(dǎo)的過程的次級過程的誘導(dǎo)、以及形態(tài)變異、比如軸突芽殖、或者維持細(xì)胞比如睫狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、運動神經(jīng)元、蒲肯野氏細(xì)胞、或者海馬神經(jīng)元生存的能力，這里僅舉幾例，不限于此。
本發(fā)明的一個較佳的具體實施方案中，CNTF和CNTFR之間的官能反應(yīng)可以通過檢測在響應(yīng)許多生長因子刺激的橫跨膜的信號(包括但不限于c-fos和c-jun)時活化的“即刻早期”初次響應(yīng)基因的生產(chǎn)量的增加來觀察到。例如，即刻早期基因的活化可通過即刻早期基因mRNA水平的Northern印跡分析進行檢測。本發(fā)明的一個較佳實施方案中，c-fos或c-jun mRNA水平可通過由用CNTF培育的靶細(xì)胞制備的mRNA的Northern印跡分析來確定，其中CNTF活性用c-fos或c-jun水平的增加來證實。值得注意的是，在本發(fā)明的某一特定實施方案中，一旦生產(chǎn)出含有重組CNTFR編碼核酸的靶細(xì)胞或通過與CNTF連接而進行選擇，就希望保證靶細(xì)胞特征性地響應(yīng)于CNTF或者具有類CNTF活性的化合物。在本發(fā)明的描述中，術(shù)語類CNTF活性是指與CNTF的活性類似但是可以相同也可以不同的生物活性;這些活性包括但不限于上述2.2節(jié)中描述的，或者具體的即刻早期啟動子比如fos或jun啟動子的活化。
本發(fā)明提供了新型的用于篩選CNTF活性或類CNTF活性的化合物的測定系統(tǒng)。連接到CNTF上的靶細(xì)胞可通過與CNTFR編碼的核酸轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)并可通過例如熒光激活細(xì)胞分類術(shù)、蓮座細(xì)胞的沉淀、或者限制性稀釋進行鑒定和分離，如下文5.6.3節(jié)所述。
一旦靶細(xì)胞系被生產(chǎn)和鑒定，就希望選擇對CNTF異常敏感的細(xì)胞。這些靶細(xì)胞可帶有大量的CNTFR;帶有大量CNTFR的靶細(xì)胞可通過選擇連接到高水平CNTF上的靶細(xì)胞進行鑒定，例如當(dāng)細(xì)胞與CNTF/標(biāo)記一起培養(yǎng)并進行免疫熒光分析時就產(chǎn)生數(shù)量相當(dāng)大的熒光。此外，對CNTF異常敏感的細(xì)胞在響應(yīng)CNTF連接時會顯示出相當(dāng)強的生物響應(yīng)，比如即刻早期基因產(chǎn)物如c-fos或c-jun的突然增加。通過改進使用對CNTF相當(dāng)敏感的靶細(xì)胞的測定系統(tǒng)，本發(fā)明提供了篩選CNTF活性或類CNTF活性的方法，該方法能夠檢測低水平的CNTF活性。
特別是，使用重組DNA技術(shù)，本發(fā)明提供了設(shè)計成對CNTF高度敏感的CNTF靶細(xì)胞。例如，按照5.1節(jié)描述的方法克隆的CNTF-受體基因可以插入到具有天然CNTF響應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果重組CNTFR基因以高水平被表達(dá)并且所得到的設(shè)計的靶細(xì)胞在其細(xì)胞表面上表達(dá)了大量的CNTFR。
換句話說，或者作為另一種情況，靶細(xì)胞可被設(shè)計成含有在響應(yīng)CNTF/受體連接時被高水平表達(dá)的重組基因。這種重組基因較佳地是伴隨有容易檢測的產(chǎn)物。例如，但并限于此，來自即刻早期基因的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)(即啟動子/增強子區(qū))可用于在一個可引入到靶細(xì)胞內(nèi)的構(gòu)建中控制報道基因的表達(dá)。即刻早期基因/報道基因構(gòu)建當(dāng)通過強啟動子/增強子或高拷貝數(shù)目在靶細(xì)胞中以高水平表達(dá)時，就可用于產(chǎn)生一種放大的響應(yīng)于CNTFR連接。例如，但并不限于此，具有CNTF響應(yīng)的啟動子(比如c-fos或c-jun啟動子)可用于控制可檢測的報道基因的表達(dá)，報道基因包括β-半乳糖苷酶、生長激素、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)酶乙酰、熒光素酶、或者β-葡糖苷酸酶。這些報道基因產(chǎn)物的檢測對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是熟知的，這種檢測可作為醫(yī)藥化合物的CNTF活性或類CNTF活性的敏感指示劑。
上述的CNTFR編碼或報道基因構(gòu)建可以用本領(lǐng)域已知的任何方法插入到靶細(xì)胞中。這些方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、磷酸鈣/DEAE葡聚糖方法、和細(xì)胞噴槍、以及帶有上述構(gòu)建作為轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)，并且從其中可以使用上述的方法選擇CNTF靶細(xì)胞。
本發(fā)明的測定系統(tǒng)使得可有效地篩選用于治療與CNTF相關(guān)疾病的醫(yī)藥化合物。例如，但不是作為限定，希望篩選CNTF活性的以及對小腦退化有治療效果的醫(yī)藥試劑。本發(fā)明的一個具體實施方案中，響應(yīng)CNTF的蒲肯野氏細(xì)胞可被鑒定和分離，然后在多井培養(yǎng)平皿的微＃中培養(yǎng)。加入了試驗試劑或加入了CNTF的培養(yǎng)基可以無限稀度與適當(dāng)?shù)膶φ瘴镆黄鸺尤氲骄小Ｈ缓髾z測到細(xì)胞的生存、軸突芽殖等得到提高，并可確定試驗試劑和CNTF的活性以及它們的相對活性。另一個例子是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)運動神經(jīng)元病灶對CNTF為良性響應(yīng)(Sendtner et al.，1990，Nature 345∶440)。因此希望鑒定能夠在軸向切除術(shù)(axotomy)之后如同CNTF一樣防止運動神經(jīng)元死亡的類CNTF化合物。具有CNTF響應(yīng)的運動神經(jīng)元可用在測定系統(tǒng)中以鑒定可用于治療運動神經(jīng)元疾病的化合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CNTF可有效地在軸向切除術(shù)之后防止運動神經(jīng)元細(xì)胞死亡，當(dāng)企圖治療脊髓損傷、肌萎縮側(cè)生胞壁增厚以及糖尿病神經(jīng)病時，在設(shè)計能有效地治療這些失調(diào)的藥品時，包括通過血液大腦障礙層所需要的藥品，上述發(fā)現(xiàn)很明顯地是特別重要的發(fā)現(xiàn)。鑒于上述發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵是找到一種如本發(fā)明提供的方法的可靠且敏感的篩選系統(tǒng)，又一個例子是，如果發(fā)現(xiàn)一種具體疾病與一具體組織中的有毛病CNTF響應(yīng)有關(guān)，那么對疾病的合理治療是為患者提供外生的CNTF。然而，希望研究出半衰期比內(nèi)生的CNTF長，或者作為CNTF興奮劑，或者以一具體組織作為目標(biāo)的分子。因此，本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)能夠用于鑒定具有所希望的性質(zhì)的分子的有效并敏感的篩選系統(tǒng)。相似的測定系統(tǒng)可用于鑒定CNTF拮抗物5.6.2.實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)本發(fā)明還提供了用于研究CNTF的生理作用的實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)。在這些模型系統(tǒng)中，CNTFR蛋白質(zhì)、肽片段或其衍生物可以或者加入到該體系中或者在該體系中制備。這些模型系統(tǒng)可用于研究CNTF過量或CNTF缺失的影響。這些實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)可用于研究在細(xì)胞或組織培養(yǎng)基內(nèi)、在整個動物體內(nèi)、特別是在整個動物的細(xì)胞或組織內(nèi)或者是組織培養(yǎng)體系內(nèi)、或者是在CNTFR表達(dá)被可誘發(fā)或改進的調(diào)節(jié)啟動子控制的實施方案中的一個具體時間間隔(包括胚胎發(fā)生過程)下對CNTF增強的或降低的響應(yīng)的影響。本發(fā)明的具體實施方案中，CMV啟動子可用于控制在轉(zhuǎn)基因動物內(nèi)CNTFR的表達(dá)。本文中術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”是指非人轉(zhuǎn)基因動物，包括轉(zhuǎn)基因嵌合體，非人轉(zhuǎn)基因動物在其某些或全部細(xì)胞中帶有轉(zhuǎn)基因，它包括任何非人物種，并可用本領(lǐng)域中已知的任何方法生產(chǎn)，所說方法包括但不限于顯微注射、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染、電穿孔、等。例如，動物可以用接合子顯微注射方法生產(chǎn)，比如在“Brinster et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82∶4438-4442”中描述的。
本發(fā)明也對自身免疫疾病提供了在其中自身免疫直接響應(yīng)于CNTFR的模型系統(tǒng)。這些模型包括用致免疫量的CNTFR免疫了的并且較佳地能生產(chǎn)抗CNTFR抗體和/或細(xì)胞傳遞免疫性的動物。為了生產(chǎn)這樣一種模型系統(tǒng)，就希望將CNTFR與免疫佐藥比如卡介苗(BCG)一起給藥。
5.6.2.1.增強的CNTF活性的模型例如，但不限于，可以制備用于研究過量CNTF活性的作用的實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)。在這樣的系統(tǒng)中，通過在模型系統(tǒng)的細(xì)胞上設(shè)計增加數(shù)量的CNTFR可使其對CNTF的響應(yīng)比沒有如此設(shè)計的細(xì)胞增加。較佳的是選擇性地在可正常表達(dá)CNTFR的細(xì)胞上增加CNTFR的數(shù)量。
細(xì)胞可通過用帶有本發(fā)明的CNTFR基因的病毒感染而設(shè)計以使其CNTF的數(shù)量增加。此外，CNTFR基因可經(jīng)轉(zhuǎn)染而提供給細(xì)胞。
如果模型系統(tǒng)是動物，那么重組CNTFR基因可通過用帶有CNTFR基因的病毒感染而引入到動物的細(xì)胞中。此外，可以得到有CNTFR基因作為轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物。
為了保證CNTFR的表達(dá)，CNTFR基因應(yīng)當(dāng)置于適當(dāng)?shù)膯幼有蛄械目刂浦隆ＯＭ袰NTFR基因置于組成型和/或組織特異性啟動子的控制之下，啟動子包括但不限于CNS神經(jīng)元特異性烯醇酶、神經(jīng)絲、和酪氨酸羥化酶啟動子、一種可誘導(dǎo)啟動子比如金屬巰基組氨酸三甲內(nèi)鹽啟動子、人免疫缺乏病毒長末端重復(fù)的UV活化的啟動子(Valeri et al.，1988，Nature 333∶78-81)、或者CMV啟動子(如下文中pCMX中所含有的)或者改進調(diào)節(jié)啟動子。
通過增加細(xì)胞的CNTFR的數(shù)目，對內(nèi)生CNTF的響應(yīng)可被增強。如果模型系統(tǒng)含有很少或不含有CNTF，那么就可把CNTF加入到該系統(tǒng)中。還希望把其它CNTF加入到該模型系統(tǒng)中以便提高過量CNTF活性的作用。過分表達(dá)CNTF(或分泌的CNTF)是較佳的用于研究對已經(jīng)表達(dá)CNTFR的細(xì)胞CNTF的提高水平的作用的方法。更佳地是在所有細(xì)胞中表達(dá)CNTFR(一般表達(dá))并確定隨后是那些細(xì)胞為CNTF賦予官能響應(yīng)，從而可能鑒定次級受體組分，如果有一個存在的話。
5.6.2.2.降低的CNTF活性的模型另一方面，作為一個例子不是作為限定，可建立一個用于研究降低的CNTF活性的作用的實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)。該系統(tǒng)可鑒定所需要的CNTF和表示可能的治療目標(biāo)的方法或神經(jīng)元。在這樣的系統(tǒng)中，對CNTF的響應(yīng)可通過提供不與細(xì)胞表面相關(guān)或者設(shè)計成對響應(yīng)于CNTF的轉(zhuǎn)導(dǎo)無效的重組CNTFR而降低。
例如，可把CNTFR蛋白質(zhì)、肽或衍生物提供給該系統(tǒng)以便使提供的受體可與內(nèi)生的CNTFR競爭CNTF連接，從而減弱了對CNTF的響應(yīng)，CNTFR可以是一種無細(xì)胞受體，它或者被加入到該系統(tǒng)中或者由該系統(tǒng)生產(chǎn)。例如，缺少橫跨膜區(qū)域的CNTFR蛋白質(zhì)可以用系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞生產(chǎn)，比如無錨CNTFR可以從產(chǎn)生的細(xì)胞中分泌出來。另外，CNTFR蛋白質(zhì)、肽或衍生物可以加入到系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞外空間中。
本發(fā)明的另一實施方案中，重組CNTFR基因可用于經(jīng)同源重組失活或“打出”內(nèi)生基因，從而生產(chǎn)一種CNTFR缺失細(xì)胞、組織或動物。例如，但不是限定，重組CNTFR基因可設(shè)計成含有一種插入突變例如neo基因而失活CNTFR。這樣一種構(gòu)建在適當(dāng)?shù)膯幼涌刂葡率褂帽热甾D(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、注射等技術(shù)而被引入到細(xì)胞中，比如胚胎干細(xì)胞。然后含有該構(gòu)建的細(xì)胞可用G418抗性選擇。缺少完整CNTFR基因的細(xì)胞然后可通過例如表達(dá)的Southern印跡或Northern印跡或測定未鑒定。缺少完整CNTFR基因的細(xì)胞然后可融合到早期胚細(xì)胞中以產(chǎn)生CNTFR缺失的轉(zhuǎn)基因動物。這樣一種動物與未表達(dá)內(nèi)生CNTF的動物相比表明，或者兩種表型完全匹配或者不完全匹配，意謂著其它類CNTF因子或受體的存在。
這樣一種動物可用于定義具體的神經(jīng)元種群或者任何其它活體過程，一般取決于CNTF。因此，如果動物不表達(dá)CNTFR從而不能響應(yīng)CNTF，那么這些種群或過程就有希望發(fā)生。
另外，與內(nèi)生受體競爭CNTF的重組CNTFR蛋白質(zhì)、肽或衍生物可表達(dá)在系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞表面上，但是可以設(shè)計成不能轉(zhuǎn)導(dǎo)對CNTF連接的響應(yīng)。
上述的重組CNTFR蛋白質(zhì)、肽或衍生物可以類似于或不同于內(nèi)生CNTFR對CNTF的親合力的親合力連接到CNTF上。為更有效地降低對CNTF的響應(yīng)，CNTFR蛋白質(zhì)、肽或衍生物較好的是以大于天然受體所顯示出的親合力的親合力連接到CNTF上。
如果CNTFR蛋白質(zhì)、肽或衍生物在模型系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生，那么核酸編碼的CNTFR蛋白質(zhì)、肽或衍生物就可通過感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染等或者作為轉(zhuǎn)基因提供給該系統(tǒng)。如上文所述，CNTFR基因可以置于適當(dāng)?shù)膯幼拥目刂葡拢瑔幼涌梢允抢缃M織特異性啟動子或是可誘導(dǎo)啟動子或是改進調(diào)節(jié)啟動子。
在本發(fā)明的一具體實施方案中，細(xì)胞的內(nèi)生CNTFR基因可以通過同源重組被突變CNTFR基因取代。
在本發(fā)明的另一實施方案中，CNTFR表達(dá)可通過提供CNTFR表達(dá)細(xì)胞而降低，該細(xì)胞含有其含量足以降低CNTFR蛋白質(zhì)表達(dá)的CNTFR反意RNA或DNA。
5.6.3.診斷用途按照本發(fā)明，CNTFR探針可用于鑒定能響應(yīng)CNTF的處于正常或有病狀態(tài)的細(xì)胞和組織。本發(fā)明提供了用于鑒定能響應(yīng)CNTF的細(xì)胞的方法，包括檢測在這些細(xì)胞中CNTFR的表達(dá)。CNTFR表達(dá)可通過CNTFR mRNA的轉(zhuǎn)錄或者CNTFR蛋白質(zhì)的生產(chǎn)來證實。CNTFR表達(dá)可使用鑒定CNTFR核酸或蛋白質(zhì)的探針來檢測。
一種可用于檢測CNTFR表達(dá)的探針是核酸探針，它可用于利用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測CNTFR編碼的RNA，這些方法包括但不限于原位雜交、Northern印跡分析或PCR相關(guān)技術(shù)。
另一種可使用的探針是標(biāo)記的CNTF，如在申請?zhí)枮镹o.07/532 285的美國專利申請中描述的，在此將其全部內(nèi)容加入本文中作為參考。
按照本發(fā)明，術(shù)語“標(biāo)記的”CNTF是指連接到第2個可檢測化合物(“標(biāo)記”)上的CNTF分子。可檢測化合物可包括放射性同位素、熒光基團、或者是能夠連接到受體上的配位體、或者是可用比色法檢測或具有催化活性的物質(zhì)。在較佳實施方案中，標(biāo)記可含有抗原定子以便抗體能夠連接到標(biāo)記上。在另一實施方案中，標(biāo)記本身可以是一種抗體;本發(fā)明的一種具體實施方案中，標(biāo)記為單克隆抗體RP3-17。希望標(biāo)記不干擾CNTF的生物活性并且標(biāo)記的檢測方法基本上不干擾CNTF連接到其受體上。
標(biāo)記可用任何本領(lǐng)域已知的方法連到CNTF上。本發(fā)明的較佳實施方案是，標(biāo)記共價連接到CNTF上，但是在某些情況下希望標(biāo)記用非共價鍵結(jié)合力相連(例如，如果標(biāo)記含有免疫球蛋白分子)。
標(biāo)記可以是任何適于保持其指示器官能而基本上不改變相連的CNTF生物活性的分子尺寸。如果標(biāo)記是為了提供抗原定子，那么就希望它至少含有約5-15個氨基酸。
作為舉例說明而不是限定，本發(fā)明的一種較佳的具體方法是，CNTF可使用“碎片”聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作標(biāo)記，其中重組神經(jīng)營養(yǎng)性因子(CNTF)設(shè)計成在其C末端帶有相應(yīng)于已知抗原定子的十個氨基酸。例如，但不是作為限定，該抗原定子可相應(yīng)于人c-真菌(c-myc)原致癌基因蛋白質(zhì)的已定義的抗原決定基。
例如，但不是作為限定，“碎片”PCR方法如下所述可用于連結(jié)十個氨基酸真菌標(biāo)記(本發(fā)明提供了用類似方法連結(jié)的氨基酸標(biāo)記)。相應(yīng)于在細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建中位于特定限制性酶分裂位點上游的CNTF序列的5′PCR引物可用于與“碎片”引物的PCR反應(yīng)中，其中使用來自CNTF響應(yīng)的細(xì)胞的cDNA作為模板，所說“碎片”引物含有相應(yīng)于3′末端CNTF序列的核酸序列以及核酸序列編碼的肽標(biāo)記。
PCR反應(yīng)也含有相應(yīng)于碎片引物序列并包含含有特定限制性內(nèi)切酶分裂位點的核酸序列的3′引物。較佳實施方案是，5′和3′引物的用量超過碎片引物，結(jié)果5′和碎片引物之間的PCR放大在幾個PCR周期后就停止，而5′和3′引物之間的放大可起動并繼續(xù)生產(chǎn)大量的全長CNTF/標(biāo)記序列。“碎片”技術(shù)可解決對長引物的需要，長引子的合成是困難并耗時的。放大的CNTF/標(biāo)記產(chǎn)物可經(jīng)凝膠提純、用限制性內(nèi)切酶浸提，然后亞克隆到表達(dá)載體的相應(yīng)限制位點內(nèi)，其中限制性內(nèi)切酶在設(shè)計到產(chǎn)物的末端的位點上分裂。例如，為了生產(chǎn)CNTF-真菌標(biāo)記，可使用下述引物5′引物＝5′ GACTCG AGT CGA CAT CGG AGG CTG ATG GGA TGCC 3′(SEQ ID No3);碎片引物＝3′ CTA AAG ACT CCT CCT AGA CAT CGC CGG CGT ATCG 5′(SEQ ID NO4);引物可以使用的比例為100ng5′引子/100ng3′引子/1ng碎片引子;詳細(xì)描述見下文6節(jié)。CNTF/標(biāo)記的表達(dá)可以按照Sendtner等人在下述文件中對重組CNTF的表達(dá)的描述進行申請日為1990年8月20日、申請?zhí)枮?7/570 651的美國專利申請，其名稱為“Ciliary Neurotrophic Factor”或者1991年4月4日出版的PCT公開No WO 91/04316。
本發(fā)明也提供了含有免疫球蛋白分子或其一部分，例如抗體分子的Fc、F(ab)2或F(ab)′片段的標(biāo)記。標(biāo)記應(yīng)連接到CNTF上并且可以是多克隆或單克隆抗體。
按照本發(fā)明，標(biāo)記的CNTF可以用細(xì)胞在能促進CNTF向所說細(xì)胞的連接或附著的條件下培育。在大多數(shù)情況下，這可在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下實現(xiàn)。例如，在本發(fā)明的較佳實施方案中，細(xì)胞可以在標(biāo)記的CNTF存在下培養(yǎng)約30分鐘。如果標(biāo)記是抗體分子，那么較佳是使CNTF首先連接到細(xì)胞上并隨后洗滌細(xì)胞以除去未連接的配位體，然后加入抗CNTF抗體標(biāo)記。
在本發(fā)明的具體實施方案中，位于CNTF響應(yīng)的細(xì)胞表面上的標(biāo)記的CNTF，下文中稱為靶細(xì)胞，可用叢生分析(rosetting assay)檢測，其中能夠連接到標(biāo)記上的指示器細(xì)胞帶有CNTF/標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果它們粘到靶細(xì)胞的CNTF/標(biāo)記上，并且連接的指示器細(xì)胞在含CNTF-標(biāo)記的細(xì)胞周圍形成了叢生狀的叢。這些可以在用平皿培養(yǎng)的細(xì)胞(plated cell)上用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡技術(shù)觀測到，或者，另一方面，可以用密度離心法分離叢生化和非叢生化細(xì)胞。在本發(fā)明的一個較佳具體實施方案中，靶細(xì)胞比如神經(jīng)元細(xì)胞可在多井(例如60個井)培養(yǎng)平皿內(nèi)在約200細(xì)胞/井的濃度下在比如帶有10%胎兒牛血清和2mM谷氨酰胺的RPM1 1640的培養(yǎng)基內(nèi)收獲并用平皿培養(yǎng)，沉積的細(xì)胞在潮濕的5%CO2氣氛的培養(yǎng)箱中在37℃培養(yǎng)約16至24小時以使細(xì)胞附著。然后，過量的細(xì)胞培養(yǎng)基被除去并且細(xì)胞可以在室溫用標(biāo)記的CNTF培養(yǎng)約30分鐘。細(xì)胞然后用加入了1%牛血清清蛋白(BSA)的PBS(帶有鈣和鎂)洗滌數(shù)次以除去未連接的配位體然后在室溫用約10μg/ml的識別標(biāo)記分子的抗體培養(yǎng)約30分鐘。細(xì)胞然后用PBS洗滌數(shù)次以去除未連接的抗體。然后，靶細(xì)胞(含有連接到抗標(biāo)記抗體上的CNTF/標(biāo)記)在室溫用連接到抗標(biāo)記抗體上的叢生指示器細(xì)胞(比如含有兔-抗-小鼠免疫球蛋白的指示器細(xì)胞)的約0.2%(V/V)懸浮液培養(yǎng)1小時。平皿然后用PBS洗滌并在相襯顯微鏡下檢驗叢生。例如，如果抗標(biāo)記抗體由鼠產(chǎn)生，那么指示器細(xì)胞可通過用另一物種生產(chǎn)的抗(小鼠免疫球蛋白)抗體涂敷紅細(xì)胞(比如人O+紅細(xì)胞)來產(chǎn)生。指示器細(xì)胞可通過按照Albino等的程序(1981，J.Exp.Med.154∶1764-1778)在鹽水中稀釋的0.01%CrCl3·6H2O存在下用抗免疫球蛋白抗體(在濃度大于約1毫克/毫升下)培養(yǎng)紅細(xì)胞來制備。另外，可以使用本領(lǐng)域已知的磁珠(magne-tic bead)或其它方法。
在本發(fā)明的另一實施方案中，在靶細(xì)胞表面上的標(biāo)記的CNTF可使用免疫熒光技術(shù)檢測，其中與標(biāo)記較佳地是與抗體起反應(yīng)的分子直接或間接地產(chǎn)生熒光。熒光可在顯微鏡下觀察到，熒光可用于通過熒光激化細(xì)胞分類技術(shù)進行含CNTF/標(biāo)記的細(xì)胞的離析。本發(fā)明的一個較佳的具體實施方案用例子描述為，靶細(xì)胞可在含有CNTF/標(biāo)記(濃度過量)和迭氮化鈉(0.05%)的分析緩沖劑中在4℃研制和再懸浮約30分鐘。細(xì)胞然后可在分析緩沖劑中經(jīng)在800轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘進行洗滌三次。細(xì)胞然后在約10微克/毫升濃度下在4℃用抗標(biāo)記抗體培養(yǎng)約30分鐘，按如上方式洗滌，然后在4℃用生物素基化的(biotinylated)抗免疫球蛋白和抗生蛋白鏈菌素-德克薩斯紅(Texas Red)共軛物培養(yǎng)約30分鐘。細(xì)胞然后被洗滌、在封固溶液(mounting solution)中再懸浮、蓋片培養(yǎng)(Coverslipped)、然后用熒光顯微術(shù)檢驗。
本發(fā)明也提供了檢驗其它形式標(biāo)記比如產(chǎn)色的標(biāo)記、催化標(biāo)記等的方法。任何具體標(biāo)記的檢測方法取決于從標(biāo)記產(chǎn)生信號所必需的條件，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)能容易地識別。
可以使用的另一種探針是抗CNTFR抗體。
按照本發(fā)明，CNTFR蛋白質(zhì)、或片段或者衍生物可用作免疫原以生產(chǎn)抗CNTFR抗體。通過使用蛋白質(zhì)合成的重組技術(shù)(以本發(fā)明的CNTFR核酸序列為基礎(chǔ))可生產(chǎn)大量的CNTFR蛋白質(zhì)，這樣就避免了限量的CNTFR這一問題。
為進一步改進生產(chǎn)抗CNTFR免疫響應(yīng)的可能性，應(yīng)對CNTFR的氨基酸序列進行分析以鑒定與增加的免疫原性相關(guān)的分子的部分。例如，對氨基酸序列進行計算機分析以鑒定表面抗原決定基，抗原決定基表示了親水性、表面幾率、靈活度、抗原指數(shù)、兩親螺旋結(jié)構(gòu)、兩親層以及CNTFR的二級結(jié)構(gòu)的由計算機產(chǎn)生的小區(qū)。另外，導(dǎo)出的不同物種的CNTFR的氨基酸序列可進行比較，并且相對的非同源區(qū)被鑒定;這些非同源區(qū)對各種物種更有可能是呈免疫原性的。
為了制備指向CNTFR的單克隆抗體，通過在培養(yǎng)基中的連續(xù)細(xì)胞系制備抗體分子的任何技術(shù)均可使用。例如，最初由kohler和Milstein研究的雜交瘤技術(shù)(1975，Nature 256∶495-497)、以及trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，1983，Immu-nology Today 4∶72)、以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，1985，in“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)等等均屬于本發(fā)明的范圍。
用于治療的單克隆抗體可以是人單克隆抗體或嵌合體人-鼠(或其它物種)單克隆抗體。人單克隆抗體可用許多本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)(例如Teng et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.807308-7312;Kozbor et al.，1983，Immunology Today 4∶72-79;Olsson et al.，1982，Meth.Enzymol.92∶3-16)。制備的嵌合體抗體可以含有小鼠抗原連接區(qū)域與人恒定區(qū)(Morrison et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81∶6851，Takeda et al.，1985，Nature 314∶452)。
本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可用于生產(chǎn)CNTFR抗原決定基的多克隆抗體。對于生產(chǎn)抗體，經(jīng)注射CNTFR蛋白質(zhì)、或片段或其衍生物可使各種宿主動物免疫，所說動物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。各種佐劑可用于增強免疫響應(yīng)，這取決于宿主物種，佐劑包括但不限于弗洛因德佐劑(完全的和不完全的)、礦物凝膠比如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)比如溶血卵磷脂、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽、油乳狀液、鑰孔
血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚、以及具有潛在用途的人的佐劑比如BCG(卡介苗)以及短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
CNTFR抗原決定基的抗體的分子克隆可用已知技術(shù)制備。重組DNA方法(參見例如Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)可用于構(gòu)建編碼單克隆抗體分子或其抗原連接區(qū)的核酸序列。
抗體分子可用已知技術(shù)，例如免疫吸附或免疫親和性色譜法、比如HPLC(高性能液相色譜)的色譜法、或它們的組合等進行提純。
本發(fā)明提供了抗體分子以及這些抗體分子的片段。含有分子的個體基因型的抗體片段可用已知技術(shù)生產(chǎn)。例如，這些片段包括但不限于F(ab′)2片段，可用抗體分子的胃蛋白酶消化生產(chǎn);Fab′片段，可經(jīng)減少F(ab′)2片段的二硫鍵來生產(chǎn);以及Fab片段，可經(jīng)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子來生產(chǎn)。
上述探針可實驗性地用于鑒定到目前為止還未用于表達(dá)CNTFR的細(xì)胞或組織。此外，這些方法可通過畸變組織比如癌用于鑒定CNTFR的表達(dá)。在其它實施方案中，這些方法可論斷性地用于把遭受紊亂的病人的細(xì)胞、液體或組織中CNTFR的表達(dá)與健康人的相似細(xì)胞、液體或組織進行比較。液體指任何體內(nèi)液體，但特別是指血液或腦脊髓液。病人與健康人相比其CNTFR表達(dá)的水平的差異表明，病人的紊亂主要地或次要地與CNTF代謝有關(guān)。CNTFR水平的增加，例如，或者表明病人的紊亂與對CNTF的正常水平的提高的敏感度有關(guān)，或者另一方面，表明病人的CNTF水平低，結(jié)果受體的數(shù)目由于補償而增加。這些病原可通過讓病人服用CNTF來彼此分開。如果病人的狀況惡化，他就患有CNTF過敏;如果病人轉(zhuǎn)好，他就患有CNTF缺失。從而可以選擇CNTF或基于CNTF拮抗物的治療方案。表達(dá)的不同可在蛋白質(zhì)和/或RNA水平下檢測出;即通過測量病人的相對于健康人的CNTFR蛋白質(zhì)或CNTFR RNA的量。
上述探針也可用于選擇用于測定系統(tǒng)中的CNTF響應(yīng)的細(xì)胞，如上所述，或者參見申請?zhí)枮镹o.07/532 285的美國專利申請，或者按照細(xì)胞選擇或細(xì)胞分類的標(biāo)準(zhǔn)方法。
5.6.4.治療用途本發(fā)明也提供了使用本發(fā)明的有效量的CNTFR蛋白質(zhì)、肽片段、或衍生物治療患有紊亂如神經(jīng)紊亂的病人的方法。包括用CNTFR、CNTFR興奮劑、CNTFR拮抗物(它與內(nèi)生CNTF競爭)或者抗CNTFR抗體給藥的治療方法都屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明也提供了在合適的藥用載體中含有CNTFR蛋白質(zhì)、肽片段、或衍生物的藥物組合物。
CNTFR蛋白質(zhì)、肽片段或衍生物可以全身地或局部地給藥。本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)慕o藥方式均可使用，包括但不限于靜脈內(nèi)、椎管內(nèi)、動脈內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、皮下、腹膜內(nèi)、或是局部注射或外科植入。還提供了持久性釋放配方。
當(dāng)我們對神經(jīng)退化疾病/神經(jīng)創(chuàng)傷認(rèn)識得更清楚時，降低內(nèi)源CNTF營養(yǎng)作用的益處就更明顯。所以，在神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷區(qū)域中，常望提供CNTF拮抗物，包括(但不限于此)無細(xì)胞CNTFR，該CNTFR可與內(nèi)源細(xì)胞受體爭奪CNTF結(jié)合。在這些情況下，在損傷部位而不是在全身局部提供CNTF可能是合乎要求的。使用提供CNTFR的植入物可能是所希望的。
另外，某些病理狀態(tài)可能從CNTF響應(yīng)性的提高得到益處。因此，在遭受這種病理狀態(tài)的患者中增加CNTFR的數(shù)量或結(jié)合親合性可能是有益的。這可通過基因療法而達(dá)到。使用由組織特異性或誘導(dǎo)啟動子控制的CNTFR基因，或通過用帶有重組體CNTFR基因的復(fù)制缺損性病毒產(chǎn)生局部感染而獲得在合適細(xì)胞中的重組體CNTFR的選擇表達(dá)那些可受益于增加對CNTF敏感性的病理狀態(tài)特別包括(但不限于)運動神經(jīng)元紊亂，包括肌萎縮側(cè)硬化、和后脊髓灰質(zhì)炎(post-polio)綜合癥。這種療法也可用于治療與糖尿病、帕金森病、Al-zheimer病和Huntington舞蹈病有關(guān)的神經(jīng)紊亂。
此外，本發(fā)明通過CNTF給藥提供對特殊組織或細(xì)胞類型紊亂的治療，這類組織或細(xì)胞類型已作為表達(dá)CNTF受體而鑒定出。在特定實施方案中，已經(jīng)表明該CNTFR基因在肌肉細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)(見下文第8節(jié))，并且該CNTF可防止與體內(nèi)去神經(jīng)支配萎縮有關(guān)的肌肉重量和肌原纖維蛋白含量的損失(見下文第9節(jié))。因此，本發(fā)明提供了治療肌肉細(xì)胞紊亂，或包括神經(jīng)肌肉單元紊亂的方法，該方法包括給需這種治療的病人服用(ⅰ)一處含有編碼CNTFR的核苷酸序列的核酸分子或官能活性部分或其衍生物，以使其能夠表達(dá)，或(ⅱ)CNTF，或其官能活性部分或其衍生物。這種紊亂包括但不限于基礎(chǔ)病理學(xué)發(fā)現(xiàn)的肌肉萎縮或營養(yǎng)不良變化。例如，這種肌肉萎縮可能是由因神經(jīng)創(chuàng)傷引起的去神經(jīng)支配(肌肉與其神經(jīng)失去接觸);退化的，代謝的或發(fā)炎的(例如格-巴二氏(Guillian-Barre)綜合癥)外周神經(jīng)病、或由環(huán)境毒物或藥物引起的對神經(jīng)的損傷而造成的。在另一實施方案中，肌肉萎縮是由因運動神經(jīng)引起的去神經(jīng)支配而造成的。這種運動神經(jīng)病包括但不限于成人運動神經(jīng)元疾病，包括肌萎縮側(cè)硬化(ALS或LouGehrig′s病);嬰幼兒脊椎肌肉萎縮，和具有多病灶傳導(dǎo)區(qū)的自身免疫的運動神經(jīng)病。在另一實施方案中，肌肉萎縮是由慢性廢用性引起的。這類廢用性萎縮可由以下這些病理狀態(tài)產(chǎn)生，包括但不限于由于中風(fēng)引起的癱瘓，脊髓損傷，腦損傷或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，由于創(chuàng)傷(如骨折、扭傷或錯位)造成的骨骼固定術(shù)或長期臥床休息。在一個實施方案中，肌肉萎縮是由代謝緊張狀態(tài)或營養(yǎng)不良造成的，這包括但不限于癌癥和其他慢性病的惡病質(zhì)，斷食或橫紋肌溶解(rhabdomyolysis)，內(nèi)分泌失調(diào)如(但不限于)甲狀腺失調(diào)和糖尿病。肌肉萎縮也可是由于肌肉營養(yǎng)不良綜合癥引起的，這包括但不限于杜興氏(Duchenne)、貝克爾氏(Becker)、肌強直的、筋膜肩胛肱骨(Fascioscapulohumeral)、Emery-Dreifuss、眼咽的(ocu-lopharyngeal)、肩胛肱骨、肢帶、和先天型的、以及已知為遺傳遠(yuǎn)側(cè)肌病(Hereditary Distal Myopathy)的營養(yǎng)不良。在另一實施方案中，肌肉萎縮是由先天肌肉病引起的，這包括，但不限于良性先天壓力過低(Benign Congenital Hypotonia)、中心核(Central Core)病。線蟲肌病(Nemaline Myopathy)、和管狀肌(Myotu-bular)(中心核)病。另外，CNTFR編碼核酸或CNTF及其活性片段或衍生物可用于治療后天(中毒或發(fā)炎)肌病。那些由于肌肉發(fā)炎疾病引起的肌病包括但不限于多肌炎和皮膚炎。中毒性肌病可以由以下這些試劑引起，包括但不限于乙胺碘呋酮、氯喹、安妥明、阿霉素、乙醇、羥基氯喹、有機磷酸鹽、雙環(huán)己乙哌啶、和長春新堿。
在本發(fā)明的另外實施方案中，對于遭受過量CNTFR、對CNTF、過量CNTF等過敏的病人可通過服用有效量的相應(yīng)于CNTFR基因編碼區(qū)的反義RNA或反義少脫氧核糖核苷酸由此降低CNTFR的表達(dá)而得到治療。
6.實施例睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體的表達(dá)克隆6.1.材料和方法6.1.1.CNTF受體表達(dá)庫的構(gòu)建SH-SY5Y細(xì)胞(由Dr.June Biedler最先獲得)用作構(gòu)建cDNA庫的mRNA來源，并且pCMX表達(dá)載體(公開在同時待批的1991年3月28日申請流水號No.07/678408的美國專利申請中，見上文)，這是一種pCDM8載體的衍生物(Seed，1987，Nature 329∶840-842)。在瓊脂糖凝膠上選擇用于cDNA庫的插入物，其尺過大于1kb。
6.1.2.“淘盤分析(panning)”方法對由Seed和Aruffo開發(fā)的“淘盤分析”方法(1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84∶3365-3369)作如下改變細(xì)胞首先用CNTF/真菌(1μg/ml)在冰上培養(yǎng)30分鐘，旋轉(zhuǎn)通過PBS/2%Ficoll以去除的配體，然后用9E10抗體(由Oncogene Sciences，Manhasset，N.Y.獲得)在冰上培養(yǎng)30分鐘，而不是用識別受體的抗體來培養(yǎng)細(xì)胞。隨后再將其旋轉(zhuǎn)通過PBS/2% Ficoll，并且在敷有從Sigma公司獲得的抗真菌肽小鼠單克隆抗體的平皿上“淘盤分析”。該平皿的制備如下將敷有抗真菌小鼠單克隆抗體細(xì)菌的60mm平皿(Falcon 100)或其等同物，或10cm皿，如Fisher 8-757-12，用50mM Tris HCl(pH9.5)稀釋至每毫升10微克。3ml的抗體用于覆蓋每個6cm皿或10ml用于每個10cm皿;將平皿暴露于抗體約1.5小時，然后將抗體轉(zhuǎn)移到下一皿中，使保持1.5小時，然后再轉(zhuǎn)移到第三個皿中。用0.15M NaCl洗滌該平皿三次(為此用洗滌瓶是較方便的)，然后在PBS中用3ml 1mg/ml BSA培養(yǎng)過夜。尤其是按下述進行“淘盤分析”將細(xì)胞在100mm皿中培養(yǎng)。從每個皿中吸出培養(yǎng)基，再加2ml PBS/0.5mM EDTA/0.02%疊氮化物，將該混合物在37℃下培養(yǎng)30分鐘以將細(xì)胞從皿上脫離下來。用短的巴氏(pas-teur)吸管用力將這些細(xì)胞搗碎，從每個皿中收集入離心管中，并在2.5位置(200xg)旋轉(zhuǎn)4分鐘。將細(xì)胞懸浮在0.5-1.0ml PBS/EDTA/疊氮化物/ 5%FBS中，并用CNTF/真菌在冰上培養(yǎng)30分鐘。加入等體積的PBS/EDTA/疊氮化物，在3ml PBS/EDTA/疊氮化物/2% Ficoll中仔細(xì)分層，在位置2.5處旋轉(zhuǎn)4分鐘，將上清液平穩(wěn)地吸出。然后用9E10抗體在冰上將這些細(xì)胞培養(yǎng)30分鐘，再重覆旋轉(zhuǎn)通過PBS/EDTA/疊氮化物/2%Ficoll。將這些細(xì)胞溶解在0.5ml PBS/EDTA/疊氮化物中，將等分試樣加入到含有3ml PBS/EDTA/疊氮化物/5%FBS的用抗真菌小鼠單克隆抗體覆蓋的皿上。至多從2個60mm皿中將細(xì)胞加入到1個60mm抗體覆蓋的平皿中，并使在室溫放置1-3小時。通過用PBS/5%血清或用培養(yǎng)基緩慢地洗滌而將未粘附于皿上的過量細(xì)胞去除(通常用3ml洗滌2-3次就足夠)。
6.1.3.含有睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體基因克隆的鑒定按照標(biāo)準(zhǔn)方法使用DEAE/氯喹將來自表達(dá)庫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到COSM5細(xì)胞中(每100mm皿約250-500ng;轉(zhuǎn)染二個皿)。轉(zhuǎn)染后二天，將細(xì)胞從其皿上脫離，并經(jīng)受如上文所述的改進的Aruffo/Seed的淘盤步驟。
從平皿上洗滌非粘附細(xì)胞后，制備Hirt上清液(Hirt，1967，J.Mol.Biol.26∶365-369)，在存在10-20μg tRNA時沉淀質(zhì)粒DNA。按照廠商的說明通過電穿孔將得到的DNA引種到DH10B細(xì)菌中(Electromax，BRL)。由電穿孔的細(xì)菌生長的培養(yǎng)基用于制備質(zhì)粒DNA以用于下一輪的轉(zhuǎn)染和淘盤;通過間接的碘化-抗體結(jié)合測試，用這種質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的一平皿COS細(xì)胞明顯表現(xiàn)為大量的表達(dá)CNTFR的COS細(xì)胞(見圖1B的典型數(shù)據(jù)，測定方法見下文)。在這些轉(zhuǎn)染子上進行第二輪淘盤/質(zhì)粒DNA分離/電穿孔后，在氨芐青霉素平皿上平板培養(yǎng)出由電穿孔步驟得到的細(xì)菌轉(zhuǎn)化體。收集個體的細(xì)菌克隆，由每個該克隆制備的質(zhì)粒DNA單個地轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中以用于測定。15個試驗質(zhì)粒中的14個，通過一系列測定，包括如下文所述的間接抗體結(jié)合測定和熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)分析，結(jié)果形成轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞中表達(dá)CNTF結(jié)合位點。
6.1.4.直接125I-hCNTF結(jié)合測定用來自庫、增強庫、或個體克隆的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。48小時后，移去培養(yǎng)基，并用僅含有125I-hCNTF的0.25ml結(jié)合緩沖液(具有10%FBS和0.1%NaN3的RPM1 1640)或用未標(biāo)記的hCNTF來代替。在室溫用125I-hCNTF培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)完全后，除去該125I-hCNTF溶液，并用1.0ml結(jié)合緩沖液洗滌這些細(xì)胞三次，然后用0.25ml的0.1N NaOH溶解。將溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到12×75mm聚苯乙烯管中并置于r計數(shù)器中。通過加入至少100倍過量的未標(biāo)記hCNTF來測定非特異性結(jié)合。在最終洗滌后，將該平皿進行放射自顯影照相。
6.1.5.熒光激活細(xì)胞分類術(shù)分析將轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞依次用CNTF/真菌、9E10抗體、以及FITC-標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體培養(yǎng)。然后從皿上脫離并經(jīng)過FACS分析。用負(fù)和正質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的結(jié)果繪于圖1D中;用CNTF受體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞含有大量的亞群，通過本測定顯示出熒光大大增強。
6.1.6 hCNTF的碘化在20℃使用乳過氧化物酶6ng/μl(Sigma)用1mci125INa磺化10μg hCNTF(560μg/ml，在10mM NaPO4中，pH7.4)15分鐘。15分鐘后，用含有0.1M NaI、0.1%BSA和0.1%細(xì)胞色素C.0.3%HOAC、0.05%酚紅和0.02%NaN3的等體積緩沖液抑制反應(yīng)。移出等分試樣以用于測定TCA的沉淀數(shù)量。將剩余部分裝到載有0.05M NaPO4、0.1M NaCl、0.5mg/ml硫酸魚精蛋白和1mg/ml BSA的BioRad PD-10生物凝膠柱上。收集餾分并測定TCA沉淀數(shù)。
6.1.7 CNTFR的序列分析依照廠商的說明，使用二脫氧雙線DNA元件(U.S.Biochemi-cal公司出售)用SequenaseTM進行序列分析6.1.8.間接的125I山羊抗小鼠抗體結(jié)合測定用來自庫、增強庫、或個體克隆的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。48小時后，在冰上依次用PBS(含有Ca、Mg)/5%FBS培養(yǎng)這些細(xì)胞30分鐘，5%FBS含有1)1μg/ml CNTF-真菌;
2)10μg/ml9E10;
3)125I山羊抗小鼠抗體(GaM)(0.5-1μCi/ml)。
每一步驟后，將細(xì)胞在PBS/5%FBS中洗滌3×5分鐘。最后一次洗滌后，將該平皿進行放射自顯影照相。
對于個體克隆，用手提式r計數(shù)器定量地測定其結(jié)合的總放射性。
6.2.結(jié)果的討論6.2.1.限制性分析在限制性分析時，將14個正克隆分為4組a)I2＝I7(2kb)b)I1＝I5＝I6(2kb)c)I4＝I8＝I9＝I11＝I14＝I15(4kb)d)I10＝I12＝I13(1.6kb)(I3為負(fù)的)用酶Pst I消化時，各組的成員都產(chǎn)生相同的帶花樣。進一步的限制性分析表明克隆的四組是重疊的，初始序列的數(shù)據(jù)證明，它們在其5′端共有重疊的序列。奇怪的是，相對其核啟動子元件，組b)表明在載體的錯誤取向上有其插入物。如表1可見，相對于其他克隆，這些克隆的表達(dá)是低的。在這些克隆中的轉(zhuǎn)錄可由在載體多銜接物的下游區(qū)中存在弱隱藏啟動子而產(chǎn)生。
6.2.2.體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯為表征對四組克隆的蛋白質(zhì)編碼，將它們?nèi)坑稍谳d體多銜接物的5′區(qū)中的T7啟動子所轉(zhuǎn)錄。在體外轉(zhuǎn)譯后，將產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上進行電穿孔。組a)不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，這是因為相對于T7啟動子位于錯誤的取向。其他三組都產(chǎn)生相同尺寸的蛋白質(zhì)(約42kd)，這證明它們編碼相同的蛋白質(zhì)。
表Ⅰ在CNTFR克隆中125Ⅰ-GaM結(jié)合的數(shù)量克隆 結(jié)合CPMⅠ1 2000Ⅰ2 8500Ⅰ3 600Ⅰ4 9000Ⅰ5 2000Ⅰ6 1600Ⅰ7 6000Ⅰ8 7500Ⅰ9 7000Ⅰ10 4500Ⅰ11 7000Ⅰ12 5000Ⅰ13 8000Ⅰ14 10000Ⅰ15 8000負(fù)對照 500本底 2506.2.3.與CNTF的結(jié)合分析使用9E10抗真菌抗體和125I山羊抗小鼠抗體的間接CNTF-真菌結(jié)合測定的結(jié)果示于圖1B和1C以及表1中。在圖1B中，在左邊的平皿是由未增強庫的轉(zhuǎn)染而得到的，而右邊的平皿是來自進行一輪淘盤后得到的增強庫質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的(使用與未增強庫大約相同數(shù)量的DNA)。僅在右邊的平皿中觀察到大量的黑點，每個黑點都代表放射自顯影檢測的單個COS細(xì)胞表達(dá)CNTF-真菌結(jié)合位點。
對于在第6.2.1.節(jié)中討論的個體正克隆，用手提式r計數(shù)器進行總放射性的定量測定。對個體克隆I1-I15的測定結(jié)果示于表1中并表明15個克隆中的14個表達(dá)CNTF結(jié)合位點(通過間接抗體結(jié)合試驗測得)。此外，如圖1C所示對來自某些個體克隆的平皿中的片段進行放射自顯影照相。
如圖1D所示，第二次間接結(jié)合的實驗使用了CNTF-真菌，隨后用9E10抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，以及FACS分析。用正克隆轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞與用負(fù)克隆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，表明其提高CNTFR的表達(dá)為100倍。
用CNTF-真菌獲得的間接結(jié)合數(shù)據(jù)通過用直接125I-CNTF結(jié)合進行了驗證，結(jié)果示于表Ⅱ。在轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞上表達(dá)的該受體如同CNTFR被克隆的SH-SY5Y細(xì)胞一樣特別易與碘化的CNTF以及CNTF-真菌配體結(jié)合。每個轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞表達(dá)比SH-SY5Y細(xì)胞高約30倍每細(xì)胞受體。
表Ⅱ用碘化了的CNTF結(jié)合分析COS Ⅰ2 SH-SY5Y125Ⅰ-CNTF 特殊的 cpm/細(xì)胞＊特殊的 cpm/細(xì)胞濃度 結(jié)合cpm 結(jié)合cpm2.16nM 1412 2.17×10-21284 4.28×10-3在24井培養(yǎng)皿中用3×105個SH-SY5Y細(xì)胞/井或6.5×104個COS細(xì)胞/井來進行單層結(jié)合測定。特殊的結(jié)合cpm的計算是從僅以所指明濃度的125I-CNTF時的結(jié)合cmp中減去存在1000倍過量的未標(biāo)記的CNTF時的結(jié)合cpm。在未轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中未檢測到特殊的結(jié)合。
＊通過用DEAE Dextran(二乙氨乙基葡聚糖)轉(zhuǎn)染后48小時進行COS細(xì)胞測定，典型地是在其中只轉(zhuǎn)染20-40%。假設(shè)轉(zhuǎn)染20%的COS細(xì)胞，特殊的結(jié)合cpm表明每個轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞比SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)約高30倍的每細(xì)胞受體。
6.2.4.CNTFR和同源于其他生長因子受體序列該CNTFR含有與一系列其他受體共有的主題。CNTFR的胞外部分含有位于N-未端的“免疫球蛋白”區(qū)域，以及通過短的鉸合區(qū)從“免疫球蛋白”中分離出的“細(xì)胞活素受體”區(qū)域。盡管很多受體既與“免疫球蛋白”又與“細(xì)胞活素受體”同源(圖3)，但只有一個受體即IL-6受體與CNTFR共有這些區(qū)域的相同的特定排列(圖3和圖4)。所以該IL-6受體是與CNTFR最相關(guān)的蛋白質(zhì)(圖4)。有意義的是，該IL-6受體也類似于CNTFR，在其中它具有非常短的胞質(zhì)區(qū)域，顯然對于IL-6結(jié)合不需要起始響應(yīng)(Hibi et al.，1990，Cell 63∶1149-1157)。最近，一種新的對IL6受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，定名為gp130，進行了分子克隆。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)物本身不結(jié)合IL-6，但它提供結(jié)合到IL-6受體上的高親合性，并為轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-6信號所需(Hibi et al.，1990，Cell 63∶1149-1157)。我們對CNTFR的克隆表明它與IL-6受體共有重要的特征，這在已知的其他受體中是沒有發(fā)現(xiàn)的，所以，定義了一個新的受體家系。IL-6R和CNTFR之間的相似性表明CNTFR可以象IL-6受體一樣使用相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，或相關(guān)的分子。最后，CNTFR相關(guān)的受體的鑒定可借助于與這些受體結(jié)合的新的配體的鑒定。
7.實施例對CNTFR信息的組織探測7.1.材料的方法7.1.1.CNTFR探針的制備將hCNTFR的編碼區(qū)分子克隆入pCMX表達(dá)載體中，這公開在與此同時申請的題目為“哺乳動物的表達(dá)載體”的美國專利申請中，所得到的表達(dá)載體繪于圖6中。合成了由CNTFR序列堿基對889伸展至堿基對1230的PCR探針，并將它用作Northern分析探針。
7.1.2.RNA的制備和Northern印跡從Sprague-Dawley大鼠中解剖出所選擇的組織并立即冰凍于液氮中。如Bothwell等人所述(1990，Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，Boston，MS，Jones and Bartlett)通過在3M LiCl、6M尿素中組織的均化而將RNA分離出。通過經(jīng)四次1%瓊脂糖-甲醛凝膠的電泳法將RNA(10μg)碎粒(Bothwell et al.，1990，Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，Boston，MS，Jones and Bartlett)，然后用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移到具有10×SSC(pH7)的尼龍膜上(MagnaGrath，Micron Separation Inc.)。通過暴露在紫外光線下將RNA紫外線交聯(lián)到該膜上(Stratalinker，Stratagen，Inc.)，并在68℃下在存在有0.5M NaPO4(pH7)，1%牛血清蛋白(餾分V，Sigma，Inc.)、7%SDS、1mM EDTA(Mahmoudi et al.，1989，Biotechniques 7∶331-333)、100μg/ml聲處理的變性鮭精DNA時與放射性標(biāo)記的探針雜交。在68℃用3×SSC、0.1%SDS洗滌濾器并在70℃下用一個或二個增強膜(Cronex，Dupont)和X射線底片(SAR-5，Kodak)進行放射自顯影照相一天至二周。對凝膠的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡染色表明對不同試樣測定的總RNA的水平是相當(dāng)?shù)?如Maisonpierre et al.，1990，Science 247∶1446-1451)。
7.2.結(jié)果如圖5所示，CNTFR mRNA在坐骨神經(jīng)和腎上腺中為低水平時的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中，以及在肌肉中是可檢測出的。這表明CNTF不僅具有神經(jīng)營養(yǎng)活性，而且也具有肌肉營養(yǎng)活性，并可以說明涉及到在特定紊亂中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉兩者，這些紊亂例如杜興氏肌肉營養(yǎng)不良和先天肌強直營養(yǎng)不良，在這些病中，病人遭受精神阻滯。CNTFR在肌肉中表達(dá)這說明CNTF可能在肌肉生理學(xué)中具有一定的作用。所以，除了作用于神經(jīng)，CNTF在肌肉中可能具有重要的作用，如作為肌營養(yǎng)劑的作用，或換句話說影響肌肉發(fā)育和/或分化。
8.實施例證明CNTF受體通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)鍵連接到細(xì)胞表面上8.1 材料和方法在補充有10%未活化的胎兒牛血清的RPMI中于24井皿(Falcon)中培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞。在實驗中，在CNTF結(jié)合之前進行磷脂酶(以及對照)處理，將培養(yǎng)基吸出，用PBS(+Ca/Mg)將細(xì)胞沖洗二次，然后用補充有或不補充磷脂酰肌醇-特性磷酯酶(PI-PLC)最終濃度為500mU/ml(購于Boehringer Mannheim 的＃1143-069產(chǎn)品)的PBS(+Ca/mg)在37℃下培養(yǎng)45分鐘。然后用結(jié)合緩沖液(PBS(+Ca/Mg)和5%胎兒牛血清)將細(xì)胞洗滌三次，然后再用250ml含有碘化的CNTF(約100微微摩爾)，該CNTF含有或不含1000倍過量的未標(biāo)記的CNTF結(jié)合緩沖液，在室溫培養(yǎng)30分鐘。在實驗中，在PI-PLC處理之前將碘化的CNTF結(jié)合，在37℃下，在含有碘化的CNTF，該CNTF含有或不含過量未標(biāo)記的CNTF的結(jié)合緩沖液中首先培養(yǎng)45分鐘。然后用PBS(+Ca/Mg)將細(xì)胞洗滌二次，再用補充或不補充PI-PLC(最終濃度為500mu/ml)的PBS(+Ca/Mg)培養(yǎng)45分鐘。而后用結(jié)合緩沖液沖洗細(xì)胞三次。在所有情況下，在0.1N NaOH中計數(shù)之前溶解細(xì)胞，然后再計數(shù)。
8.2.結(jié)果和討論CNTF受體的序列表明編碼蛋白質(zhì)終止在其后跟有外胞質(zhì)區(qū)域的疏水區(qū)中，沒有出現(xiàn)任何明顯的終止轉(zhuǎn)移序列或內(nèi)胞質(zhì)區(qū)域。這一結(jié)構(gòu)使人想起了在沒有橫跨膜區(qū)域的并通過GPI鍵連接在細(xì)胞表面上的膜蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)的C-末端(Ferguson and Williams，1988)。所以，進行實驗以試驗該CNTF受體是否是通過GPI鍵連接到細(xì)胞表面上。如表Ⅲ所示，用PI-PLC處理SH-SY5Y細(xì)胞完全消除了SH-SY5Y其后結(jié)合CNTF的能力，這與該CNTF受體通過GPI鍵連接到細(xì)胞表面上的觀點相一致。然而，可通過PI-PLC處理使已連接到SH-SY5Y細(xì)胞上的CNTF釋放(表Ⅲ)。有意義的是，可溶形式的IL-6受體可與對IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的第二膜蛋白質(zhì)(GP130)緊密地結(jié)合。所以，通過事先結(jié)合在CNTF上來防止CNTF受體釋放可能是由于CNTF、其受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物(GP130或GP130類似物)間結(jié)合的結(jié)果。另一方面，CNTF結(jié)合可改變CNTF受體的結(jié)構(gòu)，使其對PI-PLC更為不敏感(有些GPI連接的蛋白質(zhì)具有PI-PLC抗性形式)。
CNTF受體通過GPI鍵連接在細(xì)胞表面上這一發(fā)現(xiàn)有重要的結(jié)果。這表示了第一次發(fā)現(xiàn)生長因子受體以這種方式連接到膜上，增加了附加的受體可以被GPI連接的可能性。因為一些蛋白質(zhì)具有GPI連接形式和含有普通的橫跨膜區(qū)域形式這兩種形式，我們的發(fā)現(xiàn)增加了CNTF受體具有交替可編碼橫跨膜區(qū)域的C末端的可能性，并類似于IL-6受體具有GPI連接的形式。生長因子受體的GPI連接形式可使用新的受體調(diào)節(jié)和釋放機制。例如，表面受體的向下調(diào)節(jié)可通過活化外胞質(zhì)的磷脂酶活性使GPI連接的受體的釋放而迅速發(fā)生。這些釋放的受體也可作用于另外的細(xì)胞(或單獨的或以大致相同的方式與CNTF結(jié)合)，可溶的IL-6受體表明已結(jié)合IL-6并活化了表達(dá)GP130的細(xì)胞。
使用PI-PLC將CNTF受體釋放可阻滯CNTF作用的這一可能性具有重要的意義。這可用于驗證所觀察的CNTF的作用是由于克隆的CNTF受體的結(jié)果。在治療上，當(dāng)認(rèn)為CNTF活性是有害的時，PI-PLC可用于釋放CNTF受體，并可能阻滯CNTF的作用。
如果CNTF受體的CNTF可阻滯的PI-PLC釋放是由于在CNTF、其受體、和蛋白質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)之間形成了四元絡(luò)合物，那么該受體的這一特征就可用于定義和分子克隆該轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
表Ⅲ對結(jié)合于SH-SY5Y細(xì)胞上的CNTF的PI-PLC處理的分析結(jié)合cpm無冷的過量物 冷的過量物用PI-PLC予處理無PI-PLC 1440 370有PI-PLC 420 310PI-PLC之前結(jié)合CNTF無PI-PLC 1250 310有PI-PLC 1060 3009.CNTF在體外對去神經(jīng)大鼠骨骼肌的作用在此所述的實驗?zāi)康氖菫榱藱z驗純化的重組體CNTF在體外對去神經(jīng)骨骼肌的作用以及確定CNTF是否能防止與去神經(jīng)支配的萎縮，例如肌肉重量和肌原纖維蛋白質(zhì)損失有關(guān)的某些表型變化。我們發(fā)現(xiàn)該CNTF受體在骨骼肌包括管狀肌和成肌細(xì)胞兩者中表達(dá)，并且該CNTF可防止與去神經(jīng)支配的萎縮有關(guān)的肌肉重量和肌原纖維蛋白質(zhì)含量的損失。
9.1.CNTF受體在骨骼肌包括管狀肌和成肌細(xì)胞兩者中的表達(dá)如圖5所示，在由多種大鼠組織中得到的RNA試樣上進行Nor-thern印跡分析以鑒定CNTF的主要的細(xì)胞靶。來自人體CNTF受體編碼區(qū)的探針鑒定了2kb轉(zhuǎn)錄體，這些轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)通常只限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，只有意外地在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了其高水平的表達(dá)，而在腎上腺和坐骨神經(jīng)中發(fā)現(xiàn)為低水平表達(dá)。
特別是在骨骼肌中CNTF受體表達(dá)的更詳細(xì)的分析，是通過用由特殊大鼠肌肉類型、純化的人體肌肉管狀肌細(xì)胞、和一些小鼠和大鼠來源的骨骼肌細(xì)胞系制備的mRNA的Northern印跡按上文進行(圖7)。將人體探針用于CNTF受體時，在一些肌肉RNA試樣中測定了兩種mRNA種類(2.0和1.7kb)。圖7表明CNTF受體在小鼠(行1和2)或大鼠(行3和4)來源的管狀肌和成肌肌肉細(xì)胞系兩者中都表達(dá)，以及在大鼠的紅色慢顫搐比目魚肌和白色快速顫趾長伸肌(EDL)中表達(dá)(分別為行5和6)。這表明CNTF受體mRNA的水平在比目魚肌(行12)和EDL肌肉(行14)中都增加，這些肌肉相對于其假手術(shù)對側(cè)的對照物(分別為行11和行13)為第一次去神經(jīng)72小時。有意義的是，表達(dá)的最高水平是在來自由人胎兒骨骼肌得到的管狀肌的RNA試樣中觀察到的。將這些管狀肌培養(yǎng)，然后在RNA分離之前用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)純化以與成纖維細(xì)胞和其他非肌肉細(xì)胞分離(行8)。我們注意到在肌肉細(xì)胞Northern印跡上已鑒定出兩種不同的CNTF受體mRNA物種，并注意到1.7kb CNTF受體信息優(yōu)先在成肌細(xì)胞系C2C12mb(行1)中表達(dá)，這可能表示一種受體的交替連接形式。
9.2.CNTF防止與去神經(jīng)支配萎縮有關(guān)的肌肉重量和肌原纖維蛋白質(zhì)含量的損失
9.2.1.神經(jīng)切除外科手術(shù)用于這些研究的不同的動物組示于下面表Ⅳ中。通常一組中包含三只動物。對于所有實驗組，通過右后肢的中腿(midthigh)部位皮膚造成約20cm的最初切口。這一外科步驟后，在左后肢中腿部位也切20cm的切口以進行假手術(shù)。
在動物組2-6中，右后肢的比目魚肌肉通過在中腿部位處的外科手術(shù)去除坐骨神經(jīng)的2-5mm節(jié)片而進行去神經(jīng)，以分離32至35mm的遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)殘端(在圖8中用A標(biāo)記)。左側(cè)的比目魚肌肉作為對照，其中通過緩慢地將坐骨神經(jīng)拉離比目魚肌肉的神經(jīng)支配點32至35mm而在該肌肉上進行假手術(shù)。當(dāng)動物在輕度戊巴比妥麻醉(0.3g/Kg)下時，進行所有的外科手術(shù)。動物組1(對照)不作任何神經(jīng)切除術(shù)也不作任何注射。所有的動物體重均在100和150克之間。
9.2.2.處理組1和2中的動物不進行處理，組3中的動物用含有1mg/ml BSA(PBS/BSA)的磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)肌肉(IM)注射，每天一次，共注射4天。在動物兩側(cè)的中腿部位的肌肉都進行多次注射。組4中的動物用含有1mg/ml BSA(CNTF/BSA)的重組體大鼠CNTF(1mg/Kg)IM注射，每天一次，共4天。如上所述在動物的兩側(cè)都進行多次注射。組5中的動物也每天用rCNTF/BSA注射，但是通過皮下而不是IM注射。組6中的動物每天用PBS/BSA注射(SC)。
表Ⅳ組 ＃動物 外科手術(shù)方案 神經(jīng)切除術(shù)時間 處理1 3 無 96小時 無2 3 R-Den/L-Sham 96小時 無3 3 R-Den/L-Sham 96小時 PBS/BSA(1mg/ml)4 3 R-Den/L-Sham 96小時 CNTF/BSA(1mg/Kg)(IM)5 3 R-Den/L-Sham 96小時 CNTF/BSA(1mg/kg)(SC)6 3 R-Den/L-Sham 96小時 PBS/BSA(SC)R-Den＝右后肢切除神經(jīng)術(shù);L-Sham＝左后肢假手術(shù)9.2.3.肌肉重量和蛋白質(zhì)分析神經(jīng)切除外科手術(shù)進行96小時后，通過斷頭術(shù)將動物殺死，并將比目魚肌肉小心地由腱到腱切斷。將比目魚肌置于在冰上的稱重舟中，用解剖刀去除腱，然后立即將肌肉稱重以防止發(fā)生任何干燥。為制備肌原纖維蛋白勻漿，收集切斷的比目魚肌肉并在冷室中于冰上將其絞碎，然后在含有0.32M蔗糖和3mM MgCl2(2.5%w/v)的PBS中攪勻。將該勻漿以約800xg離心分離，依照廠商所推薦的使用Bio-Rad Dye Binding(染料結(jié)合)方法，對上清液測定每肌肉總的肌原纖維蛋白質(zhì)。
圖9表明去神經(jīng)支配的比目魚肌肉在96小時其凈重明顯降低(P＜0.01)約25%。每天的PBS/BSA注射對取決于去神經(jīng)支配的肌肉重量損失無作用。然而，取自每天用CNTF(1mg/Kg)/BSA注射的大鼠的去神經(jīng)比目魚肌的重量比其對側(cè)假手術(shù)對照物的重量低約5%。CNTF處理的去神經(jīng)的和假手術(shù)的比目魚肌肉的凈重量與未手術(shù)的對照物的重量沒有明顯的不同。當(dāng)每天注射(SC)共4天(組5)時，CNTF也表現(xiàn)出對肌原纖維蛋白質(zhì)的去神經(jīng)誘導(dǎo)的損失有明顯的防止作用，并且蛋白質(zhì)的損失與肌肉凈重的降低相當(dāng)(表Ⅴ)。
表ⅤCNTF對去神經(jīng)的比目魚肌蛋白質(zhì)含量的作用總的肌原纖維肌肉試樣 蛋白質(zhì)(mg/肌肉) %(假)組1-未去神經(jīng) 7.5組2-去神經(jīng)-未注射 5.8 80-假-未注射 7.2組3-去神經(jīng)+PBS(IM) 5.2 75-假-PBS(IM) 6.9組4-去神經(jīng)+CNTF(IM) 6.5 83-假+CNTF(IM) 7.8組5-去神經(jīng)+CNTF(SC) 6.6 93-假+CNTF(SC) 7.1組6-去神經(jīng)+PBS(SC) 5.3 67-假+PBS(SC) 7.9(IM)＝肌肉注射;(SC)＝皮下注射;表中數(shù)據(jù)代表收集3份比目魚肌的總蛋白質(zhì)含量當(dāng)每天IM注射時，觀察到CNTF對總的肌原纖維蛋白質(zhì)沒有顯著的作用。
我們發(fā)現(xiàn)CNTF受體在骨骼肌包括管狀肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞中表達(dá)，并且CNTF可防止與去神經(jīng)支配萎縮有關(guān)的肌肉重量和肌原纖維蛋白質(zhì)含量這兩者的損失。
10.微生物的保藏于1991年3月26日在The Agricultural Research Culture Collection(NRRL)(1815 North University Street，Peoria，Illi-nois，61604)進行了如下保藏。
載有質(zhì)粒pCMX-hCNTFR(Ⅰ2)的大腸桿菌，含有hCNTFR編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒，給定的保藏號為NRRL B-18789。
本文所引證的各種參考文獻、文獻所公開的內(nèi)容都全部與本申請結(jié)合并作為參考。
本發(fā)明并不限于所保藏的構(gòu)建或?qū)嵤├泄_的實施方案的范圍，這些都是為了說明本發(fā)明的幾個方面，任何功能相當(dāng)?shù)膶嵤┓桨付荚诒景l(fā)明的范圍之內(nèi)。另外，對本發(fā)明在此所示和描述的各種改變對于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員來講都是顯而易見的，并落在所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基本上純的編碼CNTF受體的核酸分子。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，該分子具有基本上如圖2中所繪出的核酸序列(SEQ ID No1)，或其至少為6個核苷酸長度的片段。
3.權(quán)利要求2的核酸分子是cDNA。
4.一種含有圖2中所繪出的核酸序列(SEQ ID No1)的至少6個核苷酸部分的基本純的核酸分子。
5.一種含有圖2中所繪出的核酸序列(SEQ ID No1)的至少6個核苷酸部分但帶有突變的基本上純的核酸分子。
6.一種含有具有基本上如圖2繪出的序列(SEQ ID No1)的第一種核酸分子的可雜交部分的基本上純的第二種核酸分子。
7.一種基本上純的核酸分子，該分子編碼具有基本上如圖2繪出的氨基酸序列(SEQ ID No2)的蛋白質(zhì)，或由至少6個氨基酸組成的其一部分或其衍生物。
8.一種含有權(quán)利要求1、2或7的核酸分子的生物。
9.權(quán)利要求8的生物是一種微生物。
10.權(quán)利要求9的微生物是一種細(xì)菌。
11.權(quán)利要求9的微生物是酵母。
12.權(quán)利要求8的生物是一種轉(zhuǎn)基因動物。
13.一種含有權(quán)利要求1、2或7的核酸分子的細(xì)胞。
14.一種含有權(quán)利要求1、2或7的核酸分子的永久的細(xì)胞系。
15.權(quán)利要求1、2或7的核酸分子還含有能控制基因表達(dá)的核酸序列。
16.一種基本上純的CNTF受體分子，該分子含有基本上如圖2中繪出的氨基酸序列(SEQ ID No2)，或由具至少6個氨基酸組成的一部分。
17.一種能識別權(quán)利要求16的CNTFR受體的單克隆抗體。
18.一種鑒定與CNTF結(jié)合的細(xì)胞的方法，包括通過該細(xì)胞測定CNTF受體的表達(dá)。
19.權(quán)利要求18的方法還包括通過將來自含有CNTF受體編碼RNA的懸浮細(xì)胞的試樣雜交到核酸探針上而測定CNTF受體-編碼RNA的存在，該探針含有圖2中繪出的序列(SEQ ID No1)的至少6個核苷酸部分。
20.權(quán)利要求18的方法，還包括通過(ⅰ)在可發(fā)生免疫特性結(jié)合的條件下將該細(xì)胞暴露在抗CNTF受體抗體中，然后(ⅱ)測定抗體與該細(xì)胞的結(jié)合來測定CNTF受體蛋白質(zhì)的存在。
21.一種篩選具有CNTF活性的藥用化合物的檢測系統(tǒng)，其中的CNTF包含含有重組體核酸分子的細(xì)胞，該核酸分子含有基本上如圖2中繪出的核酸序列(SEQ ID No1)或至少6個核苷酸長度的其片段。
22.一種篩選具有CNTF活性的藥用化合物的檢測系統(tǒng)，其中的CNTF含有表達(dá)重組體CNTF受體蛋白質(zhì)或其官能活性部分的細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的檢測系統(tǒng)，其中的重組體CNTF受體蛋白質(zhì)含有基本上如圖2中繪出的核酸序列(SEQ ID No2)或至少6個核苷酸長度的其片段。
24.一種研究CNTF生理學(xué)的實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)，其中的CNTF包含含有編碼CNTF受體的重組體核酸的細(xì)胞，并且與相同類型的不含編碼CNTF受體的重組體核酸的細(xì)胞相比，該細(xì)胞在其表面表達(dá)增加的CNTF受體數(shù)。
25.權(quán)利要求24的實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)是一種轉(zhuǎn)基因動物。
26.一種載有編碼與細(xì)胞表面無關(guān)的重組體CNTF受體的轉(zhuǎn)基因的非人體轉(zhuǎn)基因動物。
27.一種載有編碼在轉(zhuǎn)導(dǎo)對CNTF生物響應(yīng)中無作用的重組體CNTF受體的轉(zhuǎn)基因的非人體轉(zhuǎn)基因動物。
28.一種藥用組合物，含有CNTF受體蛋白質(zhì)、肽片段、或其衍生物;及可藥用的載體。
29.一種藥用組合物，含有具有氨基酸序列的蛋白質(zhì)及一種可藥用的載體，其中的氨基酸序列含有基本上如圖2所繪出的氨基酸序列(SEQ ID No2)或其6個氨基酸部分。
30.一種鑒定關(guān)于包括IL-6受體分子家系成員的CNTF受體分子的方法，包括(ⅰ)篩選用于雜交到CNTF受體一編碼核酸部分中的克隆的DNA庫;(ⅱ)分離和繁殖雜交到CNTF受體編碼核酸中的克隆;(ⅲ)測定在步驟(ⅱ)中分離和繁殖的克隆的核酸序列;以及(ⅳ)將步驟(ⅲ)測定的核酸序列與家系中已知成員的核酸序列相比較。
31.一種除CNTF外的基本上純的分子，該分子與CNTF爭奪結(jié)合在CNTF受體上。
32.一種含有已用致免疫量的CNTF受體免疫的動物的自免疫疾病模型系統(tǒng)。
33.一種基本上純的補充權(quán)利要求1核酸分子的第二種核酸分子。
34.一種基本上純的補充權(quán)利要求2核酸分子或片段的第二種核酸分子。
35.一種基本上純化的表達(dá)重組體CNTF受體蛋白質(zhì)或其官能活性部分的細(xì)胞組合物。
36.一種含有包含在質(zhì)粒pCMX-hCNTFR中的CNTF受體核酸序列的核酸，它已保藏在NRRL，具有的保藏號為B-18789。
全文摘要
本發(fā)明涉及睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子(CNTF)受體，并提供了CNTF受體核酸和氨基酸序列。還涉及(I)測定CNTF活性的檢測系統(tǒng)；(II)研究CNTF生理學(xué)作用的實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)；(III)鑒定CNTF相關(guān)的神經(jīng)病理狀態(tài)的診斷技術(shù)；(IV)治療CNTF相關(guān)的神經(jīng)和肌肉病理狀態(tài)的治療技術(shù)；以及(V)鑒定同源于CNTF和CNTFR的分子的方法。
文檔編號A61K38/00GK1061623SQ9110455
公開日1992年6月3日 申請日期1991年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1990年6月1日
發(fā)明者塞繆爾·戴維斯, 史蒂文·P·斯奎托, 馬克·E·弗思, 喬治·D·揚科普洛斯 申請人:里珍納龍藥品有限公司