專利名稱：表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的間充質(zhì)干細胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種間充質(zhì)干細胞及其制備方法，具體涉及骨髓、臍帶或臍血間充質(zhì) 干細胞的分離、培養(yǎng)和干細胞純化及外源性基因如神經(jīng)生長因子基因轉(zhuǎn)移入間充質(zhì)干細胞 的方法及其在細胞移植、干細胞培養(yǎng)、定向分化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干細胞是正常人體內(nèi)存在的細胞群體，具有高度自我復(fù)制和高度的分化能力。近 年來隨著干細胞研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)利用干細胞可再生各種組織器官，如肝臟、胰腺、神 經(jīng)組織、骨骼、肌腱等。因來源和分離的原因，現(xiàn)階段臨床應(yīng)用的干細胞主要有成人骨髓間充質(zhì)干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)禾口造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)、人外周血干細胞、人胚胎來源的干細胞和臍帶血造血干細胞及胎盤或臍帶間 充質(zhì)干細胞。按HSCs來源分為骨髓移植(BMT)、外周血造血干細胞移植(PBSCT)、臍帶血 干細胞移植、純化的CD34+細胞移植、胎肝HSCT。按免疫遺傳學(xué)分為異基因干細胞移植、 同基因干細胞移植、自體干細胞移植。研究表明，BMSCs (骨髓基質(zhì)來源干細胞)可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪 細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞和腱細胞等，是一種具有多向分化潛能干細胞，在體外易分離和擴 增，且便于細胞移植。此外，BMSCs獨特的增殖分裂模式使外源基因易于導(dǎo)入和表達，因此， BMSCs在組織工程、細胞治療和基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。干細胞領(lǐng)域研究最多和最清楚的仍是HSCs，它在基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究處干細胞的 最前沿，并不斷為其它干細胞研究提供理論和實踐的指導(dǎo)和依據(jù)。干細胞可分為長期亞群和短期亞群，長期亞群具有無限的自我更新能力，在個體 中持續(xù)終生，短期亞群自我更新能力有限，如短期HSCs的自我更新能力僅維持8周左右；根 據(jù)分化功能不同，干細胞分為全能性干細胞、多能性干細胞和單能性干細胞，個體形成中最 早的干細胞為全能性干細胞，包括受精卵及胚泡的內(nèi)細胞團。全能性干細胞進一步形成原 始的生殖干細胞及體干/祖細胞，并最終分化形成各種組織細胞。人類諸多疾病采用常規(guī)手段難以達到治療效果，基因治療是將人的正?；蚧蛴?治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入人體靶細胞以糾正基因的缺陷和發(fā)揮治療作用，從而達 到治療疾病目的。基因治療與常規(guī)治療方法不同，其針對的是疾病的根源_異常的基因本 身。基因治療分體細胞基因治療、生殖細胞基因治療和干細胞基因治療。自從1990年美國 國立衛(wèi)生研究院(NIH)和其下屬重組DNA顧問委員會(RAC)批準了美國第一例臨床基因治 療申請以來，基因治療已從單基因遺傳病擴展到多個病種范圍，主要有惡性腫瘤，心血管 疾病，遺傳病，AIDS，類風(fēng)濕等。理想的載體應(yīng)具組織專一性，甚至細胞專一性，使其用常規(guī)方法注射到體內(nèi)后即 可自動抵達目的細胞，并把要移植的基因整合到染色體上。由于用基因移植治療的細胞，必 須先從病人體內(nèi)取出進行人工培養(yǎng)后，再移植到病人體內(nèi)，因而基因治療難度很大，目前只有皮膚細胞和骨髓細胞可接受該處理，而且能做到的治療只是引入外源基因使其表達，以 補充缺失的或失去正常功能的酶，而不能做到用正常基因去替換突變基因。干細胞轉(zhuǎn)基因治療是繼基因治療的概念提出后，用于遺傳病治療的新手段。主要 通過自體細胞核移植得到的胚胎來獲取干細胞，然后進行基因糾正和定向分化，有望在遺 傳病的治療上獲得突破，并解決移植排斥問題。腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是由腦細胞產(chǎn)生、分泌的一種有著重要生物功 能的神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子。BDNF對中樞和外周的多種神經(jīng)細胞具有較為廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)作 用，如促進某些神經(jīng)群的生存和分化，調(diào)控神經(jīng)突軸的軔力，并與海馬的學(xué)習(xí)、記憶以及脊 髓疼痛機制有關(guān)等。BDNF除了其神經(jīng)生長作用之外，還有促進內(nèi)皮細胞生成和缺血組織新 生血管的生成，促進累及早老性癡呆的主要神經(jīng)元的功能恢復(fù)和成活。BDNF對多巴胺神經(jīng)元的生存和生長也有重要作用。它具有阻止凋亡細胞的死亡， 增加酪氨酸水解酶陽性神經(jīng)元的生存和神經(jīng)元纖維的生長。研究證明數(shù)種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾 病與此BDNF支持減少相關(guān)連。因此，BDNF作為一種強效神經(jīng)保護因子，被認為是治療某些 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個好的候選因子。膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)具有促進多巴胺能神經(jīng)元和運動神經(jīng)元 存活的作用，能減少腦缺血時遲發(fā)性神經(jīng)元的死亡和減輕腦缺血損傷后腦水腫和縮小梗死 體積。自從GDNF被克隆后，其對神經(jīng)損傷的保護作用已被眾多的研究所證實，外源性的 GDNF轉(zhuǎn)基因治療可改善腦缺血的癥狀和病理改變。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種可表達外源的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族基因的間充質(zhì)干 細胞(MSCs)及其制備方法，并提供了將該MSCs用于干細胞的體外培養(yǎng)、擴增和定向分化的 用途。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，年齡大(60周以上)的大鼠骨髓干細胞和老年人(大于 50歲以上)的骨髓干細胞，在體外擴增時，盡管有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)、內(nèi)皮生長因子(epithelial growth factor, EGF)和神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)存在的條件下，MSCs仍不能有效和活躍的擴增。因此，本發(fā)明用年輕 的胎大鼠MSCs作為MSCs培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細胞擴增大齡鼠的MSCs，取得了較滿意的結(jié)果。繼 而本發(fā)明提出了 MSCs和轉(zhuǎn)基因MSCs用于骨髓干細胞培養(yǎng)、擴增與分化的研究思路，旨在促 進大齡動物或老年人或體外難擴增的MSCs的體外擴增和定向分化。本發(fā)明從骨髓、臍帶和臍血中提取培養(yǎng)MSCs。為了使干細胞能表達外源基因，采用 重組腺相關(guān)病毒(recombinant Adeno-Associated Virus,rAAV)為載體將治療用基因-腦 細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因(人大腦來源)轉(zhuǎn)移入MSCs，從而實現(xiàn)MSCs和基因治 療相結(jié)合。本發(fā)明所述的一種表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的MSCs，是按以下步驟制備 的A)從骨髓、臍帶和臍血中提取、培養(yǎng)干細胞；因它們均具有MSCs的生物學(xué)特征， 在形態(tài)上呈均質(zhì)性，高表達⑶166、⑶54、⑶29，低表達⑶13、⑶34、⑶45，因此以下均稱為 MSCs ；
B)采用腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)為載體，將神經(jīng)營養(yǎng)因子家 族相關(guān)基因重組到AAV載體上；C)制備表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的AAV ；D)將上述表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的AAV顆粒感染分離、純化的干細胞， 得到表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的MSCs。所述步驟C中，所述的所述神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因包括膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營 養(yǎng)因子即⑶NF和腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子即BDNF。所述步驟A中，采用離心法分離骨髓干細胞和臍血干細胞，用免疫磁珠法純化 ⑶34+細胞。具體方法如下1、按臨床常規(guī)骨髓穿刺操作每次取得紅骨髓200ml或取自臍帶血庫的臍血 100ml。2、將骨髓血或臍血加入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕勻，常溫離心機中以1500r/ min進行離心15分鐘，棄上清，將沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕懸浮，細胞懸液按2 1 比例緩慢加入到比重為1. 089的干細胞分離液和淋巴細胞分離液中，20°C以2500r/min離 心10分鐘。3、離心管中液體分為四層，小心吸取富含有核細胞的中間細胞層，以PBS洗滌， 800r/min常溫離心4分鐘。細胞計數(shù)。胎盤藍染色，活細胞計數(shù)。瑞氏染色和有核細胞分 析。4、獲得單個核細胞懸液后進行CD34+細胞純化(MACS磁性分離試劑盒，購自 Miltenyi Biotech 公司，德國)。5、純化后的細胞懸液取樣計數(shù)，以PE標記的鼠抗人⑶34單克隆抗體(購自 Becton Dickinson公司，美國)標記細胞，流式細胞術(shù)測定⑶34+細胞純度。6、將純化后的⑶34陽性細胞用含10%小牛血清的DMEM/F12(Hyclone公司)培 養(yǎng)，內(nèi)含LIF 1.0IU/ml,CSF 1. 0ng/ml,bFGF 2ng/ml。培養(yǎng)24小時后進行轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作。所述步驟A中，采用膠原酶和胰酶消化法分離臍帶MSCs，具體方法如下1、將產(chǎn)后臍帶立即浸入4 °C罕氏平衡鹽溶液(Hanks ‘ Balanced Salt Solution(HBSS)(Gibco，14185-052，USA)中；2、75%乙醇消毒30秒，清除臍帶血管，間質(zhì)(Wharton' s膠)于試管中切成 0. 5cm3 大?。?、250g離心5分鐘，去上清，沉淀用0. 1M/L的PBS洗三次；4、250g離心5分鐘，沉淀用0. 1 %的膠原酶37°C消化18小時；5、洗滌，再用2. 5 %的胰酶37°C消化30分鐘；6、收集消化后游離的MSCs，用含10%小牛血清的DMEM/F12(Hycl0ne公司)培養(yǎng)， 內(nèi)含LIF 1.0IU/ml, CSF 1. 0ng/ml, bFGF 2ng/ml。培養(yǎng)24小時后進行轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作。所述步驟B中，包括以下步驟a)人神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因克隆及其N未端的構(gòu)建；b)含神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因表達盒的AAV載體的構(gòu)建。上述步驟a中，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因包括膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 即GDNF和/或腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子即BDNF。
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本發(fā)明經(jīng)動物腦內(nèi)移植實驗證實骨髓或臍血MSCs在體內(nèi)能分化形成神經(jīng)元或神 經(jīng)膠質(zhì)細胞，并且能穩(wěn)定表達⑶NF。本發(fā)明從人骨髓中提取純化骨髓MSCs的方法并不限于以上典型方法，也可用如 下方法物理方法如穿剌、引流等從骨髓中獲取骨髓血細胞。分離骨髓或臍血MSCs的方法可包括1、貼壁分離法。該法主要利用干細胞具有在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特性將干細 胞與其它細胞相分離。2、流式細胞分選法。該法是根據(jù)干細胞體積小、相對缺少顆粒和獨特的表面標志 等特性對其加以分離。3、免疫磁珠法。該法是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用包備有抗體的磁珠與干細胞表面的 一些特殊標志如CD34特異結(jié)合，通過一定強度磁場時被滯留而分選。4、密度梯度離心法。該法是根據(jù)干細胞與其它細胞的密度不同，實驗證明間質(zhì) 干細胞位于低密度細胞層。所采用的常用梯度分離液有Percoll和Ficoll，F(xiàn)icoll法或 Peroll法可有效地將造血干細胞從骨髓或臍血中分離出來，且純度較高，細胞存活好。本發(fā)明將外源基因轉(zhuǎn)入人骨髓或臍血MSCs的方法并不限于以上典型的AAV載體 的方法，也可用如下的方法1、電穿孔法；2、脂質(zhì)體法；3、鈣磷法；4、病毒載體法如皰疹病毒載體、巨細胞病毒 載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體(ADV)、腺相關(guān)病毒載體(AAV)等；5、非病 毒載體法如轉(zhuǎn)座子法(Transposon systems)、原核/真核表達載體等。本發(fā)明所轉(zhuǎn)入外源基因是與疾病發(fā)生、預(yù)防和治療相關(guān)的基因，例如生長因子基 因(表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板來源生長因子(PDGF)、腦源性 神經(jīng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)等)，營養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)與假性肥大性肌 營養(yǎng)不良基因，囊性纖維化與人CFTR基因，粘多糖病與0 -葡糖苷酸酶基因，鐮狀細胞性貧 血與血紅蛋白S基因，侏儒癥與生長激素基因和苯丙酮尿癥與苯丙氨酸羥化酶基因，白介 素IL1-28，干擾素和細胞趨化因子等基因，轉(zhuǎn)入病癥相關(guān)外源基因的骨髓或臍血MSCs可用 于轉(zhuǎn)入基因相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明將人源正常目的基因轉(zhuǎn)入骨髓或臍血MSCs，在骨髓或臍血MSCs內(nèi)表達、分 泌有治療功效目的基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)，而構(gòu)成的一種結(jié)合基因治療、達到對治療相關(guān)疾病治 療更有針對性、療效更顯著的骨髓或臍血MSCs。本發(fā)明將轉(zhuǎn)入神經(jīng)營養(yǎng)因子(如BDNF和⑶NF)基因的MSCs，用做飼養(yǎng)層細胞用于 某些特定個體(如老年動物、老年人、患萎縮性疾病(再障、腫瘤化療后和腦萎縮等)和體 質(zhì)差的患者)的骨髓干細胞或神經(jīng)干細胞培養(yǎng)擴增和維持未分化狀態(tài)。本發(fā)明將轉(zhuǎn)入神經(jīng)營養(yǎng)因子(如BDNF和⑶NF)基因的MSCs，同骨髓干細胞或神經(jīng) 干細胞共培養(yǎng)，以促進骨髓干細胞向神經(jīng)細胞方向定向分化，而神經(jīng)干細胞又可定向分化 成特定的神經(jīng)細胞如多巴胺能神經(jīng)元等。


圖1 用干細胞分離液分離和免疫磁珠法純化的的CD34+骨髓干細胞，干細胞特征 顯示為細胞小，核染色深，胞質(zhì)很少。
圖2 培養(yǎng)中的骨髓MSCs 經(jīng)過數(shù)代培養(yǎng)后，骨髓MSCs擴增明顯。圖3 綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的人骨髓MSCs及其表達應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將脂質(zhì) 體包被綠色熒光蛋白基因表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人骨髓MSCs，48小時后，用熒光倒置顯微鏡觀察綠 色熒光蛋白基因在人骨髓MSCs的表達，結(jié)果如箭頭所示人骨髓MSCs表達綠色熒光蛋白基 因，表達熒光強度達中度，轉(zhuǎn)染率達20%以上。圖4 人神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因cDNA片段(RT-PCR)產(chǎn)物.第一泳道為DNA分 子量標準；第二和第三泳道為該基因反向轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)產(chǎn)物。箭頭所指 為該基因cDNA片段在瓊脂糖電泳上的位置。圖5 重組人神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達。此圖為轉(zhuǎn)化細菌后的表達產(chǎn)物在 SDS-PAGE膠經(jīng)卡馬氏亮蘭染色后的結(jié)果。從左向右起，第一泳道為標準蛋白質(zhì)分子量標記 物；第二泳道為未誘導(dǎo)的細菌產(chǎn)物；第三和第四泳道為誘導(dǎo)的產(chǎn)物。箭頭所示為表達產(chǎn)物。圖6 該基因BDNF在表達產(chǎn)物的Western Blot分析結(jié)果。第一泳道為標準蛋白 質(zhì)分子量標記物；第二泳道為末誘導(dǎo)細菌產(chǎn)物；第三、第四和第五泳道分別為不同誘導(dǎo)時 間的產(chǎn)物。顯示表達產(chǎn)物為符合預(yù)期的BDNF基因產(chǎn)物。圖7 轉(zhuǎn)基因MSCs的上清能誘導(dǎo)PC12細胞的神經(jīng)元樣分化，細胞軸突生長明顯， 其末端膨大，并可與周圍神經(jīng)細胞形成連接。圖8 未轉(zhuǎn)基因的MSC細胞上清共培養(yǎng)的細胞也有小量的神經(jīng)突起形成，而對照組 的PC12細胞仍為單個園型或多角型細胞呈集落生長。圖9 共表達人源⑶NF和BDNF基因表達盒結(jié)構(gòu)圖從左到右，分別是pCMV啟動子、 3 -珠蛋白內(nèi)含子、人⑶NF、IRES、人BDNF和人生長激素多聚腺嘌呤組成。圖10 含共表達人源⑶NF和人源BDNF基因表達盒的重組AAV基因組結(jié)構(gòu)圖從 左到右，分別為反轉(zhuǎn)末端重復(fù)子(ITR)、共表達人源⑶NF和BDNF基因的表達盒和反轉(zhuǎn)末端 重復(fù)子(ITR)。圖11 轉(zhuǎn)BDNF基因的臍血MSCs與骨髓MSCs共培養(yǎng)，細胞呈現(xiàn)梭形、多角形、錐形 或星形，與神經(jīng)細胞類似，相互交織成網(wǎng)。
具體實施例方式實施例一骨髓MSCs分離培養(yǎng)和綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染人骨髓MSCs綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能在細 胞內(nèi)表達，且不需要其他外源底物參與的全新報告基因。本研究利用CMV-GFP基因轉(zhuǎn)染人 骨髓干細胞，觀察GFP在人骨髓干細胞內(nèi)的表達情況。一、材料1、設(shè)備超凈工作臺，水平離心機，倒置顯微鏡和普通顯微鏡。離心管和平衡天 平，骨髓穿剌針和采血袋。流式細胞儀，干燥箱，手套和手術(shù)衣。比重計(1.000-1. 100、 1. 100-1. 200)2、試劑泛影葡胺(Sigma公司)，羥甲基纖維素(Sigma公司)，氯化銫(Sigma公 司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為廣州化學(xué)試劑 廠)。3、細胞培養(yǎng)基含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。
4、淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)。5、CD34免疫磁珠試劑，購自premega公司。6、BD Procount progenitor Cell Enumeration Kit(BD公司，干細胞計數(shù)試劑盒， 批號N0. 340498)7、pGFP10II :3192kb，為含有野生型 GFP 基因 cDNA EcoR I 片段(包括 0RF 禾口 3' 端非編碼區(qū))的PBS質(zhì)粒(invitrogen公司)。二、方法1、干細胞分離液的制備稱取泛影葡胺3g、羥甲基纖維素2g、氯化銫0. 2g、聚蔗糖3g。將上述組分依次加 入100ml的量筒中，加O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液至100ml，即得干細胞分離液的濃縮液。用 比重計測得其比重為1. 123g/ml。使用時，將上述干細胞分離液的濃縮液用0. Olmol/L磷酸 鹽緩沖液稀釋至所需的比重，即為工作液。2、采集臨床志愿者髂骨內(nèi)骨髓按臨床常規(guī)骨髓穿刺操作每次取得紅骨髓200ml。將20ml骨髓加入到磷酸鹽緩沖 液(PBS)中輕勻，常溫離心機中以1500r/min進行離心15分鐘，棄上清，將沉淀物用磷酸鹽 緩沖液(PBS)輕輕懸浮，細胞懸液按2 1比例緩慢加入到比重為1.089的干細胞分離液 和淋巴細胞分離液中，20°C以2500r/min離心10分鐘。離心管中液體分為四層，小心吸取 富含有核細胞的中間細胞層，以PBS洗滌，800r/min常溫離心4分鐘。細胞計數(shù)。胎盤藍染 色，活細胞計數(shù)。瑞氏染色和有核細胞分析。3、用免疫磁珠法純化人骨髓干細胞CD34+造血干/祖細胞分離采用免疫磁珠法，從骨髓血中分離的單個核細胞，以 DMEM調(diào)整細胞濃度至107ml，洗滌后加磁珠標記的單抗，于10°C，孵育15min，過Mini MACS 細胞分離柱，脫離磁場，加壓洗脫結(jié)合的CD34陽性細胞即為純化的骨髓干細胞。4、免疫細胞化學(xué)和流式細胞檢測。試劑盒操作詳見說明書。將新鮮分離的細胞加入EppendofT管(106細胞/管)， 以1500rpm轉(zhuǎn)速離心5min，PBS洗1次，加入冷丙酮lml，4°C固定8min ；離心棄上清后加入 一抗(CD34、CD45)，混勻后37°C反應(yīng)45min，1500rpm轉(zhuǎn)速離心lOmin，PBS洗3次，離心棄上 清后加入帶二抗標記的IgG，混勻后37°C反應(yīng)30min，PBS洗滌兩次，離心后的沉淀物視量加 入PBS制備成細胞懸液，流式細胞儀進行檢測。5、人骨髓干細胞的培養(yǎng)與擴增取2 X 106ml-lCD34+細胞種入培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液含20 % FCS和LIF (lU/ml， GIBC0)、SCF(50ng/ml, GLBC0)、IL-3 (200U/ml，GLBC0)、GM-CSF (200U/ml，GIBC0) 37°C >5% C0240小時后半量換液，再培養(yǎng)48小時后分瓶培養(yǎng)擴增。以下所用細胞均為培養(yǎng)擴增的人 骨髓MSCs。6、進行pEGFP-Nl質(zhì)粒細胞轉(zhuǎn)染，用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。三、結(jié)果1、各種分離液所得細胞經(jīng)胎盤藍染色顯示，細胞存活率均達90%以上，均未顯示 對骨髓細胞有毒性作用。2、用瑞氏染色法鑒定，用干細胞分離液分離所得細胞主要為干細胞，細胞小，如紅細胞大小，核染色深，胞質(zhì)很少(圖1)。3、干細胞標志試劑盒和流式細胞儀鑒定骨髓干細胞干細胞標志試劑盒主要用于 鑒定骨髓造血干細胞，其中⑶34用于標志造血干細胞，⑶45用于標志淋巴細胞，PI主要用 于標志有核細胞。經(jīng)流式細胞儀測定，干細胞分離液所得細胞懸液中CD34、CD45和有核細 胞比例見表1。結(jié)果提示用1. 086比重的干細胞分離液所得的⑶34陽性細胞數(shù)比淋巴細 胞分離液所得的CD34+細胞數(shù)多12倍。表1，不同比重干細胞分離液分離豬骨髓細胞各種標志的細胞比例 4、用免疫磁珠法純化人骨髓干細胞，⑶34陽性細胞占96. 4%。5、分離的骨髓MSCs經(jīng)4-5代轉(zhuǎn)代后，細胞擴增明顯，大部分細胞呈梭型，同心園狀 分布，少量細胞呈小圓型(圖2)。6、用pEGFP-m質(zhì)粒進行骨髓MSCs轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細胞熒光強度為中度以上，綠色熒光 信號主要從胞體中發(fā)出(圖3)，轉(zhuǎn)染效果達20%以上。實施例二 人⑶NF和BDNF基因克隆及其N未端的構(gòu)建1、人⑶NF基因克隆及其N未端的構(gòu)建以人腦組織信息核糖核苷酸(mRNA)為模板，用Poly(T)引物在反向轉(zhuǎn)錄酶作用 下，合成人腦組織的互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)，然后以人腦組織cDNA作為模板，用人工 合成的，含有編碼人白細胞介素_2分泌先導(dǎo)多肽核苷酸和人成熟GDNF基因N-末端序列核 苷酸的正向引物和人GDNF基因C-末端序列核苷酸的反向引物進行PCR擴增，進行人GDNF 基因克隆及其N未端的改建，并在其N-末端引入內(nèi)切酶Nhel和Ndel位點，在其C_末端 引入內(nèi)切酶BamHI和Hindlll位點。弓丨物1C-末端部份序列與引物2N-末端部份序列相同 (見下劃線)；引物3C-末端含GDNF的C-末端序列。由于人白細胞介素_2分泌先導(dǎo)多肽核苷酸較長，故采用分步克隆法。即以人腦組 織cDNA作為模板，先用引物2和引物3進行第一次PCR反應(yīng)，再以此PCR產(chǎn)物為模板，用引 物1和引物3進行第二次PCR反應(yīng)。PCR引物設(shè)計如下引物 l(61mer):5，~gt |gctagccatatg| tacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt-3，引物 2(52mer)5' —actaagtcttgcacttgtcacaaacagttctgagaagaagcgccggggatca—lj，引物3(34mer)5， -tcaagcttggatcctcagatacatccacaccttt-3'
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)加尾(tailing)加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細菌后， 擴增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。測序正確后，構(gòu)建含人⑶NF基因原核細胞表達質(zhì)粒，進行表達和 westernblotting 檢測。2、人BDNF基因克隆及其N未端的構(gòu)建以人腦組織信息核糖核苷酸(mRNA)為模板，用Poly(T)引物在反向轉(zhuǎn)錄酶作用 下，合成人腦組織的互補脫氧核糖核苷酸(cDNA)。然后以人腦組織cDNA作為模板，用人工 合成的，含有編碼人白細胞介素_2分泌先導(dǎo)多肽核苷酸和人BDNF基因N-末端序列核苷酸 的正向引物和人BDNF基因C-末端序列核苷酸的反向引物進行PCR擴增，進行人BDNF基因 克隆及其N未端的改建。并在其N-末端引入內(nèi)切酶Ncol和Smal位點，在其C-末端引入 內(nèi)切酶Xbal和Hindlll位點。引物4C-末端部份序列與引物5N-末端部份序列相同(見 下劃線)；引物6C-末端含GDNF的N-末端序列。由于人白細胞介素-2分泌先導(dǎo)多肽核苷酸較長，故采用分步克隆法。即以人腦組 織cDNA作為模板，先用引物5和引物6進行第一次PCR反應(yīng)，再以此PCR產(chǎn)物為模板，用引 物4和引物6進行第二次PCR反應(yīng)。PCR引物設(shè)計如下弓丨物 4(63mer)5' —gtccatggcccgggatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt一3，弓丨物 5(55mer)5，_actaagtcttggcacttgtcacaaacagtcactctgaccctgcccgccgaggggag_3，弓丨物 6(41mer)5' -gcctctagaaagcttctatcttccccttttaatggtcaatg-3'PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)加尾(tailing)加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細菌后， 擴增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。測序正確后，構(gòu)建含人BDNF基因原核細胞表達質(zhì)粒，進行表達檢測。實施例三、共表達⑶NF和BDNF表達盒pAAV_MCS載體的構(gòu)建共表達⑶NF和BDNF表達盒pAAV_MCS載體的構(gòu)建方法(圖9，10)包括以下步驟1)應(yīng)用AAV helper-free表達系統(tǒng)中pAAV-MCS載體的多克隆位點，將⑶NF基 因以內(nèi)切酶BamHI和Xball核苷酸片段、經(jīng)純化、并與BamHI和Xball酶切消化、純化的 pAAV-MCS載體進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，進行擴增，并涂布在含適當抗生素的培養(yǎng) 皿上，37 °C培養(yǎng)箱過夜生長；2)篩選多個克隆菌落于含適當抗生素的培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，于第二天 抽取、純化pAAV-MCS質(zhì)粒DNA，并用BamHI和Xball酶切消化，以確定含有BamHI和Xball 的GDNF基因片段的pAAV-MCS載體的質(zhì)粒DNA和克隆菌株；3)確定含有⑶NF基因片段的pAAV-MCS之后，以內(nèi)切酶Hindlll和Bglll完全消 化含有⑶NF基因的pAAV-MCS質(zhì)粒DNA，1 %瓊脂糖分離、純化備用；4)為獲得IRES片段，用內(nèi)切酶Hindlll和Small完全消化pIRESneo3載體DNA， 瓊脂糖分離、純化IRES片段備用；5)用內(nèi)切酶Small和Bglll完全消化含有BDNF基因片段的T-easy載體DNA，1%
10瓊脂糖分離、純化BDNF基因片段備用；6)將上述內(nèi)切酶HindHI和Small消化的IRES片段和內(nèi)切酶Small和Bglll消 化的BDNF基因片段經(jīng)連結(jié)酶反應(yīng)，拼接到上述內(nèi)切酶Hindlll和Bglll完全消化的含⑶NF 基因的pAAV-MCS載體質(zhì)粒DNA上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，370C培養(yǎng)擴增，并涂布在含適當抗生素 的培養(yǎng)皿上，37°C培養(yǎng)箱過夜生長；7)篩選多個克隆菌落于含適當抗生素的培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，于第二天 抽取、純化pAAV-MCS質(zhì)粒DNA，并用上述內(nèi)切酶消化pAAV-MCS質(zhì)粒DNA，確定含⑶NF基因、 IRES片段和BDNF因的pAAV-⑶NF/IRES/BDNF質(zhì)粒；將此pAAV-⑶NF/IRES/BDNF表達質(zhì)粒 用脂質(zhì)體導(dǎo)入真核細胞，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法，觀察由CMV啟動子驅(qū)動共表達⑶NF和BDNF的 狀況。實施例四、⑶NF-AAV的表達⑶NF-AAV的表達，包括以下步驟1、在轉(zhuǎn)染前48小時，在加入10ml DMEM生長培養(yǎng)液的100毫米培養(yǎng)皿中接種約3 百萬個AAV-293細胞，2天后細胞密度應(yīng)為70-80% ；2、解凍含上述表達盒的 pAAV-MCS、pAAV-RCH 和 pHelper 質(zhì)粒 DNA，用 pH 7. 5 的 TE 緩沖液調(diào)整每種質(zhì)粒DNA為lmg/ml ；3、在15毫升培養(yǎng)管中從上述3種質(zhì)粒溶液中各取10微升DNA溶液，再加入1毫 升0.4M CaCl2，輕輕混勻；4、在另一支15毫升培養(yǎng)管中加入1毫升2x HBS溶液，再將上述3)中的1.03毫 升的DNA/CaCl2滴入1毫升2x HBS溶液中，倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)管多次，混勻；5、立即將DNA/CaCl2/HBS混懸液滴入AAV-293細胞培養(yǎng)皿中，并使其均勻分布在 培養(yǎng)液中；6、將AAV-293細胞培養(yǎng)皿放入37°C培養(yǎng)箱中6小時，隨后去除AAV-293細胞培養(yǎng) 皿中的培養(yǎng)液，加入10毫升新鮮DMEM生長培養(yǎng)液，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時；7、3天后觀察，如觀察到培養(yǎng)液顏色變化、或看到有細胞形態(tài)變園，脫離板面或漂 浮在培養(yǎng)液中，則表明有重組AAV病毒顆粒產(chǎn)生；8、此時收集細胞培養(yǎng)液、并收集細胞，通過4次凍/融法，裂解細胞，使其胞內(nèi)重組 AAV病毒釋放出來，最后在室溫下以10，OOOXg離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新管中，貯 存于_80°C冰箱保存。此即為表達人源GAD65和⑶NF基因的重組AAV母液，下一步可進行 病毒擴增、病毒滴定度檢測及GDNF基因表達產(chǎn)物的檢測。為了使骨髓或臍血MSCs能表達外源基因，發(fā)明人采用AAV為載體，以CMV為啟動 子，將⑶NF基因轉(zhuǎn)移入骨髓或臍血MSCs。rAAV載體由AAV-293細胞哺育生產(chǎn)，AAV載體病 毒的純化采用兩次氯化銫離心法。1X106細胞/ml的濃度加入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)6-12小時后，換新的培養(yǎng)液。⑶NF 在培養(yǎng)上清中的表達用抗GDNF單克隆抗體進行ELASA測定。實施例五、腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs的制備1、材料1. 1 主要試劑:Trizol Reagent, LipofectamineTM2000 (美國 Invitrogen 公司)。 逆轉(zhuǎn)錄酶DNA合成試劑盒(美國Fermentas公司)。T4DNA連接酶(美國MBI公司)。PCR
11Kit(Qiagen公司)；BamHI和Xho I限制性內(nèi)切酶(Promega公司)；引物合成、核苷酸序列 測定(Qiagen公司)；Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen公司)；原位-半乳糖苷酶染色 試劑盒(Stratagene公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)；喜 樹堿(Sigma公司)。1. 2病毒載體、細胞株及菌種pAAV系列質(zhì)粒及AAV-293、AAV-HT1080細胞 (Stratagene公司)，DH5宿主菌由本室制備保存。2、方法2. lpAAV-BDNF重組AAV載體的構(gòu)建從胎腦組織中提取總RNA，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及01igo_dT引物合成第一條cDNA 鏈，然后在PCR管中加入ExTaqTM;利用PCR法擴增BDNF目的基因，上游引物為5’ -GCTCTAGAGCCACCATGACCATCCTTTTCCTTACTATG-3’，其中TCTAGA為Xbal I識別位點，下游引物為5，-GCGGTACCCTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAAT-3，。上、下游引物經(jīng)5’端修飾分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和Xhol位點。擴增產(chǎn)物 經(jīng)BamHI和Xhol酶切后定向克隆入pAAV_MCS載體多克隆位點。重組質(zhì)粒pAAV_BDNF經(jīng)雙 酶切鑒定正確后，進行DNA測序。2. 2 重組 AAV (AAV-BDNF)的包裝采用Qiagen試劑盒大量提取超純質(zhì)粒pAAV-BDNF、pHelper和pAAV-RC質(zhì)粒，分別 測定0D值，并用TE溶液調(diào)整質(zhì)粒濃度為lg/L。DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)AAV-293，細胞融合至 70% 80%時，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將pAAV-BDNF質(zhì)粒與AAV包裝質(zhì)粒pAAV_RC、AAV輔助質(zhì)粒 pHelper三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，構(gòu)建帶有BDNF全長0RF的重組AAV-BDNF。pAAV-LacZ 作為報告基因同pAAV-BDNF —樣共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞。轉(zhuǎn)染后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后換新 鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)66 72h后回收病毒。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。2. 3病毒顆粒的收集用細胞刮子將細胞懸浮，收集細胞懸液，進行4輪冷凍(液氮)_復(fù)溫(37°C水浴) 循環(huán)，每次冷凍、復(fù)溫均lOmin。10, OOOr/min離心lOmin收集上清液-初級病毒液，于_80°C保存。2. 4重組pAAV-BDNF病毒滴度檢測培養(yǎng)AAV-HT1080細胞，以每孔3X 105個接種12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜，使細胞達到 80%融合。每孔加入0. 2mL AAV容納培養(yǎng)基(使培養(yǎng)基中喜樹堿終濃度達0. 8 y mol/L)，混 勻后培養(yǎng)4h。吸出培養(yǎng)基，病毒原液稀釋100倍后，再進行體積為2. 5mL的5倍系列稀釋， 稀釋度從2 X 10_3到8X 10_5。取0. 5mL分別加入3個培養(yǎng)孔，同時以無病毒原液作為陰性 滴度對照。培養(yǎng)2h，每孔再加入0. 5mLDMEM,培養(yǎng)48h，棄上清，使用Stratagene公司的原 位日-半乳糖苷酶染色試劑盒對細胞進行固定和染色，在細胞密度適當?shù)呐囵B(yǎng)孔中計數(shù)藍 染的細胞，計算每mL貯存物中病毒顆粒(染色細胞數(shù))。2. 5BDNF基因重組的pAAV的純化及其體外表達目的基因的檢測用病毒接種于大約10瓶75cm2培養(yǎng)瓶的HT1080細胞，待出現(xiàn)細胞病變時如上收 集病毒，用CsCl密度梯度離心法純化pAAV，_70°C保存?zhèn)溆?。將純化的pAAV的轉(zhuǎn)染HT1080 細胞，取其培養(yǎng)基配制電泳樣品，用未接種的同時傳代的HT1080細胞培養(yǎng)基配制樣品做為陰性對照，分別取第1天，第2天，第3天的培養(yǎng)基用于樣品制備，蛋白電泳及Western blot 法檢測BDNF基因在HT1080細胞中的表達，其中在We stern blot過程中使用羊抗大BDNF多 克隆抗體(1 1000)與PVDF(聚偏氟乙稀)膜上的BDNF蛋白質(zhì)進行結(jié)合。2. 6BDNF-pAAV 轉(zhuǎn)染大鼠骨髓MSCs和體外細胞培養(yǎng)活性測定大鼠骨髓基質(zhì)細胞(MSCs)的分離、原代和傳代培養(yǎng)在無菌條件下取出大鼠股骨 和脛骨。剪掉骨頭兩端，露出骨髓腔，用無血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，反復(fù)2次或3次， 以lOOOr/min離心5min。離心后棄上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞， 接種于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)24h后換液，后每3d全量換液1次，細胞基本鋪滿瓶壁后，以胰酶消 化傳代。在MSCs培養(yǎng)基中加入適量病毒液。37°C CO2孵箱中孵育，培養(yǎng)3，10天，取培養(yǎng)上 清，進行BDNF的Western blot檢測和對PC12細胞(源于大鼠腎上腺髓質(zhì)瘤/嗜鉻細胞瘤， 是一種單胺能細胞株)的神經(jīng)營養(yǎng)活性測定。以未轉(zhuǎn)染BDNF-pAAV的MSCs培養(yǎng)上清做陰 性對照。3、結(jié)果3. 1 重組 pAAV-BDNF 的鑒定體積分數(shù)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳顯示約860bp處有擴增條帶，片段大小與預(yù)期值 一致(圖4)。重組質(zhì)粒pAAV-BDNF經(jīng)雙酶切后，電泳顯示出現(xiàn)大小為4. 6kb和861bp的載 體片段和目的基因片段，結(jié)果與預(yù)期相符(圖4)。重組質(zhì)粒pAAV-BDNF測序亦證實插入片 段BDNF與Genbank序列完全一致，全長編碼區(qū)無堿基突變。3. 2三種載體共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞及病毒粗提物的制備3種載體共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞6h后，顯微鏡下觀察到培養(yǎng)基底部出現(xiàn)無數(shù)小黑色 顆粒，細胞無明顯變化。24h后觀察到AAV-293細胞部分變圓，隨著病毒增殖，細胞成串浮 起，出現(xiàn)細胞病理效應(yīng)；48h后細胞逐漸從壁上脫落；而陰性對照組細胞則貼壁完整，無明 顯形態(tài)變化。3. 3病毒滴度測定不同稀釋度的AAV-LacZ病毒感染AAV-HT1080細胞后，細胞經(jīng)固定及X_gal染色 后，在顯微鏡下可明顯觀察到藍染的細胞。在藍染細胞密度合適的細胞孔中記數(shù)全部的藍 染細胞數(shù)，計算重組病毒的滴度約為l.OXliTpfu。3. 4蛋白電泳及Western blot檢測結(jié)果(圖5，6)對照組3、10dMSCs培養(yǎng)基均未見明顯特異性條帶，而實驗組，轉(zhuǎn)染后3、10d取其培 養(yǎng)基進行檢測，可見BDNF的表達逐漸增強，并較對照組有顯著性增強，圖中的黑色條帶即 為檢測到的BDNF蛋白(圖5，6)。3. 5對PC12細胞的神經(jīng)營養(yǎng)活性轉(zhuǎn)基因MSCs的上清能誘導(dǎo)PC12細胞的神經(jīng)元樣分化，細胞軸突生長明顯，其末端 膨大，并可與周圍神經(jīng)細胞形成連接(圖7)。未轉(zhuǎn)基因的MSC細胞上清共培養(yǎng)的細胞也有 小量的神經(jīng)突起形成，而對照組的PC12細胞仍為單個園型或多角型細胞呈集落生長(圖 8)。實施例六、腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs對腦缺血性動物模 型的腦損傷保護作用
一、材料與方法1、BDNF轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs按實施例二所述方法由本室自制。2、實驗動物與分組健康Wistar大鼠80只(購自中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，體重180g 220g。大鼠腦缺血再灌流模型的建立，根據(jù)Honma等(Honma T,Honmou 0，Iihoshi S, et al. Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat. Exp Neurol, 2006，199 =56-66.)的方法，大鼠麻醉后取頸正中切口，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈，于頸總動 脈分叉下方剪一切口，將一末端用酒精燈燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動脈17-18mm，結(jié)扎頸 內(nèi)動脈。2小時后拔線，實現(xiàn)再灌注。腦缺血再灌注后1天進行神經(jīng)缺損評分，方法為6級 評分法0級，無功能障礙；1級，不能伸展左側(cè)前肢；2級，向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3級，向左側(cè)傾倒；4 級，無自主活動伴意識障礙；5級，死亡。評分2 3級者為模型制備成功，進入本實驗。假 手術(shù)組除不插尼龍線外，其余步驟同手術(shù)組。實驗分4組假手術(shù)組(8只)、缺血對照組(8只)、MSCs組(8只)、轉(zhuǎn)基因MSCs 組(8只)。3、大鼠骨髓MSCs的分離、原代和傳代培養(yǎng)在無菌條件下取出大鼠股骨和脛 骨。剪掉骨頭兩端，露出骨髓腔，用無血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，反復(fù)2次或3次，以 1000r/min離心5min。離心后棄上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，接 種于培養(yǎng)瓶中。24h后換液，后每3d全量換液1次，細胞基本鋪滿瓶壁后，以胰酶消化傳代。4、大鼠MSCs轉(zhuǎn)基因在MSCs細胞培養(yǎng)基中加入適量病毒液。37°C CO2孵箱中孵 育10天，經(jīng)Western blot檢測能表達BDNF。5、尾靜脈注射MSCs 腦缺血再灌注24小時后，將ImL轉(zhuǎn)基因MSCs (1 X IO6個細胞 /ml)經(jīng)尾靜脈注射入轉(zhuǎn)基因MSCs組大鼠體內(nèi)，將未進行轉(zhuǎn)基因MSCs (1 X IO6個細胞/ml) 經(jīng)尾靜脈注入MSCs組大鼠體內(nèi)，缺血對照組和假手術(shù)組大鼠體內(nèi)分別注入ImL生理鹽水。6、功能評估大鼠模型制備前后每3天均采用Combs和D' Alecy(Combs DJ, D' Alecy L G. Motor performance in rat s exposed to severe forebrain ischemia effect of fasting and 1，3-butanediol. Stroke，1987，18 :503_511.)的方法進行網(wǎng)屏測 驗、平衡木測驗、抓握牽引測驗，觀察大鼠在行為學(xué)方面的差異。每項試驗進行兩次，取較高 的分數(shù)值作為大鼠的該項得分。7、各組大鼠于MSCs治療后28天以4%多聚甲醛灌注取腦。取腦組織冠狀面均勻 切2mm厚腦片，2% TTC染色，數(shù)碼相機拍照，以圖像處理軟件測量梗死面積，計算梗死面積 與損傷側(cè)腦半球的面積比。8、統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13. O統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標準差(χ士s)表 示。采用方差分析或t檢驗進行組間比較，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。二、結(jié)果1、神經(jīng)功能評分MSCs組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)較缺血對照組明顯提前，MSCs治療后 第4天即出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能改善，MSCs治療21天以后與缺血對照組比較無顯著差異。 而轉(zhuǎn)基因MSCs組在治療后第4天大鼠神經(jīng)功能評分即與MSCs組、對照組比較均有顯著 差異(ρ <0.01)，至治療后21天效果更加明顯(ρ <0.001)，到28天時仍有顯著差異(ρ < 0. 01)。
2、腦梗死面積比較MSCs治療后28天，腦組織TTC染色顯示，梗死區(qū)與損傷側(cè)腦 半球面積比值與缺血對照組比較無顯著差異(p>0. 05)，而轉(zhuǎn)基因MSCs組腦梗死區(qū)面積明 顯縮小，梗死區(qū)與損傷側(cè)腦半球面積比值與缺血對照組比較有顯著差異(P < 0. 05)。三、結(jié)論 轉(zhuǎn)BDNF基因MSCs對大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷有明顯的治療作用，效果優(yōu) 于單用MSCs。實施例七、共表達神經(jīng)營養(yǎng)因子⑶NF和BDNF基因的自體骨髓MSCs的構(gòu)建構(gòu)建 本發(fā)明的共表達神經(jīng)營養(yǎng)因子⑶NF和BDNF的轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs，首先克隆人⑶NF和BDNF 基因，構(gòu)建共表達人⑶NF和BDNF基因的重組AAV ；用此重組AAV轉(zhuǎn)染人自體骨髓MSCs， 完成共表達GDNF和BDNF的轉(zhuǎn)基因修飾自體骨髓MSCs的構(gòu)建。本發(fā)明采用的AAV系統(tǒng)為 Stratagene 公司的 AAV helper-free 系統(tǒng)。1、人⑶NF和人BDNF基因克隆及其N未端的構(gòu)建(見實施例二 )；2、含共表達⑶NF和BDNF表達盒的pAAV_MCS載體的構(gòu)建(見實施例三)；3、共表達⑶NF和BDNF的AAV的制備，具體操作過程如下1)在轉(zhuǎn)染前48小時，在加入IOml DMEM生長培養(yǎng)液的100毫米培養(yǎng)皿中接種約3 百萬個AAV-293細胞，2天后細胞密度應(yīng)為70-80% ；2)解凍含上述表達盒的 pAAV-MCS、pAAV-RCH 和 pHelper 質(zhì)粒 DNA，用 pH 7.5 的 TE 緩沖液調(diào)整每種質(zhì)粒DNA為lmg/ml ；3)在15毫升培養(yǎng)管中從上述3種質(zhì)粒溶液中各取10微升DNA溶液，再加入1毫 升0.4M CaCl2，輕輕混勻；4)在另一支15毫升培養(yǎng)管中加入1毫升2x HBS溶液，再將上述3)中的1.03毫 升的DNA/CaCl2滴入1毫升2x HBS溶液中，倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)管多次，混勻；5)立即將DNA/CaCl2/HBS混懸液滴入AAV-293細胞培養(yǎng)皿中，并使其均勻分布在 培養(yǎng)液中；6)將AAV-293細胞培養(yǎng)皿放入37°C培養(yǎng)箱中6小時，隨后去除AAV-293細胞培養(yǎng) 皿中的培養(yǎng)液，加入10毫升新鮮DMEM生長培養(yǎng)液，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時；7)3天后觀察，如觀察到培養(yǎng)液顏色變化、或看到有細胞形態(tài)變園，脫離板面或漂 浮在培養(yǎng)液中，則表明有重組AAV病毒顆粒產(chǎn)生；8)此時收集細胞培養(yǎng)液、并收集細胞，通過4次凍/融法，裂解細胞，使其胞內(nèi)重組 AAV病毒釋放出來，最后在室溫下以10，OOOg離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新管中，貯 存于_80°C冰箱保存。此即為表達人源GAD65、BDNF和⑶NF基因的重組AAV母液，下一步 可進行病毒擴增、病毒滴定度檢測及GDNF和BDNF基因表達產(chǎn)物的檢測。4、骨髓MSCs的分離和培養(yǎng)(參見實施例一)；5、轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs的構(gòu)建在75cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)約3 5百萬個MSCs，將4毫升含約5百萬個pAAV_GDNF/ BDNF重組AAV顆粒轉(zhuǎn)染骨髓MSCs約4小時，然后加入適量的骨髓MSCs培養(yǎng)液，置37°C二 氧化碳培養(yǎng)箱過夜。6、共表達⑶NF和BDNF的轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs的鑒定待轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs培養(yǎng)24 48小時后，收集部分培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs和培養(yǎng)上清液，進行PT-PCR反應(yīng)和western blotting反應(yīng)，確定轉(zhuǎn)基因的骨髓MSCs是否共表 達GDNF和BDNF及其表達水平。7、共表達⑶NF和BDNF的轉(zhuǎn)基因骨髓MSCs的應(yīng)用應(yīng)用外科神經(jīng)核定位技術(shù)及微管輸送系統(tǒng)，將共表達⑶NF和BDNF的轉(zhuǎn)基因骨髓 干細胞定點移植至中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)部位，觀察對中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，如腦血管疾病、 腦缺氧和腦外傷導(dǎo)致的腦功能損傷以及早老性癡呆疾??；以及移植至中樞神經(jīng)核如絞狀 體、豆狀核和黑質(zhì)等，觀察對中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病帕金森氏病的治療效應(yīng)。實施例八、轉(zhuǎn)BDNF基因臍血MSCs對體外培養(yǎng)人骨髓MSCs增殖的影響。一、材料與方法
1、主要試劑見實施例一和實施例五。2、臍血間充質(zhì)干細胞(umbilical cord blood-derived MSCs, UBMSCs)的分離培 養(yǎng)(參見實施例一)，細胞培養(yǎng)擴增至3 X IO6左右進行凍存，共三管，每管1 X IO6左右。3、轉(zhuǎn) BDNF 基因的 UBMSCs (transgene UBMSCs, TUBMSCs)的制備在 UMSCs 細胞培 養(yǎng)基中加入適量轉(zhuǎn)BDNF基因的AAV病毒液，37°C 5% CO2中孵育2天，經(jīng)Western blot檢 測能表達BDNF。細胞培養(yǎng)擴增至3 X IO6左右進行凍存，共三管，每管IXlO6左右。4、人骨髓單個核細胞的制備53歲成人，參照實施例一的方法制備骨髓單個核細 胞，細胞總數(shù)為2. BXlO805、UBMSCs和TUBMSCs作為飼養(yǎng)層細胞的制備收集第3代的UBMSCs和TUBMSCs，分 別加入絲裂霉素C (浙江海正藥業(yè)，國藥準字H33020786，100 μ g/ml，用DMEM培養(yǎng)基配制) 處理lh，用DMEM培養(yǎng)液洗滌4次，用骨髓MSCs培養(yǎng)基稀釋成0. 5 X 105/ml細胞濃度待用。6、分組試驗1)對照組成人骨髓單個核細胞，用骨髓MSCs培養(yǎng)基稀釋成IX 106/ml加入24孔 板中，每孔0. 5ml，每組4孔。2)UBMSCs飼養(yǎng)層細胞對照組(對照U)絲裂霉素處理后的UBMSCs，0. 25X 105/ml 細胞濃度加入以24孔板內(nèi)，每孔0. 5ml，每組4孔。3) TUBMSCs飼養(yǎng)層細胞對照組(對照T)絲裂霉素處理后的TUBMSCs，0. 25 X IO5/ ml細胞濃度加入以24孔板內(nèi)，每孔0. 5ml，每組4孔。4) UBMSCs飼養(yǎng)層細胞+成人骨髓單個核細胞培養(yǎng)實驗組(實驗U)用骨髓MSCs 培養(yǎng)基調(diào)整細胞終濃度為絲裂霉素處理后的UMSCs，0. 25XlOVml細胞濃度；骨髓小單核 細胞，1 X106/ml細胞濃度；加入24孔板中，每孔0. 5ml，每組4孔。5) TUBMSCs飼養(yǎng)層細胞+成人骨髓單個核細胞培養(yǎng)實驗組(實驗T)用骨髓MSCs 培養(yǎng)基調(diào)整細胞終濃度為絲裂霉素處理后的TUBMSCs，0. 25XlOVml細胞濃度；骨髓小單 核細胞，1 XlO6Ail細胞濃度；加入24孔板中，每孔0. 5ml，每組4孔。7、上述細胞于培養(yǎng)后第三天第一次全部換液，以后每二天換液一半，維持二周，其 間在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待有細胞生長到融合時用胰酶消化和進行細胞計 數(shù)。8、統(tǒng)計學(xué)處理采用t檢驗和分組方差分析，ρ <0.01顯示有顯著性差異。二、結(jié)果1、形態(tài)學(xué)觀察
對照組第一次細胞培養(yǎng)換液后，可見少量細胞貼壁生長，細胞形態(tài)呈多樣性，可 見少量梭形細胞生長。培養(yǎng)二周后梭形細胞呈增多趨勢。對照U組和對照T組細胞形態(tài)相似，第一次細胞換液后，細胞呈梭形，排列有一定 方向性，細胞生長密度約為30%，10天后細胞密度未見明顯增加。實驗U組在第一次換液后細胞呈梭形生長，至第8天細胞多呈長梭形，排列有方 向性，呈螺旋狀生長，至第10天細胞密度已達約70-80%。實驗T組在第一次換液后細胞呈梭形生長，至第8天細胞多呈長梭形，排列有方 向性，呈螺旋狀生長，至第10天細胞密度已達約90-95%。2、細胞計數(shù)，各組細胞計數(shù)結(jié)果見表2。表2，各組細胞培養(yǎng)至第10天時的計數(shù)結(jié)果(X士SD，η = 4) 結(jié)果提示用臍血MSCs做飼養(yǎng)層細胞，可使細胞擴增數(shù)量增加約6倍((實驗U組 細胞數(shù)_飼養(yǎng)層細胞數(shù))/對照細胞數(shù)=5. 6)；而用轉(zhuǎn)基因臍血MSCs做飼養(yǎng)層細胞，可使 細胞擴增數(shù)增加10倍((實驗T組細胞數(shù)-飼養(yǎng)層細胞數(shù))/對照細胞數(shù)=10. 0)。三、結(jié)論用臍血MSCs做飼養(yǎng)細胞，可明顯促進老年人骨髓MSCs的生長和擴增；而用轉(zhuǎn) BDNF基因的臍血MSCs做飼養(yǎng)細胞，骨髓MSCs擴增更明顯。實施例九轉(zhuǎn)BDNF基因臍血MSCs對體外培養(yǎng)人骨髓MSCs增殖和定向分化的影 響。發(fā)明人在利用轉(zhuǎn)BDNF基因臍血MSCs促進體外培養(yǎng)人骨髓MSCs增殖時研究發(fā)現(xiàn)， 部分骨髓MSCs出現(xiàn)多突起的改變，狀似神經(jīng)細胞。為此，發(fā)明人進行了轉(zhuǎn)BDNF基因臍血 MSCs促進體外培養(yǎng)人骨髓MSCs向神經(jīng)細胞分化的實驗研究。一、材料和方法1、轉(zhuǎn)BDNF基因的UMSCs (transgene UMSCs, TUMSCs)和人骨髓單個核細胞的制備 見實施例五。2,TUMSCs和人骨髓單個核細胞共培養(yǎng)。取終濃度TUMSCs細胞，0. 25X 105/ml ；骨 髓小單核細胞，IX 106/ml細胞濃度，25cm2的培養(yǎng)瓶，用骨髓MSCs培養(yǎng)基(見實施例一)每 瓶5ml進行培養(yǎng)。
3、每3-4天換液1次。待貼壁細胞達80% -90%融合時，以0. 125%胰酶消化，按1 3比例傳代。
4、待細胞出現(xiàn)明顯的多突起時，以1 X IOVcm2接種于預(yù)鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板 中制備細胞爬片，以人MSCs為分化對照，同時制備細胞爬片。每孔加入含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液2ml，達80%融合時終止培養(yǎng)。5、以免疫細胞化學(xué)方法檢測神經(jīng)細胞表面標志物NSE的表達。人MSCs和混合培養(yǎng) MSCs細胞爬片，用4%多聚甲醛室溫下固定30min，0. 2% TritonX-IOOPBS滲透細胞5min， 0. 3%過氧化氫室溫下封閉30min，羊血清封閉30min。加NSE多克隆抗體(1 400稀釋 度)，4°C孵育12h過夜。加入生物素標記的二抗，室溫下孵育30min，加入鏈酶親和素-過 氧化物酶復(fù)合物(SABC)，37°C孵育60min。DAB顯色，中性樹脂封固，光學(xué)顯微鏡觀察。二、結(jié)果1、細胞接種36h后可見少量細胞貼壁，呈梭形，類似成纖維細胞，成集落樣生長， 以后逐漸增多。培養(yǎng)1周左右，細胞形態(tài)開始變化，可見較多指狀突起細胞。培養(yǎng)至12天 時，細胞融合成片。將混合細胞傳代培養(yǎng)于載玻片上，五天后部分細胞呈現(xiàn)梭形、多角形、錐 形或星形，似神經(jīng)細胞，相互接成網(wǎng)(見圖11)。2、細胞表面標志物的變化載玻片上混合培養(yǎng)的MSCs與單純骨髓MSCs比較，細胞 NSE染色明顯增強。三、結(jié)論骨髓MSCs具有向神經(jīng)細胞分化的能力，轉(zhuǎn)BDNF基因的臍血MSCs能促進MSCs向 神經(jīng)細胞方向定向分化。實施例十、轉(zhuǎn)⑶NF基因臍帶MSCs對體外培養(yǎng)人骨髓MSCs增殖的影響。MTT比色法(噻唑藍法)主要用于檢測細胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的活力，它可反映細 胞的增殖活力和細胞數(shù)量。本實驗用MTT法檢測轉(zhuǎn)GDNF基因臍帶MSCs對體外培養(yǎng)人骨髓 MSCs增殖的影響。一、材料與方法1、主要試劑見實施例一和實施例五。2、臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord MSCs, UMSCs)的分離培養(yǎng)(參見實施例 一)，細胞培養(yǎng)擴增至3 X IO6左右進行凍存，共三管，每管1 X IO6左右。3、轉(zhuǎn) GDNF 基因的 UMSCs(transgene UMSCs, TUMSCs)的制備在 UMSCs 細胞培養(yǎng)基 中加入適量轉(zhuǎn)⑶NF基因的AAV病毒液，37°C 5% CO2中孵育2天，經(jīng)Western blot檢測能 表達⑶NF。細胞培養(yǎng)擴增至3-4X106左右進行凍存，共三管，每管IXlO6左右。4、人骨髓單個核細胞的制備53歲成人，參照實施例一的方法制備骨髓單個核細 胞，細胞總數(shù)為2. BXlO805、UMSCs和TUMSCs作為飼養(yǎng)層細胞的制備收集第3代的UMSCs和TUMSCs，分別 加入絲裂霉素C (浙江海正藥業(yè)，國藥準字H33020786，100 μ g/ml，用DMEM培養(yǎng)基配制)處 理lh，用DMEM培養(yǎng)液洗滌4次，用骨髓MSCs培養(yǎng)基稀釋成0. 5 X 105/ml細胞濃度待用。6、分組試驗1)對照組成人骨髓單個核細胞，用骨髓MSCs培養(yǎng)基稀釋成1 X 106/ml加入96孔 板中，每孔0. 1ml，每組8孔。2)UMSCs飼養(yǎng)層細胞對照組(對照U)絲裂霉素處理后的UMSCs，0. 25X 105/ml細胞濃度加入以96孔板內(nèi)，每孔0. lml，每組8孔。3) TUMSCs飼養(yǎng)層細胞對照組(對照T)絲裂霉素處理后的TUMSCs，0. 25X 105/ml 細胞濃度加入以96孔板內(nèi)，每孔0. 1ml，每組8孔。4) UMSCs飼養(yǎng)層細胞+成人骨髓單個核細胞培養(yǎng)實驗組(實驗U)用骨髓MSCs培 養(yǎng) 基調(diào)整細胞終濃度為絲裂霉素處理后的UMSCs，0. 25 XlOVml細胞濃度；骨髓小單核細 胞，1 X106/ml細胞濃度；加入96孔板中，每孔0. 1ml，每組8孔。5) TUMSCs飼養(yǎng)層細胞+成人骨髓單個核細胞培養(yǎng)實驗組(實驗T)用骨髓MSCs 培養(yǎng)基調(diào)整細胞終濃度為絲裂霉素處理后的TUMSCs，0. 25XlOVml細胞濃度；骨髓小單 核細胞，1 XlO6Ail細胞濃度；加入96孔板中，每孔0. 1ml，每組8孔。7、上述細胞于培養(yǎng)后第三天第一次全部換液，以后隔天換液一半，第三次 換液后 48 小時，每孔加入 5mg/ml 噻唑藍(3-(4，5)-dimethylthiahiazo (_z-yl)-3， 5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)PBS 液 20ulo繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加lOOOulDMSO，振蕩 10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。MK3型酶標儀(Thermo公司，美國)測定570nm波長附近的吸光度，計算光密度值 (OD)。8、統(tǒng)計學(xué)處理采用t檢驗和分組方差分析，ρ <0.01顯示有顯著性差異。二、結(jié)果各組細胞光密度值測量結(jié)果見表3。表3.轉(zhuǎn)⑶NF基因UMSCs對人MSCs生長的影響(0D值，X士 sd，η = 8) *，同對照組比較，ρ < 0. 05 ；#，同對照組比較，ρ < 0.01 ；+，同實驗U組比較，ρ < 0. 01 ；三、結(jié)論用臍帶MSCs做飼養(yǎng)細胞，可明顯促進老年人骨髓MSCs的生長；而用轉(zhuǎn)⑶NF基因 的臍帶MSCs做飼養(yǎng)細胞，骨髓MSCs生長更明顯。序列表(SEQUENCELISTING)<110>廣州和竺生物科技有限公司<120>表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的間充質(zhì)干細胞及其應(yīng)用<130><160>6
<170>PatentIn version 3. 4
<210>1<211 >61<212>DNA<213>人工合成<400>1gtgctagcca tatgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt cttgcacttg 60t61<210>2<211>52<212>DNA<213>人工合成<400>2actaagtctt gcacttgtca caaacagttc tgagaagaag cgccggggat ca52<210>3<211>34<212>DNA<213>人工合成<400>3tcaagcttgg atcctcagat acatccacac cttt34<210>4<211>64<212>DNA<213>人工合成<400>4gtccatggcc cgggatgtac aggatgcaac tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac 60ttgt64<210>5<211>55<212>DNA<213>人工合成<400>5actaagtctt gcacttgtca caaacagtca ctctgaccct gcccgccgag gggag55<210>6<211>41<212>DNA<213>人工合成<400>6gcctctagaa agcttctatc ttcccctttt aatggtcaat g4權(quán)利要求
一種能表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的間充質(zhì)干細胞，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞是按以下步驟制備的A)從骨髓、臍帶或臍血中提取干細胞；B)采用腺相關(guān)病毒或者其它病毒載體或非病毒載體為載體，將神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因重組到AAV載體上；C)制備表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的AAV；D)將上述AAV顆粒感染分離、純化的間充質(zhì)干細胞，得到表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的間充質(zhì)干細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細胞，其特征在于所述間充質(zhì)干細胞的提取分離 方法采用密度遞度離心法、免疫吸附法、流式細胞分篩法和細胞貼壁生長法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細胞，其特征在于所述步驟B中，所述的其它病毒 載體或非病毒載體包括腺病毒載體、皰疹病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等現(xiàn)行常用病毒載體 或非病毒載體如轉(zhuǎn)座子、原核或真核表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細胞，其特征在于所述步驟C中，所述的所述神經(jīng) 營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因包括膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子即GDNF和腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因 子即BDNF。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細胞，其特征在于所述步驟B中，包括以下步驟a)神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的克隆及其N未端的構(gòu)建；b)含神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因表達盒的AAV載體的構(gòu)建。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間充質(zhì)干細胞，其特征在于所述步驟a中，所述神經(jīng)營養(yǎng)因 子家族相關(guān)基因包括膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子即GDNF和/或腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 即 BDNF。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間充質(zhì)干細胞，其特征在于所述步驟b中，所述神經(jīng)營養(yǎng) 因子家族相關(guān)基因包括膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子即GDNF和腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子即 BDNF,所構(gòu)建的AAV載體為pAAV-MCS載體。
8.如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細胞用于促進骨髓干細胞或神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)擴增 的飼養(yǎng)層細胞的用途。
9.如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細胞用于促進骨髓干細胞或神經(jīng)干細胞的定向分化 的飼養(yǎng)層細胞的用途。
10.如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細胞用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦血管疾病、運 動神經(jīng)元病和脊髓損傷等的藥物制劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種骨髓、臍帶或臍血間充質(zhì)干細胞及其在細胞移植、干細胞培養(yǎng)、擴增與定向分化領(lǐng)域的用途。本發(fā)明所述的表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的間充質(zhì)干細胞，該間充質(zhì)干細胞是按以下步驟制備的從骨髓、臍帶或臍血中提取間充質(zhì)干細胞；采用腺相關(guān)病毒(AAV)為載體，將神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因重組到AAV載體上；制備表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的AAV；將上述AAV顆粒感染分離、純化的間充質(zhì)干細胞，得到表達神經(jīng)營養(yǎng)因子家族相關(guān)基因的間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明將其作為飼養(yǎng)層細胞為干細胞培養(yǎng)、擴增和定向分化提供人工可控的微環(huán)境，促進干細胞增殖和定向分化，以達到為人類疾病提供一種新的治療手段。
文檔編號A61K35/28GK101857854SQ20091003858
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者李遠友, 王尚武, 鄒清雁, 陳文明 申請人:廣州和竺生物科技有限公司