腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子bdnf標(biāo)本的染色化學(xué)檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本的染色化學(xué)檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]一般的，結(jié)腸慢傳輸型便秘(slowtransitconstipat1n，STC)是以結(jié)腸傳輸無力導(dǎo)致大便駐留時(shí)間延長為特點(diǎn)的頑固性便秘。有研究證實(shí)STC的發(fā)病與腸神經(jīng)系統(tǒng)病變有關(guān)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的一員，在神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)可塑性方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，BDNF在腸神經(jīng)系統(tǒng)、腸黏膜上皮和腸肌層均有表達(dá)。Lommatzseh，等通過原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠整個(gè)腸道內(nèi)環(huán)肌和腸上皮組織BDNFmRNA有陽性表達(dá)。Boesmans等取膝鼠的回腸組織，在其肌間神經(jīng)叢及粘膜下神經(jīng)叢檢測到有大量BDNF與其受體TrkB的表達(dá)，腸上皮組織亦有明顯的BDNF表達(dá)。BDNF能促進(jìn)神經(jīng)元間連通結(jié)構(gòu)的形成，在突觸的成熟及可塑性過程中發(fā)揮重要作用，并在腸神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)及胃腸道感覺、動(dòng)力調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。然而，BDNF是否參與STC患者排便障礙的發(fā)生，且引起STC患者腸黏膜神經(jīng)纖維可塑性改變的研究少見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本的染色化學(xué)檢測方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下方式實(shí)現(xiàn)的，該腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本的染色化學(xué)檢測方法包括:
(一)標(biāo)本HE染色步驟:
(1)脫蠟與水化:腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本干燥后的切片用二甲苯脫蠟，再逐級(jí)經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水；
(2)蘇木精液染色60s;
(3)流水洗去蘇木精液1s;
(4)1%鹽酸乙醇洗3s;
(5)水洗2s;
(6)促藍(lán)液返藍(lán)洗10s;
(7)流水沖洗30s;
(8)伊紅染色60s;
(9)蒸餾水洗2s;
(10)80%乙醇洗 2s;
(11)95%乙醇洗 2s;
(12)無水乙醇洗2s;
(13)石炭酸二甲苯洗3s; (14)二甲苯洗3s;
(15)二甲苯洗3s;
(16沖性樹膠封固，封片時(shí)每片載玻片滴加I?2滴明膠，將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現(xiàn)氣泡；
(二)標(biāo)本染色后化學(xué)法檢測步驟:
a.石蠟切片脫臘及水化
al.脫蠟:將染色后切片放入染色筐中，二甲苯1、Π、ΙΠ中各放置15min進(jìn)行完全脫臘；a2.水化:切片放入100%酒精1、Π中各1min后，于95%酒精水化5min—90%酒精水化5min—80%酒精水化5min—70%酒精水化5min—蒸餾水浸洗1min;
b.抗原修復(fù):將a步驟切片插入250ml、濃度為0.0 Imo I/L、pH值為6.0的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中，用微波高檔加溫緩沖至96°C15 min，注意避免煮沸，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗；
c.清除內(nèi)源性過氧化物酶活性:用0.3% H2O2甲醇溶液孵育20分鐘，放入60%酒精5min，放入蒸饋水5min，PBS緩沖液洗5min ；
d.封閉:用于二抗來源動(dòng)物相同的正常山羊血清封閉60分鐘；
e.一抗孵育:加入兔抗人TOG9.5抗體，300倍稀釋，陰性對(duì)照滴加I3BS，4°C孵育過夜；
f.二抗孵育:加二抗前用PBS對(duì)切片漂洗三次，每次5min，把未結(jié)合的一抗完全洗掉;加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，二抗按1:2000稀釋，室溫孵育30分鐘，后用PBS洗滌5minX 3次；
g.加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素液，孵育30分鐘;PBS洗滌洗5min X 3次；
h.DAB顯色:先以少量PBS或Tris-HCl緩沖液溶解DAB，然后再加入余量緩沖液，在顯色前加入30% H2O2,將洗滌后的切片浸入顯色液中5-10-20min，閉光下反應(yīng)，并隨時(shí)在顯微鏡下觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)部分為棕色時(shí)終止反應(yīng)，在自來水洗滌切片1min;
1.細(xì)胞核復(fù)染:將切片放入蘇木素中做核復(fù)染20s?Imin，經(jīng)酒精-HCl分化后，放入自來水中繼續(xù)分化細(xì)胞核；
j.封片:經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%1、100% Π酒精脫水各2min，二甲苯1、Π分別透明5min后，用樹膠封片。
[0005]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所產(chǎn)生的有益效果是:
該腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本的染色化學(xué)檢測方法有利于探討STC患者腸黏膜BDNF的表達(dá)改變及與排便障礙的相關(guān)性，并觀察STC患者腸黏膜神經(jīng)纖維密度和超微結(jié)構(gòu)的異常。
[0006]該腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本的染色化學(xué)檢測方法設(shè)計(jì)合理、、安全可靠、操作方便，具有很好的推廣使用價(jià)值。
【附圖說明】
[0007]附圖1為一正常對(duì)照的腸粘膜活檢組織圖片，可見腸粘膜上皮細(xì)胞排列整齊，大腸腺排列及杯狀細(xì)胞正常，固有層中肌纖維及神經(jīng)叢分布均勻，在粘膜下層可見淋巴小結(jié)分布。(HE染色，X200)。
[0008]附圖2為一便秘患者的腸粘膜活檢組織圖片，腸粘膜大腸腺分布稀疏，杯狀細(xì)胞收縮，固有層中可見炎癥細(xì)胞分布，腸粘膜上皮細(xì)胞未見明顯異常。(HE染色，X 200)。
[0009]附圖3為一黑便病患者的腸粘膜活檢組織圖片，腸粘膜大腸腺分布稀疏，杯狀細(xì)胞收縮，腸粘膜上皮細(xì)胞未見明顯異常。(HE染色，X 200)。
[0010]附圖4為一正常對(duì)照的腸粘膜活檢組織PGP9.5免疫染色圖片，在腸腺固有層及粘膜下層中PGP9.5陽性表達(dá)明顯，表達(dá)區(qū)域廣泛。(免疫染色，X200)。
[0011]附圖5為一便秘患者腸粘膜活檢組織PGP9.5免疫染色圖片，在腸腺固有層中PGP9.5有陽性表達(dá)，表達(dá)區(qū)域尚廣泛，但在粘膜下層陽性表達(dá)較少。(免疫染色，X 200)。
[0012]附圖6為一便秘患者腸粘膜活檢組織PGP9.5免疫染色圖片，在腸腺固有層中PGP9.5陽性表達(dá)呈零星分布，染色強(qiáng)度呈弱陽性表達(dá)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞陽性表達(dá)染色下降。(免疫染色，X 200)。
[0013]附圖7是PGP9.5在便秘患者及正常對(duì)照人群腸粘膜中的表達(dá)及相關(guān)性。
[0014]附圖8是腸黏膜神經(jīng)纖維外周超微結(jié)構(gòu)。
[0015]附圖9是腸黏膜神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本的染色化學(xué)檢測方法作以下詳細(xì)說明。
[0017]如附圖所示，本發(fā)明的腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本的染色化學(xué)檢測方法，該方法包括:
(一)標(biāo)本HE染色步驟:
(1)脫蠟與水化:腸黏膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF標(biāo)本干燥后的切片用二甲苯脫蠟，再逐級(jí)經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水；
(2)蘇木精液染色60s;
(3)流水洗去蘇木精液1s;
(4)1%鹽酸乙醇洗3s;
(5)水洗2s;
(6)促藍(lán)液返藍(lán)洗10s;
(7)流水沖洗30s;
(8)伊紅染色60s;
(9)蒸餾水洗2s;
(10)80%乙醇洗 2s;
(11)95%乙醇洗 2s;
(12)無水乙醇洗2s;
(13)石炭酸二甲苯洗3s;
(14)二甲苯洗3s;
(15)二甲苯洗3s;
(16沖性樹膠封固，封片時(shí)每片載玻片滴加I?2滴明膠，將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現(xiàn)氣泡；
染色結(jié)果評(píng)定:細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色；
(二)標(biāo)本染色后化學(xué)法檢測步驟:
a.石蠟切片脫臘及水化
al.脫蠟:將染色后切片放入染色筐中，二甲苯1、Π、ΙΠ中各放置15min進(jìn)行完全脫臘；
a2.水化:切片放入100%酒精1、Π中各1min后，于95%酒精水化5min—90%酒精水化5min—80%酒精水化5min—70%酒精水化5min—蒸餾水浸洗1min;
b.抗原修復(fù):將a步驟切片插入250ml、濃度為0.0 Imo I/L、pH值為6.0的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中，用微波高檔加溫緩沖至96°C15 min，注意避免煮沸，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗；
c.清除內(nèi)源性過氧化物酶活性:用0.3% H2O2甲醇溶液孵育20分鐘，放入60%酒精5min，放入蒸饋水5min，PBS緩沖液洗5min ；
d.封閉:用于二抗來源動(dòng)物相同的正常山羊血清封閉60分鐘；
e.—抗孵育:加入兔抗人H)G9.5抗體(Rabbitanti_PGP9.5，bs_3806R, B1ss C0.,LTD)，300倍稀釋，陰性對(duì)照滴加PBS，4°C孵育過夜；
f.二抗孵育:加二抗前用PBS對(duì)切片漂洗三次，每次5min，把未結(jié)合的一抗完全洗掉;加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，二抗按1:2000稀釋，室溫孵育30分鐘，后用PBS洗滌5minX 3次；
g.加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素液，孵育30分鐘;PBS洗滌洗5min X 3次；
h.DAB顯色:先以少量PBS或Tris-HCl緩沖液溶解DAB，然后再加入余量緩沖液，在顯色前加入30% H2O2,將洗滌后的切片浸入顯色液中5-10-20min，閉光下反應(yīng)，并隨時(shí)在顯微鏡下觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)部分為棕色時(shí)終止反應(yīng)，在自來水洗滌切片1min;
1.細(xì)胞核復(fù)染:將切片放入蘇木素中做核復(fù)染20s?Imin，經(jīng)酒精-HCl分化后，放入自來水中繼續(xù)分化細(xì)胞核；
j.封片:經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%1、100% Π酒精脫水各2min，二甲苯1、Π分別透明5min后，用樹膠封片。
[0018]結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):
1.PGP9.5:是一種由2450個(gè)堿基組成，包含212個(gè)氨基酸的神經(jīng)元特異性羧基末端水解酶，在腸神經(jīng)系統(tǒng)中PGP9.5有良好的表達(dá)功能，可顯示陽性神經(jīng)元形態(tài)，特征性地評(píng)價(jià)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能。腸神經(jīng)系統(tǒng)主要分為肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢，神經(jīng)叢內(nèi)的肽能神經(jīng)元是一種以多肽為神經(jīng)遞質(zhì)的特殊神經(jīng)元，眾多神經(jīng)遞質(zhì)參與其中，對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)控起著主要作用。腸神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)與腸動(dòng)力是直接相關(guān)的，通過對(duì)其標(biāo)志物表達(dá)的檢測可反映其功能狀態(tài)。PGP9.5是一分泌性細(xì)胞因子，在正常人腸粘膜及粘膜下的神經(jīng)元及神經(jīng)叢中分布豐富，而在腸運(yùn)動(dòng)功能障礙患者尤其是慢性傳輸性便秘患者腸粘膜及粘膜下層表達(dá)減少。
[0019]2.參考雙評(píng)分半定量法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，在Leica DM4000B型顯微鏡400倍高倍鏡下根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比例進(jìn)行判定:陽性細(xì)胞區(qū)域分4級(jí)，陽性率〈10 %為I級(jí)計(jì)I分，10 % -49 %為2級(jí)計(jì)2分，50 % -79 %為3級(jí)計(jì)3分，>80 %為4級(jí)計(jì)4分。染色強(qiáng)度按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分:無陽性為O分，弱陽性為I分，中度陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分。兩種評(píng)分相加，0-1分為陰性(一)，2分為弱陽性(+)，3_4分為陽性(++)，5_6分為強(qiáng)陽性(+++)。
[0020]3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS法統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，檢測結(jié)果以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0021]結(jié)論:
BDNF參與STC患者結(jié)腸傳輸?shù)陌l(fā)生，且引起ST