專利名稱：由對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起的感染的治療方法及其組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有至少兩個組分的組合物，這兩個組分在體內(nèi)以協(xié)同的形式作用，并且在治療由對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起的感染中是有效的。本發(fā)明進(jìn)一步包含了通過使用有效劑量的這種組合物來治療被感染的病人的方法，以及在體外活性補(bǔ)體存在下根據(jù)抗菌活性篩選組合物的方法。
在危重病人中，細(xì)菌感染仍是病人死亡的主要原因，基本上是死于革蘭氏陰性菌感染(Klatersky et al.，1988，Eur J.Cancer Clinical Oncology，2451535-545)。這些病人身上發(fā)生感染后，進(jìn)展迅速，并且常常是致命的。
接受化學(xué)治療的病人常常有一個低水平的粒性白細(xì)胞數(shù)，即出現(xiàn)粒性白細(xì)胞減少癥，并特別容易遭受細(xì)菌感染(Klatersky，1986，Am.J.Med，80∶2-12)。感染這些病人的最常見的微生物是革蘭氏陰性桿狀菌如大腸桿菌，銅綠色假單孢菌，肺炎克氏桿菌和革蘭氏陽性球菌如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
其它的對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都敏感的病人多是那些經(jīng)受胃腸道的外科手術(shù)(Bergamini and Polk，1989，J.Antimicrobial Chemotherapy 23∶301-303)的，可是其它外科手術(shù)的病人也有這種感染的危險，當(dāng)前，抗生素對這些病人是唯一有效的療法。
2.1 β-內(nèi)酰胺抗生素在這些病人的治療中已證明有效其它抗菌素是β-內(nèi)酰胺抗生素，它能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。β-內(nèi)酰胺抗生素的一般性質(zhì)是它們能殺死多種不同的細(xì)菌。這是一個重要的特征，因為經(jīng)常實(shí)際上不能確定是哪種細(xì)菌引起的疾病。另外，抗生素治療大多數(shù)常常在對傳染微生物作出診斷之前就開始了，因為在這些病人發(fā)生的細(xì)菌感染常常能很快使病人致死。β-內(nèi)酰胺抗生素的例子包含青霉素類，頭孢菌素類，頭霉素類，單菌霉素類，pirazidons，penems，carbapenems。已經(jīng)觀察到低濃度的青霉素類可誘導(dǎo)大腸桿菌鞭毛生成，而膨脹和細(xì)胞溶解則發(fā)生在有較高的抗生素濃度的情況下(參見Waxman and Strominger，1983，Annual Rev.Biochem.52∶825～869)。也已經(jīng)表明β-內(nèi)酰胺抗生素的靶目標(biāo)是肽葡聚糖轉(zhuǎn)肽酶，并證明了細(xì)菌細(xì)胞膜上的許多與青霉素及相關(guān)β-內(nèi)酰胺抗生素共價結(jié)合之蛋白質(zhì)的多重性。
青霉素G可有效地抑制革蘭氏陽性球菌如肺炎球菌和鏈球菌，以及革蘭氏陰性球菌如腦膜炎奈氏球菌(Neu，1987，Medical Clinics of North America 71∶1051-1064)。起初，氨基青霉素類如氨芐青霉素和羥氨芐青霉素被廣泛地用于治療由流感嗜血桿菌(H.influenzae)，大腸桿菌(E.coli)，沙門氏菌和志賀氏菌引起的感染。然而已經(jīng)觀察到，在這些微生物中質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶越來越普遍存在。已表明頭孢菌素有抗銅綠假單孢菌，由常見病原體引起的腦膜炎和由多抗性微生物引起的感染的活性，盡管對這些藥劑的抗性也在增加。另一類β-內(nèi)酰胺抗生素包括羧芐青霉素類，例如imipenem，它能抑制好氧的和厭氧的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。已注意到carbapenems對與青霉素結(jié)合的蛋白質(zhì)有高度的親合力。
鑒于對β-內(nèi)酰胺抗生素抗性的不斷增加，故也已給這些病人聯(lián)合使用多種抗生素。已將氨基青霉素類與Clavulanate聯(lián)合使用，后者是一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，用以抑制存在于流感嗜血桿菌，大腸桿菌，沙門氏菌和志賀氏菌中的質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶(Neu，1987，Medical Clinics of North America 71∶1051-1064)。β-內(nèi)酰胺類也可與氨基糖苷類結(jié)合使用(Klastersky，1986，Am，J.Med.80∶2-13)已發(fā)現(xiàn)這樣的一個結(jié)合物是頗為有效的，其效果隨這種聯(lián)合用藥所對抗細(xì)菌類型而異。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺與其它抗生素合用可導(dǎo)致兩個化合物之間的拮抗作用。
有越來越多的報導(dǎo)表明，抗生素能夠以除所期望的殺菌作用之外的方式影響細(xì)菌(Darveau et al.，1990，J.Infect.Dis.162∶914-921，Essig et al.，1982，Arch.Microbiol.132∶245-250;Kadurugamuwa et al.，1988，Antimicrob.Agents and Chemother.32∶364-368;Leying et al.，1986，Antimicrob.Agents and Chemother.30∶475-480;Raponi et al.，1989，Antimicro.Chemother.23∶565-576;Sauerbaum et al.，1987，Antimicrob.Agents and Chemother.31∶1106-1110;Taylor et al.，1981，Antimicrob.Agents and Chemother.19∶786-788;Taylor et al.，1982，Drugs Exptl.Clin.Res.8∶625-631 and Veringa et al.，1988，Drugs Exptl.Clin.Res.14∶1-8)。
這些效果的某些例子包含抑制外源酶產(chǎn)生(Grimwood et al.，1989，Antimicrob.Agents and Chemother.33∶41-47)，改變肽葡聚糖結(jié)構(gòu)(Garcia-Bustos and Dougherty，1987，Antimicrob.Agents and Chemother.31∶178-182)，及失去侵染性粘附特征(Schifferli and Beachey，1988，Antimicrob.Agents and Chemother.32∶1603-1608 and Vosbeck et al.1979，Rev.Inf.Dis.1∶845-851)。通常當(dāng)細(xì)菌與低于最小抑制濃度(MIC)的抗生素一起培養(yǎng)時，即可觀察到這些效果?？股氐膩喴种茲舛鹊男Ч梢詭椭拗飨麥缂?xì)菌。這特別與β-內(nèi)酰胺抗生素相關(guān)，已知抗生素的殺菌作用需花費(fèi)相當(dāng)長時間才能顯示出來。
通常在整個治療中，抗生素的給藥劑量要超過MIC水平。然而，由于宿主和細(xì)菌兩個因素，如β-內(nèi)酰胺酶能夠影響感染部位 的活性抗菌素的量，因此，超最小抑制濃度(MIC)劑量對每種微生物達(dá)到足夠的抗菌濃度不能保證。
2.2 陽離子寡肽已從人和動物來源中分離出來多種有抗菌能力的陽離子寡肽。這些包含magainin(Zasloff et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.845449-5453;Zasloff et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85910-913;and Zasloff，1989，U.S.Patent No.4，810，777);Cecropins(Christensen et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855072-5076and Stein et al.，1981，Nature(London)292246-248);肌毒素(sarcotoxins)(Nakajima et al.，1987，J.Biol.Chem.2621665-1669and Okada and Natori，1985，Biochem.J.229453-458);和defensins(Selsted et al.，1985，J.Clin.Investig.761436-1439 and Lehrer et al.，U.S.Patent Nos.4，543，252;4，659，692and 4，705，777)。
Magainins是從爪蟾(Xemerus Laevis，一種南非有爪蟾蜍)皮膚的分泌物中發(fā)現(xiàn)的。已分離了兩種類型的magainins，即magainin 1和magainin 2(Zasloff et al.，1987，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.845449-5453)。Magainin 1和magainin 2兩者很相近，每個都是23個氨基酸長，所不同的只是兩個氨基酸的取代。這些肽是水溶性的，在其有效殺菌濃度是非溶血性的，并且可能是兩親性的。已經(jīng)發(fā)明在無血清培養(yǎng)基和緩沖液中magainin活性所需的有效殺菌濃度與magainin和被處理的微生物呈函數(shù)關(guān)系。
也已研究各種合成的magainin類似物的殺菌活性(Cuervo et al.，1988，Peptide Research 8181-86;Zasloff et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85910-913;and Chen et al.，1988，Antimicrobial Peptides and Proces for Making the Same，PAT-APPL-7-280，363National Technical Information Service)。發(fā)現(xiàn)除去magainin 2 之N-末端的三個氨基并不影響殺菌活性(Zasloff at al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85910-913)。但除去第四個氨基酸卻明顯地降低殺菌活性。已發(fā)現(xiàn)magainin 1中的整個N-末端區(qū)是必不可少的(Cuervo et al.，1988，Peptide Researeh 181-86)。然而，冊除C末端區(qū)，特別是殘基丙氨酸-15，甘氨酸-18或谷氨酸-19而又具有與原始magainin 1或magainin 2相關(guān)之等同的或提高之殺菌活性的類似物，即具有可變的溶血作用(Cuervo et.al.，1988，Peptide Research 181-86)。已發(fā)現(xiàn)其中有低螺旋結(jié)構(gòu)形式傾向的氨基酸殘基被有高螺旋結(jié)構(gòu)形式傾向的氨基酸殘基取代了的magainin肽類似物，降低了對肽鏈端解酶的敏感性，并增強(qiáng)兩親性結(jié)構(gòu)特征及抗菌性質(zhì)(Chen et al.，1988，Antimicrobial Peptides and Processes for Making the Same，PAT-APPL-7-280，363National Technical Information Service)。
已經(jīng)從昆蟲中分離出來兩類陽離子寡肽，即Cecropins和肌毒素類。已經(jīng)從不同種昆蟲中分離出Cecropins(Christensen et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855072-5076 and Stein et al.，1981，Nature(London)292246-248)。已經(jīng)分離出三個主要的Cecropins，即分別有37、36和36個殘基，各有一個兩親性特性的Cecropin A、B和D。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)N-末端區(qū)對于導(dǎo)致這種肽的膜破裂能力是必須的。已發(fā)現(xiàn)三種肌毒素是在戟形麻繩(Sarcophaga Peregrina)的血淋巴中被誘導(dǎo)的。
也已從人來源分離出被稱為防御素的有殺菌活性的陽離子寡肽(Selsted et al.，1985，J.Clin.Investig.761436-1439 and Lehrer et al.，U.S.Patent Nos.4，543，252;4，659，692and 4，705，777)。發(fā)現(xiàn)這類肽在巨噬細(xì)胞和粒性白細(xì)胞中，并具有高半胱氨酸和精氨酸的含量。已鑒定了六種這樣的蛋白質(zhì)。
也已顯示線粒體蛋白質(zhì)前體的肽片段有抗革蘭氏陽性菌的活性(Lee el.al.，1986，Biochem，Biophys Acta 862211～219)。在磷脂脂質(zhì)體存在下，這些肽的CD譜表明，殺菌活性通常與α螺旋的兩親性含量有平行關(guān)系。
迄今所檢驗的抗微生物陽離子寡肽均展示某些共同的特征?；旧希ㄟ^常規(guī)體外分析確定他們是能殺死各種不同細(xì)菌的陽離子肽。一些明顯的證據(jù)表明，其作用機(jī)制是通過插入到細(xì)菌內(nèi)膜形成一個小孔，以允許小離子通過(Christensen et al.，1988，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.855072-5076;Nakajima et al.，1987，J.Biol.Chem.2621665-1669;Okada and Natori，1985，Biochem.J.229453-458;and Westerhoff et al.，1989，Biochem.Biophys.Acta.975361-369)。
這種離子載體活性通過抑制對氧化磷酸化作用必不可少的質(zhì)子梯度形成來阻斷ATP的產(chǎn)生(Okada and Natori，1985，Biochem，J.229453-458;and Westerhoff et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.866597-6601)。
按照這一作用機(jī)制，已顯示有幾種這樣的肽在有機(jī)溶劑中具有α螺旋結(jié)構(gòu)(Lehrer et al，U.S.Patent Nos.4，543，252;4，659，692 and 4，705，777;Westerhoff et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.866597-6601;and Marion et al.，1988，F(xiàn)EBS Letters 22721-26)，并在人工膜系統(tǒng)中形成小孔(Christensen et al，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855072-5076 and Cruciani et al.，1988，Biophysical J.539a)。
為了使magainin或相似的化合物能有效地用于治療可能導(dǎo)致菌血癥的細(xì)菌感染，它們必須能在人血清存在下發(fā)揮其殺菌作用。這就提出了一個棘手的問題，因為已證明至少有一種人防御素(defensin)能被人血清完全失活(Paher et al.，1986，J.Virol.601068-1074)。
2.3 血清對細(xì)菌生長的影響許多細(xì)菌，特別是革蘭氏陰性細(xì)菌會被新鮮血清殺死(Feingold，1969，J.nfections Dis 120437～444)。已認(rèn)識了補(bǔ)體激活的兩個主要途徑(revicwed in Joiner et.al.，1984，Ann Rev.Immunol，2461～491)。傳統(tǒng)途徑一般是通過抗體與抗原表面的相互作用被激活的。激活的第一步是補(bǔ)體蛋白質(zhì)C1與抗原結(jié)合之抗體的FC區(qū)結(jié)合，隨后是激活C1分子，緊接著傳統(tǒng)的途徑涉及使用所有補(bǔ)體蛋白，即C1-C9，第二個途徑，即另一個途徑是通過其它血清蛋白與細(xì)菌結(jié)合和繼之激活補(bǔ)體蛋白C3這一途徑然后以類似于傳統(tǒng)途徑的方式激活C9補(bǔ)體蛋白。
已經(jīng)觀察到在沒有早期成分的情況下可通過補(bǔ)體C5b-9的終末成分殺死細(xì)菌。使用純化的補(bǔ)體成分C5，C6，C7，C8和C9觀察到差不多殺死3Log深粗糙型明尼蘇達(dá)沙門氏菌(Salmonella minnesota)Re 595并殺死1log粗糙型大腸桿菌J5菌株(參見Joiner et.al.，1984，Ann Rev.Immunol.2461～491)。已經(jīng)證明補(bǔ)體介導(dǎo)的膜損傷和細(xì)胞溶解作用受到兩親的和管狀的C5b-9復(fù)合物的在靶膜上自身組裝的影響(Podack and Tschopp，1984，Mol.Immunol.21589-603)。似乎C5b-9可產(chǎn)生跨越細(xì)菌外和內(nèi)膜的功能性孔(Born and B.hadki，1986，Immunology，59139-145)。形成的透壁孔或通道允許快速K+流出，通過膜勢能的損壞導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
2.4 對有殺菌活性之組合物的體外選擇方法通常是使用體外方法篩選可能的殺菌組合物。這些方法與Manual of Clinical Microbiology，F(xiàn)ourth Edition，Lennette，E.H.Ed in Chief，American.Society for Microbiology，1985 PP.959-989中所述者相似。某些參考文獻(xiàn)中只是對培養(yǎng)基、緩沖液制備等稍作改動。對治療感染之適當(dāng)抗菌劑的選擇要考慮許多方面，其中包括(1)其它靶微生物的體外敏感性和(2)靶菌株與同種的其它成員之體外敏感性的相互關(guān)系。在體外抑制或殺死微生物所需的可能的抗生劑的濃度和在體內(nèi)治療期間從體液中獲得的濃度需在實(shí)驗室中直接測得。
標(biāo)準(zhǔn)的敏感性測試方法包括園盤擴(kuò)散、液體稀釋和瓊脂稀釋。上述方法中的每一個都不包括構(gòu)成活性補(bǔ)體級聯(lián)的成分，因此，殺菌活性只與殺菌劑殺死靶微生物本身的能力有關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些具有體外殺菌活性的肽，當(dāng)作包括人血清的體內(nèi)試驗時均失去效力，在體內(nèi)也是無效的。Magainins就是這一現(xiàn)象的實(shí)例。進(jìn)一步地說，任何單獨(dú)使用沒有殺菌活性或有有限殺菌活性而只靠提高血清補(bǔ)體的能力殺死細(xì)菌的組合物均應(yīng)避免使用。
發(fā)明的總結(jié)本發(fā)明涉及用于治療由對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起之感染的組合物和方法。微生物可以是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌。本發(fā)明的組合物包含在體內(nèi)以協(xié)調(diào)的方式起作用的至少兩個組分。本發(fā)明組合物的一個組分是β-內(nèi)酰胺抗生素。此內(nèi)酰胺抗生素可以是青霉素，頭孢菌素，Cerbapenem，單菌霉素，Pyrazidom，頭霉素或Perem，更具體地說，頭孢菌素是Cefepime，頭孢氨噻或頭孢噻甲羧肟，Carbapenem是imipenem，且單菌霉素是aztreonam。
本發(fā)明組合物的第二個組分是陽離子寡肽。與β-內(nèi)酰胺抗生素結(jié)合，用于提供協(xié)同組合物的陽離子寡肽包括magainins，Cecropins、肌毒素，線粒體前體蛋白及這些肽的片段、類似物和衍生物。其它陽離子肽包括人血小板因子-4(PF-4)和其片段、類似物及衍生物，其中包括PF-4的C-13片段。另外，陽離子寡肽在脂/液界面存在下可形成一個兩親性螺旋。寡肽至少有8到11個氨基酸長，并且一般具有下示氨基酸殘基序列aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3-aa4-X;
其中aa1是Pro，Ala或Lys，aa2是Ile或Leu，aa3是Glu或Lys，aa4是Ser、Leu或Lys，且X是呈α螺旋的5個氨基酸序列，并有通式序列aa5-Lys-Lys-aa6-Gly，其中aa5是Ala或Leu，且aa6是Leu或Phe。用作舉例的陽離子寡肽可以是Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃5);
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Sequence I.D.＃6);
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃7);
Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-GlyAla-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃8);
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly(Seq.I.D.＃10);
Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃11);和Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃12).
一個陽離子寡肽也能包括Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly等其中，氨基酸殘基可以是d-氨基酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療由腸桿菌科細(xì)菌，特別是大腸桿菌、陰溝腸桿菌和肺炎克氏桿菌引起之感染的組合物。本發(fā)明的組合物對治療由銅綠色假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的感染也是有效的。該組合物結(jié)合有上述的β-內(nèi)酰胺抗生素與一種膜活性物質(zhì)。膜活性物質(zhì)破壞膜的基本功能，如依賴于包括氧化磷酸化作用之質(zhì)子移動力、基本運(yùn)輸?shù)鹊哪すδ堋Ｄせ钚晕镔|(zhì)包括上面和下文中所述的陽離子寡肽。
本發(fā)明也提供了用于治療由對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起之感染的治療方法。對本發(fā)明組合物的治療有反應(yīng)的某些感染是由腸桿菌科特別是大腸桿菌引起的。在該治療方法中，給病人定期使用足以抑制細(xì)菌生長的治療有效量的本發(fā)明之組合物。用于治療由大腸桿菌引起的細(xì)菌感染的具體結(jié)合包括Cefepime與magain2，血小板因子4的C-13肽和有如下氨基酸序列的陽離子寡肽結(jié)合Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Sequence I.D.＃6);
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃7)Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-GlydAla-dLeu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dSer-dAla-dLys-dLys-dLeu-Gly.
本發(fā)明進(jìn)一步提供了在體外用補(bǔ)體根據(jù)抗菌活性篩選組合物的方法。受試組合物在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中與靶細(xì)菌及活性補(bǔ)體級聯(lián)成分結(jié)合，經(jīng)過足夠時間后檢測抗菌活性?；钚匝a(bǔ)體成分可以單獨(dú)地作為血清或補(bǔ)體級聯(lián)成分被加入。但優(yōu)選的是人血清。
通過下面的詳細(xì)描述，實(shí)施例和權(quán)利要求，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和益處將對本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是顯而易見的。


圖1顯示magainin 2在緩沖液中殺死未處理的和Cefepime改造的大腸桿菌。大腸桿菌ATCC25922在加(Cefepime改變的)和不加(未處理的)1/4 MIC Cefepime(0.016μg/ml Cefepime)條件下生長到對數(shù)生長中期。按后述方法稀釋細(xì)胞，并加到含GVB++緩沖液，加或不加Cefepime及不同濃度的magainin 2肽(在X軸上表示)的試管中。存在于試管中的Cefepime用于檢驗有這種抗生素時細(xì)胞的預(yù)生長。37℃下180分鐘后，經(jīng)檢測每個試管中菌落形成單位(cfu)的數(shù)量來確定細(xì)菌的存活率。細(xì)菌數(shù)被分成一式二份檢驗。每個magainin濃度Log殺傷二無magainin時的Log10 cfu(無magainin)一含magainin時的Log10 cfu。
圖2圖解顯示magainin 2殺死人血清中之未處理的和Cefepime改造的大腸桿菌。將按如圖1所示方法制備的細(xì)胞加入含40%人血清的試管中。37℃保溫180分鐘后，通過檢測每個試管中菌落形成單位(cfu)的數(shù)目確定細(xì)菌的存活率。試驗中每個樣品均重復(fù)三份，每個magainin濃度Log10殺傷＝無magainin的Log10 cfu-含magainin的Log10 cfu。
圖3圖解說明magainin 2殺傷在活性的和失活之血清中的大腸桿菌。將按圖1所述制備的細(xì)胞加入含40%人血清或40%熱滅活血清的試管中。用存在于試管中的Cefepime檢驗有這種抗生素的細(xì)胞預(yù)生長。試管中還含有100μg/ml的magainin 2或不加magainin。按下列公式計算在活性或熱滅活的血清中末處理的和Cefepime改造后之細(xì)菌的Log10殺傷Log10殺傷＝無magainin的Log10 cfu-含magainin的Log10。
圖4圖解說明無活性血清抑制magainin殺傷Cefepime改造的細(xì)菌。使細(xì)胞按圖1說明所述在Cefepime中預(yù)生長。將細(xì)胞加入一套含Cefepime和0、2.5、5、10、20或40%熱滅活血清的試管中。另一套試管內(nèi)則裝入含200μg/ml magainin 2之同樣量的熱滅活血清。各濃度之熱滅活血清的百分抑制率＝(含magainin cfu/不含magainin的cfu)×100。
圖5圖解說明人補(bǔ)體在magainin殺傷未處理的和Cefepime改造的大腸桿菌中的作用。大腸桿菌ATCC25922在含或不含1/4MIC Cefepime條件下生長將細(xì)胞加入一套試管中，這些試管含40%人補(bǔ)體C8被特異地消耗的人血清(無C8)，或40%C8被消耗而又加入純化的C8補(bǔ)回到50μg/ml(+C8)。Cefepime被加至0.016μg/ml(+Cefepime)。每套試管還含有0，6.25，12.5，25和50mg/ml的magainin 2。在向血清內(nèi)加入細(xì)菌(引入)時測定細(xì)菌的存活數(shù)，并在三小時后測定存活百分率。試驗分成-式三份進(jìn)行，結(jié)果以均數(shù)+/-1試驗內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
圖6圖解說明在合并的正常人血清中，不同抗生素對magainin殺傷力的影響。預(yù)培養(yǎng)大腸桿菌ATCC25922，并在不含抗生素和在各被檢驗的抗生素濃度為1/32、1/16、和1/8MIC時進(jìn)行試驗。將細(xì)菌加到含40%合并的正常人血清并含有200μg/ml magainin 2或無magainin的兩套試管中。對于每個抗生素濃度Log10殺傷＝無magainin的Log10 cfu-含magainin的Log10 cfu。CiPro＝ciProfloxacin ND＝未檢測出。
圖7圖解說明殺傷不同細(xì)菌所需之magainin/cefepime的量。在含和不含1/4MIC的cefepime的情況下使細(xì)菌細(xì)胞生長到對數(shù)生長中期。將細(xì)菌加入兩套含40%合并之正常人血清及分別含200μg/ml magainin或不含magainin的試管中。另外，用存在于試管中的cefepime檢測在有這種抗菌素時細(xì)胞的預(yù)生長。對于每個菌株，按下式計算Log10殺傷MGN2＝無MGN的Log10殺傷一加MGN的Log10殺傷;cefepime＝無MGN Log10殺傷-無MGN加cefepime的Log10殺傷;MGN+cefepime＝無MGN Log10殺傷-加MGN和cefepime Log10殺傷。E.cola＝陰溝腸桿菌;K.P.＝肺炎克氏桿菌。
圖8圖解說明在活性的和熱滅活的血清中，來自PF-4的C-13肽對大腸桿菌的殺傷。使大腸桿菌ATCC25922在加和不加1/5MIC cefepime的環(huán)境中生長。將細(xì)胞加入一套含40%合并之正常人血清或40%熱滅活血清的試管中。用存在于試管中的cefepime檢驗細(xì)胞在有這種抗菌素情況下的預(yù)生長情況。試管中也含200μg/ml C-13肽。對于在有活性或熱滅活的血清中未處理的和cefepime改造的細(xì)菌Log10殺傷＝無C-13的Log10 cfu-有C-13的Log10 cfu。注對在無活性血清中的cefepime改造的細(xì)菌未造成殺傷。
5.本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及用于治療由對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起之感染的組合物和方法。這種組合物含有以協(xié)同方式作用的至少兩個組分。因此，該組合物所得到的效果比使用單個組分的效果更好。與單用某一組分相比，使用較低量和/或較少次數(shù)即能發(fā)揮的相同的或更好的效力，也可顯示出這種協(xié)同作用。本發(fā)明的組合物也可用于殺傷抗生素抗性菌株。另外，本發(fā)明涉及體外篩選組合物方法，即根據(jù)對細(xì)菌細(xì)胞的殺傷，篩選與β-內(nèi)酰胺抗菌素協(xié)同作用的組合物，以及能夠與有殺菌活性的活性補(bǔ)體殺死細(xì)菌的組合物。
5.1治療由對-內(nèi)酰胺抗生素敏感之微生物引起之感染的組合物本發(fā)明涉及到含有兩種或更多種組分的用于治療對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起之感染的組合物。對β-內(nèi)酰胺敏感的微生物可以是革蘭氏陽性菌(如鏈球菌)或革蘭氏陰性菌，例如腸桿菌科(大腸桿菌，肺炎克氏桿菌和陰溝腸桿菌等)、假單孢桿菌科(如銅綠色假單孢桿菌)和擬桿菌科細(xì)菌。在一具體方案中，該組合物包含(1)一種能抑制微生物生長的β-內(nèi)酰胺抗生素和(2)一種陽離子寡肽。β-內(nèi)酰胺抗生素可通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)抑制細(xì)菌生長，陽離子寡肽則可在細(xì)菌膜中形成通道來抑制細(xì)菌生長。因此，β-內(nèi)酰胺抗生素與陽離子寡肽能以協(xié)同方式發(fā)揮作用。
上文中所定義的β-內(nèi)酰胺抗生素是那些抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素。這種抗生素包括并不限于青霉素類、頭孢菌素類(如cefepime、頭孢氨噻和頭孢噻甲羧肟)，corbapenems(如imipenem)，單菌霉素(如aztreonm)，頭霉素類、Pyrazidons和Penems。β-內(nèi)酰胺抗菌素可以從商業(yè)來源以及使用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所知的通常方法獲得。
在說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“陽離子寡肽”是指具有抗微生素活性的兩親性寡肽，它們可以插入到細(xì)菌內(nèi)膜中，并且當(dāng)在體內(nèi)與β-內(nèi)酰胺抗生素結(jié)合時，能以協(xié)同形式殺死細(xì)菌細(xì)胞。
在一具體實(shí)施方案中，陽離子寡肽含有當(dāng)存在脂/液界面時其本質(zhì)上是α-螺旋的區(qū)域。所形成的螺旋可以是左手或右手螺旋并且能包含非蛋白質(zhì)氨基酸(如α，α-二烷基氨基酸，d-氨基酸，或氨基酸衍生物)。另外，該陽離子寡肽可形成兩親性螺旋。線性肽的某些區(qū)域是疏水的，而另一些則是親水的，這樣當(dāng)螺旋形成時，螺旋的一側(cè)便主要是親水的，而另一側(cè)則是疏水占優(yōu)勢的。雖然這一特征在檢查線性序列時可能不明顯，通過使用螺旋凈重圖(helicalnet diagrams)(Crick，1953，Acta.Crystallagr.6∶684-697)或軸向螺旋投影(axial helical projection)(Schiffer et al.，1967，Biophys.J.7∶121-135)可很容易地認(rèn)識這一特性。疏水和親水特性區(qū)域不一定無例外地由有這樣特性的氨基酸殘基構(gòu)成，而只要保持其兩親性，只須有優(yōu)勢疏水或親水氨基酸即可。同樣應(yīng)說明的是，有相似物理性質(zhì)的區(qū)域并不需要嚴(yán)格地與螺旋的軸平行，而可以與軸有一個斜角。另外，螺旋性區(qū)域可能被非螺旋區(qū)域破壞，并且當(dāng)β-內(nèi)酰胺抗菌素存在時仍保留增加的殺菌活性。
特定的具體例子中，陽離子寡肽可以是人血小板因子-4和其片段、類似物及衍生物。類似物和衍生物是那些保持肽的陽離子兩親性α螺旋性質(zhì)并且仍具有殺菌活性的肽。由70個氨基酸組成的人血小板因子-4(PF-4)是一種對肝素有高親合性的血小板α-顆粒蛋白，其可抑制生長因子刺激的內(nèi)皮細(xì)胞增殖(Maione et al.，1990，Science 247∶77-80)，而且還具有免疫調(diào)節(jié)活性(Zucker et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86∶7571-7574)。已發(fā)現(xiàn)了一個有13個氨基酸長的羧基末端片段(氨基酸58～70)，在下文將其稱之為C-13PF-4片段或有下示序列的C-13肽。
Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser(Seq.I.D.＃1)其保持了生長抑制和免疫調(diào)節(jié)活性(Maione et al.，1990，Science 247∶77-80and Zucker et al.，1989，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.86∶7571-7574)。但發(fā)現(xiàn)，較小的肽即C-12(氨基酸58-69)和C-11(氨基酸58-68)有較小的抑制性(Maione et.al.，1990，Science 247∶77-80)。用C-10(氨基酸58-67)肽觀察到幾乎沒有抑制作用。
可以按本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法制備該陽離子寡肽。在一具體的實(shí)例中，可使用本領(lǐng)域已知的方法從其天然來源中分離陽離子寡肽。例如象上文所述，可從爪蟾中分離magainins(Zasloff，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84∶5449～5453)，可從昆蟲中分離cecropins和肌毒素類(Christensen et.al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85∶5072-5076和Nakajime et.al.，1987，J.Biol.Chem.262∶1655-1669)，可從線粒體中分離人血小板因子-4，另外陽離子寡肽也可以通過重組DNA方法獲得。
例如已公開了獲得magainins(Zasloff，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84∶5449-5453)，Cecropins(Christensen el.al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85∶5072-5076)，肌毒素類(Nakainna et.al.，1989，J.Biol.Chem.262∶1665-1669)，及人血小板因子-4(St.Charles et.al.，1989，J.Biol.Chem.264∶2092-2099)的方法。
也可以用本領(lǐng)域已知的程序通過化學(xué)合成肽序列的方法獲得本發(fā)明的陽離子寡肽，例如使用市場上提供的肽合成儀和其類似的儀器。這種肽合成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在出版物中已作過描述，如可參見Merrifield，1963，J.Chem.Soc.84∶2149-2154和Hunkapillar等人，1984，Nature(London)310∶105-111。
已合成了人血小板因子-4之C-13肽的各種類似物。
這些保留殺菌活性的類似物是α螺旋，其每圈有大約3.6個氨基酸，至少有11到18個氨基酸長，每2到3個氨基酸殘基有改變的疏水和親水區(qū)域，這些類似物也看作是本發(fā)明的一部分。破壞分子之螺旋性質(zhì)或分子之兩親性的合成的類似物可降低或消除殺菌活性。
一般說來，本發(fā)明有殺菌活性之陽離子α螺旋兩親組合物的氨基酸順序包括aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3-aa4-X其中aa1是Pro，Ala或Lys;aa2是Ile或Leu;aa3是Glu或Lys;aa4是Ser，Leu或Lys，以及X是含有氨基酸序列Ala-Lys-Lys-Leu-Gly的5氨基酸序列。本發(fā)明的具體實(shí)例包含有下列氨基酸殘基序列的寡肽Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser;
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;
dAla-dLeu-dTyr-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dLys-dLeu-dLeu-dLys-dSer-dAla-dLys-dLys-dLeu-Gly;
Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly;
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;
Ala-Leu-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Leu-Arg-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Gly;
Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly;
Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;andAla-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly.
由于已經(jīng)描述了陽離子α螺旋兩親性殺菌組合物人血小板因子-4的C-13肽以及有抗菌活性的各種類似物和衍生物的一般結(jié)構(gòu)，所以可以通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如使用商業(yè)上可提供的肽合成儀等合成這些肽。
應(yīng)提到的是，給出本發(fā)明抗菌組合物的一般結(jié)構(gòu)和用于篩選與β-內(nèi)酰胺抗菌素或人補(bǔ)體組分有協(xié)同作用的組合物的方法，即可使用標(biāo)準(zhǔn)的和普通的方法，例如使用計算機(jī)模型等，很容易地預(yù)測，產(chǎn)生和/或制備出各種其它的類似物和衍生物。所有在結(jié)構(gòu)和功能上與本文中描述的組合物相等的類似物和衍生物都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在一具體實(shí)施方案中，該組合物含有(1)可抑制細(xì)菌生長的β-內(nèi)酰胺抗生素和(2)能用于治療由細(xì)菌引起之感染的膜活性物質(zhì)。上文討論了β-內(nèi)酰胺抗生素的例子。用于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求的術(shù)語“膜活性物質(zhì)”是指一種能干擾整體膜功能的物質(zhì)。這種功能包括但不限于氧化磷酸化作用、基本的運(yùn)輸功能和其它與質(zhì)子移動力相關(guān)的膜活性。這種物質(zhì)的例子是陽離子寡肽。上文描述的陽離子寡肽包括但不限于magainins(如magainin 1和magainin 2)，cecropins，肌毒素類，線粒體前體蛋白，人血小板因子-4和其片段、類似物及衍生物。
在一很特定的實(shí)施方案中，一種組合物含有可用于治療由大腸桿菌、銅綠色假單孢菌、陰溝腸桿菌和肺炎克氏桿菌引起之感染的(a)cefepime和(b)magainin 2。另一個具體實(shí)例中，一種組合物含有可用于治療由大腸桿菌引起之感染的(a)cefepime和(b)人血小板因子-4的C-13肽。再一個具體實(shí)例中，一個組合物含有用于治療由大腸桿菌引起之感染的(a)ceftazidime、aztreonam或imipenem和(b)magainin 2。還有一個特定實(shí)例中，組合物含有可用于治療由大腸桿菌引起之感染的(a)aztreonam和(b)C-13肽類似物G。
5.2應(yīng)用和使用方法本發(fā)明還涉及治療由對β-內(nèi)酰胺敏感的微生物引起之感染的方法。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，該方法包括給病人使用有效劑量的組合物，該組合物包含(1)一種抑制微生物生長的β-內(nèi)酰胺抗生素;(2)一種作用一段時間后足以有效抵御細(xì)菌感染的陽離子寡肽。β-內(nèi)酰胺抗生素和陽離子寡肽已在上面5.1節(jié)給出定義并進(jìn)行了討論。在一個特定實(shí)例中，β-內(nèi)酰胺可以是亞抑制劑量的。
本發(fā)明還涉及對由腸細(xì)菌科細(xì)菌引起的感染進(jìn)行特異治療的方法。即給病人服用含一定量可抑制腸桿菌科細(xì)菌生長的β-內(nèi)酰胺抗生素和至少一種生物膜活性物質(zhì)的組合物。在一具體實(shí)施方案中所用的β-內(nèi)酰胺抗生素的量可在病人感染部位產(chǎn)生亞抑制性濃度。上文所討論的生物膜活性物質(zhì)可包括血清及其組分和陽離子寡肽。
在一更具體的實(shí)施方案中，可給病人服用有效劑量的含下列成分的組合物以治療由大腸桿菌、銅綠色假單孢桿菌、陰溝腸桿菌和肺炎克氏桿菌引起的感染(a)cefepime和(b)magainin 2。在另外一個非常具體的實(shí)施方案中，可給病人使用含有(a)cefepime和(b)人類血小板因子-4之C-13多肽的組合物，治療由大腸桿菌引起的感染。在另外一個非常具體的實(shí)施方案中，治療由大腸桿菌引起的感染，可使用含下列組分的有效劑量的組合物(a)ceftazidime，aztreonam或imipenem和(b)magainin 2或使用有效劑量含aztreonam和如下文所述的C-13多類似物G的組合物。
本發(fā)明的組合物可用于治療各種不同的細(xì)菌感染。如上文所討論的有幾組病人對細(xì)菌感染特別敏感如病情危急的病人;正在進(jìn)行化學(xué)治療的癌癥病人;以及外科病人。這些組合物可有效地治療這樣的病人。
本發(fā)明組合物可配制成適于不同給藥方式，包括全身、表面或局部給藥的劑型。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，這些活性藥劑可在給藥前混合。而在另一個具體實(shí)施方案中，這些活性藥劑也可在同一時間分別給藥或在不同時間分別給藥。
使用本發(fā)明組合物的方法及其配制一般可參見Remigton′s pharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，PA，最新版本。全身給藥最好是注射，并且可以是肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)以及皮下注射。用于注射的組合物在溶液中配制，最好是在生理互溶緩沖液如Hank′s或Ringer′s緩沖液中配制。另外該組合物也可以固態(tài)形式配制，并在使用前立即溶解或懸浮在溶劑中。還包括凍干形式的制劑。
還可采用透過粘膜，透過表皮方法全身給藥或口服使用該組合物。為了透過粘膜或透過表皮給藥，可在配方中使用適于穿透屏障的滲透劑。這些滲透劑是本領(lǐng)域中已知的。如包括適于透過粘膜給藥的膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。另外，可加入去污劑以促進(jìn)滲透。透過粘膜給藥如可通過鼻內(nèi)噴霧，或使用栓劑。為了口服給藥，可將組合物配制成常規(guī)口服給藥劑型，例如膠囊、片劑和補(bǔ)劑。
為了局部給藥，可將本發(fā)明的組合物配制或本領(lǐng)域公知的軟膏、油膏、凝膠、乳膏等。
5.3體外篩選與β-內(nèi)酰胺抗生素有協(xié)同作用之組合物的方法此外，本發(fā)明還涉及體外篩選有殺菌活性的組合物，特別是陽離子α-螺旋兩親性多肽組合物的改良方法。這些方法一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法，但還進(jìn)一步包括功能性補(bǔ)體級聯(lián)成分?，F(xiàn)有技術(shù)方法包括園盤擴(kuò)散瓊脂稀釋，微量稀釋以及微量稀釋培養(yǎng)液方法。這些方法中的每一個都可改進(jìn)，使其包含一個活性補(bǔ)體級聯(lián)。這種功能性補(bǔ)體級聯(lián)的包涵物能夠識別某些為產(chǎn)生殺菌活性而需要活性補(bǔ)體的組合物。體內(nèi)使用時，這些組合物通過給藥而與補(bǔ)體結(jié)合，因為補(bǔ)體是哺乳動物免疫系統(tǒng)的一部分。現(xiàn)有技術(shù)中不含有活性補(bǔ)體的體外篩選方法并不能識別這些組合物，因而不能發(fā)現(xiàn)包括本發(fā)明新組合物在內(nèi)的許多新的活性組合物。
可將用于本發(fā)明之體外篩選法的活性補(bǔ)體以血清的形式加入。已知由人、老鼠、豚鼠、兔等體內(nèi)分離的血清含有高水平的活性補(bǔ)體，并可用于本發(fā)明的檢測法中。最好是人體補(bǔ)體。功能性補(bǔ)體級聯(lián)可以提供不同成份，加入到標(biāo)準(zhǔn)測定介質(zhì)中。
上面已描述了本發(fā)明及其某些實(shí)施方案，下面給出的實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明而不是限制本發(fā)明。
6.實(shí)施例頭孢菌素與陽離子肽magainin 2的協(xié)同作用本實(shí)施例中證明了不同類型的β-內(nèi)酰胺抗生素與magainin的協(xié)同作用。在這些實(shí)驗中，亞抑制濃度的抗生素與magainin組合能殺死細(xì)菌，而單獨(dú)使用任一藥劑時，則很少或不能殺死細(xì)菌。第二種類型協(xié)同是將兩種試劑應(yīng)用于人血清中。在人血清存在下，將抗生素與magainin合用可以在低于緩沖液中濃度的情況下殺死細(xì)菌。這些結(jié)果表明這些組合物可以用于體內(nèi)治療由細(xì)菌引起的感染。這代表了另一合成效果。在血清中的協(xié)同需要一種熱不穩(wěn)定性因子。通過用血清進(jìn)行補(bǔ)體蛋白質(zhì)C8特殊消耗實(shí)驗證實(shí)這種因子是血清補(bǔ)體。
6.1 材料和方法6.1.1試劑和緩沖液使用下述緩沖液明膠-佛羅那緩沖液(GVB++)(Gewortz H.et.al.，1985，in Manual ofClinical Immunology，N.R.Rose and H.Freedman(eds)ASM，Washington，D.C.)。另外，將0.1%的葡萄糖加入到緩沖液中作為碳源。實(shí)驗室制備磷酸鹽緩沖鹽水。由Bristol-Myers Squibb Company，Wallingford，Conn.的Robert Kessler博士處得到凍干形式的抗生素。在實(shí)驗室內(nèi)根據(jù)已公開的氨基酸序列(Zasloff et.al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84∶5479-5483;Zasloff et.al.，1988，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85∶910-913;and Zasloff，1989，U.S.Patent No.4，810，777)合成magainin 2。
6.1.2細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件本發(fā)明中大多數(shù)實(shí)驗所使用的大腸桿菌ATCC 25922是由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)得到的。其它大腸桿菌菌株是由Harborview Medical Center，Seattle，WA提供的A011菌株，和得自Walter Reed Army Inst.of Researeh，Dept.of Bacterial Disease.，Washington，D.C.的H16菌株。另外檢驗了得自Vetorans Administration Hospital，Seattle，WA的肺炎克氏桿菌菌株ATCC13883和Enterobacter cloacae。檢查了菌株的純度，專屬的特征，然后于-70℃下儲存。所有菌株均生長在AMH(Adjusted Mueller Hinton)(Jones et.al.，1985，in Manual of clinical Microbiology，E.H.Lennette(ed.)，ASM，Washington，D.C.)中。
6.1.3 血清從五個健康的自愿者身上抽取血液，并在室溫下凝固一小時。4℃下保溫20分鐘后，以1500xg離心15分鐘。除去血清并合并之，再向其中加入10mM乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)，并取少量血清在-70℃下儲存，作為集中備用的正常人體血清(PNHS)。使用前很快將血清解凍，并向9份血清中加入1份0.1M CaCl2?；蛘呤遣患覧DTA添加劑冷凍血清并在不加CaCl2情況下使用。此血清在冰上保留，同時將它與細(xì)菌混合以進(jìn)行血清殺菌試驗。除特別指出者外，血清補(bǔ)體均在56℃加熱30分鐘滅活。
6.1.4 最小抑制濃度的測定(MIC)MIC代表產(chǎn)生完全抑制作用所需的最低抗菌劑濃度。使用AMH以微量稀釋皿稀釋法(Manual of Clinical Microbiology，F(xiàn)ourth Edition，Lennette，E.H.Ed.in Chief，ASM.1985.PP.972-977)測定MIC。每個菌株用每種抗生素至少進(jìn)行三次不同的測定。
6.1.5 血清殺菌試驗在有或沒有抗生素的條件下過夜培養(yǎng)接種的細(xì)菌，使之生長至對數(shù)中期。(在660nm處吸光率為0.35至0.5;有Cefepime存在下大約2～3×108細(xì)胞/ml;沒有Cefepime存在下9×108細(xì)胞/ml)。細(xì)胞不經(jīng)洗滌就在明膠-佛羅那緩沖液(GVB++)中稀釋至1×104細(xì)胞/ml，并取0.05ml加至Eppendorf瓶內(nèi)1.5ml血清中。將在抗生素中預(yù)生長的細(xì)菌細(xì)胞也稀釋到含同樣濃度抗生素的GVB++緩沖液中。集中備用的正常人體血清(PNHS)或加熱滅活的PNHS是以適當(dāng)濃度稀釋到0.2mlGVB++緩沖液中而預(yù)先制備的?？股鼗騧againin是在加入細(xì)菌之前加入到血清混合物中的。反應(yīng)混合物總量為0.25ml。通過向只含有GVB++緩沖液的試管中加入0.05ml細(xì)菌懸浮液，并在測定開始時鋪板，以檢測加入血清中的細(xì)菌數(shù)目。然后將反應(yīng)混合物在37℃下旋轉(zhuǎn)保溫3小時，間隔地移出樣品(25μl)進(jìn)行平板計數(shù)分析。加胰蛋白酶大豆瓊脂保溫過液后檢測所形成之菌落單位的數(shù)目。以一式三份計數(shù)菌落形成單位并取其平均值。
6.2 結(jié)果研究了magainin 2(MGN2)和Cefepime(一種頭孢菌素抗生素)在緩沖液中的效果。如圖1所示Cefepime與100μg/ml MGN2合用的殺菌能力高于1.5Log。而單獨(dú)加入Cefepime，則殺菌能力小于0.3Log10。另外單獨(dú)使用100μg/ml的MGN2沒發(fā)現(xiàn)顯著的殺菌效果。但是當(dāng)細(xì)菌與200μg/ml MGN2一起保溫時則殺菌能力超過3Log(99.9%)。這一觀察結(jié)果就鑒定協(xié)同結(jié)合來說擴(kuò)展了Zasioft的數(shù)據(jù)。
在40%集中備用之正常人體血清(PNHS)存在下，檢驗了MGN2對未處理細(xì)菌(沒有用Cefepime處理的細(xì)菌)和Cefepime改造之細(xì)菌的效果(見圖2)。當(dāng)未處理的細(xì)菌加入到血清中時，沒觀察到顯著的MGN殺菌效果。這與以前所觀察到的在緩沖液中200μg/ml MGN2完全殺死菌株的結(jié)果完全相反(比較圖1和圖2)。顯然在檢測殺死未處理細(xì)菌的殺菌能力時PNHS阻斷了MGN2(和MGN1)的作用(沒有給出后者的數(shù)據(jù))。而在測定Cefepime改造的細(xì)菌時，PNHS的存在促進(jìn)了MGN的殺菌能力。在PNHS中觀察到25μg/ml MGN有殺菌力，而以此濃度在緩沖液中則未見有殺菌力。因此，PNHS阻礙了MGN2對未處理細(xì)菌的殺菌活性，但增強(qiáng)了對Cefepime改造之細(xì)菌的殺菌活性。
為了確定PNHS中熱不穩(wěn)定性因子或熱穩(wěn)定性因子是否負(fù)責(zé)Cefepime和MGN2之間的協(xié)同，檢測了PNHS中活性血清和熱滅活血清(在55℃加熱30分鐘使血清補(bǔ)體失活)的殺菌能力。對于未處理的細(xì)菌，有或沒有100μg/ml的MGN，都再一次沒有觀察到或觀察到很小的殺菌效果(見圖3)。當(dāng)檢測Cefepime改造的細(xì)菌時，觀察到活性血清中MGN/Cefepime有殺菌能力，而失活血清則沒有(見圖3和圖4)。這些實(shí)驗清楚地證明檢測在PNHS中的殺菌能力時，PNHS中的熱不穩(wěn)定因子(可能是補(bǔ)體)對于MGN殺傷Cefepime改造的細(xì)菌是必不可少的。
血清中熱不穩(wěn)定因子的性質(zhì)被確定為血清補(bǔ)體。檢測了magainin在已特異性排除了補(bǔ)體蛋白質(zhì)C8的血清中殺傷Cefepime改造的或未處理的大腸桿菌ATCC25922的能力。如果血清中除去補(bǔ)體級聯(lián)的這一組分，則沒有觀察到magainin對細(xì)菌的殺傷(圖5)。但將純化的C8加至生理濃度(50μg/ml)時，則發(fā)現(xiàn)有顯著殺菌效果。另外發(fā)現(xiàn)殺傷Cefepime改變的大腸桿菌所需magainin濃度要比殺傷未處理細(xì)菌所需magainin濃度低得多。
同時也研究了集中備用的正常人血清中不同抗生素的效果。使細(xì)菌預(yù)生長，然后在1/32MIC、1/16MIC、1/8MIC對每種被檢抗生素進(jìn)行分析。向兩組試管中加入細(xì)菌。兩組試管都含有40%集中備用的正常人血清，并且一組中含有200μg/ml的magainin 2，而另一組則沒有。如圖6，β-內(nèi)酰胺抗生素，imipenem，與magainin 2有協(xié)同作用;而抗生素BBK8(一種氨基葡糖苷)和Ciproflaxacin(一種喹啉)兩者都沒有協(xié)同作用。并且cefepime，aztreonam和Ceftazidime這些β-內(nèi)酰胺型抗生素都與magainin有協(xié)同作用。
研究了殺傷多種細(xì)菌所需之magainin/cefepime的量。所研究的細(xì)菌包括大腸桿菌菌株A645、大腸桿菌菌株AO11、大腸桿菌菌株H16、E.Clocae和肺炎克氏桿菌。
在有或沒有1/4MIC cefepime存在下，使細(xì)菌生長至對數(shù)中期。將其加入到兩組分別含40%集中備用之正常人血清的兩組試管中，其中一組含有200μg/ml magainin 2，另一組則不含magainin。
由圖7可見，對所有五個細(xì)菌菌株均顯示出某些與magainins的協(xié)同。當(dāng)有MGN存在時，殺傷數(shù)比單獨(dú)使用MGN或cefepime時有顯著提高。殺菌力比單獨(dú)使用cefepime的殺菌力高出大約一個Log值。
本文還研究了magainin/cefepime合用時殺傷銅綠色假單孢桿菌的效果。同上面一樣，當(dāng)magainin存在時，殺菌力與單獨(dú)使用從MGN或cefepime相比有顯著的提高。
7. 實(shí)施例頭孢菌素與人血小板因子-4的陽離子多肽C-13的協(xié)同作用本實(shí)施例中證明了β-內(nèi)酰胺、頭孢菌素和C-13人血小板因子-4肽(HPF-4)的協(xié)用作用。在這些實(shí)驗中，亞抑制濃度的頭孢菌素和C-13人血小板因子-4肽合用時能殺死細(xì)菌，而當(dāng)單給予其中之一時，則很少或不能殺死細(xì)菌。這些實(shí)驗是在40%正常人血清中進(jìn)行的。血清中的協(xié)同作用需要一個熱不穩(wěn)定因子，因為對血清較微加熱滅活即會完全破壞任何協(xié)同作用。
7.1 材料和方法7.1.1 試劑和緩沖液使用下列緩沖液明膠-佛羅那(GVB++)(Gewortz H.et.al.，1985，in Manual of Clinical Immunology，N.R.Rose and H.Freedman(eds.)ASM，Washington.D.C.)。另外將0.1%葡萄糖加到緩沖液中作為碳源。實(shí)驗室內(nèi)制備磷酸鹽緩沖鹽水。抗生素以凍干形式獲得(見上文)。按照已公開的氨基酸序列(Maione.et.al.，1990，Science 247∶77-80)在實(shí)驗室中合成C-13 PF-4肽。也在實(shí)驗室中以標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)合成修飾的C-13 PF-4肽。
7.1.2 細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件本實(shí)驗所用的大腸桿菌ATCC25922得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。檢查菌株的純度，專屬特征，然后在-70℃下儲存。細(xì)菌在AMH中生長。
7.1.3 血清從五個健康自愿者身上抽取血液，在室溫下凝固1小時，再在4℃下保溫20分鐘后，以1500xg離心15分鐘。將血清移出、匯集，并在-70℃下少量儲存(PNHS)。使用前立即將血清解凍，并在冰上保存直至與細(xì)菌混合用于血清殺菌試驗。除特別指出者外，血清補(bǔ)體均在56℃加熱30分鐘滅活。
7.1.4 最小的抑制濃度的測定(MIC)使用AMH以微量稀釋皿稀釋，檢測MIC(Manual of Clinical Microbiology，F(xiàn)ourth Edition，Lennette，E.H.Ed.in Chief，ASM，1985，PP.972-977)。對每個菌株的每種抗生素至少進(jìn)行三次不同的檢測。
7.1.5 血清殺菌檢測法已接種的細(xì)菌經(jīng)過夜培養(yǎng)，生長至對數(shù)中期(有或沒有抗生素)，(在660nm處吸光率在0.35至0.5之間)，在cefepime存在下細(xì)胞生長大約是2～3×108細(xì)胞/ml，在沒有cefepime存在下細(xì)胞生長大約是9×108細(xì)胞/ml。細(xì)胞不經(jīng)洗滌就在明膠-佛羅那緩沖液(GVB++)中稀釋至1×104細(xì)胞/ml，并將其中的0.05ml加入到一個1.5ml Eppendorf瓶內(nèi)的血清中。在抗生素中預(yù)生長的細(xì)菌細(xì)胞也在含有相同濃度抗生素的GVB++緩沖液中稀釋。預(yù)先制備好的PNHS或熱滅活PNHS，在0.2ml GVB++中稀釋到適當(dāng)濃度。先向血清混合物中加入抗生素或magainin，再向其中加入細(xì)菌。反應(yīng)混合物總量為0.25ml。向只含有GVB++的試管中加入0.05ml細(xì)菌懸浮液，并在試驗開始的鋪板，以確定加到血清中細(xì)菌的數(shù)目。然后，反應(yīng)混合物在37℃下旋轉(zhuǎn)保溫3小時。間隔取樣(25ml)進(jìn)行平板計數(shù)分析。加入胰蛋白酶大豆瓊脂保溫過夜后檢測菌落形成單位數(shù)目。菌落形成單位測定三次取平均值。
7.2. 結(jié)果研究了由人血小板因子-4中獲得的C-13肽的殺菌效果。基于該陽離子多肽的氨基酸序列，它應(yīng)在疏水環(huán)境中形成兩親性α-螺旋。檢測了這種肽在集中備用的人血清中殺傷大腸桿菌的能力(見圖8)。將在有或沒有1/5MIC存在下生長的細(xì)菌細(xì)胞分別加入到活性的或熱失活的40%集中備用的正常人血清中。如圖所示，當(dāng)血清沒有熱失活時，這種肽能有效地殺死cefepime改造的細(xì)菌，血清沒有經(jīng)過熱失活時，則不能殺死在不加cefepime條件下生長的細(xì)菌。另外，當(dāng)血清被熱失活時，這種肽也不能殺傷cefepime改造的細(xì)菌。這些數(shù)據(jù)清楚地表明該肽可與β-內(nèi)酰胺抗生素和活性血清協(xié)同，殺死細(xì)胞。同時研究了由人體血小板因子-4獲得的，具有如下序列的修飾的C-13肽的殺菌效果Pro-Leu-Tyr-Lys-Pro-Lys-Ile-Ile-Lys-Pro-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser(Seq.I.P.＃2)當(dāng)這一序列在正常人體血清存在下與cefepime一起加入到細(xì)菌中去時，發(fā)現(xiàn)只有較低或沒有協(xié)同效果。這是由于減少了被修飾之C-13序列的α螺旋特性，因為已知脯氨酸可破壞α-螺旋。
8.實(shí)施例magainin與cefepime合用的體內(nèi)保護(hù)效果檢測了合用magainin與cefepime以防止小鼠免受由大腸桿菌引起的致死感染的能力。先給小鼠注射環(huán)磷酶胺，使其患嗜中性白血球減少癥，然后用大腸桿菌攻擊。將小鼠分成四個組1)不作進(jìn)一步處理的小鼠;2)只給予magainin或C-13多肽的小鼠;3)只給予cefepime的小鼠;及4)合用magainin 2或C-13多肽與cefepime的小鼠。注射后觀察十天，記錄小鼠死亡數(shù)目。從這些研究結(jié)果明顯看出;未作處理或單用magainin C-13多肽或cefepime處理的都不能有效地保護(hù)小鼠免于死亡。而magainin與cefepime或C-13多肽與cefepime合用則能有效地保護(hù)小鼠。而當(dāng)用丁胺卡那霉素(一種氨基葡糖苷)做相同實(shí)驗時，既沒有發(fā)現(xiàn)體外殺菌活性，也沒有發(fā)現(xiàn)體內(nèi)保護(hù)效果。
8.1 原料和方法8.1.1 試驗和緩沖液在實(shí)驗室中制備磷酸鹽緩沖鹽水。cefepime以凍干形式獲得(見上文)。C-13多肽和magainin 2可在實(shí)驗室內(nèi)根據(jù)已公開的氨基酸序列合成。
8.1.2 細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件大腸桿菌H16得自Walter Reed Army Institute of research，Department of Bacterial Disease，Washington，D.C.。檢查此菌株的純度，專屬特征，然后在-70℃下儲存。細(xì)菌在AMH培養(yǎng)液中生長。
8.1.3 體內(nèi)實(shí)驗用細(xì)菌攻擊前五天，使小鼠患嗜中性白血球減少癥。經(jīng)皮下注射250mg/kg環(huán)磷酰胺以誘發(fā)嗜中性白血球減少癥。然后腹膜內(nèi)注射2×104個大腸桿菌H16進(jìn)行攻擊。將小鼠分成四組1)1)細(xì)菌攻擊后1小時和3.5小時給小鼠注射PBS;2)細(xì)菌攻擊后1小時和3.5小時分兩次給小鼠注射含magainin 2的PBS(每次注射劑量為1mg/小鼠);3)細(xì)菌攻擊后1小時和3.5小時，分兩次給小鼠注射含magainin 2的PBS(每次注射劑量是0.1mg/kg)，兩次注射magainin 2的總量為0.2mg/kg;4)細(xì)菌攻擊后1小時和3.5小時，給小鼠注射1mg/小鼠的magainin2和0.1mg/kg cefepime，兩次注射總量為2mg/小鼠magainin2和0.2mg/kg cefepime。所有magainin 2和cefepime注射都是肌內(nèi)注射。對小鼠存活率至少追蹤觀察十天。
8.2 結(jié)果檢查細(xì)菌攻擊后小鼠存活率，結(jié)果如下第一組只給予PBS，15只小鼠中存活1只;
第二組只給予MGN2，15只小鼠中存活1只;
第三組只給予cefepime，20只小鼠中存活1只;
第四組聯(lián)合給予MGN和cefepine，20只小鼠中存活11只。聯(lián)合用藥組中小鼠存活數(shù)的提高表明，相比于未處理組或單獨(dú)使用cefepime或magainin 2組，聯(lián)合用藥組顯著提高保護(hù)作用(P＜0.05，F(xiàn)isher準(zhǔn)確度試驗)。
另外用PF-4的C-13肽做相似的動物保護(hù)試驗。在這些實(shí)驗中，除一組和三組同上外，第二組改成用C-13多肽，而不用MGN 2;第四組改為合用C-13肽和cefepime。實(shí)驗結(jié)果如下第一組和第三組實(shí)驗結(jié)果同上;只服用C-13肽的第二組，10只小鼠中存活一只;聯(lián)合給予C-13肽和cefepine的第四組，10只小鼠中存活4只。這一實(shí)驗結(jié)果表明，合用C-13肽和cefepime，可提高小鼠的存活率。
檢驗了體內(nèi)合用丁胺卡那霉素(一種氨基葡糖苷)與MGN2的效果。測定丁胺卡那霉素的MIC值后將小鼠分為如上四個組，得到如下結(jié)果只給予PBS組8只小鼠無一存活;只給予MGN 2(兩次注射，每次1mg/小鼠)組，9只小鼠無一存活;只給予丁胺卡那霉素(兩次注射，每次3mg/kg)組，10只小鼠存活三只;聯(lián)合給予MGN 2與丁胺卡那霉素(劑量同上文)組，10只小鼠存活1只。
9 實(shí)施例C-13肽類似物的合成使用固相合成技術(shù)合成了不同C-13肽的類似物(表1)。設(shè)計類似物以便以特定方式改變C-13肽的物理參數(shù)。某些物理參數(shù)的改變影響多肽類似物與細(xì)菌膜之間的相互作用。發(fā)現(xiàn)延伸分子以增加一圈α螺旋，并改變沿著單環(huán)的正電荷密度，可引起與cefepime之協(xié)同活性的改變。
9.1 材料和方法9.1.1 試劑與方法在使用Boc/芐基保護(hù)的430A型Applied Biosystems肽成儀上，以固相合成技術(shù)(Merrifield，R.B.1963，J.Am.Chem.Soc.85∶2149-2154)合成MGN2、Cecropin和C-13肽類似物。用低/高HF方法(Tam，J.P.et.al.，1983，J.Am.Chem.Soc.105∶6402-6455)或用標(biāo)準(zhǔn)高HF方法(90% HF/10%茴香醚)處理固載的肽樹脂并裂解之。用高效液相層析法(HPLC)在Dynamax C-8柱(Rainin)上純化去保護(hù)的肽。再用標(biāo)準(zhǔn)HPLC分析和氨基酸分析方法鑒定純化的肽。

10.實(shí)施例根據(jù)殺菌活性和溶血活性，體外篩選C-13肽以體外殺菌和血細(xì)胞溶解分析法試驗化學(xué)合成的血小板因子-4之C-13肽類似物與Cefepime的協(xié)同活性。至少約有11至18個氨基酸的肽形成大約4或5圈α-螺旋可使殺傷一半細(xì)菌細(xì)胞所需的肽量減少8-80倍。
破壞肽的α螺旋特征或其兩親性的肽類似物會使殺菌活性減少或消除。加入氨基酸，形成第五個α螺旋環(huán)，可提高殺菌活性。改變沿著螺旋分布的正電荷密度，能進(jìn)一步提高這一活性。
發(fā)現(xiàn)當(dāng)C-13類似物H、F以及少量G，X，L和抗生素合用時，可改善殺菌能力。發(fā)現(xiàn)類似物H，F(xiàn)，G，X，II，KK，N和J需要補(bǔ)體，當(dāng)篩選介質(zhì)中存在補(bǔ)體時，它們能大大提高殺菌效果。當(dāng)在肽的氨基方向上增加長度，或在4，5，8，9，12，15，16位置上以精氨酸取代賴氨酸時，都能提高C-13肽類似物的血細(xì)胞溶解活性。
10.1 材料和方法10.1.1 試劑和緩沖液使用下面緩沖液明膠-佛羅那緩沖液(GVB++，如上所述)。另外向緩沖液中加入0.1%的葡萄糖作為碳源。在實(shí)驗室中制備磷酸鹽緩沖鹽水?？股丶碿efepme如上文所述以凍干形式得到。
10.1.2 細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件在大多數(shù)實(shí)驗室中使用的大腸桿菌菌株ATCC 25922是從美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)得到的。使用的其它大腸桿菌是得自Harborview Medical Center，Seattle，WA的A011，和得自Walter Reed Army.Institute ofResearch，Washington，D.C.的K1衣殼分離物H16。本實(shí)驗室生長的大楊桿菌A645 AP是ATCC25922菌株在動物體內(nèi)傳代后得到的變體。大腸桿菌A645AP(PBR322)是含有賦予β-內(nèi)酰胺抗生素抗性之質(zhì)粒PBR322的大腸桿菌，并是在實(shí)驗室中產(chǎn)生的。肺炎克氏桿菌C329(ATCC13883)和銅綠色假單孢桿菌菌株A366(ATCC27317)均由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。金黃色葡萄球菌菌株A546得自Harborview Medical Center，Seattle，WA;陰溝腸桿菌菌株G438得自Veterans Administration Hospital，Seattle，WA;無乳鏈球菌菌株1334得自Childrens Orthopedic Hospital，Seattle，WA。抗生素抗性銅綠色假單孢桿菌菌株M990 得自本室培養(yǎng)物保藏中心。檢查菌株的純度，專屬特性后在-70℃儲存。每星期由冷凍的細(xì)菌原培養(yǎng)物制得新的培養(yǎng)物，以避免重復(fù)的繼代培養(yǎng)。所有菌株均生長在含有50μg/l CaCl2和25mg/l MgCl2的Adjusted Mueller Hinton培養(yǎng)液(AMH)中。
10.1.3. 血清殺菌試驗在有或沒有1/4或1/5MIC Cefepime存在下，由過夜培養(yǎng)物接種各細(xì)菌的所有菌株并使之生長至對數(shù)中期(660nm吸光率在0.35-0.5之間，在Cefepime存在下細(xì)胞生長大約是2-3×108個細(xì)胞/ml，在沒有Cefepime存在下細(xì)胞生長大約9×108個細(xì)胞/ml)。細(xì)胞不經(jīng)洗滌即加入明膠-佛羅那緩沖液(GVB++)稀釋至5×104個細(xì)胞/ml，并取其中0.05ml加入到1.5ml Eppendorf瓶內(nèi)的血清中(見7.1.3節(jié))。對于在Cefepime中予生長的細(xì)菌細(xì)胞，在制備和檢測殺菌活性時，加入與生長時期相同量的Cefepime。事先在0.2ml GVB++中將集中備用的正常人血清或熱滅活血清稀釋至適當(dāng)濃度。在加入細(xì)菌細(xì)胞之前向血清混合物中加入Cefepime。在去離子水中稀釋多肽，制成2mg/ml的儲備溶液，并加入到反應(yīng)瓶中以達(dá)到適當(dāng)濃度。總反應(yīng)體積為0.25ml。通過向只含有GVB++緩沖液的試管中加入0.05ml細(xì)菌懸浮液，并在分析開始時鋪板，來檢測加入到血清中的細(xì)菌的數(shù)目。然后使反應(yīng)混合物在37℃下旋轉(zhuǎn)保溫3小時。間隔取樣(25μl)做平板計數(shù)分析。與胰蛋白酶大豆瓊脂保溫過夜后檢測菌落形成單位的數(shù)目。三處重復(fù)檢測菌落形成單位數(shù)目并取平均值。
10.1.4 溶血作用試驗將由健康自愿者身上獲得的血液稀釋在PBS中，使紅細(xì)胞濃度大約為6×108細(xì)胞/ml。將肽懸浮在PBS中制成濃度為2mg/ml的備液，并取100μl儲備溶液加入到900μl稀釋的紅細(xì)胞中。樣品在37℃保溫45分鐘，以1000xg離心5分鐘，取上清液。用分光光度法在541nm處檢查上清液。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可讀出溶血作用的百分?jǐn)?shù)。血液以1∶10稀釋在蒸餾水中，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行一系列稀釋，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在蒸餾水中1∶10稀釋度代表100%溶血。
10.2 結(jié)果試驗了有或沒有抗生素以及有或沒有活性補(bǔ)體存在下，各種陽離子寡肽的殺菌效果，其中包括Magainin，Cecropin，HPF-4的C-13肽及各種C-13多肽類似物和衍生物(見表2)。

另外通過檢測肽溶解人血紅細(xì)胞的能力。檢測毒性的潛能。首先檢測二級結(jié)構(gòu)的兩個不同方面。含有能破壞分子兩親性(類似物B)或α螺旋性質(zhì)(類似物W)之氨基酸替代的肽，均在所有試驗條件下失活，因為肽的α螺旋和兩親性質(zhì)對保持活性是必不可少的。因此在下步修飾中保留了此兩種參數(shù)。檢驗了一種通過加入五個氨基酸使α螺旋再增加一圈并保留兩親特性的修飾(類似物H)。這種修飾大大增強(qiáng)了在NHS中與Cefepime組合的殺菌力。在NHS中殺死Cefepime改造之細(xì)菌的抗菌活性提高了8倍(肽類似物H)，而在HI-NBS中或殺死未處理細(xì)菌的能力卻沒有相應(yīng)的提高。對類似物F之兩個疏水性氨基酸的稍許改變(類似物H)，可導(dǎo)致抗菌活性輕度提高。當(dāng)類似物F中谷氨酸殘基被賴氨酸取代時(類似物G)，對于NHS中之Cefepime改造之細(xì)菌的殺菌活性提高了10倍。而此肽在HI-NHS中或?qū)τ谖刺幚淼募?xì)菌則其抗菌能力沒有相應(yīng)提高。另外，也未觀察到血紅細(xì)胞(RBC)溶解數(shù)目的增加。肽類似物G證實(shí)了單一電荷的變化即可大大影響殺菌活性在氨基未端連接五個氨基酸使螺旋增加一圈(類似物J)，并沒有提高抗菌活性。這種修飾增加了血紅細(xì)胞(RBC)溶解數(shù)目。這表明有較多數(shù)目螺旋的肽是有毒性的。體外分析中，肽(類似物G)與Cefepime在NHB中的抗菌活性增加了80倍。相反在HI-NHB或?qū)τ谖刺幚淼募?xì)菌則沒有抗菌活性。對于類似物G的進(jìn)一步實(shí)驗表明，殺死其它細(xì)菌菌株的殺菌活性依賴于NHS(表3)。這些數(shù)據(jù)還表明，抗生素可不同程度上加強(qiáng)正常人血清中類似物G的殺菌活性，且其加強(qiáng)程度取決于細(xì)菌菌株。

11.實(shí)施例C-13肽類似物與Cefepime合用的體內(nèi)保護(hù)效果檢測了合用C-13肽類似物和Cefepime使小鼠免于由大腸桿菌引起之致命性感染的能力。注射環(huán)磷酰胺使小鼠患嗜中性白細(xì)胞減少癥，然后用大腸桿菌攻擊。將小鼠分成四組(1)給予PBS的小鼠;(2)只給予C-13肽類似物的小鼠;(3)只給予Cefepime的小鼠;(4)合用C-13肽類似物與Cefepime的小鼠。感染后觀察10天，并記錄小鼠死之?dāng)?shù)目。結(jié)果清楚地表明未處理，只用Cefepime處理或用C-13肽類似物Q，X，II和F處理均不足以保護(hù)小鼠免于死之。而合用C-13肽類似物和Cefepime則能有效地保護(hù)小鼠。
11.1. 材料和方法11.1.1 試劑與緩沖劑在實(shí)驗室中制備磷酸鹽緩沖鹽水。Cefepime以凍干形式從Robert Kessler博士(Bristol-Myers Squibb Company，Wallingford，Conn.)處得到。Cecropin在實(shí)驗室內(nèi)按已公開的序列合成。環(huán)磷酰胺購自Mead Johnson(under the Tradename Cytoxan)。
11.1.2 細(xì)菌菌株的培養(yǎng)條件大腸桿菌H16得自Walter Reed Army Institute of Researd，Washington，D.C.;大腸桿菌A645 AP在實(shí)驗室內(nèi)由大腸桿菌ATCC25922經(jīng)動物傳代而產(chǎn)生。檢查菌株的純度，專屬特征，并在-70℃儲存。每個星期從冷凍的細(xì)菌儲備培養(yǎng)物制得新的培養(yǎng)物，以避免重復(fù)培養(yǎng)。所有菌株均生長在含有500mg/l CaCl2和25mg/l MgCl2的Adjusted Mueller Hintor培養(yǎng)液中。
11.1.3 體內(nèi)實(shí)驗使雄性CrLCF1小鼠患嗜中性白血球減少癥，五天后用細(xì)菌攻擊之。嗜中性白血球減少癥是經(jīng)皮下注射250mg/kg環(huán)磷酰胺而誘發(fā)的。腹膜內(nèi)注射2×104個大腸桿菌H16(表4)或5×104個A645AP攻擊小鼠。將小鼠分成作下列不同處理的四個組1)PBS;2)C-13肽類似物(15mg/kg);3)Cefepime(0.1mg/kg);4)聯(lián)合注射Cefepime和C-13肽類似物，注射前合并。細(xì)菌攻擊1小時和3.5小時后，分別在小鼠的四條腿上進(jìn)行肌肉內(nèi)注射，所有注射液均在(0.2ml)PBS中配制。監(jiān)測小鼠存活率10天，并用Fisher準(zhǔn)確度試驗分析結(jié)果。
11.2 結(jié)果檢測了C-13肽類似物和Cefepime保護(hù)小鼠免于大腸桿菌H16之全身性感染的效果(表4)。單用PBS、Cefepime或C-13肽類似物G、X、II和F，不能明顯有效地保護(hù)小鼠，而相比于未處理或單用Cefepime或C-13肽類似物處理者，聯(lián)合給予Cefepime和C-13肽類似物G或F，小鼠則顯著地提高了存活率(P＜0.05，F(xiàn)isher試驗)。另外用Cecropin做了同樣的實(shí)驗，無論是單獨(dú)使用或合用Cecropin與Cefepime，都沒有顯著提高保護(hù)作用。
另外，在一相似實(shí)驗中試驗了另一種抗生素aztreonam。當(dāng)這種β內(nèi)酰胺抗生素與C-13肽類似物G合用時，統(tǒng)計結(jié)果表明有顯著的保護(hù)作用(P＜0.05;Fisher試驗)。實(shí)驗結(jié)果如下單用PBS，9只小鼠無一存活;單用aztreonam，20只小鼠中只存活一只;單用C-13肽類似物G，10只小鼠中無一存活;合用aztreonam和C-13肽類似物G，則20只小鼠中存活11只。
還檢測了C-13肽類似物G對用非K1大腸桿菌菌株A645AP(5.0×104生物體)攻擊之嗜中性白血球減少癥小鼠的保護(hù)效果。細(xì)菌激發(fā)后檢測小鼠存活率，結(jié)果如下第一組只給PBS，20只小鼠中存活3只;第二組只給類似物G，15只小鼠無一存活;第三組給予Cefepime，20只老鼠中存活3只;第四組給予類似物G和Cefepime，11只小鼠中存活8只。聯(lián)合用藥再一次顯著提高了小鼠存活率(P＜0.05，F(xiàn)isher試驗)。表明聯(lián)合用藥比單用肽或抗生素能提高存活率。
表4C-13多肽類似物與Cefepime對一系列大腸桿菌感染的效果處理 存活數(shù)/總數(shù) 百分存活率PBS 2/25 8Cefepime 3/25 12G 1/15 6.7Cefepime+G 11/20 55X 1/18 5.6Cefepime+X 15/20 75II 0/5Cefepime+II 3/10 30F 0/10Cefepime+F 3/10 30Cefepime 2/20 20Cefepime+Cecropin 2/10 20本文所描述和闡明的發(fā)明并不局限于本文公開的特定實(shí)施方案范圍。因為這些實(shí)施方案是為了描述本發(fā)明的某些方面。任何等同的實(shí)施方案也都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上對于本領(lǐng)域的熟練工作者來說，通過上文的描述，對于本文以外的本發(fā)明的不同改動是顯而易見的。這些改動也落入待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
序列-覽表(1)總的情報(ⅰ)申請人Darveau，Richard P.
Blake，James J.
Cosand，Wesley L.
(ⅱ)發(fā)明名稱治療由對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起之感染的組合物和方法(ⅲ)序列數(shù)12(ⅳ)住址(A)住址Bristol-Myers Squibb公司專利部(B)名3005 First Avenue(C)城市西雅圖(D)州名華盛頓(E)國家USA(F)ZIP98121(ⅰ)計算機(jī)易讀形式(A)中等類型Floppy盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟盤Patent In Release

1.0，Version

1.25(ⅵ)目前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S(B)申請日1991年2月19日
(C)分類(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 07/484，020(B)申請日1990年2月23月(ⅷ)代理人/代理機(jī)構(gòu)情報(A)姓名Poor，Brian W.
(B)注冊號32，928(C)參考文獻(xiàn)/一覽表號ONO 63A(ⅸ)通訊情報(A)電話206/728-4800(B)傳真206/448-4775(2)SEQ ID NO1情報(ⅰ)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性的(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)NO(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile1 5Lys Lys Leu Leu Glu Ser10(2)SEQ ID NO2
(ⅰ)序列特征(A)長度十五個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)Yes(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Pro Leu Tyr Lys Pro Lys Ile1 5Ile Lys Pro Lys Leu Leu Gly10Ser15(2)SEQ ID NO3(ⅰ)序列特征(A)長度(LENGTH)13個氨基酸(B)類型(TYPE)氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(TOPOLOGY)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)(HYPOTHETICAL)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO3Pro Leu Lys Lys Tyr Ile Ile1 5Lys Lys Glu Leu Leu Ser10
(2)SEQ ID NO4(ⅰ)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Pro Leu Tyr Lys Lys Pro Ile1 5Lys Lys Pro Leu Glu Ser10(2)SEQ ID NO5(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Ile1 5Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ala10
Lys Lys Leu Gly15(2)SEQ ID NO6(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Ile1 5Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ala10Lys Lys Leu Gly15(2)SEQ ID NO7(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7
Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu1 5Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ala10Lys Lys Leu Gly15(2)SEQ ID NO8(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu1 5Lys Lys Leu Leu Lys Ser Ala10Lys Lys Leu Gly15(2)SEQ ID NO9(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9Ala Leu Tyr Arg Arg Leu Leu1 5Arg Arg Leu Leu Arg Ser Ala10Arg Arg Leu Gly15(2)SEQ ID NO10(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Leu1 5Lys Lys Leu Leu Lys Phe Ala10Lys Lys Phe Gly15
(2)SEQ ID NO11(ⅰ)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11Lys Trp Lys Leu Tyr Lys Lys1 5Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys10Ser Ala Lys Lys Leu Gly15 20(2)SEQ ID NO12(ⅰ)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)YES(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu15Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Lys10Leu Leu Lys Ser Ala Lys Lys15 20Leu Gly
權(quán)利要求
1.一種制備治療對β-內(nèi)酰胺抗菌素敏感的微生物引起感染的組合物的方法，其特征為將(a)一種能抑制微生物生長的β-內(nèi)酰胺抗生素與(b)陽離子寡肽和藥物載體混合。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中β-內(nèi)酰胺抗生素選自青霉素、頭孢菌素、carbapenem、單菌霉素、頭霉素、pyrazidon和penem。
3.權(quán)利要求2所述方法，其中β-內(nèi)酰胺抗生素是頭孢菌素。
4.權(quán)利要求3所述方法，其中頭孢菌素選自cefepime、頭孢氨噻(cefotaxime)和頭孢噻甲羧肟(ceftazidime)。
5.權(quán)利要求2所述方法，其中β-內(nèi)酰胺抗生素是carbapenem。
6.權(quán)利要求5所述方法，其中carbapenem是imipenem。
7.權(quán)利要求2所述方法，其中β-內(nèi)酰胺抗生素是指單菌霉素。
8.權(quán)利要求7所述方法，其中單菌霉素是aztreonam。
9.權(quán)利要求1所述方法，其中陽離子寡肽選自magainin、cecropin、肌毒素(sarcotoxin)、線粒體前體蛋白和其片段，類似物及衍生物。
10.權(quán)利要求9所述方法，其中陽離子寡肽是magainin。
11.權(quán)利要求10所述方法，其中magainin選自magainin 1和magainin 2。
12.權(quán)利要求1所述方法，其中陽離子寡肽是人血小板因子-4或其片段，類似物或衍生物。
13.權(quán)利要求12所述方法，其中人血小板因子-4的片段是具有下列序列的C-13肽Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser (Seq.I.D.＃1)
14.權(quán)利要求1所述方法，其中陽離子寡肽在脂/水的界面存在下，形成一個雙親的α螺旋。
15.權(quán)利要求14所述方法，其中陽離子寡肽至少有11個氨基酸長。
16.權(quán)利要求14所述方法，其中陽離子寡肽實(shí)質(zhì)上是相當(dāng)于一個氨基酸殘基序列，其含有aa1，-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3-aa4-X;其中aa1是Pro、Ala或Lys，aa2是Ile或Leu，aa3是Glu或Lys，aa4是Ser、Leu或Lys，而X是在自然狀態(tài)呈α螺旋的五氨基酸序列，并且具有aa5-Lys-Lys-aa6-Gly的一般序列，其中aa5是Ala或Leu，而aa6是Leu或Phe。
17.權(quán)利要求16所述方法，其中陽離子寡肽含有一個選自下列的氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃5);Ala-Leu-Tyr-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Giu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Sequence I.D.＃6);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃7);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃8);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly(Seq.I.D.＃10);Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃11);和Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃12)。
18.權(quán)利要求14所述方法，其中陽離子寡肽含有氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;其中氨基酸殘基可以是d-氨基酸。
19.權(quán)利要求15所述方法，其中陽離子寡肽含有氨基酸序列Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly.
20.一種治療由腸桿菌科細(xì)菌引起之感染的方法，其包括(a)能抑制腸桿菌科細(xì)菌生長的β-內(nèi)酰胺抗生素，(b)膜活性物質(zhì)。
21.權(quán)利要求20所述方法，其中β-內(nèi)酰胺抗生素選自青霉素、頭孢菌素、carbapenem、單菌霉素、頭霉素、Pyrazidon和Penem。
22.權(quán)利要求21所述方法，其中β-內(nèi)酰胺抗生素是頭孢菌素。
23.權(quán)利要求22所述方法，其中頭孢菌素選自cefepime、頭孢氨噻、頭孢噻甲羧肟。
24.權(quán)利要求21所述方法，其中β-內(nèi)酰胺抗素是carbapenem。
25.權(quán)利要求24所述方法，其中Carbapenem是imipenem。
26.權(quán)利要求21所述方法，其中β-內(nèi)酰胺抗生素是單菌霉素。
27.權(quán)利要求26所述方法，其中單菌霉素是aztreonam。
28.權(quán)利要求20所述方法，其中膜活性物質(zhì)是陽離子寡肽。
29.權(quán)利要求28所述方法，其中陽離子寡肽是magainin。
30.權(quán)利要求29所述方法，其中magainin選自magainin 1和magainin 2。
31.權(quán)利要求26所述方法，其中陽離子寡肽是人血小板因子-4或其片段，類似物或衍生物。
32.權(quán)利要求31所述方法，其中人血小板因子-4的片段是具有下列序列的C-13肽Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser(Seq.I.D.＃1).
33.權(quán)利要求28所述方法，其中陽離子寡肽在脂/水的界面存在下形成一個雙親的α螺旋。
34.權(quán)利要求33所述方法，其中陽離子寡肽至少有11個氨基酸殘基長。
35.權(quán)利要求33所述方法，其中陽離子寡肽實(shí)質(zhì)上相應(yīng)于一個氨基酸殘基序列，其包含aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3-aa4-X其中aa1是Pro、Ala或Lys，aa2是Ile或Leu，aa3是Glu或Lys，aa4是Ser、Leu或Lys，而X是在自然狀態(tài)下呈α螺旋的五氨基酸序列，且含有一般序列aa5-Lys-Lys-aa6-Gly，其中aa5是Ala或Leu，且aa6是Leu或Phe。
36.權(quán)利要求35所述方法，其中陽離子寡肽含有選自下列的氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃5);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Sequence I.D.＃6);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃7);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃8);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly(Seq.I.D.＃10);Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃11);和Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃12).
37.權(quán)利要求33所述方法，其中陽離子寡肽包含氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;其中氨基酸殘基可以是d-氨基酸。
38.權(quán)利要求34所述方法，其中陽離子寡肽含有氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly.
39.一種用于治療由大腸桿菌引起之細(xì)菌感染的組合物，其含有(a)cefepime和(b)magainin 2。
40.一種用于治療由大腸桿菌引起之感染的組合物，其含有(a)cefepime和(b)含下列氨基酸殘基序列的人血小板因子-4的C-13肽Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser(Seq.I.D.＃1).
41.一種用于治療由大腸桿菌引起之細(xì)菌感染的組合物，其含有(a)cefepime和(b)陽離子雙親性α-螺旋寡肽。
42.權(quán)利要求41所述組合物，其中寡肽至少有11個氨基酸殘基長。
43.權(quán)利要求42所述組合物，其中寡肽實(shí)際上相當(dāng)于一個氨基酸殘基序列，其含有aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3-aa4-X其中aa1是Pro、Ala或Lys，aa2是Ile或Leu，aa3是Glu或Lys，aa4是Ser、Leu或Lys，而X是在自然狀態(tài)下呈α螺旋的五氨基酸序列，且含有一般序列aa5-Lys-Lys-aa6-Gly，其中aa5是Ala或Leu，而aa6是Leu或Phe。
44.權(quán)利要求43所述組合物，其中陽離子寡肽含有選自下列的氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃5);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Sequence I.D.＃6);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃7);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃8);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly(Seq.I.D.＃10);Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃11);和Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃12).
45.權(quán)利要求44所述組合物，其中陽離子寡肽含有氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly其中氨基酸殘基可以是d-氨基酸。
46.權(quán)利要求42所述組合物，其中陽離子寡肽含有下列氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly.
47.一種用于治療由大腸桿菌引起之感染的組合物，其含有(a)aztreonom和(b)magainin 2。
48.一種治療由對β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起之感染的方法，其包括給患者使用在用藥一段時間后能有效抑制微生物生長的、治療上有效量的組合物，該組合物含有(a)能抑制微生物生長的β-內(nèi)酰胺抗生素和(b)陽離子寡肽。
49.權(quán)利要求48的方法，其中β-內(nèi)酰胺的量是亞抑制劑量。
50.權(quán)利要求48的方法，其中β-內(nèi)酰胺選自青霉素、頭孢菌素、carbapenem、單菌霉素、頭霉素、pyrazidon和penem。
51.權(quán)利要求48的方法，其中陽離子寡肽選自magainin、cecropin、肌毒素(sarcotoxin)、線粒體前體蛋白及其片段、類似物和衍生物。
52.權(quán)利要求48的方法，其中陽離子寡肽是人血小板因子-4片段，類似物或衍生物。
53.權(quán)利要求52的方法，其中人血小板因子-4的片段是一個具有下列氨基酸殘基序列的C-13肽Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser(Seq.I.D.＃1).
54.權(quán)利要求48的方法，其中陽離子寡肽在脂/水界面存在下形成一個雙親性α螺旋。
55.權(quán)利要求54的方法，其中陽離子寡肽至少有11個氨基酸殘基長。
56.權(quán)利要求55的方法，其中陽離子寡肽實(shí)際上相應(yīng)于一個含有下列序列的氨基酸殘基序列aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3-aa4-X其中aa1是Pro、Ala或Lys，aa2是Ile或Leu，aa3是Glu或Lys，aa4是Ser、Leu或Lys，而X是在自然狀態(tài)下呈α螺旋的五氨基酸序列，且含有一般序列aa5-Lys-Lys-aa6-Gly，其中aa5是Ala或Leu，且aa6是Leu或Phe。
57.權(quán)利要求56的方法，其中陽離子寡肽含有一個選自下列的氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃5);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Sequence I.D.＃6);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃7);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃8);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly(Seq.I.D.＃10);Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃11);和Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃12).
58.權(quán)利要求57的方法，其中陽離子寡肽含有氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;其中氨基酸殘基可以是d-氨基酸。
59.權(quán)利要求55的方法，其中陽離子寡肽含有下列序列Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly.
60.一種治療腸桿菌科細(xì)菌感染的方法，包括給患者使用在用藥一段時間后足以有效地抑制細(xì)菌生長的，治療上有效量的組合物，該組合物含有(a)能抑制腸桿菌科細(xì)菌生長的β-內(nèi)酰胺抗生素，和(b)至少一種膜活性物質(zhì)。
61.權(quán)利要求60的方法，其中β-內(nèi)酰胺抗生素的劑量是亞抑制劑量。
62.權(quán)利要求60的方法，其中β-內(nèi)酰胺抗菌素選自青霉素、頭孢菌素、carbapenem、單菌霉素、頭霉素、pyrazidon和penem。
63.權(quán)利要求60的方法，其中膜活性物質(zhì)是陽離子寡肽。
64.權(quán)利要求63的方法，其中陽離子寡肽選自magainin、cecropin、肌毒素(sarcotoxin)，線粒體前體蛋白、其片段、類似物，和衍生物。
65.權(quán)利要求63的方法，其中陽離子寡肽是人血小板因子-4，其片段、類似物或衍生物。
66.權(quán)利要求65的方法，其中人血小板因子-4的片段是一個含有下列氨基酸殘基序列的C-13肽，Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser(Seq.I.D.＃1).
67.權(quán)利要求63的方法，其中陽離子寡肽是一個在脂/水界面存在下的雙親性α-螺旋。
68.權(quán)利要求67的方法，其中陽離子寡肽至少有11個氨基酸殘基長。
69.權(quán)利要求68的方法，其中陽離子寡肽含有氨基酸殘基序列aa1-Leu-Tyr-Lys-Lys-aa2-aa2-Lys-Lys-Leu-Leu-aa3-aa4-X其中aa1是Pro、Alu或Lys，aa2是Ile或Leu，aa3是Glu或Lys，aa4是Ser、Leu或Lys，而X是在自然狀態(tài)下呈α-螺旋的五氨基酸序列且含有一般序列aa5-Lys-Lys-aa6-Gly，其中aa5是Ala或Leu，aa6是Leu或Phe。
70.權(quán)利要求69的方法，其中陽離子寡肽含有一個選自下列的氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃5);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Sequence I.D.＃6);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃7);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃8);Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly(Seq.I.D.＃10);Lys-Trp-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃11);和Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Seq.I.D.＃12).
71.權(quán)利要求69的方法，其中陽離子寡肽含有氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly，其中氨基酸殘基可以是d-氨基酸。
72.權(quán)利要求68的方法，其中陽離子寡肽含有氨基酸殘基序列Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly.
73.一種治療由大腸桿菌引起細(xì)菌感染的方法，包括給患者使用足以有效地抑制細(xì)菌生長之一段時間的、治療上有效量的組合物，該組合物含有(a)cefepime和(b)magainin 2。
74.一種治療由大腸桿菌引起之細(xì)菌感染方法，包括給患者使用足以有效抑制細(xì)菌生長之一段時間的治療上有效量的組合物，該組合物含有(a)cefepime和(b)包含下列氨基酸殘基序列的人血小板因子-4的C-13肽Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser;(Seq.I.D.＃1)
75.一種治療由大腸桿菌引起之細(xì)菌感染的方法，包括給患者使用足以有效抑制細(xì)菌生長之一段時間的、治療上有效量的組合物，該組合物含有(a)cefepime和(b)包含下列氨基酸殘基序列的陽離子寡肽Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(序列標(biāo)號＃7)
76.一種用于治療由大腸桿菌引起之細(xì)菌感染的方法，包括給患者使用足以有效抑制細(xì)菌生長之一段時間的、治療上有效量的組合物，該組合物含有(a)cefepime和(b)包含下列氨基酸殘基序列的陽離子寡肽Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly;其中所有的氨基酸殘基是d-氨基酸。
77.一種治療由大腸桿菌引起之細(xì)菌感染的方法，包括給患者使用足以有效抑制細(xì)菌生長之一段時間的、治療上有效量的組合物，該組合物含有(a)cefepime和(b)包含下列氨基酸殘基序列的陽離子寡肽Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly(Sequence I.D.＃6);
78.一種治療由大腸桿菌引起之細(xì)菌感染的方法，包括給患者使用足以有效抑制細(xì)菌生長之一段時間的、治療上有效量的組合物，該組合物有(a)cefepime和(b)包含下列氨基酸殘基序列的陽離子寡肽Ala-Leu-Tyr-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Orn-Leu-Leu-Orn-Ser-Ala-Orn-Orn-Leu-Gly
79.一種治療由大腸桿菌引起之細(xì)菌感染的方法，包括給患者使用足以有效抑制細(xì)菌生長之一段時間的、治療上有效量的組合物，該組合物含有(a)aztreonam和(b)MGN 2。
80.一種體外用活性補(bǔ)體篩選具有抗菌活性組合物的方法，其包括(a)把被篩選的組合物與靶細(xì)菌和活性補(bǔ)體級聯(lián)組份合并;(b)檢測組合物對靶細(xì)菌的抗菌活性。
81.權(quán)利要求80的方法，其中在合并步驟前用亞最小抑菌濃度的β-內(nèi)酰胺抗生素預(yù)處理靶細(xì)菌。
82.權(quán)利要求80的方法，其中活性補(bǔ)體級聯(lián)組份是血清提供的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療由對含有兩種或多種活性劑的β-內(nèi)酰胺抗生素敏感的微生物引起之感染的組合物和方法。在一個實(shí)施方案中，本組合物含有(1)一種β-內(nèi)酰胺抗生素和(2)一種陽離子寡肽，在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及一種含有(1)能抑制腸桿菌科細(xì)菌生長的β-內(nèi)酰胺抗生素和(2)至少一種膜活性物質(zhì)的組合物。另外，本發(fā)明還涉及一種體外篩選可能的殺菌組合物的改良方法，其中包含活性補(bǔ)體級聯(lián)組份。
文檔編號A61K38/17GK1054900SQ9110222
公開日1991年10月2日 申請日期1991年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月23日
發(fā)明者理查德·P·達(dá)維尤, 詹姆斯·J·布雷克, 韋斯利·L·克塞德 申請人:布里斯托爾-米爾斯·斯奎布公司