專利名稱:含白細(xì)胞介素-4活性組份的藥物組合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及含有活性組份IL-4的藥物組合物,該活性組份可誘導(dǎo)接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物產(chǎn)生對其有效免疫反應(yīng)。本發(fā)明還涉及IL-4在制造誘發(fā)對地方性慢性傳染原有效免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用,以及涉及通過對哺乳動物施用有效量的白細(xì)胞介素-4,誘發(fā)哺乳動物受地方性慢性傳染原作用后產(chǎn)生對其有效免疫反應(yīng)的方法。
最初M.Howard等將白細(xì)胞介素-4〔下文稱為“IL-4,但也稱為B細(xì)胞刺激因子1(BSF-1)〕描述為T細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子(J.Exp.Med.(1982),Vol.155,pp.914-23),其與IL-2不同,后者系正常的小鼠B淋巴細(xì)胞可經(jīng)長期的組織培養(yǎng)并與活化的B淋巴細(xì)胞反應(yīng),以保持其長達(dá)4個月的繁殖。雖然混合的B淋巴細(xì)胞外植體已經(jīng)用于促進培養(yǎng),但似乎在組織培養(yǎng)中的IL-4特別能提高具有未成熟表型的B淋巴細(xì)胞。例見C.Perchel et al.,J.Immunol.(1989),Vol.142,1558-1568。此外,G.Trenn等(J.Immunol.(1988),Vol.140,1101-1106)揭示了IL-4刺激靜止鼠T細(xì)胞Lyt-2+亞群中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的發(fā)育。H.Spits等(J.Immunol.(1987),Vol.139,1142-47)揭示了IL-4可以作為T細(xì)胞生長因子作用于離體人細(xì)胞,因而與IL-2不同。
鼠IL-4基因已經(jīng)在COS-7細(xì)胞中克隆和表達(dá)(參閱T.Otsuka et al.,Nuc.Acids Res.1987,Vol.15,333-334)??寺〉囊蜃泳哂性谟蒚細(xì)胞培養(yǎng)物上清液經(jīng)純化后所得因子的組織培養(yǎng)中的全部活性。關(guān)于人IL-4基因的克隆和表達(dá),N.Arai和T.Yokota等介紹了通過組織培養(yǎng)方法,在COS-7細(xì)胞中產(chǎn)生的因子具有類似于天然分子的活性(N.Arai et al.,J.Immunol.1989,Vol.142,274-282和T.Yokota et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.1986,Vol.83,5844-5848)。對人和鼠細(xì)胞系統(tǒng)的IL-4的研究,可以認(rèn)為,產(chǎn)生附加的體外的活性是由于分子的原因,即ⅰ)IL-4在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)IgE合成中起著重要的作用,產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞亞群的方法可以誘導(dǎo)繁殖(參閱S.Romagnani et al.,Clin.Immunol,Immunopathol.1989,Vol.50,513-523);ⅱ)在組織培養(yǎng)中的正常人B淋巴細(xì)胞上,IL-4可以誘導(dǎo)低親和力的Fcε受體(CD23)(參閱T.DeFrance et al.,J.Exp.Med.1987,Vol.165,1459-1457);ⅲ)采用非常精確的方法,IL-4可與其他淋巴細(xì)胞活素尤其是干擾素-γ和T細(xì)胞相互作用(參閱R.L.Coffman et al.,Immunol.Res.1988,Vol.102,5-27和S.Romagnani et al.,引文同上,以及M.D.Widmer et al.,Nature,1987,Vol.326,795-798),從而使B細(xì)胞繁殖和改變。
但是仍然需要證明的是所報導(dǎo)的人IL-4體外活性能夠增加和增強免疫反應(yīng),例如哺乳動物受地方性慢性傳染原作用后增加抗體水平。
我們出乎意料地發(fā)現(xiàn),對接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物(例如人)施用有效量的IL-4,可以在接受或重復(fù)接受這類傳染原的哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)對這類傳染原的有效免疫反應(yīng)。
因此,本發(fā)明提供了對接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物誘導(dǎo)對這類傳染原的有效免疫反應(yīng)的藥物組合物,所述組合物含有活性組份IL-4。
本發(fā)明還提供IL-4在制造對接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物誘導(dǎo)對該傳染原的有效免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物對該傳染原的有效免疫反應(yīng)的方法,該方法包括給所述哺乳動物施用有效誘導(dǎo)量的IL-4。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)初次或重復(fù)接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物產(chǎn)生有效量的抗體的方法,該方法包括施用有效誘導(dǎo)量的IL-4。
本發(fā)明還提供了對重復(fù)接受過地方性慢性傳染原由于沒有IL-4免疫反應(yīng)還不能足以充分或迅速地防止疾病復(fù)發(fā)的哺乳動物,增強其免疫反應(yīng)的方法,該方法包括給所述哺乳動物施用有效量的IL-4。
本發(fā)明還提供了對初次接受過地方性慢性傳染原由于沒有IL-4,其免疫反應(yīng)還不能足以充分或迅速地防止發(fā)病的哺乳動物,增強其免疫反應(yīng)的方法,該方法包括給所述哺乳動物施用有效量的IL-4。
附
圖1說明根據(jù)本發(fā)明給人病毒病(猿猴水痘病毒)的猿猴模擬(非洲綠猴)施用人IL-4獲得的免疫反應(yīng)。
附圖2說明根據(jù)本發(fā)明施用重組人IL-4產(chǎn)生對人病毒病的抗體。
本發(fā)明的任務(wù)在于將已經(jīng)報導(dǎo)的組織培養(yǎng)中的許多人IL-4活性轉(zhuǎn)變?yōu)閷Σ溉閯游锛丛澈锬M的體內(nèi)活性。為了確定IL-4的體內(nèi)活性,選擇了人水痘皰疹病毒傳染的猿猴模擬。在該模擬中,用猿猴水痘病毒(SVV)對非洲綠猴(Cercopithecus aerthiops)。進行幾乎致死的攻擊。通過用SVV再感染,殘存者提高了對疾病的穩(wěn)定的免疫性,而這種免疫性根據(jù)E.D.Roberts等介紹,分別是由固定的和/或循環(huán)的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的循環(huán)抗SVV抗體得到的(參閱E.D.Roberts et al.,Am.J.Vet,Res.1984,45,523-530)。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員采用這種傳統(tǒng)的體內(nèi)哺乳動物模擬方法來確定可能的人抗水痘皰疹抗病毒性和該哺乳動物模式的具體細(xì)節(jié)及其使用的實例已由K.F.Soike等(Antimicrob.Ag.Chemother.,1986,Vol.29,20-25和Antiviral Res.,1981,Vol.1,325-337)作了介紹。D.W.Horohov等也報導(dǎo)了在組織培養(yǎng)中,IL-4誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞的改變能夠影響復(fù)制流感病毒。1型人T細(xì)胞白血病病毒的復(fù)制已由S.Miyatake等作了介紹(Nuc.Acids Res.,1988,Vol.16,6541-6566)。因此,確定SVV猿猴模擬中的IL-4對確定IL-4對抗體產(chǎn)生和免疫細(xì)胞繁殖的作用是適宜的。
我們將未得到重組人IL-4的猴子作對比,出乎意料地發(fā)現(xiàn),通過再感染或再接受而得到有效量的重組人IL-4的非洲綠猴對SVV產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)上較強而快速的免疫反應(yīng)。
本文所說“對接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物誘導(dǎo)其對該傳染原的有效免疫反應(yīng)”包括(1)對初次接受這類地方性慢性傳染原的哺乳動物誘導(dǎo)有效量的抗體;(2)誘導(dǎo)重復(fù)接受過地方性慢性傳染染原的哺乳動物產(chǎn)生有效量的抗體;(3)對重復(fù)接受過地方性慢性傳染原但由于沒有IL-4而不能產(chǎn)生足夠強或足夠迅速地防止疾病復(fù)發(fā)的免疫反應(yīng)的哺乳動物,增強其免疫反應(yīng);(4)對初次接受過地方性慢性傳染原但由于沒有IL-4而不能產(chǎn)生足夠強或足夠迅速地防止發(fā)病的免疫反應(yīng)的哺乳動物,增強其免疫反應(yīng)。盡管所述哺乳動物由于沒有IL-4所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不能足夠強或足夠迅速地防止該哺乳動物發(fā)病,但我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)了有效的方法,該方法包括給所述哺乳動物施用各種有效量的IL-4,最好施用重組人IL-4。
本文所述“地方性慢性傳染原“系指誘導(dǎo)哺乳動物免疫反應(yīng)的那些傳染原,包括病毒傳染原,如產(chǎn)生人免疫缺陷病毒(HIV)即愛滋病病毒的病毒傳染原;引起細(xì)菌傳染的細(xì)菌傳染原,如葡萄球菌屬;產(chǎn)生真菌傳染的傳染原,如假絲酵母菌sp.;以及引起原生動物傳染的原生動物傳染原,如毛滴蟲屬sp.。
任何適合的IL-4都可用于本發(fā)明。最近許多實驗室已經(jīng)對IL-4的互補DNA(cDNA)進行了克隆或編定順序,例如Yokota等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,Vol.83,5894-5898(人);Lee等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,Vol.83,2061-2065(鼠);Noma等(Nature,1986,Vol.319,640-646(鼠),以及麻省波斯頓的Genzyme公司(人和鼠)。此外,由各種培養(yǎng)物上清液純化得到非重組IL-4,例如Grabstein等(J.Exp.Med.,1985,Vol.163,1405-1413(鼠);Ohara等(J.Immunol.,1985,Vol.135,2518-2523(鼠BSF-1)。所有上述論文涉及用于本發(fā)明的DNA、氨基酸順序和獲得適宜的IL-4材料的方法,都結(jié)合在本文內(nèi)容中。
用于本發(fā)明的IL-4優(yōu)選用人IL-4,特別優(yōu)選的是具有下列文獻(xiàn)所述順序的人IL-4Yokotaet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),Vol.83,5894-5898和1987年5月21日公開的PCT專利申請№87/02990,該文介紹了在大腸桿菌中表達(dá)并由大腸桿菌中分離得到的人IL-4(1987年7月29日申請的美國專利№079666和1988年7月12日申請的美國專利№194799)。由CHO細(xì)胞生產(chǎn)IL-4已由1989年7月28日申請的美國專利SN386937作了介紹。由大腸桿菌生產(chǎn)IL-4已由1989年10月31日申請的美國專利SN429588作了介紹。上述論文、PCT申請和美國專利申請的內(nèi)容都作為參考文獻(xiàn)結(jié)合在本文中。
根據(jù)本發(fā)明,哺乳動物施用有效量的IL-4,可防止由接受地方性慢性傳染原而引起的發(fā)病或疾病復(fù)發(fā),增加抗體水平和/或?qū)Τ醮谓邮芎?或重復(fù)接受地方性慢性傳染原的有效免疫反應(yīng)。這樣的有效量被限定為能顯著增加抗體水平的任何量的IL-4,但至少增加25%,優(yōu)選增加50%則被認(rèn)為是有意義的。優(yōu)選的施用量為每天每千克體重約0.25-15mg的IL-4,最好由大腸桿菌或CHO細(xì)胞經(jīng)重組方法產(chǎn)生的人IL-4。對哺乳動物更優(yōu)選的施用量為每天每千克體重約5-15.0mg的hIL-4,哺乳動物最優(yōu)選的施用量為每天每千克體重約5-10.0mg的hIL-4。
常用或定期使用的量視諸因素可以改變,例如嗜中心白細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)(如單核細(xì)胞減少或粒細(xì)胞減少的嚴(yán)重程度)、患者的年齡和營養(yǎng)水平等。通常開始時IL-4每天施用,然后在患者活著期間可以定期繼續(xù)施用。在開始檢查中性白細(xì)胞數(shù)和IL-4對提高抗體水平的作用程度,可以確定劑量和施藥次數(shù)。
藥物可以通過靜脈、鼻腔、非腸胃道、口服、皮下、肌內(nèi)、局部、皮膚或任何其他可接受的方法施用。IL-4可以任何數(shù)量的常規(guī)劑量形式施用。非經(jīng)腸胃道的制劑包括無菌溶液或混懸液。吸入用藥可以采用鼻腔或口腔噴霧或吹入方法。局部劑量形式包括冷霜,軟膏,洗劑,皮膚裝置(例如常規(guī)的儲器或基質(zhì)貼片)等。
由上述劑量形式組成的藥物組合物可采用常規(guī)技術(shù)和藥物上可接受的常規(guī)賦形劑和添加劑進行制備。
IL-4最好采用靜脈注射方式施用。施用溶液以采用凍干粉末進行配制,還可含有防腐劑、緩沖液和分散劑等。
IL-4優(yōu)先采用10毫摩爾檸檬酸緩沖液和不含防腐劑的無菌水配制成最高濃度不超過100mg/ml,通過連續(xù)靜脈滴注或靜脈注射施用。連續(xù)滴注可將日劑量藥物加到5ml標(biāo)準(zhǔn)鹽水中,采用機械泵或重力方法進行溶液滴注。
通過提高哺乳動物抗體水平,IL-4在增強對病毒傳染原的免疫反應(yīng)上的作用,可以采用下述測定方法測定。
用于下述兩個試驗的人重組IL-4是由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的,其制備方法在1989年7月29日申請的美國專利SN386937中已經(jīng)作了介紹。
所做的兩個試驗可鑒定由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的人重組IL-4(“rHuIL-4”)對于人抗體SVV再攻擊的反應(yīng)的作用和對血細(xì)胞參數(shù)的作用。
將開始就經(jīng)受由SVV試驗性感染引起的嚴(yán)重疾病的非洲綠猴用于再攻擊試驗,以便確定IL-4的作用。動物獲得IL-4為15天,在0天、給藥期和給藥后測定血清SVV中和抗體和血細(xì)胞量。在下述試驗1中,靜脈注射30和5.0μg//kg/天的由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4,每天注射2次;在下述試驗2中,以與試驗1同樣方式給藥,用藥量為5.0,1.0和0.25μg/kg/天的由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4。以4頭動物為一組,分配在各試驗中,各組在0天時,中和SVV抗體水平的分布相同。
由索馬里得到的非洲綠猴(Arcopithecus aethiops)是通過商業(yè)途徑買到的野生動物。全部猴子至少在使用前90天進行檢疫,它們都是捕獲的野生動物,不同性別和年齡混合在一起,體重為2至6kg。選擇處理組的猴子應(yīng)該每組的性別比率和平均體重相似。
用于這些研究的猿猴水痘病毒(“SVV”)都是由受天然傳染的patas猴(Erythocebus patas)中分離得到的。將該分離物在非洲綠猴中傳代,制造病毒原種。在受傳染猴的周圍血淋巴細(xì)胞的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出SVV。刮下受感染的細(xì)胞與新鮮接種的Vero培養(yǎng)物以1∶3的比例,通過傳代增加受感染的培養(yǎng)物。在傳代到第5代時,將從表面上刮下受感染的Vero細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中,懸浮在含5%(重量)的胎牛血清和35%(重量)山梨醇的Eagle基本培養(yǎng)基中。將SVV原種分散在安瓿瓶中,在-70℃下貯藏。
用原種SVV的預(yù)定稀釋液感染猴子,即將1.5ml稀釋液經(jīng)氣管進入環(huán)狀軟骨組織,并將1.5ml稀釋液經(jīng)皮下進入腹部區(qū)。在進行各試驗時,滴定接種物在Vero細(xì)胞中形成噬菌斑的單位。
在每個試驗的0天和規(guī)定的時間測定SVV中和抗體的量。滴定度用中和80%病毒所需要的最大稀釋度的倒數(shù)表示,以測定在Vero細(xì)胞上SVV噬菌斑的形成。扼要地說,將猴血清樣品與SVV的100-200個噬菌斑形成單位一起在37℃溫育60分鐘。溫育后,將混合物置于已在37℃下溫育60分鐘的細(xì)胞上,用瓊脂層復(fù)蓋。在37℃下溫育7天后,細(xì)胞被染色,測定留存SVV噬菌斑數(shù)。
采用以前已由E.D.Roberts(E.D.Roberts et al.,Am.J.Vet.Res.,1984,Vol.45,523-530)和K.F.Soivie(K.F.Soivie et al.,Antimicro.Ag.Chemother,1986,Vol.29,20-25和Antiviral Res.,1981,Vol.1,325-337)所述方法,測定每個血清樣品中的紅血細(xì)胞、白血細(xì)胞和亞類的總數(shù)、以及每毫升血小斑數(shù)。此外,采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法,測定血紅蛋白和血細(xì)胞容量。
下述兩個試驗是測定由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4對用SVV在非洲綠猴再感染的免疫反應(yīng)的作用。
試驗1使用開始由SVV進行嚴(yán)重感染而仍存活的非洲綠猴。用SVV再攻擊,可以看到抗體迅速增加。在每天不注射或靜脈注射兩種劑量(5.0和30.0μg/kg/天,每天2次)的rHuIL-4和安慰劑的條件下研究再攻擊的反應(yīng)。每組有4只動物,在0天開始給藥,連續(xù)15天。在給rHuIL-4或安慰劑的第8天,用SVV再次攻擊動物。在不同的時間采取血樣,以檢測SVV中和抗體、白血細(xì)胞量和其他血液參數(shù)。SVV中和抗體的測定結(jié)果示于圖1。
5.0和30.0μg/kg/天的rHuIL-4對SVV再攻擊產(chǎn)生了具有統(tǒng)計學(xué)上意義的高水平的抗體反應(yīng)。5.0的反應(yīng)顯著高于30.0μg/kg/天。沒有劑量反應(yīng)可能是由于對組織培養(yǎng)中的IL-4的最佳劑量。
此外,獲得rHuIL-4的動物,其抗體水平的計算斜度也不同,說明在這些動物組中的抗體出現(xiàn)比安慰劑組迅速。
試驗2試驗方法與試驗1相似,但使用3個劑量水平的由CHO產(chǎn)生的rHuIL-4。采用與試驗1相似方法,在15天內(nèi)靜脈注射5.0、1.0和0.25μg/kg/天,每天2次。每組有4只動物。
SVV抗體產(chǎn)生的結(jié)果示于圖2。雖然在低劑量時不存在有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異,但是5.0μg的劑量,在第22天出現(xiàn)趨向于抗體量增高。低劑量(1.0和0.25μg/kg/天)對增強抗體反應(yīng)無效。試驗1和2都證明,增加抗體發(fā)生在5.0μg/kg/天和接受過SVV地方性慢性傳染的猴中。
基于上述試驗的結(jié)果,可以期望哺乳動物在最初或第一次接受過地方性慢性傳染后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)還不能充分或迅速地足以防止發(fā)病時,IL-4優(yōu)選rHuIL-4能夠增強哺乳動物的免疫反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.制備用于誘導(dǎo)接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物產(chǎn)生對其有效免疫反應(yīng)的藥物組合物的方法,該方法包括將有效量的活性組份IL-4和藥物上可接受的賦形劑相混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備藥物組合物的方法,其中活性組份是人IL-4,最好是由大腸桿菌產(chǎn)生的重組人IL-4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的制備藥物組合物的方法,其中IL-4的使用量約為每天每千克體重0.25-15mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制備藥物組合物的方法,其中所述誘導(dǎo)包括(a)誘導(dǎo)第一次或重復(fù)接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物產(chǎn)生有效量的抗體;或(b)增強重復(fù)接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物的免疫反應(yīng),其中由于所述哺乳動物缺乏IL-4而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不能足以充分和迅速地防止疾病復(fù)發(fā);或(c)增強初次接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物的免疫反應(yīng)的方法,其中由于所述哺乳動物缺乏IL-4而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不足以充分或迅速地防止發(fā)病。
5.以上任何一項權(quán)利要求所述的方法,其中地方性慢性傳染原是病毒、細(xì)菌、真菌或原生動物傳染原。
全文摘要
本文介紹了IL-4在制備誘發(fā)接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用和含有該活性組份IL-4,優(yōu)選由大腸桿菌產(chǎn)生的重組IL-4的藥物組合物,以及通過給哺乳動物施用有效量的IL-4,優(yōu)選施用由大腸桿菌產(chǎn)生的重組人IL-4,誘導(dǎo)接受過地方性慢性傳染原的哺乳動物產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)的方法。
文檔編號A61K38/20GK1055116SQ91101850
公開日1991年10月9日 申請日期1991年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1990年3月21日
發(fā)明者杰羅姆·施瓦茨, 克羅德·H·納什 申請人:先靈公司