本發(fā)明涉及一種利用石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行腫瘤檢測(cè)的方法，特別是一種基于基于腫瘤內(nèi)間質(zhì)流體壓力響應(yīng)的利用石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行腫瘤檢查的方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，許多研究者致力于研究高性能、具有生物響應(yīng)特性的材料來(lái)響應(yīng)并放大腫瘤區(qū)域病變信號(hào)，從而區(qū)分腫瘤組織和正常組織。這在腫瘤診斷和治療方面正引起科學(xué)界廣泛關(guān)注，但仍存在極大的挑戰(zhàn)。

相異于正常組織，腫瘤內(nèi)微環(huán)境存在著特異性信號(hào)：腫瘤組織血管生長(zhǎng)異常，結(jié)構(gòu)錯(cuò)雜、腫瘤組織內(nèi)間質(zhì)流體壓力(ifp)較高、缺氧環(huán)境、酸性ph環(huán)境、存在癌細(xì)胞特異性生物標(biāo)記物等。利用這一系列特性，可區(qū)分正常組織及腫瘤組織。目前，文獻(xiàn)曾報(bào)道，利用癌細(xì)胞特異性標(biāo)記物如egfr，her2/neu等，設(shè)計(jì)熒光染料抗體進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)，但這類(lèi)標(biāo)記物及其表達(dá)水平與具體腫瘤種類(lèi)有密切關(guān)系，無(wú)法廣泛應(yīng)用于大范圍普遍的腫瘤檢測(cè)。也有研究利用腫瘤微環(huán)境中血管形成異常及酸性環(huán)境，設(shè)計(jì)具有ph響應(yīng)的材料進(jìn)行腫瘤檢測(cè)，但材料制備非常復(fù)雜。利用腫瘤組織特異性信號(hào)檢測(cè)腫瘤靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，但目前腫瘤類(lèi)型的局限性、缺少新型材料的制備、背景干擾等方面還存在許多問(wèn)題需要解決。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有流體壓力響應(yīng)以及腫瘤細(xì)胞核靶向的石墨烯量子點(diǎn)生物熒光探針進(jìn)行腫瘤檢測(cè)的新方法?

為達(dá)到上述目的,克服這些問(wèn)題，我們利用腫瘤內(nèi)ifp效應(yīng)來(lái)檢測(cè)區(qū)分腫瘤及正常組織，因腫瘤內(nèi)ifp較高，是實(shí)體瘤內(nèi)普遍存在的性質(zhì)，適用性廣泛，可用于普遍的腫瘤檢測(cè)。根據(jù)這一特性，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一種具有ifp響應(yīng)的石墨烯量子點(diǎn)(gqds)，制備方法詳見(jiàn)專(zhuān)利：(磺酸基石墨烯量子點(diǎn)生物熒光探針及其應(yīng)用)（201510394852.8）。在正常組織，正常壓力下無(wú)法穿透細(xì)胞；而在腫瘤組織內(nèi)，ifp較高時(shí)，具有ifp響應(yīng)的gqds容易透過(guò)細(xì)胞膜，靶向標(biāo)記腫瘤細(xì)胞核。經(jīng)我們驗(yàn)證，在多種腫瘤組織內(nèi)皆有此現(xiàn)象，并且這種材料具有低毒、量子產(chǎn)率高、高熒光強(qiáng)度的優(yōu)點(diǎn)，并且可高效快速靶向腫瘤細(xì)胞核(0.5h)，非常適用于對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。

根據(jù)上述機(jī)理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用石墨烯量子點(diǎn)進(jìn)行腫瘤檢測(cè)的方法，其特征在于具有以下的過(guò)程和步驟：建立動(dòng)物腫瘤模型，每隔一天將石墨烯量子點(diǎn)gqds按(30～200mg/kg靜脈注射入動(dòng)物模型，0.5h后，檢測(cè)腫瘤內(nèi)壓力，并切片觀察gqds在腫瘤組織內(nèi)分布，在2-7mmhg腫瘤內(nèi)壓條件下，gqds無(wú)法靶向腫瘤組織，無(wú)法標(biāo)記細(xì)胞核；>11mmhg，gqds可以特異靶向腫瘤組織，并高效標(biāo)記腫瘤組織細(xì)胞核。

腫瘤壓力響應(yīng)，藥物降壓后，無(wú)法標(biāo)記腫瘤細(xì)胞核

當(dāng)用藥物降低腫瘤組織內(nèi)ifp后，gqds在腫瘤組織內(nèi)分布無(wú)腫瘤靶向，并且不能標(biāo)記細(xì)胞核，說(shuō)明此量子點(diǎn)靶向腫瘤組織細(xì)胞核的性能與ifp有密切聯(lián)系，具有良好的腫瘤ifp響應(yīng)性能，可以應(yīng)用于腫瘤組織細(xì)胞核標(biāo)記診斷檢測(cè)。降低內(nèi)壓的具體方法如下：煙酰酸和伊馬替尼溶于生理鹽水中，煙酰酸通過(guò)腹腔注射(500mg/kg,0.01ml/g，注射后1h檢測(cè))；伊馬替尼通過(guò)灌胃注射(50mg/kg,每日給藥，四天后檢測(cè))。利用“針芯”技術(shù)來(lái)檢測(cè)腫瘤內(nèi)ifp值。將標(biāo)準(zhǔn)23號(hào)注射針填充尼龍線(xiàn)和生理鹽水(其中添加50ie/ml肝素)，將其插入腫瘤組織中心，注射器連接至壓力傳感器。此裝置可以連續(xù)而穩(wěn)定地檢測(cè)流體壓力。檢測(cè)過(guò)程中，通過(guò)壓縮和解壓縮方式確定針頭與傳感器之間流體的連通性。腫瘤ifp值取兩次讀數(shù)平均值，肌肉或皮下組織內(nèi)ifp值作為空白，此方法處理后，腫瘤ifp值下降40%以上。

利用壓力響應(yīng)的gqds(30-200mg/kg)靜脈注射進(jìn)入動(dòng)物模型，0.5h后，gqds特異靶向腫瘤組織，并高效標(biāo)記腫瘤組織細(xì)胞核，我們利用兩種可降低腫瘤組織內(nèi)ifp的藥物煙酰酸以及伊馬替尼，使腫瘤組織內(nèi)ifp分別降低了60%以及40%后(相比于空白)，也發(fā)現(xiàn)gqds無(wú)法靶向小鼠腫瘤組織，無(wú)法標(biāo)記細(xì)胞核。gqds在小鼠腫瘤組織內(nèi)分布比較分散，在組織間質(zhì)內(nèi)分散。印證了此量子點(diǎn)靶向腫瘤組織細(xì)胞核的性能與腫瘤ifp敏感性。

體內(nèi)，體外均無(wú)毒，并且可以快速，完全代謝

gqds體內(nèi)體外毒性均很低，靜脈注射0.5h后，立即特異靶向腫瘤組織，并高效標(biāo)記腫瘤組織細(xì)胞核，24h后大部分從體內(nèi)代謝出來(lái)，在體內(nèi)低毒。gqds大量聚集在腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)，只有少量存在于正常組織間質(zhì)內(nèi)，并不進(jìn)入正常組織細(xì)胞核。

本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)如下所述:

(1)石墨烯量子點(diǎn)對(duì)腫瘤細(xì)胞核特異性靶向。進(jìn)行標(biāo)記識(shí)別的方法簡(jiǎn)單，低毒，高熒光強(qiáng)度，不需要對(duì)材料進(jìn)行二次修飾?

(2)石墨烯量子點(diǎn)對(duì)腫瘤細(xì)胞核靶向特性具有良好的腫瘤ifp響應(yīng)效應(yīng)?

(3)在體內(nèi)可以直接標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，靶向效率高，應(yīng)用范圍廣。

附圖說(shuō)明

圖1石墨烯量子點(diǎn)(gqds)體內(nèi)高效靶向腫瘤組織細(xì)胞核的壓力敏感響應(yīng)。其中a:ifp隨皮下腫瘤體積增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)。b:不同ifp條件下，gqds在腫瘤組織內(nèi)分布變化。綠色：gqds；紅色：syto-17紅色細(xì)胞核染料。標(biāo)尺：10μm。

圖2經(jīng)過(guò)煙酰酸改變腫瘤ifp后，gqds在小鼠乳腺癌組織內(nèi)分布情況變化。a：經(jīng)過(guò)煙酰酸降壓藥物處理后，小鼠乳腺癌組織內(nèi)間質(zhì)流體壓力(ifp)變化情況。b,c：ifp改變后，60mg/kggqds在體內(nèi)腫瘤組織內(nèi)分布情況變化。b：空白，c：煙酰酸藥物處理。綠色：gqds；紅色：syto-17紅色細(xì)胞核染料。標(biāo)尺：10μm。

圖3經(jīng)過(guò)伊馬替尼改變腫瘤ifp后，gqds在小鼠乳腺癌組織內(nèi)分布情況變化。a：經(jīng)過(guò)伊馬替尼降壓藥物處理后，小鼠乳腺癌組織內(nèi)ifp變化情況。b,c：ifp改變后，60mg/kggqds在體內(nèi)腫瘤組織內(nèi)分布情況變化。b：空白，c：伊馬替尼藥物處理。綠色：gqds；紅色：syto-17紅色細(xì)胞核染料。標(biāo)尺：10μm。

圖4gqds在體內(nèi)體外毒性情況。a：小鼠乳腺癌細(xì)胞與不同濃度gqds共孵育12和24h后細(xì)胞活力檢測(cè)。b：gqds體內(nèi)分布情況。60mg/kggqds靜脈注射入動(dòng)物模型，0.5-24h后，在臟器內(nèi)分布情況。c：gqds體內(nèi)血生化毒性檢測(cè)。60mg/kggqds靜脈注射進(jìn)入動(dòng)物模型，0.5，24和96小時(shí)，檢測(cè)血生化指標(biāo)。腎功能指標(biāo)：血尿素氮(bun)和肌酐(crea)；肝指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)、堿性磷酸酶(alp)、總膽紅素(tbil)。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)將本發(fā)明的具體實(shí)施例敘述于后?

實(shí)施例1:

gqds對(duì)腫瘤內(nèi)壓力響應(yīng)能力：

壓力響應(yīng)gqds對(duì)腫瘤特異性靶向能力的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)皮下移植法，在小鼠右后肢接種乳腺癌腫瘤，建立動(dòng)物腫瘤模型。每隔一天將gqds(30-200mg/kg)靜脈注射入動(dòng)物模型，0.5h后，檢測(cè)腫瘤內(nèi)壓力，并切片觀察gqds在腫瘤組織內(nèi)分布。利用“針芯”技術(shù)來(lái)檢測(cè)腫瘤內(nèi)ifp值。將標(biāo)準(zhǔn)23號(hào)注射針填充尼龍線(xiàn)和生理鹽水(其中添加50ie/ml肝素)，將其插入腫瘤組織中心，注射器連接至壓力傳感器。此裝置可以連續(xù)而穩(wěn)定地檢測(cè)流體壓力。檢測(cè)過(guò)程中，通過(guò)壓縮和解壓縮方式確定針頭與傳感器之間流體的連通性。腫瘤ifp值取兩次讀數(shù)平均值，肌肉或皮下組織內(nèi)ifp值作為空白。為研究低ifp是否會(huì)阻礙gqds對(duì)腫瘤細(xì)胞核靶向性，60mg/kggqds注射入動(dòng)物模型0.5h后，將腫瘤組織取出后，組織樣品制成20μm厚的冷凍切片樣品，用于進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察gqds在腫瘤組織內(nèi)分布情況。發(fā)現(xiàn)ifp小于等于7mmhg腫瘤內(nèi)壓條件下，gqds在腫瘤組織內(nèi)分布比較分散，在組織間質(zhì)內(nèi)分散，無(wú)法靶向腫瘤組織，無(wú)法標(biāo)記細(xì)胞核。當(dāng)ifp大于等于11mmhg時(shí)，gqds可以特異靶向腫瘤組織，并高效標(biāo)記腫瘤組織細(xì)胞核。說(shuō)明此量子點(diǎn)靶向腫瘤組織細(xì)胞核的性能與腫瘤ifp有密切聯(lián)系，具有良好的腫瘤ifp響應(yīng)性能，可以應(yīng)用于腫瘤組織診斷檢測(cè)。具體結(jié)果參見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2:

gqds腫瘤壓力響應(yīng)敏感，藥物降壓后，無(wú)法標(biāo)記腫瘤細(xì)胞核：

煙酰酸溶于生理鹽水中，煙酰酸通過(guò)腹腔注射(500mg/kg,0.01ml/g，注射后1h檢測(cè))；此方法處理后，ifp下降了60%。伊馬替尼溶于生理鹽水中，伊馬替尼通過(guò)灌胃注射(50mg/kg,每日給藥，四天后檢測(cè))。利用上述“針芯”技術(shù)來(lái)檢測(cè)腫瘤內(nèi)ifp值。腫瘤ifp值取兩次讀數(shù)平均值，肌肉或皮下組織內(nèi)ifp值作為空白，此方法處理中腫瘤ifp值下降了40%。隨后60mg/kggqds注射入動(dòng)物模型0.5h后，將腫瘤組織取出，制成20μm厚的冷凍切片樣品，用于進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察gqds在腫瘤組織內(nèi)分布情況，發(fā)現(xiàn)gqds在未處理的腫瘤組織內(nèi)，ifp大于11mmhg,gqds可以特異性靶向腫瘤細(xì)胞核?而通過(guò)煙酰酸和伊馬替尼處理后的小鼠腫瘤組織內(nèi)，ifp小于7mmhg，無(wú)細(xì)胞核靶向性能。說(shuō)明此量子點(diǎn)靶向腫瘤組織細(xì)胞核的性能與腫瘤ifp有密切聯(lián)系。具體結(jié)果參見(jiàn)圖2，3。

實(shí)施例3:

gqds體內(nèi)，體外均無(wú)毒，并且可以快速，完全代謝：

在壓力敏感響應(yīng)腫瘤細(xì)胞核體內(nèi)靶向標(biāo)記的過(guò)程中，gqds均不產(chǎn)生毒性，能夠快速代謝出細(xì)胞和組織。尾靜脈注射0.5h后，體內(nèi)立即特異靶向腫瘤組織，并高效標(biāo)記腫瘤組織細(xì)胞核，24h后大部分從體內(nèi)代謝出來(lái)，在體內(nèi)低毒。gqds大量聚集在腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)，只有少量存在于正常組織間質(zhì)內(nèi)，并不進(jìn)入正常組織細(xì)胞核。此方法無(wú)腫瘤特異性，具有普適性和應(yīng)用性。