本發(fā)明涉及一種中藥活性成分，特別涉及一種槐耳醇提物的用途及制備方法。

背景技術(shù)：

槐耳是我國民間重要的藥用真菌，槐耳為多孔菌科真菌槐栓菌trametesrobiniophilamurr.的干燥子實(shí)體，別名槐檽、槐菌、槐雞、槐蛾、赤雞等，主要分布于陜西、山東、河北等地?！缎滦薇静荨酚涊d：槐耳，此槐樹上菌也，當(dāng)取堅(jiān)如桑耳者良。桑、槐、楮、榆、柳，此為五耳，軟者并堪啖，楮耳人常食，槐耳治痔。依此可見，堅(jiān)硬的入藥用的槐耳應(yīng)該并非作為食用的木耳。槐栓菌的菌蓋為半圓形，似耳樣，生長在古中國槐上，所以古稱“槐耳”，由于整個(gè)子實(shí)體形似蛾，所以又叫“槐菌”、“槐蛾”。綜上所知，歷代本草所記錄描述的“槐耳”，應(yīng)是生長在古老中國槐上的槐栓菌。

槐耳性平，味苦、辛，具有止血、止痢、抗癌等作用?；倍墓πг跉v代醫(yī)書中早有記載，《藥性論》記載：“能治風(fēng)，破血，益力?！薄侗静輬D經(jīng)》云：“治大便血及五痔、脫肛等?！弊鳛樵谥袊褢?yīng)用了1600余年的傳統(tǒng)中藥槐耳，無論是單味藥物及其提取物還是已用于癌癥輔助治療的槐耳顆粒，商品名“金克”在近年來都受到了學(xué)界的廣泛關(guān)注，尤其是抗腫瘤方面^[2]。

迄今為止，對(duì)槐耳化學(xué)成分進(jìn)行分離與細(xì)致的研究鮮有報(bào)道，大部分研究將目光聚焦在其粗提物槐耳清膏上，其良好的抗癌療效與極低的副作用已得到臨床廣泛的肯定?；倍w粒的制備是槐耳用熱水、乙醇提取清膏，濃縮到相對(duì)密度1.33以上，加人適量糊精、糖粉等輔料，混合均勻后制成顆粒，烘干后的棕黃色顆粒，每袋20g即槐耳顆粒劑，主要活性成分為多糖蛋白。經(jīng)小鼠肉瘤s180抑瘤試驗(yàn)，抑瘤率達(dá)40％～47％，說明多糖蛋白具有抗癌活性，是槐耳菌質(zhì)和槐耳清膏的有效作用部位。它是一種棕褐色粉末，沒有明顯的熔點(diǎn)，易溶于水，微溶于低濃度的乙醇，不溶于高濃度乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)溶劑。其水溶液透明呈黏稠狀，ph值為5.5，無旋光性。經(jīng)高效液相色譜和電泳分析表明其主成分基本為均一多糖，并由光譜和氣相層析方法證明槐耳多糖為一蛋白結(jié)合雜多糖，其中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.53％，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.93％，水分8.72％，其水解產(chǎn)物含l-阿拉伯糖(arabinose)，d-木糖(xylose)，d-甘露糖(mannose)，d-半乳糖(galactose)，d-葡萄糖(glucose)等6種單糖，以及脯氨酸(proline)，甘氨酸(glycine)，丙氨酸(alanine)，胱氨酸(cystine)，異亮氨酸(isoleucine)，天冬氨酸(asparticacid)，蘇氨酸(threonine)，絲氨酸(serine)，谷氨酸(glutamicacid)等18種氨基酸。

槐耳現(xiàn)有的提取方法有普通水提法、高溫高壓水提法、冷堿法、熱堿法，堿提法水溶性提取物的得率高于水提法，其中熱堿法提取物的得率最高為29.65％，但其粗多糖含量最低，冷堿法粗多糖的實(shí)際得率最高為6.93％。

目前，對(duì)于槐耳的研究，近年來主要集中在槐耳顆粒或浸膏對(duì)腫瘤細(xì)胞抗性方面，槐耳提取方法及化學(xué)成分進(jìn)行分離與細(xì)致的研究鮮有報(bào)道，大部分研究將目光聚焦在其粗提物槐耳清膏上，槐耳清膏為槐耳菌質(zhì)發(fā)酵后的熱水提取物，其含有多糖、蛋白質(zhì)、生物堿等多種有機(jī)成分及10余種礦物質(zhì)元素，主要活性成分為多糖蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種槐耳醇提物的用途，槐耳醇提物具有顯著的抑制胃癌bgc823細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞hct116增殖的效果，說明槐耳醇提物同樣具備抗腫瘤作用，對(duì)槐耳的藥用成分進(jìn)行了進(jìn)一步的開發(fā)利用，為抗胃癌、結(jié)腸癌藥物的開發(fā)提供了新的途徑。

本發(fā)明還提供了槐耳醇提物的制備方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種槐耳醇提物的用途，槐耳醇提物作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。

現(xiàn)有技術(shù)均采用槐耳水提物或多糖進(jìn)行研究，并用于抗腫瘤，并未揭示槐耳醇提物是否具有藥用價(jià)值，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)槐耳醇提物具有較好的抗腫瘤作用，且優(yōu)于現(xiàn)有認(rèn)為的槐耳水提物或多糖的抗腫瘤作用。對(duì)槐耳的藥用成分進(jìn)行了進(jìn)一步的開發(fā)利用，為抗胃癌、結(jié)腸癌藥物的開發(fā)提供了新的途徑。

作為優(yōu)選，所述抗腫瘤藥物為抗胃癌藥物或抗結(jié)腸癌藥物。

作為優(yōu)選，所述槐耳醇提物通過以下方法制備而得：將槐耳子實(shí)體粉碎，過篩得槐耳粉碎物，按照1g槐耳粉碎物：30ml乙醇的料液比將槐耳粉碎物與乙醇混合后，加熱回流提取2-3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取液，合并的提取液旋蒸回收乙醇，濃縮至稠膏狀，冷凍干燥。

作為優(yōu)選，所述乙醇的質(zhì)量濃度為70％。

一種具有抗癌作用的槐耳醇提物的制備方法，將槐耳子實(shí)體粉碎，過篩得槐耳粉碎物，按照1g槐耳粉碎物：20-40ml乙醇的料液比將槐耳粉碎物與乙醇混合后，加熱回流提取2-3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取液，合并的提取液旋蒸回收乙醇，濃縮至稠膏狀，冷凍干燥。

作為優(yōu)選，所述乙醇的質(zhì)量濃度為60-90％。

作為優(yōu)選，將槐耳子實(shí)體粉碎，過篩得槐耳粉碎物，按照1g槐耳粉碎物：30ml質(zhì)量濃度為70％的乙醇的料液比將槐耳粉碎物與乙醇混合后，加熱至80℃回流提取3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取液，合并的提取液旋蒸回收乙醇，濃縮至稠膏狀，冷凍干燥。

一種具有抗癌作用的槐耳提取物的制備方法，步驟如下：

(1)醇提：將槐耳子實(shí)體粉碎，過篩得槐耳粉碎物，按照1g槐耳粉碎物：30ml質(zhì)量濃度為70％的乙醇的料液比將槐耳粉碎物與乙醇混合后，加熱至80℃回流提取3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取液得醇提液；

(2)水提：將步驟(1)醇提后剩余的藥渣干燥后，按照1g藥渣：30ml蒸餾水的料液比加蒸餾水，加熱回流提取3次，每次2.5h，過濾，合并提取液得水提液；

(3)將醇提液和水提液混合，真空減壓濃縮至稠膏狀，冷凍干燥。

作為優(yōu)選，抗癌作用為抗胃癌或抗結(jié)腸癌作用。

本發(fā)明的有益效果是：槐耳醇提物具有顯著的抑制胃癌bgc823細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞hct116增殖的效果，說明槐耳醇提物同樣具備抗腫瘤作用，對(duì)槐耳的藥用成分進(jìn)行了進(jìn)一步的開發(fā)利用，為抗胃癌、結(jié)腸癌藥物的開發(fā)提供了新的途徑。

附圖說明

圖1是乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。

圖2是乙醇倍量對(duì)總黃酮提取率的影響。

圖3是提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

圖4是提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例：

以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，通過單因素考察及正交實(shí)驗(yàn)，確定槐耳醇提物的最佳提取工藝。

1.單因素考察

選擇乙醇濃度，乙醇倍量，提取時(shí)間，提取次數(shù)進(jìn)行考察，每個(gè)因素的各個(gè)水平平行3次試驗(yàn)。以下為各個(gè)因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.1.乙醇濃度考察

將槐耳子實(shí)體粉碎，過20目篩，稱取槐耳子實(shí)體粉8份，約1g/份，精密稱定，考察不同乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響，分別選擇60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的乙醇，料液比1g:30ml，80℃水浴回流提取1次，1h/次，放冷，補(bǔ)重，過濾。精密移取續(xù)濾液適量，紫外分光光度法測定總黃酮的含量，平行三次試驗(yàn)。計(jì)算總黃酮提取率，總黃酮提取率(mg/g)＝總黃酮/生藥，結(jié)果見圖1。

1.2.乙醇倍量考察

將槐耳子實(shí)體粉碎，過20目篩，稱取槐耳子實(shí)體粉5份，約1g/份，精密稱定，考察乙醇倍量對(duì)總黃酮提取率的影響，分別加入10、20、30、40、50倍量(g:ml)的70％乙醇，80℃水浴回流提取1次，1h/次，放冷，補(bǔ)重，過濾。精密移取續(xù)濾液適量，紫外分光光度法測定總黃酮的含量，平行三次試驗(yàn)。計(jì)算總黃酮提取率，總黃酮提取率(mg/g)＝總黃酮/生藥。結(jié)果見圖2。

1.3.提取時(shí)間的考察

將槐耳子實(shí)體粉碎，過20目篩，稱取槐耳子實(shí)體粉5份，約1g/份，精密稱定，考察提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，選擇5個(gè)水平0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，80℃水浴回流，液固比30:1，乙醇濃度70％。精密移取續(xù)濾液適量，紫外分光光度法測定總黃酮的含量，平行三次試驗(yàn)。計(jì)算總黃酮提取率，總黃酮提取率(mg/g)＝總黃酮/生藥。結(jié)果見圖3。

1.4.提取次數(shù)考察

將槐耳子實(shí)體粉碎，過20目篩，稱取槐耳子實(shí)體粉3份，約1g/份，精密稱定，加入30倍量的70％乙醇，80℃水浴回流2h，考察提取次數(shù)分別為1次、2次、3次，2h/次，計(jì)算總黃酮提取率，總黃酮提取率(mg/g)＝總黃酮/生藥。結(jié)果見圖4。

2.正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用四因素三水平正交試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次，以槐耳總黃酮含量為指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，以水浴加熱回流方法進(jìn)行最佳工藝的考察，確定乙醇濃度(a)、溶劑倍量(b)、提取時(shí)間(c)、提取次數(shù)(d)為考察因素，選用l9(3⁴)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1因素與水平表

2.1.正交試驗(yàn)結(jié)果分析

選擇l9(3⁴)正交表可得9組工藝條件。直觀分析見表2，方差分析見表3。

表2正交設(shè)計(jì)結(jié)果表

表3方差分析結(jié)果表

注：*p<0.1，**p<0.05，***p<0.01。

槐耳中總黃酮以蘆丁計(jì)含量為考察指標(biāo)，由直觀分析可知，各因素對(duì)醇提物總黃酮提取的影響大小依次為提取次數(shù)(d)>提取時(shí)間(c)>乙醇濃度(a)>溶劑倍量(b)。由方差分析可知，經(jīng)f檢驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)、提取時(shí)間和乙醇濃度為主要因素，溶劑倍量沒有影響，故槐耳總黃酮的提取優(yōu)化工藝為a1b3c2d3。

正交試驗(yàn)顯著性分析可知，溶劑倍量對(duì)總黃酮的含量無顯著影響，考慮能源及時(shí)間節(jié)約，綜合考慮，因此確定槐耳醇提最佳提取工藝條件為a1b1c2d3，即30倍量，70％乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次2h。

2.2.最佳提取工藝試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定槐耳醇提最佳提取工藝為a1b1c2d3。取三批槐耳藥材，依上述最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果見表4。

表4驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表

平行3次測定，槐耳中總黃酮平均含量為25.76mg/g，rsd為1.70％，表明提取工藝重現(xiàn)性良好，穩(wěn)定可行。

試驗(yàn)部分：

以結(jié)腸癌細(xì)胞hct116和胃癌bgc823細(xì)胞為試驗(yàn)細(xì)胞株，槐耳不同組分提取物為細(xì)胞給藥樣本，采用mtt比色法，研究槐耳不同組分提取物對(duì)hct116細(xì)胞和bgc823細(xì)胞增殖作用，篩選出槐耳有效部位，為槐耳有效部位的提取工藝研究提供科學(xué)依據(jù)。

一、實(shí)驗(yàn)材料

(一)實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

槐耳藥材，產(chǎn)于山東，批號(hào)20131001

mtt(美國sigma公司，型號(hào)m2123)

胰蛋白酶(美國amresco公司，1:250)

胎牛血清(fetalbovineserun，fbs)(四季青，批號(hào)20151112)

雙抗(penicillin-streptomycinsolution)(hyclone公司，批號(hào)j130043)

dmso(dimethylsulfoxide)(ɑmresco公司，批號(hào)3544b028)

磷酸鹽緩沖鹽(pbs)(賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，批號(hào)nza1064)

96孔板(賽默飛世爾thermofisher)。

(二)實(shí)驗(yàn)器材

高速多功能粉碎機(jī)(上海力箭機(jī)械有限公司，型號(hào)yb-1000a)

超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，型號(hào)kq5200de)。

二、方法與結(jié)果

1細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌hct116細(xì)胞和胃癌bgc823細(xì)胞株，均來源于中國科學(xué)院生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。將hct116細(xì)胞(bgc823細(xì)胞)接入25cm²細(xì)胞培養(yǎng)板，加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)液6ml，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中，半旋開培養(yǎng)瓶的瓶蓋并保持培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度，1-2d更換一次培養(yǎng)液。每天觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞融合80％后進(jìn)行細(xì)胞傳代或凍存。

2細(xì)胞傳代

細(xì)胞生長至80％融合需進(jìn)行傳代。在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，棄培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用pbs緩沖液洗2～3次，每次2～3ml，注意不要直接沖洗細(xì)胞，加入0.25％胰蛋白酶液2ml，作用2-5min左右(視具體細(xì)胞而定)，加入等體積的培養(yǎng)液進(jìn)行中和。將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，設(shè)置轉(zhuǎn)速為800r·min-1，離心5min，棄去上清液，用培養(yǎng)液輕輕洗1～2次。細(xì)胞沉淀用少許新完全培養(yǎng)液慢慢吹散，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后分瓶傳代培養(yǎng)或傳板分組實(shí)驗(yàn)。

3細(xì)胞樣本制備

稱取槐耳子實(shí)體粉末約10g，按最佳提取工藝提取，即醇提加入30倍量70％乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次2h，旋蒸回收乙醇，濃縮至稠膏狀，冷凍干燥后得到樣品a(槐耳醇提浸膏粉)；

醇提后藥藥渣干燥后加入30倍量蒸餾水回流3次，每次2.5h，旋蒸回收乙醇，濃縮至稠膏狀，冷凍干燥后得到樣品b(槐耳水提浸膏粉)；

另用相同方法制備一份醇提液和水提液，將醇提液和水提液合并，真空減壓濃縮至稠膏狀，冷凍干燥得到樣品a+b(槐耳醇水雙提浸膏粉)，并以市售槐耳顆粒c作為對(duì)照，將制備的細(xì)胞樣本用于hct-116細(xì)胞(bgc-823細(xì)胞)生長抑制試驗(yàn)。

4細(xì)胞給藥濃度梯度

精密稱定槐耳不同進(jìn)出部位樣本浸膏粉0.064g(槐耳顆粒按比例轉(zhuǎn)化)，溶于10ml不含血清培養(yǎng)基中，配置成浸膏6400μg/ml母液，梯度稀釋至各實(shí)驗(yàn)濃度。細(xì)胞給藥濃度梯度見表5。

表5槐耳不同浸出部位細(xì)胞給藥濃度梯度

采用以上藥物樣本，比較各個(gè)提取部位對(duì)hct116細(xì)胞(bgc823細(xì)胞)增殖抑制實(shí)驗(yàn)(mtt實(shí)驗(yàn))，通過比較各組的抑制率的ic50值，篩選出藥效最佳(ic50值最小)的浸出部位，以此有效部位進(jìn)行下一步槐耳最佳提取工藝研究。

5篩選方法

用mtt法測定腫瘤細(xì)胞抑制增殖實(shí)驗(yàn)，對(duì)各浸出物的腫瘤抑制率ic50值進(jìn)行比較，進(jìn)而篩選出藥效最佳的浸出部位。

6細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長期的hct116細(xì)胞(bgc823細(xì)胞)用0.25％胰蛋白酶消化，離心，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，配制為每孔5×l04個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔板，為防止邊緣效應(yīng)，96孔板外緣一圈加入200μl的pbs磷酸緩沖液，其余每孔加入100μl細(xì)胞懸液，放置于co2濃度為5％，溫度為37℃的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h(視細(xì)胞生長狀況而定)，吸棄培養(yǎng)液，加入不含血清的不同質(zhì)量濃度樣本，分別為浸膏640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml每孔100μl，平行設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組不添加細(xì)胞懸液，只加入100μl新鮮培養(yǎng)基，平行測定3次。在同樣條件的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即5％濃度)，繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)，小心吸去培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μldmso，置于低速搖床上振蕩10min，以溶解殘留的mtt-甲臜結(jié)晶，于多功能酶標(biāo)儀上490nm處測定各孔的光密度(od)值，以正常對(duì)照組測得的od值為對(duì)照，按照抑制率公式計(jì)算槐耳各提取物組對(duì)于hct116細(xì)胞(bgc823細(xì)胞)增殖的抑制效果。槐耳不同組分的作用時(shí)間分別設(shè)定為24h和48h，計(jì)算出ic50值。

抑制率＝[1-(實(shí)驗(yàn)組mtt檢測od值-空白組od)/(對(duì)照組mtt檢測od值-空白組od)]×100％。

改良寇式法：lgic50＝xm-i(p-(3-pm-pn)/4)

xm:lg最大劑量

i:lg(最大劑量/相臨劑量)

p:陽性反應(yīng)率之和

pm:最大陽性反應(yīng)率

pn:最小陽性反應(yīng)率。

結(jié)腸癌hct116細(xì)胞結(jié)果見表6；胃癌bgc823細(xì)胞結(jié)果見表7。

表6槐耳不同提取物對(duì)hct116細(xì)胞增殖抑制ic50值

表7槐耳不同提取物對(duì)bgc823細(xì)胞增殖抑制ic50值

三、討論與分析

本部分實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，槐耳各浸出部位在640～20μg·ml-1濃度下對(duì)結(jié)腸癌hct116細(xì)胞及胃癌bgc823細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，呈劑量依賴關(guān)系。

槐耳不同提取物對(duì)hct116細(xì)胞和bgc823細(xì)胞均具有不同增殖抑制作用，hct116細(xì)胞和bgc823細(xì)胞兩種細(xì)胞均顯示作用時(shí)間48h較24h效果好，且呈劑量依賴關(guān)系，槐耳醇水雙提提取物ic50值最低，其次是醇提物，不同浸出部位之間有顯著差異(槐耳水提物與槐耳顆粒之間沒有顯著性差異)。因此，選擇ic50值最小(抗腫瘤效果最佳)的醇水雙提提物作為后期試驗(yàn)有效部位。

本項(xiàng)結(jié)果表明，槐耳醇提物具有顯著的抑制胃癌bgc823細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞hct116增殖的效果，說明槐耳醇提物同樣具備抗腫瘤作用。而此前國內(nèi)外研究僅限于對(duì)槐耳水提物及其多糖成分，并未對(duì)槐耳的其他藥用部位進(jìn)行成分分析，致使相關(guān)藥用部位被摒棄。本研究提示槐耳醇提物具備抑制腫瘤的作用，這無疑提示著槐耳醇提物的化學(xué)成分分離與系統(tǒng)研究是極具價(jià)值的，具備開發(fā)前景。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。