本發(fā)明屬于生物質(zhì)醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

凝膠材料是溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下相互連接形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有極高的孔隙率、極低的密度以及高表面積的多孔材料。目前，廣泛應(yīng)用于分離、吸附、催化、光電、傳感器、生物醫(yī)藥等方面。生物質(zhì)凝膠材料因其在具備傳統(tǒng)凝膠特性的同時融入了自身的優(yōu)異性能，如良好的生物相容性和可降解性，在制藥業(yè)和化妝品等方面具有很大的應(yīng)用，儼然成為研究熱點(diǎn)。

纖維素是自然界最富含的生物質(zhì)材料，其良好的生物兼容性能使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。纖維素經(jīng)過一系列的化學(xué)或物理過程可以得到纖維素微纖以及納米纖維素,納米纖維素中纖維素分子鏈近乎完美的排列,使納米纖維素具有良好的機(jī)械性能,同時纖維素微纖又具有成本低、密度低、較好的生物兼容性、容易分離、可再生、封存二氧化碳、可生物降解、易化學(xué)或物理改性等優(yōu)點(diǎn)。

專利CN105524956A公布了一種醫(yī)用細(xì)菌纖維素凝膠，該專利以能分泌細(xì)菌纖維素的菌株活化制備成種子液；將明膠加入水中，加熱攪拌制得明膠溶液；將海藻酸用氫氧化鈉溶液加熱溶解，配制成海藻酸鈉黃色乳狀溶液；將制備的種子液、明膠溶液和海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻，將丙三醇添加至上述的混合溶液中，將共混液進(jìn)行過濾、靜置制得纖維素凝膠，該凝膠可以較好的應(yīng)用于生物醫(yī)用領(lǐng)域，但制備過程較為復(fù)雜。專利CN102666669A公開了一種纖維素納米粒氣凝膠、水凝膠和有機(jī)凝膠的制備方法，該專利將納米纖維素與水、有機(jī)溶劑以及金屬納米粒子復(fù)合制備出各種不同類型的復(fù)合水凝膠和氣凝膠，該專利提供的納米纖維素氣凝膠和水凝膠應(yīng)用廣泛，但由于成凝方法是通過直接的濃度控制的方法實(shí)現(xiàn)凝膠，因此相對力學(xué)性能較差，且在納米纖維素中復(fù)合金屬粒子等使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用受到限制。專利CN106084259A公開了一種纖維素水凝膠的制備方法，該方法將普通的植物纖維溶解漿置于由甲醇、乙醇、N‐N二甲基乙酰胺、異丙醇或水其中兩種溶劑組成的混合溶液中，然后加入NaOH或KOH。反應(yīng)后加入醋酸鈉、氯乙酸鈉或硫代乙酸鈉中的一種或兩種，反應(yīng)；過濾后的纖維溶于水制成纖維水溶液，并將溶液置于高速乳化機(jī)進(jìn)行分散；將分散液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粘稠狀態(tài)常溫?cái)嚢?，烘干得到，該方法在纖維素凝膠過程中引入了過多的化學(xué)試劑使最后的溶劑置換和洗滌更加困難且引入過多的化學(xué)試劑不利于凝膠在醫(yī)用領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對傳統(tǒng)纖維素凝膠材料制備復(fù)雜，成膠過程需借助重金屬粒子或化學(xué)引發(fā)以致造成纖維素凝膠的應(yīng)用和清洗困難的問題，本發(fā)明提供一種通過在TEMPO氧化的帶有負(fù)電荷的納米纖維素中加入一定比例的部分脫乙酰帶有正電荷的納米甲殼素作為物理交聯(lián)劑，通過正負(fù)電荷相互組裝的物理交聯(lián)方法生成納米纖維素/納米甲殼素水凝膠并將抗癌藥物負(fù)載到該水凝膠中制備出納米生物質(zhì)基的抗癌緩釋凝膠，該方法操作簡單，成本低，成膠效果顯著。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠的制備方法，包括如下步驟：

（1）在漂白的漿板中加入水，使水漫過漿板，然后在纖維素解離機(jī)中疏解，再化學(xué)氧化疏解后的纖維素分散液；

（2）測定氧化后纖維素的固含量，配制纖維素分散液置于超細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲即得到帶負(fù)電荷的納米纖維素分散液，低溫密封保存；

（3）將甲殼素原料去蛋白、去礦物質(zhì)、漂白后烘干，將烘干后的甲殼素進(jìn)行部分脫乙酰處理，然后加入質(zhì)子酸調(diào)節(jié)PH=3-4之間對部分脫乙酰的甲殼素進(jìn)行質(zhì)子化處理；

（4）測定質(zhì)子化后的甲殼素的固含量，配制甲殼素分散液置于超細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲即得帶正電荷的納米甲殼素分散液，低溫密封保存；

（5）將納米甲殼素分散液加入納米纖維素分散液中，并攪拌使納米甲殼素與納米纖維素相互物理交聯(lián)形成納米纖維素/納米甲殼素水凝膠；

（6）將納米纖維素/納米甲殼素水凝膠干燥，然后置于抗癌藥物的PBS溶液中浸潤，再將潤脹的納米纖維素/納米甲殼素水凝膠再次干燥得到納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠。

優(yōu)選的，步驟（1）所述漂白的漿板的原料為秸稈、闊葉木、麥草、針葉木、甘蔗渣等一切含有纖維素的生物質(zhì)原料。所述化學(xué)氧化所用試劑為2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物0.012-0.020g/g纖維素、次氯酸鈉8-22mmol/g纖維素、溴化鈉0.10-0.20g/g纖維素；所述化學(xué)氧化的溫度為30-40℃，PH=10-10.5。

優(yōu)選的，步驟（1）、（4）所述密封保存的溫度為4℃。

優(yōu)選的，步驟（2）所述纖維素分散液的質(zhì)量濃度為1.5-2%；所述超聲的時間為30-60min。

優(yōu)選的，步驟（3）所述甲殼素原料來源于廢棄的蝦殼、蟹殼或魷魚頂骨；所述質(zhì)子酸為醋酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、乙醇酸、乳酸、天冬氨酸、衣康酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸等中的一種以上。

優(yōu)選的，步驟（3）中采用0.1-0.5mol/L氫氧化鈉溶液浸泡甲殼素原料1-3h去除殘余蛋白，然后用去離子水洗至中性，再采用2-4mol/L的鹽酸浸泡2-5h去除礦物質(zhì)，然后用去離子水洗至中性，再采用0.02-0.05mol/L的亞氯酸鈉溶液浸泡1-3h對處理后的甲殼素進(jìn)行漂白；烘干漂白后的甲殼素，然后將烘干后的甲殼素在60-95℃下浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25-33%的氫氧化鈉溶液中1-3h進(jìn)行部分脫乙酰處理。

優(yōu)選的，步驟（4）所述甲殼素分散液的質(zhì)量濃度為1.5-2%；所述超聲的時間為30-60min。

優(yōu)選的，步驟（5）所述納米甲殼素與納米纖維素的相互交聯(lián)是通過正負(fù)電荷的自組裝交聯(lián)方式形成網(wǎng)狀水凝膠結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，步驟（5）所述攪拌是機(jī)械攪拌10-20min。

優(yōu)選的，步驟（5）所述納米甲殼素分散液的質(zhì)量占混合分散液質(zhì)量的10-90%，所述納米纖維素分散液的質(zhì)量占混合分散液質(zhì)量的10-90%，所述混合分散液納米是甲殼素分散液和納米纖維素分散液的混合液。

優(yōu)選的，步驟（6）所述干燥為在50-60℃真空干燥5-8h；所述浸潤的時間為18-24h，進(jìn)一步優(yōu)選為24h。

優(yōu)選的，步驟（6）所述抗癌藥物為5-氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他賽等中的一種以上；所述抗癌藥物的PBS溶液的濃度為0.2-0.5mg/ml；用量為20ml-40ml。

由以上所述的制備方法制得的一種納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、由于本發(fā)明使用的制備、反應(yīng)、干燥設(shè)備簡單常見，不需要添加貴重設(shè)備，因此可低成本地實(shí)現(xiàn)制備工藝。

2、本發(fā)明所提供的納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠，是由TEMPO氧化后帶負(fù)電荷的納米纖維素和部分脫乙酰后帶正電荷的納米甲殼素通過正負(fù)電荷的組裝物理交聯(lián)得到，是天然的生物質(zhì)基凝膠。

3、本發(fā)明所提供的一種納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠的制備方法，工藝簡單，所需材料來源廣泛，制備成本低，得到的凝膠屬于高附加值產(chǎn)品。該制備方法可高效利用自然生物質(zhì)原料，提高其使用價(jià)值，為高效納米生物醫(yī)學(xué)材料的制備提供另一條思路和途徑。

附圖說明

圖1a是純納米甲殼素的電鏡圖。

圖1b是純納米纖維素的電鏡圖。

圖1c是20%納米甲殼素/80%納米纖維素水凝膠的電鏡圖。

圖1d是40%納米甲殼素/60%納米纖維素水凝膠的電鏡圖。

圖1e是60%納米甲殼素/40%納米纖維素水凝膠的電鏡圖。

圖1f是80%納米甲殼素/20%納米纖維素水凝膠的電鏡圖。

圖2是納米纖維素/納米甲殼素混合凝膠的彈性模量性能圖。

圖3是納米纖維素/納米甲殼素混合凝膠的溶脹性能圖。

圖4是5-氟尿嘧啶溶液的吸光度與濃度關(guān)系曲線圖。

圖5是負(fù)載5-氟尿嘧啶的凝膠藥物釋放曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例與附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施作進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

將10g漂白的桉木漿板加蒸餾水，使其漫過漿板，然后在纖維素解離機(jī)中疏解，每克漿料采用0.016gTEMPO、20mmol次氯酸鈉、0.16g溴化鈉，所述氧化溫度為30℃，在PH=10.5下氧化疏解后的纖維素直到使其PH值保持穩(wěn)定。測定氧化后纖維素的固含量，加去離子水配制質(zhì)量濃度為1.6%的纖維素分散液置于超細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲30min即得到表面帶負(fù)電荷的納米纖維素分散液，置于4℃下密封保存，該納米纖維素表面帶電荷量為-42.56mv，納米纖維素的羧基含量為1.2mmol/g。

將10g廢棄的蝦殼浸泡在0.1mol/L氫氧化鈉溶液中1h去除殘余蛋白，然后用去離子水洗至中性，接著浸泡在2mol/L的鹽酸中3h去除礦物質(zhì)并用去離子水洗至中性，最后浸泡在0.02mol/L亞氯酸鈉溶液中1h對處理后的甲殼素進(jìn)行漂白，漂白后烘干，將烘干后的甲殼素浸泡在33 wt%的NaOH溶液中2h在90℃下進(jìn)行部分脫乙酰處理，然后加入醋酸調(diào)節(jié)pH=3.5對部分脫乙酰的甲殼素質(zhì)子化處理，測定質(zhì)子化后的甲殼素的固含量，加去離子水配制質(zhì)量濃度為1.6%的甲殼素分散液置于超細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲30min即得到表面帶正電荷的納米甲殼素分散液，置于4℃下密封保存，該納米甲殼素帶電荷量為+43.25mv。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1制備的納米甲殼素分散液在55℃下真空干燥5h，稱取0.1g干燥的納米甲殼素，然后置于20ml 0.5mg/ml的5-氟尿嘧啶的PBS溶液中，浸潤24h使其完全潤脹，然后將潤脹的納米甲殼素再次在55℃下真空干燥5h，得到載藥納米甲殼素，其帶電荷量為+43.25mv，載藥量為341微克，圖1a為冷凍干燥后納米甲殼素的電鏡圖，納米甲殼素分散液的彈性模量見圖2，圖2中，cellulose表示納米纖維素，Chitin表示納米甲殼素，Chitin-20表示納米甲殼素20%的混合凝膠，Chitin-40表示納米甲殼素40%的混合凝膠，Chitin-60表示納米甲殼素60%的混合凝膠，Chitin-80表示納米甲殼素80%的混合凝膠。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1制備的納米纖維素分散液在55℃下真空干燥5h，稱取0.1g干燥的納米纖維素，然后置于20ml 0.5mg/ml的5-氟尿嘧啶的PBS溶液，浸潤24h使其完全潤脹，然后將潤脹的納米纖維素再次在55℃下真空干燥5h，得到載藥納米纖維素，其帶電荷量為-42.56mv，載藥量為233.6微克，圖1b為冷凍干燥后納米纖維素的電鏡圖，納米纖維素分散液的彈性模量見圖2。

實(shí)施例4

將實(shí)施例1制備的2ml納米甲殼素分散液加入8ml納米纖維素分散液中機(jī)械攪拌20min使其相互交聯(lián)形成20%納米甲殼素/80%納米纖維素水凝膠，將20%納米甲殼素/80%納米纖維素水凝膠在55℃下真空干燥5h，稱取0.1g干燥的凝膠，然后置于20ml 0.5mg/ml的5-氟尿嘧啶的PBS溶液，浸潤24h使其完全潤脹，然后將潤脹的納米纖維素/納米甲殼素水凝膠在55℃下再次真空干燥5h得到納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠，該凝膠的帶電荷量為-17.47mv，凝膠載藥量為267微克，圖1c為冷凍干燥后20%納米甲殼素/80%納米纖維素水凝膠的電鏡圖，20%納米甲殼素/80%納米纖維素水凝膠的彈性模量見圖2。

實(shí)施例5

將實(shí)施例1制備的4ml納米甲殼素分散液加入6ml納米纖維素分散液中機(jī)械攪拌20min使其相互交聯(lián)形成40%納米甲殼素/60%納米纖維素水凝膠，將40%納米甲殼素/60%納米纖維素水凝膠在55℃下真空干燥5h，稱取0.1g干燥的凝膠，然后置于20ml 0.5mg/ml的5-氟尿嘧啶的PBS溶液，浸潤24h使其完全潤脹，然后將潤脹的納米纖維素/納米甲殼素水凝膠在55℃下再次真空干燥5h得到納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠，該凝膠的帶電荷量為+1.21mv，凝膠載藥量為533.70微克，圖1d為冷凍干燥后40%納米甲殼素/60%納米纖維素水凝膠的電鏡圖，40%納米甲殼素/60%納米纖維素水凝膠的彈性模量見圖2。

實(shí)施例6

將實(shí)施例1制備的6ml納米甲殼素分散液加入4ml納米纖維素分散液中機(jī)械攪拌20min使其相互交聯(lián)形成60%納米甲殼素/40%納米纖維素水凝膠，將60%納米甲殼素/40%納米纖維素水凝膠在55℃下真空干燥5h，稱取0.1g干燥的凝膠，然后置于20ml 0.5mg/ml的5-氟尿嘧啶的PBS溶液，浸潤24h使其完全潤脹，然后將潤脹的納米纖維素/納米甲殼素水凝膠在55℃下再次真空干燥5h得到納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠，該凝膠的帶電荷量為+10.19mv，凝膠載藥量為469.80微克，圖1e為冷凍干燥后60%納米甲殼素/40%納米纖維素水凝膠的電鏡圖，60%納米甲殼素/40%納米纖維素水凝膠的彈性模量見圖2。

實(shí)施例7

將實(shí)施例1制備的8ml納米甲殼素分散液加入2ml納米纖維素分散液中機(jī)械攪拌20min使其相互交聯(lián)形成80%納米甲殼素/20%納米纖維素水凝膠，將80%納米甲殼素/20%納米纖維素水凝膠在55℃下真空干燥5h，然后置于20ml 0.5mg/ml的5-氟尿嘧啶的PBS溶液，浸潤24h使其完全潤脹，稱取0.1g干燥的凝膠，然后將潤脹的納米纖維素/納米甲殼素水凝膠在55℃下再次真空干燥5h得到納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠，該凝膠的帶電荷量為+37.79mv，凝膠載藥量為417.50微克，圖1f為冷凍干燥后80%納米甲殼素/20%納米纖維素水凝膠的電鏡圖，80%納米甲殼素/20%納米纖維素水凝膠的彈性模量見圖2。

實(shí)施例8

在PBS中分別配制濃度為0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.12mg/ml的5-氟尿嘧啶溶液，采用UV-分光光度儀測定配制溶液在266nm處的吸光度，建立吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=31.7502x+0.1483，其中x為濃度，y為吸光度，圖4為5-氟尿嘧啶溶液吸光度與濃度的關(guān)系曲線圖。

實(shí)施例 9

將實(shí)施例4-7制備的納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠在未進(jìn)行藥液吸收前，在55℃下真空干燥5h，稱取干燥后的凝膠0.1g，然后分別浸入20ml去離子水中，并以150rpm磁性攪拌，其中每間隔3h取出水凝膠并將其置于濾紙上靜置5min，然后用濾紙吸去凝膠表面的去離子水，稱取凝膠的吸液重量，依次重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)直至凝膠達(dá)到溶脹平衡即吸液量保持穩(wěn)定，然后得到凝膠的溶脹曲線，圖3為納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠的溶脹曲線圖，其中Chitin-0表示納米纖維素，Chitin-100表示納米甲殼素，Chitin-20表示納米甲殼素20%的混合凝膠，Chitin-40表示納米甲殼素40%的混合凝膠，Chitin-60表示納米甲殼素60%的混合凝膠，Chitin-80表示納米甲殼素80%的混合凝膠。

實(shí)施例 10

將實(shí)施例4-7制備的納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠分別浸入20mlPBS溶液中，并以150rpm磁性攪拌24h，其中每間隔3h取4ml溶液并加入4ml PBS新鮮溶液，確保緩釋溶液體積不變，采用UV-分光光度儀測定配制溶液在266nm處的吸光度,計(jì)算不同時間藥物緩釋量，圖5為納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠的藥物緩釋曲線，由圖5可知，本發(fā)明的納米生物質(zhì)基抗癌緩釋凝膠具有緩釋效果。

各位技術(shù)人員須知：雖然本發(fā)明已按照上述具體實(shí)施方式做了描述，但是本發(fā)明的發(fā)明思想并不僅限于此發(fā)明，任何運(yùn)用本發(fā)明思想的改裝，都將納入本專利專利權(quán)保護(hù)范圍內(nèi)。