本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗癌活性的阿司匹林偶聯(lián)物作為藥物載體或者分子探針載體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自二十世紀(jì)以來(lái)，癌癥已成為困擾人類(lèi)健康的主要危害之一。無(wú)論是發(fā)達(dá)國(guó)家還發(fā)展中國(guó)家，都存在著較高的癌癥發(fā)病率。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和研究方法的改善（尤其納米科技的發(fā)展），使人們對(duì)癌癥有一個(gè)全新的認(rèn)識(shí)。

阿司匹林(Asp)是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，但近年研究發(fā)現(xiàn),阿司匹林不僅可以預(yù)防多種癌癥,降低癌癥的發(fā)生率,還對(duì)多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著地抑制作用,并促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

五環(huán)三萜類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的天然化合物，在抗腫瘤方面的研究頗多，比如：熊果酸(UA)、樺木酸(BA)、等，在癌癥治療中有非常好的前景。含氨基類(lèi)抗癌藥物在臨床中的應(yīng)用逐漸增多，并且都有較好的療效，比如：阿霉素。本課題組基于前期工作，基于阿司匹林為母體，對(duì)其羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾及改造。

近幾年來(lái)，納米材料由于其獨(dú)特且優(yōu)異的性質(zhì)，得到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，尤其是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有多種脂質(zhì)體和磷脂形納米載藥體系已經(jīng)進(jìn)入了臨床應(yīng)用；其中，利用多功能的納米材料用于癌癥的同時(shí)診斷與治療也逐漸受到廣泛的重視，出現(xiàn)了越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道。雖然當(dāng)前的納米藥物載體在一定程度上提高了疏水性藥物的生物利用度，但是載體本身的生物相容性和細(xì)胞毒性引起了廣泛的關(guān)注，此外，大多數(shù)載體本身在體內(nèi)的代謝機(jī)制不明確，成為阻礙納米載藥體系進(jìn)一步應(yīng)用于臨床的棘手問(wèn)題。與傳統(tǒng)的納米載體相比，無(wú)載體納米粒解決了載體納米體系復(fù)雜，質(zhì)控困難，作用機(jī)制不明確，代謝不清楚等問(wèn)題。無(wú)載體納米粒優(yōu)點(diǎn)是避免引入載體對(duì)人體帶來(lái)的毒副作用，同時(shí)減輕額外的代謝負(fù)擔(dān)，也解決了載體納米粒制備過(guò)程中批次質(zhì)量不可控問(wèn)題。

本專利基于阿司匹林為母體，通過(guò)簡(jiǎn)單的化學(xué)偶聯(lián)，在阿司匹林的羧基引入五環(huán)三萜類(lèi)抗腫瘤藥物或氨基類(lèi)抗腫瘤藥物，制得阿司匹林-抗癌藥物偶聯(lián)物；該抗癌藥物偶聯(lián)物可以在水中進(jìn)一步自組裝形成無(wú)載體的納米顆粒，形成穩(wěn)定的膠束結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用，更重要的是，作為分子成像探針/抗腫瘤藥物等的載體，解決了現(xiàn)有納米載體存在的諸多問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種具有抗癌活性的阿司匹林偶聯(lián)物作為藥物載體或者分子探針載體的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)載體納米體系復(fù)雜，質(zhì)控困難，作用機(jī)制不明確，代謝不清楚等問(wèn)題。

本發(fā)明的具體做法為，以阿司匹林和五環(huán)三萜類(lèi)化合物進(jìn)行偶聯(lián)制備得到含有酯鍵的抗癌前藥，或以阿司匹林和氨基類(lèi)抗癌化合物進(jìn)行偶聯(lián)制備得到含有酯鍵的抗癌前藥，然后抗癌前藥作為載體包載其他的抗癌藥物以達(dá)到更好的癌癥治療效果，或者包載分子探針，以達(dá)到實(shí)現(xiàn)診療一體化。

一種具有抗癌活性的阿司匹林偶聯(lián)物作為藥物載體或者分子探針載體的應(yīng)用；所述的阿司匹林偶聯(lián)物為阿司匹林與含羥基五環(huán)三萜類(lèi)化合物或含有氨基類(lèi)抗癌藥物的偶聯(lián)物。

該應(yīng)用的實(shí)現(xiàn)為阿司匹林偶聯(lián)物包載藥物或者分子探針形成納米粒。

具體實(shí)現(xiàn)方式為：

1）將阿司匹林偶聯(lián)物溶于良性溶劑中，為溶液A；溶液濃度范圍為20μM-20000μM；良性溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、正丙醇、甲醇、吡啶、乙酸、二甲基亞砜一種或多種的混合；

2）將溶液A滴入攪拌中的不良溶液中，為懸濁液B；懸濁液最后的濃度范圍為2μM-2000μM；不良溶液為磷酸鹽緩沖液、水、生理鹽水、葡萄糖溶液一種或多種的混合；

3）將含有待包載的藥物或分子探針溶液滴入攪拌中的懸濁液B，得懸濁液C；其中阿司匹林偶聯(lián)物：藥物或分子探針和的物質(zhì)的量的濃度為1:5-10；即載體和待包載的目標(biāo)物的比例為1:5-10，其目標(biāo)藥物濃度為0.2μM-400μM；

4）將懸濁液C繼續(xù)攪拌，之后超聲處理，之后離心取上清液，即得具抗癌活性的載有藥物或者分子探針的阿司匹林偶聯(lián)物納米粒。超聲時(shí)間為20s-1200s;攪拌時(shí)間1min-30min;攪拌過(guò)程中允許在20-70攝氏度下加熱；

所述的偶聯(lián)物為阿司匹林與含羥基五環(huán)三萜類(lèi)化合物或含有氨基類(lèi)抗癌藥物，含羥基五環(huán)三萜類(lèi)化合物可以為甘草酸、熊果酸、齊墩果酸、白樺酸或雷公藤酮等；所述的氨基類(lèi)抗腫瘤藥物為：阿霉素、氨基蝶呤等。例如如式I所示的齊墩果酸和阿司匹林偶聯(lián)物（Asp-OA）；如式II所示的熊果酸和阿司匹林的偶聯(lián)物 （Asp-UA）；如式III所示的阿霉素和阿司匹林的偶聯(lián)物 （Asp-DOX）；

其制備方法包括但不限于此：先對(duì)阿司匹林的羧基進(jìn)行活化后，與含羥基五環(huán)三萜類(lèi)化合物或含有氨基類(lèi)抗癌藥物中的氨基進(jìn)行偶聯(lián)后得到。

具體的制備步驟：

草酰氯活化法

1.將乙酰水楊酸（阿司匹林）溶于干燥的二氯甲烷，加入草酰氯，攪拌10 h，減壓蒸除氣體和溶劑。

2.重新加入二氯甲烷，溶液通過(guò)恒壓漏斗向溶有五環(huán)三萜類(lèi)藥物或氨基類(lèi)抗癌藥物和DMAP的吡啶：二氯甲烷（1v/1v）混合溶液中滴加，滴加完成后繼續(xù)攪拌8-10 h。

3.反應(yīng)完全后，減壓蒸除二氯甲烷。

4.向反應(yīng)瓶中加入水析出產(chǎn)物，抽濾，并用水洗濾餅至中性，真空干燥，柱層析得該偶聯(lián)物。

以阿司匹林ASP和樺木酸BA為例，偶聯(lián)物ASP-BA合成路線反應(yīng)式如下：

a、阿司匹林酰氯化：

b、樺木酸和酰氯化的阿司匹林偶聯(lián)：

未包載藥物的納米粒即一種具有抗癌活性的阿司匹林偶聯(lián)物無(wú)載體納米粒，其特征在于制備方法如下：

1）將阿司匹林偶聯(lián)物溶于良性溶劑中，為溶液A

2）將溶液A滴入攪拌中的不良溶液中，為懸濁液B；

3）將懸濁液B繼續(xù)攪拌，之后超聲處理，之后離心取上清液，即得所述的具抗癌活性的阿司匹林偶聯(lián)物無(wú)載體納米粒；

其中，所述的良性溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、正丙醇、甲醇、吡啶、乙酸、二甲基亞砜一種或多種的混合；

所述的不良溶液為為磷酸鹽緩沖液、水、生理鹽水、葡萄糖溶液一種或多種的混合；

所述的偶聯(lián)物為阿司匹林與含羥基五環(huán)三萜類(lèi)化合物或含有氨基類(lèi)抗癌藥物，其制備方法為：先對(duì)阿司匹林的羧基進(jìn)行活化后，與含羥基五環(huán)三萜類(lèi)化合物或含有氨基類(lèi)抗癌藥物中的氨基進(jìn)行偶聯(lián)后得到。

具有抗癌活性的阿司匹林偶聯(lián)物無(wú)載體納米粒，其特征在于所述含羥基五環(huán)三萜類(lèi)化合物為甘草酸、熊果酸、齊墩果酸、白樺酸或雷公藤酮；所述的氨基類(lèi)抗腫瘤藥物為：阿霉素、氨基蝶呤。

阿司匹林偶聯(lián)物作為藥物載體或者分子探針載體的應(yīng)用；藥物包括但不限于以下：鹽酸厄洛替尼、甲苯磺酸索拉非尼、阿柔比星、阿柔比星B、伊達(dá)比星、吡柔比星、紫杉醇、多西他賽、福美坦、埃博霉素、雷公藤內(nèi)酯醇、米非司酮、紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、秋水仙堿、長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤、他莫西芬、替尼泊苷、順鉑和6-巰基嘌呤、鹽酸柔紅霉素、鹽酸表阿霉素、鹽酸佐柔比星、鹽酸米托蒽醌和5-氟尿嘧啶；

分子探針包括但不限于以下：釓配合物造影劑、雙吡啶硫酮、花氰熒光染料、全氟化碳。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明所制備的偶聯(lián)物作為載體具有一定的抗癌效果但作為載體有沒(méi)有太大的細(xì)胞毒性，合成簡(jiǎn)單方便；

2、本發(fā)明所制備偶聯(lián)物在水中可以通過(guò)溶劑交換法自組裝成為納米粒,做為抗癌藥物或熒光物質(zhì)的載體，有效地解決了一系列抗癌藥物水溶性問(wèn)題；

3、本發(fā)明的納米粒具備pH響應(yīng)性；

4、可以對(duì)無(wú)載體納米粒表面進(jìn)行修飾,可以使納米粒具有靶向性等功能;

5、本發(fā)明所制備的納米?？梢越鉀Q傳統(tǒng)納米載體在體內(nèi)代謝不明確，體系復(fù)雜等問(wèn)題，并能為以后新藥研發(fā)和制備提供新的思路。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2中Asp-BA作用24h后對(duì)HeLa細(xì)胞的增值抑制作用；

圖2為實(shí)施例3中Asp-UA納米粒粒徑圖；

圖3.為實(shí)施例4中Asp-UA納米粒的pH響應(yīng)激光圖；

圖4.為實(shí)施例6中Asp-UA自組裝形成的無(wú)載體納米粒作用24 h后對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用；

圖5.為實(shí)施例7中Asp-UA@DOX納米粒粒徑圖；

圖6.為實(shí)施例7中Asp-UA@DOX納米粒的丁達(dá)爾效應(yīng)圖；

圖7.為實(shí)施例8中Asp-UA@DOX納米粒的紫外吸收光譜圖；

圖8.為實(shí)施例9中Asp-UA@DOX納米粒作用24 h后對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用；

圖9.為實(shí)施例11中Asp-UA@El納米粒作用24 h后對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用；

圖10.為實(shí)施例13中Asp-UA@ICG納米粒的熒光光譜圖；

圖11.為實(shí)施例14中Asp-UA@ICG納米粒小動(dòng)物成像圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實(shí)施例1

阿司匹林-樺木酸的合成

室溫下，0.5 g 乙酰水楊酸（阿司匹林）溶于20 mL 干燥的二氯甲烷，加入2 mL草酰氯，磁力攪拌10 h，減壓蒸除氣體和溶劑。重新向反應(yīng)瓶中加入20 mL 二氯甲烷，通過(guò)恒壓漏斗向溶有1.27 g 樺木酸和0.1eq DMAP 的20 mL 1v/1v 吡啶：二氯甲烷混合溶液中滴加，滴加完成后繼續(xù)攪拌8-10 h。反應(yīng)完全后，減壓蒸除二氯甲烷。向反應(yīng)瓶中加入100 mL 水析出產(chǎn)物，抽濾，用500 mL 水洗濾餅至中性，真空干燥，柱層析得阿司匹林-樺木酸（Asp-BA)。

性狀：白色粉末；產(chǎn)率：70.51% ；

分子式：C₃₉H₅₄O₆

核磁結(jié)果：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01 (dd, J = 7.4, 2.0 Hz, 1H), 7.56 – 7.49 (m, 1H), 7.35 – 7.27 (m, 1H), 7.14 (dd, J = 7.4, 2.0 Hz, 1H), 4.81 – 4.76 (m, 1H), 4.75 – 4.70 (m, 1H), 3.79 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 2.39 (s, 3H), 2.26 – 2.07 (m, 3H), 1.97 – 1.86 (m, 3H), 1.84 – 1.76 (m, 1H), 1.74 (s, 3H), 1.68 – 0.98 (m, 22H), 0.97 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.73 (d, J = 10.4 Hz, 6H).

高分辨質(zhì)譜分子量：618.8575

實(shí)施例2

Asp-BA納米粒子的制備方法

精確稱取Asp-BA粉末0.00618g，溶于1 ml的甲醇中，超聲溶解，配置成10 mM的溶液；取20 μL甲醇溶液，逐滴加入到裝有180 μL的EP管中（注：滴加過(guò)程中進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，然。后超聲1min，以12000rpm離心5min，上清即為Asp-BA納米粒。

本實(shí)施例制備的Asp-BA納米粒水溶液的粒徑的平均尺寸在170納米左右，粒徑圖如圖1所示。

因?yàn)槟壳按蠖鄶?shù)批準(zhǔn)的抗癌納米醫(yī)學(xué)顆粒的尺寸范圍為100-200納米，并且在一定范圍內(nèi)，較小尺寸的抗癌納米醫(yī)學(xué)顆粒，在體內(nèi)顯示出更強(qiáng)的抗癌性能。

實(shí)施例3

抗癌活性實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞毒性來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT 比色法測(cè)定了Asp-BA納米粒和Asp, BA溶液以及組合物對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制活性。具體步驟為：（1）取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為0.8×105 個(gè)/mL，配成細(xì)胞懸液。于每孔100 μL接種到96孔板中，周?chē)肞BS封板，置于37 ℃, 5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（2）去除舊的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL不同濃度梯度的含樣品的培養(yǎng)基，另設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h。

（3）移除培養(yǎng)基，于每孔中加入100 μL MTT溶液（無(wú)血清、無(wú)酚紅的RMPI1640培養(yǎng)基：MTT母液=9:1，V:V），繼續(xù)孵育4 h。

（4）取出96孔板終止培養(yǎng)，用移液槍輕輕吸去96孔板中的上清液，每孔加入DMSO溶液 100 μL，振蕩搖勻10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶全部溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的OD值，使用GraphPad Prism 5處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果如圖2所示。

圖2結(jié)果表明，在濃度范圍為20 μM-100 μM之間，BA和其組合物對(duì)HeLa具有顯著性的細(xì)胞增值抑制作用，且藥物殺傷具有明顯的藥物劑量依賴性，但兩者的作用沒(méi)有顯著性差異，而偶聯(lián)物Asp-BA納米粒在5 μM已經(jīng)對(duì)HeLa細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞增殖抑制作用，因此偶聯(lián)物納米粒相對(duì)于其他藥物具有明顯的細(xì)胞增殖抑制作用。

實(shí)施例4

將實(shí)施例2所制備的納米粒水溶液取200ul兩份于比色皿中，然后分別加入pH為7.0和pH為5.0的PBS溶液800ul，然后用激光筆照射，觀察現(xiàn)象，結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，結(jié)果表明Asp-BA納米粒水溶液在中性pH=7.0溶液中保持其納米結(jié)構(gòu)，在酸性條件pH=5.0時(shí)，膠體結(jié)構(gòu)破壞，產(chǎn)生絮狀沉淀。眾多研究表明，腫瘤微環(huán)境呈弱酸性，這對(duì)于藥物進(jìn)入腫瘤微環(huán)境后，pH響應(yīng)后，藥物大量釋放。

實(shí)施例5

精確稱取Asp-BA粉末0.00618 g，溶于1mL的乙醇中，超聲溶解，配置成10 mM的溶液；取20 μL上述溶液，逐滴加入到裝有176 μL葡萄糖水溶液（10 mg/mL）的EP管中（注：滴加過(guò)程中進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，之后滴加10mM的鹽酸厄洛替尼（簡(jiǎn)寫(xiě)El）乙醇溶液4 μL，然后超聲1min，以12000rpm離心5min，上清即為Asp-BA@El納米粒葡糖糖水溶液。

本實(shí)施例制備的Asp-BA納米粒水溶液的粒徑的平均尺寸在100-170納米。

實(shí)施例6

阿司匹林和熊果酸偶聯(lián)物納米粒的生物學(xué)效應(yīng)

根據(jù)本課題組專利ZL201510466210.4，制備Asp-UA,按照實(shí)施例3的方法制備Asp-UA納米粒，其抗癌活性實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞毒性來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT 比色法測(cè)定了無(wú)載體的Asp-UA納米粒和Asp-UA溶液對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制活性。具體步驟為參照實(shí)施例2，結(jié)果如圖4所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，無(wú)載體的Asp-UA納米粒作用于HeLa細(xì)胞24 h之后， UA給藥組、Asp-UA給藥組、Asp-UA納米粒給藥組和Asp給藥組對(duì)HeLa細(xì)胞具有不同程度的增殖抑制作用，并呈濃度依賴性依賴性。Asp-UA給藥組在>50μM的條件下能有效的抑制HeLa細(xì)胞的增殖，此時(shí)細(xì)胞的存活率大約在60%左右；與Asp-UA給藥組相比無(wú)載體的Asp-UA納米粒能夠明顯的降低抗癌前藥Asp-UA的毒副作用；UA給藥組能夠更加有效的抑制HeLa細(xì)胞的增殖，效果最好；Asp給藥組幾乎沒(méi)有毒副作用。

實(shí)施例 7

Asp-UA@DOX納米粒子的制備方法

取10mM的Asp-UA二氯甲烷溶液20 μL，在室溫下將其逐滴加入176 μL的水中（注：整個(gè)制備過(guò)程進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，然后加入濃度為10mM的抗腫瘤藥DOX水溶液4 μL，室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)振蕩，之后超聲1min即得包載抗腫瘤藥鹽酸阿霉素（縮寫(xiě)DOX）的Asp-UA@DOX納米粒水溶液。

本實(shí)施例制備的Asp-UA@DOX納米粒水溶液的粒徑的平均尺寸在150納米左右，粒徑圖如圖5所示，粒徑小于單一的藥物納米，更利于藥物的吸收和利用，發(fā)揮更好的抗癌效果。

將空白水溶液、Asp-UA@DOX納米粒、Asp-UA納米粒稀釋5倍于比色皿中激光照射，產(chǎn)生丁達(dá)爾效應(yīng)，如圖6所示。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)做出為膠體溶液。

實(shí)施例8

將實(shí)施例5和實(shí)施例6所制備的Asp-UA納米粒水溶液和Asp-UA@DOX納米粒水溶液稀釋10倍以及相同濃度的Asp-UA的甲醇溶液和DOX水溶液進(jìn)行紫外檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。

如圖7所示，DOX被包載后，發(fā)生位移變化，結(jié)果證實(shí)DOX被成功包載在Asp-UA納米空腔內(nèi)。

實(shí)施例 9

Asp-UA@DOX的抗癌活性

Asp-UA@DOX抗癌活性實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞毒性來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT 比色法測(cè)定了無(wú)載體的Asp-UA納米粒和包載DOX的無(wú)載體的Asp-UA納米粒對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制活性，具體步驟參見(jiàn)實(shí)施例3。結(jié)果如圖8所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，無(wú)載體的Asp-UA@DOX納米粒作用于HeLa細(xì)胞24 h之后，Asp-UA給藥組、DOX給藥組、Asp-UA和DOX聯(lián)合給藥組、無(wú)載體的Asp-UA納米粒及包載抗腫瘤藥鹽酸阿霉素的無(wú)載體的Asp-UA@DOX納米粒給藥組對(duì)HeLa細(xì)胞具有不同程度的增殖抑制作用，并呈濃度依賴性依賴性。Asp-UA給藥組在>50μM的條件下能有效的抑制HeLa細(xì)胞的增殖，此時(shí)細(xì)胞的存活率大約在60%左右；與Asp-UA給藥組相比無(wú)載體的Asp-UA納米粒能夠明顯的降低抗癌前藥Asp-UA的毒副作用；包載抗腫瘤藥鹽酸阿霉素的無(wú)載體的Asp-UA@DOX納米粒給藥組相比于Asp-UA給藥組、DOX給藥組、Asp-UA和DOX聯(lián)合給藥組能夠更加有效的抑制HeLa細(xì)胞的增殖，效果最好。

實(shí)施例10

Asp-UA@El納米粒子的制備方法

取10mM的Asp-UA乙醇溶液20 μL，在室溫下將其逐滴加入178ul的生理鹽水中（注：整個(gè)制備過(guò)程進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，然后加入濃度為10mM的鹽酸厄洛替尼（簡(jiǎn)寫(xiě)El）乙醇溶液2 μL，室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)，之后超聲1min即得包載抗腫瘤藥鹽酸厄洛替尼的Asp-UA@El納米粒生理鹽水溶液。

實(shí)施例11

Asp-UA@El的抗癌活性

Asp-UA@El抗癌活性實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞毒性來(lái)實(shí)現(xiàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT 比色法測(cè)定了無(wú)載體的Asp-UA納米粒和包載El的無(wú)載體的Asp-UA納米粒對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制活性，操作步驟同實(shí)施例3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，無(wú)載體的Asp-UA@El納米粒作用于A549細(xì)胞24 h之后，Asp-UA給藥組、El給藥組、Asp-UA和El

聯(lián)合給藥組、無(wú)載體的Asp-UA納米粒及包載抗腫瘤藥鹽酸厄洛替尼的無(wú)載體的Asp-UA@El納米粒給藥組對(duì)A549細(xì)胞具有不同程度的增殖抑制作用，并呈濃度依賴性依賴性。Asp-UA給藥組在>25 μM的條件下能有效的抑制A549細(xì)胞的增殖，此時(shí)細(xì)胞的存活率大約在60%左右；與Asp-UA給藥組相比無(wú)載體的Asp-UA納米粒能夠明顯的降低抗癌前藥Asp-UA的毒副作用；包載抗腫瘤藥鹽酸厄洛替尼的無(wú)載體的Asp-UA@El納米粒給藥組相比于Asp-UA給藥組、El給藥組、Asp-UA和El聯(lián)合給藥組能夠更加有效的抑制A549細(xì)胞的增殖，效果最好。

實(shí)施例12

Asp-UA@Sora納米粒子的制備方法

取10mM的Asp-UA甲醇溶液20 μL，在室溫下將其逐滴加入177 μL的水中（注：整個(gè)制備過(guò)程進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，然后加入濃度為10 mM的甲苯磺酸索拉非尼（簡(jiǎn)稱Sora）甲醇溶液3 μL，室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)，之后超聲1min即得包載抗腫瘤藥甲苯磺酸索拉非尼的Asp-UA@Sora納米粒水溶液。其制備的納米粒粒徑在100-150 nm。

實(shí)施例13

Asp-UA@ICG納米粒的制備方法

取10mM的Asp-UA甲醇溶液20 μL，在室溫下將其逐滴加入160 μL的水中（注：整個(gè)制備過(guò)程進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，然后加入濃度為3mg/ml的ICG甲醇溶液20 μL，室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)振蕩，之后超聲1 min即得包載吲哚菁綠（縮寫(xiě)ICG）的Asp-UA@ICG納米粒水溶液。

取其溶液200μL和同等濃度的ICG溶液200 μL于EP管中，進(jìn)行熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Asp-UA@ICG溶液和ICG溶液，熒光位移不同，說(shuō)明Asp-UA無(wú)載體納米粒可以作為載體成功包載ICG。

實(shí)施例14

小動(dòng)物成像

Bev/Asp-UA@ICG納米粒的制備方法

取10mM的Asp-UA甲醇溶液100 μL，在室溫下將其逐滴加入800 μL的水中（注：整個(gè)制備過(guò)程進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，然后加入濃度為3 mg/mL的ICG甲醇溶液50 μL，室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)振蕩，除去甲醇，之后滴加10 mg/mL貝伐單抗（BEV）50 μL，超聲1min即得靶向包載吲哚菁綠（縮寫(xiě)ICG）的BEV/Asp-UA@ICG納米粒水溶液。

將上述制備的納米粒，取通過(guò)尾靜脈注射200 μL于腫瘤裸鼠體內(nèi)，然后對(duì)其進(jìn)行拍照。結(jié)果如圖11所示：

如圖11所示，包載ICG的納米粒成功進(jìn)入體內(nèi)，成功靶向腫瘤組織并成像。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)需借助納米材料載體，借助無(wú)載體納米粒Asp-UA，即可完成熒光材料ICG的運(yùn)輸，即可完成診療一體化。

實(shí)施例15

Asp-UA@ZnPc納米粒的制備方法

取10 mM的Asp-UA甲醇溶液20 μL，在室溫下將其逐滴加入160 μL的鋅酞菁水溶液(濃度為3 mg/mL，簡(jiǎn)稱ZnPc)中（注：整個(gè)制備過(guò)程進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20 s)，室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)，之后超聲1min即得包載光敏劑ZnPc的Asp-UA@ZnPc納米粒水溶液。

實(shí)施例16

Asp-OA@DOX納米粒的制備

取10mM的阿司匹林和齊墩果酸偶聯(lián)物Asp-OA甲醇溶液20 μL，在室溫下將其逐滴加入176 μL的水中（注：整個(gè)制備過(guò)程進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，然后加入濃度為10 mM的抗腫瘤藥DOX水溶液4 μL，室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)振蕩，之后超聲1 min即得包載抗腫瘤藥鹽酸阿霉素（縮寫(xiě)DOX）的Asp-OA@DOX納米粒水溶液。其納米粒粒徑大小為100-150 nm。

實(shí)施例17

Asp-DOX納米粒的制備

取10 mM的阿司匹林和阿霉素偶聯(lián)物Asp-DOX甲醇溶液20 μL，在室溫下將其逐滴加入180 μL的磷酸鹽緩沖液中（pH=7.0）（注：整個(gè)制備過(guò)程進(jìn)行渦旋，20 μL滴加時(shí)間為20s)，室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)振蕩，之后超聲1min即得Asp-DOX納米粒磷酸鹽溶液。其納米粒粒徑大小為100-150nm。