本發(fā)明涉及到一種獸藥制劑，具體為一種具有提高動(dòng)物免疫機(jī)能的藥物制劑地黃粉及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，食品安全事件頻發(fā)，從2006年的蘇丹紅鴨蛋到2008年的三聚氰胺奶粉，到2011年的瘦肉精，再到后來的速生雞，藥雞門事件，這些食品安全問題的矛頭直指畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，國家對(duì)食品安全的重視也達(dá)到空前的高度，某些抗生素及抗病毒藥物的使用在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)被明令禁止。而另一方面，隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，豬雞的疫病流行也越來越復(fù)雜，傳染性疾病呈現(xiàn)非典型性或變異性表現(xiàn)，免疫后的動(dòng)物由于抗體水平參差不齊依然發(fā)病，一些新的疫病的大范圍出現(xiàn)并流行。養(yǎng)殖企業(yè)為了生存必須尋求改變，逐漸向大型集約化生產(chǎn)集中，養(yǎng)殖安全深入人心，飼養(yǎng)管理理念也隨之向生物安全控制和動(dòng)物保健方向轉(zhuǎn)型，同時(shí)綠色環(huán)保無殘留的保健產(chǎn)品也逐漸走進(jìn)了養(yǎng)殖企業(yè)的眼中。

說到綠色安全無污染保健品，不得不說的就是具有悠久歷史的中獸醫(yī)和中獸藥?！爸挝床　弊鳛閭鹘y(tǒng)中獸醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要理論思想由來已久，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂；上工治未病，不治已病”即完整地體現(xiàn)了這一思想。中獸醫(yī)學(xué)擅長調(diào)理，即通過提前藥物干預(yù)，調(diào)整動(dòng)物機(jī)體狀態(tài)，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防疾病的目的。中獸醫(yī)理論認(rèn)為：中藥保健產(chǎn)品的適當(dāng)應(yīng)用能夠提高畜禽機(jī)體抵抗力，增強(qiáng)疫苗保護(hù)力，平行原本參差不齊的免疫滴度，從而使畜禽少發(fā)病，少用藥，減少經(jīng)濟(jì)損失。

地黃是諸多中獸藥中較為重要的一味藥材，它是玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊根，秋季采挖，除去蘆頭、須根及泥沙，鮮用；或?qū)⒌攸S緩緩烘焙至約八成干。前者習(xí)稱“鮮地黃”，后者習(xí)稱“生地黃”。鮮地黃味甘、苦，性寒。歸心、肝、腎經(jīng)，具清熱生津，涼血，止血之功效，主治熱病傷陰，高熱口渴，熱性出血。生地黃味甘，性寒；歸心、肝、腎經(jīng)；具滋陰生津，清熱涼血之功效，主治陰虛發(fā)熱，鼻衄，尿血，咽喉腫痛。

地黃是一種常用中藥，具有滋陰補(bǔ)血，填精生髓之功效，為臨床補(bǔ)血之要藥。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。《本草綱目》言其“填骨髓，益精血，長肌肉，補(bǔ)五臟內(nèi)傷不足，通血脈，利耳目，黑須發(fā)，男子五勞七傷，女子傷中胞漏，經(jīng)候不調(diào)，胎產(chǎn)百病?！爆F(xiàn)代藥理研究表明，以地黃多糖為主要成分的中藥材地黃可通過多種途徑對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)起到調(diào)控作用，具有增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗衰老等多種藥理作用。然而，藥用價(jià)值如此高的藥材地黃在獸藥中卻很少被應(yīng)用，即使是被用到，也是在散劑或者合劑中作為一味輔助藥材出現(xiàn)，至今未見作為單方制劑應(yīng)用的報(bào)道。

在中國獸藥典中，中獸藥制劑多以傳統(tǒng)的散劑、合劑的形式記錄在冊(cè)，暫無粉劑的記載。而散劑一般為一種或幾種中藥材直接粉碎混合制成，合劑也一般只是經(jīng)過水提或醇提制成的口服液劑。散劑是傳統(tǒng)劑型，生產(chǎn)工藝簡單，但因其本身的缺陷嚴(yán)重阻礙了其臨床應(yīng)用，對(duì)于不能充分消化纖維素的動(dòng)物而言，散劑適口性差，生物利用度低，且在大規(guī)模集約化飼養(yǎng)條件下，產(chǎn)業(yè)動(dòng)物特別是豬、雞的給藥途徑受到多重限制；而傳統(tǒng)的合劑存在穩(wěn)定性差，運(yùn)輸不便等不足，也限制了其臨床應(yīng)用。

附圖說明

圖1-1地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后白細(xì)胞總數(shù)的影響；

圖1-2地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中溶菌酶含量的影響；

圖1-3地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中IFN-α含量的影響；

圖1-4地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中TNF-α含量的影響；

圖1-5地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后對(duì)脾臟指數(shù)的影響；

圖1-6地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后對(duì)法氏囊指數(shù)的影響；

圖1-7地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后對(duì)抗體效價(jià)的影響；

圖1-8地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后ANAE陽性率的影響；

圖2-1地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后白細(xì)胞總數(shù)的影響；

圖2-2地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清溶菌酶含量的影響；

圖2-3地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清中IFN-α含量的影響；

圖2-4地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清中TNF-α含量的影響；

圖2-5地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后脾臟指數(shù)的影響；

圖2-6地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后法氏囊指數(shù)的影響；

圖2-7地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后抗體效價(jià)的影響；

圖2-8地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后ANAE陽性率的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有提高動(dòng)物免疫機(jī)能的藥物制劑地黃粉，其將中藥材地黃經(jīng)過水提取濃縮成密度適當(dāng)?shù)那甯嗪蠼?jīng)噴霧干燥制成的粉劑，生產(chǎn)工藝先進(jìn)，水提工藝最大限度的保留了其水溶性有效成分，而后經(jīng)過噴霧干燥制成粉劑，便于保存，運(yùn)輸及臨床應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種具有提高動(dòng)物免疫機(jī)能的藥物制劑地黃粉，取生地黃藥材，加8-12倍重量的水，浸泡1-2h，然后75～85℃真空煎煮1-2h，然后常壓55-105℃回流提取1-4h，然后減壓濃縮至料液比為1:1～2的清膏，最后在進(jìn)風(fēng)溫度為140～150℃，出風(fēng)溫度為80～90℃的條件中進(jìn)行噴霧干燥，得本發(fā)明的地黃粉。

進(jìn)一步的，所述真空煎煮過程中的真空度為-0.02～-0.04MPa。

進(jìn)一步的，所述真空煎煮時(shí)間為1.5h，溫度為80℃。

進(jìn)一步的，所述回流提取溫度為75～85℃。

進(jìn)一步的，所述減壓濃縮過程的壓力為-0.02～-0.04MPa。

進(jìn)一步的，所述回流提取的溫度為80℃，時(shí)間為3h。

進(jìn)一步的，減壓濃縮至所述料液比為1:1.5的清膏。

進(jìn)一步的，所述料液在60℃的相對(duì)密度為1.10～1.15。

進(jìn)一步的，減壓濃縮至料液比為1:1的清膏，所述料液在60℃的相對(duì)密度為1.15～1.20。

進(jìn)一步的，減壓濃縮至料液比為1:2的清膏，所述料液在60℃的相對(duì)密度為1.05～1.10。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益技術(shù)效果：

粉劑應(yīng)用更加靈活方便，可用于飲水，避免了拌料過程，更加適用于大型規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，另一方面，地黃粉經(jīng)過水提噴霧干燥工藝提取了其有效成分，去除了原藥材中的纖維素成分，動(dòng)物服用后易于吸收，生物利用度明顯優(yōu)于散劑，而且粉劑性質(zhì)更加穩(wěn)定，不會(huì)產(chǎn)生酸敗脹氣等現(xiàn)象，更便于保存，運(yùn)輸及臨床應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

地黃作為常用的補(bǔ)益類中藥，療效確切，應(yīng)用也比較廣泛，但是一般都在復(fù)方制劑作為輔助藥材，作為單方制劑應(yīng)用的至今未見報(bào)道。而本發(fā)明第一次應(yīng)用生地黃藥材制成單方制劑，質(zhì)量穩(wěn)定，且可控性優(yōu)于以往的復(fù)方制劑，同時(shí)最大程度的發(fā)揮了地黃的藥理作用。

在制備工藝方面，應(yīng)用了水提工藝，最大程度的保留了生地黃中的水溶性有效成分，而后用噴霧干燥工藝制得了地黃粉。中藥粉劑的劑型在現(xiàn)行的中獸藥標(biāo)準(zhǔn)中并不多見，粉劑在獸藥臨床應(yīng)用上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)劑型：相對(duì)散劑而言，粉劑應(yīng)用更加靈活方便，可用于飲水，避免了拌料過程，更加適用于大型規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，另一方面，地黃粉經(jīng)過水提噴霧干燥工藝提取了其有效成分，去除了原藥材中的纖維素成分，動(dòng)物服用后易于吸收，生物利用度明顯優(yōu)于散劑。相對(duì)于口服液而言，粉劑性質(zhì)更加穩(wěn)定，不會(huì)產(chǎn)生酸敗脹氣等現(xiàn)象，更便于保存，運(yùn)輸及臨床應(yīng)用。

目前市場(chǎng)上，具有免疫增強(qiáng)作用的中藥提取物產(chǎn)品魚龍混雜，質(zhì)量參差不齊，絕大多數(shù)都是作為三無產(chǎn)品來銷售，產(chǎn)品質(zhì)量難以得到保證。目前具有正規(guī)批號(hào)生產(chǎn)的僅有北京生泰爾的黃芪多糖粉、無錫正大的參芪粉以及齊魯動(dòng)保的紫錐菊制劑。但是上述幾種產(chǎn)品也有其局限性，黃芪多糖粉是通過水提醇沉工藝得到的比較精制的黃芪多糖組分，而經(jīng)過臨床試驗(yàn)證實(shí)具有提高免疫作用的水溶性成份大部分被除去，無端的浪費(fèi)，同時(shí)也增加了成本，另外大量試驗(yàn)證明，中藥發(fā)揮較高療效的作用很可能不是單一成分，而是多組分的一類或幾類化合物的共同作用。參芪粉雖然考慮到了水溶成份的作用，保留了水溶成份，但是原料價(jià)格尤其是黨參卻過于昂貴并不適用于大規(guī)模畜禽用藥，目前由于中藥價(jià)格的持續(xù)增長，生產(chǎn)廠家要保證產(chǎn)品質(zhì)量，就必須選用好飲片生產(chǎn)提取，勢(shì)必造成產(chǎn)品價(jià)格高昂，這會(huì)給使用方增加成本負(fù)擔(dān)，在價(jià)格上會(huì)失去競爭優(yōu)勢(shì)；紫錐菊制劑目前僅有紫錐菊末和紫錐菊口服液兩種劑型，紫錐菊末屬于散劑，既有體積大，使用貯存不方便的缺點(diǎn)，又有不易吸收適口性差等缺點(diǎn)，其使用無疑會(huì)受到限制。

實(shí)施例1

一種具有提高動(dòng)物免疫機(jī)能的藥物制劑地黃粉，其制備方法如下：

取生地黃藥材1kg，加10kg的水，浸泡1.5h，然后在80℃真空(-0.02～-0.04MPa)條件下，煎煮1.5h，然后常壓80℃回流提取3h，然后減壓(-0.02～-0.04MPa)濃縮至料液比為1:1.5的清膏(該料液在60℃的相對(duì)密度為1.12)，最后在進(jìn)風(fēng)溫度為145℃，出風(fēng)溫度為85℃的條件中進(jìn)行噴霧干燥，得本發(fā)明的地黃粉。

其中每3.5h噴霧干燥150L清膏。大約每小時(shí)噴霧干燥43L清膏。

實(shí)施例2

一種具有提高動(dòng)物免疫機(jī)能的藥物制劑地黃粉，其制備方法如下：

取生地黃藥材1kg，加8kg的水，浸泡1h，然后在80℃真空(-0.02～-0.04MPa)條件下，煎煮2h，然后常壓80℃回流提取2h，然后減壓(-0.02～-0.04MPa)濃縮至料液比為1:1的清膏(該料液在60℃的相對(duì)密度為1.15)，最后在進(jìn)風(fēng)溫度為145℃，出風(fēng)溫度為85℃的條件中進(jìn)行噴霧干燥，得本發(fā)明的地黃粉。

其中每3.5h噴霧干燥150L清膏。大約每小時(shí)噴霧干燥43L清膏。

實(shí)施例3

一種具有提高動(dòng)物免疫機(jī)能的藥物制劑地黃粉，其制備方法如下：

取生地黃藥材1kg，加12kg的水，浸泡2h，然后在80℃真空(-0.02～-0.04MPa)條件下，煎煮2h，然后常壓80℃回流提取4h，然后減壓(-0.02～-0.04MPa)濃縮至料液比為1:2的清膏(該料液在60℃的相對(duì)密度為1.09)，最后在進(jìn)風(fēng)溫度為145℃，出風(fēng)溫度為85℃的條件中進(jìn)行噴霧干燥，得本發(fā)明的地黃粉。

其中每3.5h噴霧干燥150L清膏。大約每小時(shí)噴霧干燥43L清膏。

地黃粉試制完成后，我們?nèi)≠|(zhì)量穩(wěn)定的中試試驗(yàn)產(chǎn)品進(jìn)行了以雞為靶動(dòng)物的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其臨床療效是否確切。臨床試驗(yàn)分兩部分分別考察了地黃粉與新城疫疫苗或禽流感疫苗同時(shí)使用的增免效果。

1.地黃粉對(duì)雞ND疫苗免疫效果的影響，評(píng)價(jià)其有效性和安全性的臨床研究

1.1試驗(yàn)動(dòng)物、分組與處理

900只1日齡海蘭灰蛋雞雛，公母雛各半，購于河北華裕家禽育種有限公司，隨機(jī)選取30只1日齡雛雞，采血制備血清，用于母源抗體測(cè)定。飼養(yǎng)至7日齡，淘汰弱雛后隨機(jī)分6組，每組135只。

(1)“地黃粉”試驗(yàn)組設(shè)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)劑量組，分別用低、中、高劑量的“地黃粉”混飲(每1L水，0.5g、1g、1.5g)，每日1次，于7日齡首次免疫新城疫活疫苗(La Sota株)后飲水飼喂，連續(xù)飼喂7天。

(2)藥物對(duì)照組即Ⅳ組，為黃芪多糖粉組，以臨床推薦劑量使用(每1L水，200mg)，于7日齡首次免疫新城疫活疫苗(La Sota株)后飲水飼喂，連續(xù)飼喂7天。

(3)陰性對(duì)照組即Ⅴ組，雞只免疫后不添加任何藥物。

(4)空白對(duì)照組即Ⅵ組，該組雞既不免疫也不添加任何藥物。

以上各組雞，于7日齡分別滴鼻、點(diǎn)眼接種雞新城疫活疫苗(La Sota株)，1羽份/只，頸部皮下注射新城疫滅活疫苗(La Sota株)，0.2ml/只；28日齡滴鼻、點(diǎn)眼接種雞新城疫活疫苗((La Sota株)，1羽份/只。

1.2試驗(yàn)方法

各組雞只分別于7日齡、14日齡、21日齡、28日齡、35日齡、42日齡、49日齡和56日齡時(shí)隨機(jī)選取15只采血(采血后淘汰)，將血液分為2份，1份加抗凝劑，備用；1份制備血清，備用。

1.2.1白細(xì)胞計(jì)數(shù)：采用直接染色法進(jìn)行雞白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2血清中酶活力的測(cè)定：嚴(yán)格按照溶菌酶(LZM)試劑盒說明書操作，測(cè)定雞血清中的酶活力。

1.2.3血清中IFN-α和TNF-α含量的測(cè)定：嚴(yán)格按照雞干擾素-α(IFN-Α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及雞腫瘤壞死因子-α(TNF-Α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用說明書中方法進(jìn)行操作，測(cè)定雞血清中IFN-α和TNF-α的含量。

1.2.4脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)的測(cè)定：將采血后淘汰的雞只剖殺，取脾和法氏囊，剝離多余組織用濾紙吸水后稱重，按公式計(jì)算脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)：

脾指數(shù)(mg/g)＝脾重(mg)/體重(g)

法氏囊指數(shù)(mg/g)＝法氏囊重(mg)/體重(g)

1.2.5血清新城疫抗體的測(cè)定：用HI試驗(yàn)測(cè)定各組各日齡雞只血清新城疫抗體效價(jià)，采用微量板法。

1.2.6外周血液酸性-醋酸萘酯酶陽性淋巴細(xì)胞值的測(cè)定：按照雞外周血淋巴細(xì)胞分離液KIT說明書操作，計(jì)算出ANAE染色陽性率的比值。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

1.4試驗(yàn)結(jié)果

1.4.1地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后白細(xì)胞總數(shù)的影響

各組雞免疫新城疫疫苗后的白細(xì)胞總數(shù)結(jié)果變化如表1-1和圖1-1所示，7日齡時(shí)，各組雞的白細(xì)胞總數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組及陽性對(duì)照黃芪多糖粉組較對(duì)照組(Ⅴ組)和空白對(duì)照組(Ⅵ組)均可不同程度的提高機(jī)體白細(xì)胞總數(shù)。對(duì)整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析表明，地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，在免疫后的各個(gè)檢測(cè)日齡，白細(xì)胞總數(shù)顯著高于對(duì)照組(Ⅴ組)和空白對(duì)照組(Ⅵ組)(P<0.05)，并且高于地黃粉的低劑量組，表明中、高劑量地黃粉與新城疫疫苗配合使用，能夠更好地增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫機(jī)能，進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

1.4..2地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中酶活力的影響

結(jié)果如表1-2和圖1-2所示，7日齡時(shí)，各組雞的血清中溶菌酶含量均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組(Ⅴ組)和空白對(duì)照組(Ⅵ組)均能不同程度提高血清中溶菌酶含量，除56日齡地黃粉低劑量組外，四個(gè)給藥組與兩個(gè)對(duì)照組相比均呈顯著性差異(P＜0.05)。統(tǒng)計(jì)分析表明，從整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果來看地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，這表明中、高劑量地黃粉與ND疫苗配合使用，能夠更好地增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫機(jī)能，進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表1-1地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后白細(xì)胞總數(shù)(×10⁹/L)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

表1-2地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中溶菌酶含量的影響(μg/ml)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

1.4.3地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中IFN-α含量的影響

由表1-3和圖1-3可以看出，7日齡時(shí)，各組雞的血清中IFN-α含量均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組的血清IFN-α含量較對(duì)照組(Ⅴ組)和空白對(duì)照組(Ⅵ組)均高，且均呈顯著性差異(P＜0.05)；其中，14日齡時(shí)，地黃粉高劑量組和黃芪多糖粉組的血清中IFN-α含量最高；21日齡、28日齡、35日齡、42日齡、49日齡和56日齡時(shí)，地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的血清中IFN-α含量最高；從整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果來看地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，這表明地黃粉與新城疫疫苗配合使用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的的非特異性免疫機(jī)能。

表1-3地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中IFN-α含量的影響(ng/L)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

1.4.4地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中TNF-α含量的影響

地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中TNF-α含量的影響結(jié)果如表1-4和圖1-4所示。7日齡，各組雞的血清中TNF-α含量均無顯著性差異(P>0.05)。給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和陽性對(duì)照黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度提高血清TNF-α含量；14日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組的血清TNF-α含量均高于對(duì)照組和空白對(duì)照組，其中四個(gè)用藥組與空白對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)；21日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組的血清TNF-α含量均高于對(duì)照組和空白對(duì)照組，其中四個(gè)用藥組與空白對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，地黃粉高、中兩個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)；28日齡、35日齡、42日齡、49日齡和56日齡時(shí)，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組的血清TNF-α含量與對(duì)照組和空白對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)；這表明地黃粉與新城疫疫苗配合使用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的的非特異性免疫機(jī)能。

表1-4地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后血清中TNF-α含量的影響(ng/L)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

1.4.5地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后脾臟指數(shù)的影響

各組試驗(yàn)動(dòng)物免疫新城疫疫苗并按計(jì)劃給藥后，分別于各個(gè)監(jiān)測(cè)日齡測(cè)定了其脾臟指數(shù)，結(jié)果如表1-5和圖1-5所示，7日齡時(shí)，各組雞的脾臟指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度的提高機(jī)體脾臟指數(shù)，其中，地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果都比較好，在免疫后的各個(gè)檢測(cè)日齡，脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，49日齡的脾指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果更表明地黃粉高劑量組顯著高于其他各組，這表明中、高劑量地黃粉與ND疫苗配合使用，能夠更好地促進(jìn)雞的脾臟發(fā)育，提高機(jī)體脾臟指數(shù)，從而進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表1-5地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后對(duì)脾臟指數(shù)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

1.4.6地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后法氏囊指數(shù)的影響

各組試驗(yàn)動(dòng)物免疫新城疫疫苗并按計(jì)劃給藥后，分別于7日齡，14日齡，21日齡，28日齡，35日齡，42日齡，49日齡及56日齡測(cè)定了其法氏囊指數(shù)，各組法氏囊指數(shù)結(jié)果如表1-6和圖1-6所示，7日齡時(shí)，各組雞的法氏囊指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度的提高機(jī)體法氏囊指數(shù)。其中，地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，在免疫后的各個(gè)檢測(cè)日齡，法氏囊指數(shù)顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，這表明中、高劑量地黃粉與ND疫苗配合使用，能夠更好地促進(jìn)雞的法氏囊發(fā)育，提高機(jī)體法氏囊指數(shù)，從而進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表1-6地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后對(duì)法氏囊指數(shù)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

1.4.7雞新城疫抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

各組各日齡動(dòng)物的新城疫抗體結(jié)果如表1-7和圖1-7所示，7日齡時(shí)雛雞的新城疫母源抗體水平已轉(zhuǎn)為陰性，說明此時(shí)進(jìn)行免疫較為合理。14日齡時(shí)，地黃粉低劑量組、對(duì)照組和空白對(duì)照組的新城疫抗體滴度較7日齡相比，均有不同程度降低；但地黃粉中劑量組和黃芪多糖粉組的新城疫抗體水平略有提高。21日齡、28日齡、35日齡、42日齡、49日齡和56日齡時(shí)，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度的提高新城疫抗體水平；其中，地黃粉中劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好且二者之間并無顯著差異，新城疫抗體水平不僅顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，也高于地黃粉的高劑量組和低劑量組，這表明中劑量地黃粉與新城疫疫苗配合使用，能夠更好地增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫機(jī)能，進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表1-7地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后對(duì)抗體效價(jià)(log2)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

1.4.8地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后ANAE陽性率的影響

試驗(yàn)結(jié)果如表1-8和圖1-8所示：7日齡時(shí)，6個(gè)試驗(yàn)組的外周血液酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)陽性淋巴細(xì)胞值均無顯著性差異(P>0.05)；之后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組ANAE陽性率均有不同程度的提高；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，地黃粉中、高劑量組與陽性對(duì)照黃芪多糖粉組的效果相當(dāng)，在免疫后的各個(gè)檢測(cè)日齡，ANAE陽性率不僅顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，亦高于地黃粉的低劑量組，這表明中、高劑量地黃粉與新城疫疫苗配合使用，能夠更好地提高外周血液酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)陽性淋巴細(xì)胞值，從而進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表1-8地黃粉對(duì)雞免疫新城疫疫苗后ANAE陽性率(％)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.地黃粉藥對(duì)H9禽流感疫苗免疫效果的影響，評(píng)價(jià)其有效性和安全性的臨床研究

2.1試驗(yàn)動(dòng)物、分組與處理

900只1日齡海蘭灰蛋雞雛，公母雛各半，購于河北華裕家禽育種有限公司，隨機(jī)選取30只1日齡雛雞，采血制備血清，用于母源抗體測(cè)定。飼養(yǎng)至14日齡，淘汰弱雛后隨機(jī)分6組，每組135只。

(1)“地黃粉”試驗(yàn)組設(shè)A、B、C三個(gè)劑量組，分別用低、中、高劑量的“地黃粉”混飲(每1L水，0.5g、1g、1.5g)，每天1次，于14日齡免疫禽流感滅活疫苗后飲水飼喂，連續(xù)飼喂7天。

(2)藥物對(duì)照組即D組，為黃芪多糖粉組，以臨床推薦劑量使用(每1L水，200mg)，于14日齡免疫禽流感滅活疫苗后飲水飼喂，連續(xù)飼喂7天。

(3)陰性對(duì)照組即E組，雞只免疫后不添加任何藥物。以上各組雞，于14日齡分別頸部皮下注射禽流感滅活疫苗(H9亞型)，0.3ml/只。

(4)空白對(duì)照組即F組，該組雞既不免疫也不添加任何藥物。

所有試驗(yàn)雞只飼喂無任何抗生素的全價(jià)日糧，自由采食和飲水。

2.2試驗(yàn)方法

各組雞只分別于14日齡、21日齡、28日齡、35日齡、42日齡、49日齡和56日齡時(shí)隨機(jī)選取15只采血(采血后淘汰)，將血液分為2份，1份加抗凝劑，備用；1份制備血清，備用。

2.2.1白細(xì)胞計(jì)數(shù)：采用直接染色法進(jìn)行雞白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.2.2血清中酶活力的測(cè)定：嚴(yán)格按照溶菌酶(LZM)試劑盒說明書操作，測(cè)定雞血清中的酶活力。

2.2.3血清中IFN-α和TNF-α含量的測(cè)定：嚴(yán)格按照雞干擾素-α(IFN-Α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及雞腫瘤壞死因子-α(TNF-Α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用說明書中方法進(jìn)行操作，測(cè)定雞血清中IFN-α和TNF-α的含量。

2.2.4脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)的測(cè)定：將采血后淘汰的雞只剖殺，取脾和法氏囊，剝離多余組織用濾紙吸水后稱重，按公式計(jì)算脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)：

脾指數(shù)(mg/g)＝脾重(mg)/體重(g)

法氏囊指數(shù)(mg/g)＝法氏囊重(mg)/體重(g)

2.2.5血清新城疫抗體的測(cè)定：用HI試驗(yàn)測(cè)定各組各日齡雞只血清禽流感H9亞型抗體效價(jià)，采用微量板法。

2.2.6外周血液酸性-醋酸萘酯酶陽性淋巴細(xì)胞值的測(cè)定：按照雞外周血淋巴細(xì)胞分離液KIT說明書操作，計(jì)算出ANAE染色陽性率的比值。

2.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2.4試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后白細(xì)胞總數(shù)的影響

試驗(yàn)對(duì)各組別各日齡試驗(yàn)動(dòng)物免疫禽流感H9疫苗后的白細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2-1和圖2-1所示，14日齡時(shí)，各組雞的白細(xì)胞總數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度的提高機(jī)體白細(xì)胞總數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析表明，地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果相當(dāng)，在用藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，白細(xì)胞總數(shù)顯著高于對(duì)照組(E組)和空白對(duì)照組(F組)(P<0.05)，且高于地黃粉的低劑量組，這表明中、高劑量地黃粉與禽流感H9亞型疫苗配合使用，能夠更好地增強(qiáng)機(jī)體的的非特異性免疫機(jī)能。

表2-1地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后白細(xì)胞總數(shù)的影響(×10⁹個(gè)/L)(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.4.2地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清溶菌酶活性的影響

結(jié)果見表2-2和圖2-2，在14日齡時(shí)，各組雞的血清溶菌酶含量均無顯著性差異(P>0.05)。給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組(Ⅴ組)和空白對(duì)照組(Ⅵ組)均能不同程度的提高機(jī)體的血清溶菌酶含量。對(duì)整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析表明，地黃粉中劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，在用藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，血清溶菌酶含量顯著高于對(duì)照組(E組)和空白對(duì)照組(F組)(P<0.05)，亦高于地黃粉的高劑量組和低劑量組(P<0.05)，這表明中劑量地黃粉與禽流感H9亞型疫苗配合使用，能夠更好地增強(qiáng)機(jī)體的的非特異性免疫機(jī)能。

表2-2地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清溶菌酶含量的影響(ug/ml)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.4.3地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清中IFN-α含量的影響

從表2-3和圖2-3可以看出，在14日齡時(shí)，各組雞的血清中IFN-α含量均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組(E組)和空白對(duì)照組(F組)均能不同程度的提高機(jī)體血清IFN-α濃度。統(tǒng)計(jì)分析表明，從整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果來看地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，在給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，血清IFN-α濃度顯著高于對(duì)照組(E組)和空白對(duì)照組(F組)(P<0.05)，且效果好于地黃粉的低劑量組(P<0.05)，這表明地黃粉與禽流感H9亞型疫苗配合使用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的的非特異性免疫機(jī)能。

表2-3地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清中IFN-α含量的影響(ng/L)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.4.4地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清中TNF-α含量的影響

地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清中TNF-α含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2-4和圖2-4，在14日齡時(shí)，各組雞的血清中TNF-α含量均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度的提高機(jī)體血清TNF-α濃度。統(tǒng)計(jì)分析表明，地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，在給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，血清TNF-α濃度顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，且還高于地黃粉的低劑量組并呈顯著性差異，這表明地黃粉與禽流感H9亞型疫苗配合使用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的的非特異性免疫機(jī)能。

表2-4地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后血清中TNF-α含量的影響(ng/L)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.4.5地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后脾臟指數(shù)的影響

各組試驗(yàn)動(dòng)物免疫禽流感H9疫苗并按計(jì)劃給藥后，分別于14日齡，21日齡，28日齡，35日齡，42日齡，49日齡及56日齡測(cè)定了其脾臟指數(shù)，結(jié)果如表2-5和圖2-5所示，在14日齡時(shí)，各組雞的脾臟指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度的提高脾臟指數(shù)。其中，地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果為最優(yōu)，在免疫后的各個(gè)檢測(cè)日齡，脾臟指數(shù)不僅顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，也優(yōu)于地黃粉的低劑量組，這表明中、高劑量地黃粉與禽流感H9亞型疫苗配合使用，能夠更好地促進(jìn)雞的脾臟發(fā)育，提高機(jī)體脾臟指數(shù)，從而進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表2-5地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后脾臟指數(shù)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.4.6地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后法氏囊指數(shù)的影響

各組試驗(yàn)動(dòng)物免疫禽流感H9疫苗并按計(jì)劃給藥后，分別于14日齡，21日齡，28日齡，35日齡，42日齡，49日齡及56日齡測(cè)定了其法氏囊指數(shù)，結(jié)果見表2-6和圖2-6，在14日齡時(shí)，各組雞的法氏囊指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度的提高法氏囊指數(shù)，其中地黃粉中劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，在免疫后的各個(gè)檢測(cè)日齡，法氏囊指數(shù)不僅顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，還高于地黃粉的高劑量組和低劑量組，這表明中劑量地黃粉與禽流感H9亞型疫苗配合使用，能夠更好地促進(jìn)雞的法氏囊發(fā)育，提高機(jī)體法氏囊指數(shù)，從而進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表2-6地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后法氏囊指數(shù)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.4.7雞禽流感H9亞型抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)中對(duì)各組別各日齡的雞進(jìn)行了禽流感H9抗體效價(jià)的測(cè)定，結(jié)果如表2-7和圖2-7所示，14日齡時(shí)雛雞的H9亞型禽流感母源抗體水平在4.87log2～5.13log2之間，說明此時(shí)進(jìn)行免疫較為合理。21日齡、28日齡時(shí)，各試驗(yàn)組的H9亞型禽流感抗體較14日齡相比，均呈下降趨勢(shì)。21日齡、28日齡、35日齡、42日齡、49日齡、56日齡時(shí)，空白對(duì)照組的H9亞型禽流感抗體一直處于陰性范圍內(nèi)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，35日齡、42日齡、49日齡、56日齡時(shí)，地黃粉低劑量組、地黃粉中劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組均能不同程度的提高H9亞型禽流感抗體水平，且呈顯著性差異(P＜0.05)。35日齡、42日齡、49日齡、56日齡時(shí)，地黃粉高劑量組較對(duì)照組均能不同程度的提高H9亞型禽流感抗體水平，其中在35日齡、42日齡和49日齡時(shí)呈顯著性差異(P＜0.05)；這表明中劑量地黃粉與禽流感H9亞型疫苗配合使用，能夠更好地增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫機(jī)能，進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表2-7地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后抗體效價(jià)(log2)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.4.8地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后ANAE陽性率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表2-8和圖2-8，在14日齡時(shí)，6個(gè)試驗(yàn)組的外周血液酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)陽性淋巴細(xì)胞值均無顯著性差異(P>0.05)；給藥后的各個(gè)檢測(cè)日齡，地黃粉高、中、低三個(gè)劑量組和黃芪多糖粉組較對(duì)照組和空白對(duì)照組均能不同程度的提高外周血液酸性-醋酸萘酯酶(ANAE)陽性淋巴細(xì)胞值；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，地黃粉中、高劑量組和黃芪多糖粉組的效果最好，在免疫后的各個(gè)檢測(cè)日齡，ANAE不僅顯著高于對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，還高于地黃粉的低劑量組；這表明中劑量地黃粉與禽流感H9型疫苗配合使用，能夠更好地提高外周血液酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)陽性淋巴細(xì)胞值，從而進(jìn)一步顯著提高機(jī)體的抵抗力。

表2-8地黃粉對(duì)雞免疫禽流感H9亞型疫苗后ANAE陽性率(％)的影響(X±SD)

注：同一列標(biāo)記不同小寫字母的代表差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記相同字母的或未標(biāo)記字母的代表差異不顯著(P>0.05)。下表同。

3.結(jié)論

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果表明，新獸藥地黃粉對(duì)靶動(dòng)物雞有確切的免疫增強(qiáng)作用，與雞的新城疫疫苗及禽流感H9疫苗共同使用可提高其抗體滴度。不同劑量的地黃粉均可提高雞的特異性及非特異性免疫功能，且以中劑量效果最為顯著。

以上所述的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。