本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體涉及一種蘆丁類藥物在制備預(yù)防或治療藥物性心臟毒性的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤疾病目前屬于人類的多發(fā)病之一，給患者帶來了較大痛苦，目前腫瘤的治療多以化學(xué)治療為主，然而對患者進行化學(xué)治療的同時，由于治療藥物的副作用，又給患者增加了疾病本身以外的痛苦，輕微的如頭痛、惡心、乏力，嚴(yán)重的如脫發(fā)、肝腎及心臟毒性等等。

蒽環(huán)類藥物，如表柔比星、吡柔比星等已被廣泛地用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體腫瘤，如乳腺癌、淋巴瘤、急性白血病等。其在抗腫瘤方面具有良好的效果。2014年《nccn乳腺癌指南》推薦，乳腺癌首選輔助化療方案為ac×4→t(p)×4(表柔比星、吡柔比星/環(huán)磷酰胺-紫杉醇)。然而，該類藥物最突出的化療毒副反應(yīng)為心臟毒性(anthracycline-inducedcardiotoxicity，aic)，所述心臟毒性主要分為嚴(yán)重的急性、慢性或遲發(fā)性心肌毒性，其中

急性心臟毒性，急性心臟毒性經(jīng)常發(fā)生在給藥后的幾個小時或幾天內(nèi)，表現(xiàn)為心內(nèi)傳導(dǎo)紊亂和心律失常，具有以下幾種特征性表現(xiàn)：電生理學(xué)的異常，可導(dǎo)致非特異性st段和t波改變，qrs低電壓，qt間期延長；竇性心動過速是最常見的節(jié)律紊亂，曾報道過發(fā)生室性、室上性心律失常；房室和束支傳導(dǎo)阻滯。

慢性心臟毒性通常在化療的1年內(nèi)發(fā)生，表現(xiàn)為左心室功能障礙，最終導(dǎo)致心衰。

遲發(fā)性損傷是在化療后數(shù)年發(fā)生，可表現(xiàn)為心衰、心肌病及心律失常等。最近研究發(fā)現(xiàn)，患者無癥狀，而在治療1年后會發(fā)生隱匿性心室功能障礙、心力衰竭和心律失常。

通常針對不同的心臟毒性，其治療是不同的，通常采用對癥處理；當(dāng)出現(xiàn)心衰后予以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑(arb)和β-受體阻滯劑治療或予以心臟保護劑。

鑒于蒽環(huán)類藥物的心臟毒性問題，國內(nèi)外很多研究人員曾對心臟保護劑，包括輔酶q10、左卡尼汀、n-乙酰半胱氨酸、抗氧化劑(vc和ve等)以及其他的鐵螯合劑(如去鐵敏和edta)進行了相關(guān)研究，這些研究認(rèn)為，這些保護劑或許具有一定的心臟保護效果。但是，van等使用meta分析顯示，輔酶q10、左卡尼汀、n-乙酰半胱氨酸、vc和ve等對于蒽環(huán)類化療沒有明顯的心臟保護作用。

右丙亞胺(dexrazoxane)是美國chiron公司開發(fā)的心臟保護藥，其為雙內(nèi)酰亞胺類化合物，是乙二胺四乙酸(edta)的衍生物，1995年7月獲fda批準(zhǔn)，專屬用于女性乳腺癌接受吡柔比星治療所產(chǎn)生的心臟毒性的保護藥。chakrabarti等研究表明，右丙亞胺在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán)螯合劑，干擾鐵離子中介的自由基的形成。van等認(rèn)為，只有右丙亞胺可使病人明顯獲益，心衰的發(fā)生率明顯降低。然而，該藥是否會干擾蒽環(huán)類藥物的抗癌藥效，是目前擔(dān)心的問題，事實上己有證據(jù)提出該藥可能會降低蒽環(huán)類藥的抗癌藥效。

因此，臨床腫瘤化療迫切需要開發(fā)新的預(yù)防或治療蒽環(huán)類心臟毒性的藥物。

蘆丁類藥物如蘆丁片、曲克蘆丁在臨床廣泛應(yīng)用。主要用于脆性增加的毛細血管出血癥，高血壓腦病、腦出血、視網(wǎng)膜出血、出血性紫癜、急性出血性腎炎、再發(fā)性鼻出血、創(chuàng)傷性肺出血、產(chǎn)后出血等的輔助治療，

孫波等人(《實驗動物科學(xué)》，第31卷第1期，2014年2月)發(fā)表了《蘆丁對大鼠糖尿病心肌病rocki蛋白的影響》，而糖尿病性心肌病和藥物特別是抗腫瘤藥物致心臟毒性屬于不同的臨床疾病，其發(fā)病誘因不同，病程，病理改變，心臟功能改變特征，治療原則也不同，其對藥物性心臟毒性是否具有預(yù)防或治療作用沒有報道或啟示。

mandziuks等人(《drugchemtoxicol》38(1)：1-8.2015年1月)公開了《mutellinapurpurea多酚化合物對阿霉素致h9c2心肌細胞毒性的保護作用》，其公開了mutellinapurpurea多酚化化合物對延遲心肌病的保護作用，文中通過比較阿霉素分別聯(lián)合lh8、槲皮素、蘆丁及綠原酸處理h9c2心肌細胞以觀察其形態(tài)學(xué)變化及mtt實驗結(jié)果，結(jié)果提示：蘆丁的抗氧化作用是清楚的，但是對于阿霉素致心肌細胞活性降低沒有影響(即對阿霉素致心肌細胞的損傷沒有保護作用)，作者并最后提出了需更廣泛的實驗研究以進行驗證的觀點，因此、該文獻沒有明確地得出蘆丁對阿霉素致遲發(fā)性心臟毒性是否具有保護作用的結(jié)論。

發(fā)明人追蹤相關(guān)研究進展發(fā)現(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)蘆丁類藥物用于藥物性、特別是吡柔比星或表柔比星致心臟毒性相關(guān)研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上情況，本發(fā)明提供一種蘆丁類藥物在制備預(yù)防或治療藥物性心臟毒性的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，作為實施方案之一，所述藥物性心臟毒性為藥物性急性心肌毒性、藥物性慢性心肌毒性、或藥物性遲發(fā)性心肌毒性。

本發(fā)明中，作為實施方案之一，所述蘆丁類藥物為蘆丁或曲克蘆丁。蘆丁類藥物中的蘆丁單體、曲克蘆丁單體為羥乙基蘆丁類化合物，其具體結(jié)構(gòu)如下：

所述蘆丁或曲克蘆丁均為已知的化合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以市購或按照現(xiàn)有技術(shù)合成得到符合藥用的上述化合物。

本發(fā)明所述藥物性心臟毒性是指由于施用抗腫瘤的蒽環(huán)類藥物導(dǎo)致的心臟毒性，優(yōu)選為吡柔比星或表柔比星，作為非限制性的說明，所述藥物性心臟毒性還可以用于包括但不限于柔紅霉素、去甲氧柔紅霉素或阿克拉霉導(dǎo)致的心臟毒性等等。

本發(fā)明應(yīng)用中，作為實施方案之一，可以直接向心肌細胞施用蘆丁類藥物，，作為實施方案之一、所述蘆丁類藥物可以為液體制劑，液體制劑中蘆丁類藥物的濃度為10～280μmol/l。

作為實施方案之一，直接向心肌細胞施用蘆丁時，所述液體制劑中蘆丁的濃度10～100μmol/l；作為實施方案之一，優(yōu)選為10～70μmol/l；作為實施方案之一，進一步優(yōu)選為30～70μmol/l；作為實施方案之一，最佳為50μmol/l；作為示例性的說明，例如包括但不限于10μmol/l、30μmol/l、50μmol/l、70μmol/l或100μmol/l。

作為實施方案之一，直接向心肌細胞施用曲克蘆丁時，所述液體制劑中曲克蘆丁的濃度為10～180μmol/l；作為實施方案之一，優(yōu)選為10～140μmol/l、更優(yōu)選為30～100μmol/l；更進一步優(yōu)選為30～70μmol/l；最佳為70μmol/l；作為示例性的說明、例如包括但不限于10μmol/l、35μmol/l、70μmol/l、140μmol/l或280μmol/l。

本發(fā)明應(yīng)用中，作為實施方案之一，向受試者通過胃腸道施用蘆丁類藥物，作為實施方案之一，所述施用蘆丁類藥物的劑量范圍為36mg/kg～219mg/kg。

本發(fā)明應(yīng)用中，作為實施方案之一，經(jīng)胃腸道向受試者施用蘆丁的劑量范圍為36mg/kg～180mg/kg；優(yōu)選110mg/kg～180mg/kg；最佳為180mg/kg；作為示例性的說明，例如包括但不限于36mg/kg、108mg/kg或180mg/kg。

本發(fā)明應(yīng)用中，作為實施方案之一，經(jīng)胃腸道向受試者施用曲克蘆丁的劑量范圍為55mg/kg～219mg/kg；優(yōu)選108mg/kg～219mg/kg；最佳為219mg/kg；作為示例性的說明，包括但不限于55mg/kg、110mg/kg或219mg/kg。

由于施用藥物的受試者的類型的不同、本領(lǐng)域技術(shù)人員通常會根據(jù)上述劑量范圍并針對不同類型的受試者進行相應(yīng)劑量的變化和/或調(diào)整，這種劑量的變化和調(diào)整均為依據(jù)本領(lǐng)域常識，作為示例性說明，可以依據(jù)以下關(guān)系進行換算：

人和動物間按體表面折算的等效劑量比值

例如向人類受試者施用蘆丁類藥物時，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常會按照上述比例關(guān)系換算成相應(yīng)的劑量，作為示例性的說明，以成年人(70kg)為例，由大鼠換算成人的劑量，按照70kg人與200g大鼠按上表相交處為56(倍)，如蘆丁大鼠劑量為36mg/kg，200g大鼠給藥36×0.2＝7.2mg，即(7.2×56)/70＝5.76mg/kg。以此類推進行計算。

本發(fā)明中，作為實施方案之一，經(jīng)胃腸道向人類施用蘆丁類藥物，其中施用蘆丁類藥物的劑量范圍為5.76mg/kg～35.04mg/kg。

本發(fā)明中，經(jīng)胃腸道向人類施用蘆丁時，作為實施方案之一、其中施用蘆丁的劑量范圍為5.76mg/kg～28.8mg/kg；優(yōu)選17.6mg/kg～28.8mg/kg；最佳為28.8mg/kg；

作為另一實施方案之一，施用曲克蘆丁的劑量范圍為8.8mg/kg～35.04mg/kg；優(yōu)選為17.28mg/kg～35.04mg/kg；最佳為35.04mg/kg。

本發(fā)明應(yīng)用中，可以將蘆丁類藥物制成單獨的制劑、單獨地直接適用于心肌細胞或向受試者通過包括但不限于胃腸道途徑施用。

本發(fā)明應(yīng)用中，當(dāng)直接用于心肌細胞時，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備成可直接向心肌細胞施用的制劑(例如包括但不限于液體制劑)。當(dāng)包括但不限于通過胃腸道施用時、可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備成適于胃腸道給藥或非胃腸道給藥的藥物制劑，本發(fā)明優(yōu)選制成胃腸道給藥的藥物制劑，其制劑形式可以為常規(guī)片劑或膠囊、或控釋、緩釋制劑。在本發(fā)明中，根據(jù)不同的制劑形式和制劑規(guī)格，所述蘆丁類藥物在制劑中的含量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容及本領(lǐng)域常識進行確定；制劑使用的輔料可采用本領(lǐng)域常規(guī)的輔料，以不和本發(fā)明蘆丁類藥物發(fā)生反應(yīng)或不影響本發(fā)明藥物的療效為前提；所述制劑的制備方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法進行制備。本發(fā)明中蘆丁類藥物制劑的制備方法沒有什么限制。

本發(fā)明應(yīng)用中，可以將蘆丁類藥物與蒽環(huán)類藥物包括在同一種藥物制劑如片劑或膠囊中，也可以將蘆丁類藥物與蒽環(huán)類藥物分別做成制劑，如分別做成片劑或膠囊，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，患者然后按照藥品說明書的指示同時服用；

在本發(fā)明應(yīng)用中，當(dāng)與抗腫瘤藥物制成先后給藥的藥劑的方案，可以將蘆丁類藥物與蒽環(huán)類藥物分別做成不同的制劑，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，患者然后按照藥品說明書指示的先后順序進行服用，或?qū)⑸鲜鰞深愃幬锍煞种瞥梢环N控釋的制劑，先釋放其中的一種成分、再釋放另一種成分，患者只需要服用該控釋組合制劑；

在本發(fā)明應(yīng)用中，制備成交叉給藥的藥劑的方案中，可以將蘆丁類藥物與蒽環(huán)類藥物分別做成不同的制劑，并采用本領(lǐng)域常規(guī)的方式將它們包裝或結(jié)合在一起，患者然后按照藥品說明書指示的交叉順序服用，或者將該藥物組合制備成交叉釋放的控釋制劑。

本發(fā)明中，蘆丁類藥物的給藥劑量根據(jù)給藥對象、給藥途徑或藥物的制劑形式不同可以進行適當(dāng)?shù)淖兓员ＷC該藥物蘆丁類藥物在哺乳動物體內(nèi)能夠達到有效的血藥濃度為前提。

本發(fā)明的體外實驗顯示：予以吡柔比星處理h9c2心肌細胞，復(fù)制心臟毒性(急性心肌毒性)模型，分別給予右丙亞胺及蘆丁(蘆丁提前1h處理細胞)，以觀察二者對心肌細胞的保護作用。處理細胞24h后的結(jié)果顯示，吡柔比星對心肌細胞抑制率為42.30％；吡柔比星聯(lián)合右丙亞胺可減輕吡柔比星所致心肌細胞損傷作用，減低細胞抑制率(26.89％)；而30、50及70μmol蘆丁對心肌細胞抑制率有不同程度降低(25.02％，12.04％及21.87％)，且均低于右丙亞胺陽性藥對照組，但僅50μmol蘆丁對降低心肌細胞的抑制率較右丙亞胺具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。

另外，通過預(yù)先予以大鼠不同濃度的蘆丁灌胃7天，第7天尾靜脈注射吡柔比星(18mg/kg)復(fù)制wistar大鼠急性心臟毒性(損傷)模型，結(jié)果顯示，吡柔比星可致大鼠心率增快、qrs波畸形或倒置、房顫、室上性心動過速等心電圖改變；心臟收縮及舒張功能降低；外周血心肌酶譜升高、sod活力下降及mda升高。應(yīng)用右丙亞胺可以改善吡柔比星所致上述心臟毒性，36、108及180mg/kg蘆丁亦可改善吡柔比星所致心臟毒性，其中以中高濃度蘆丁組改善作用為好，改變具有降低外周血心肌酶、抗氧化損傷相關(guān)酶活力及改善心臟收縮與舒張功能障礙。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，尾靜脈注射吡柔比星后，大鼠心肌組織內(nèi)可見數(shù)量不等的灶狀、小灶狀性或涉及幾個心肌細胞的病變。表現(xiàn)為肌漿紅染，部分細胞的細胞核濃染，不規(guī)則，部分細胞核消失；也可見部分細胞空泡變性及脂肪變性。未見肌間水腫及炎細胞浸潤。病變主要分布于中膜。右丙亞胺組及蘆丁各濃度組均能減輕上述心肌病變程度及病變數(shù)量，以蘆丁中高濃度療效最佳，在很多或絕大多數(shù)指標(biāo)的改善方面顯著優(yōu)于右丙亞胺。研究提示，蘆丁對吡柔比星所致心臟毒性具有保護作用。

本發(fā)明蘆丁類藥物對吡柔比星所致心臟毒性具有保護作用，減輕或避免了毒副作用的發(fā)生。

附圖說明

圖1：試驗例1中1.1.1部分蘆丁對吡柔比星致h9c2心肌細胞毒性的保護作用

圖2：試驗例1中1.2.1部分曲克蘆丁對表柔比星致h9c2心肌細胞毒性的保護作用

圖3-1：實驗例2中a)部分蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性24h心電圖的影響；x軸：時間ms；y軸：電壓mv；a：正常組；b：吡柔比星組；c：右丙亞胺組；d：蘆丁低劑量組；e：蘆丁中劑量組；f：蘆丁高劑量組；

圖3-2：實驗例2中a)部分蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性48h心電圖的影響；x軸：時間ms；y軸：電壓mv；a：正常組；b：吡柔比星組；c：右丙亞胺組；d：蘆丁低劑量組；e：蘆丁中劑量組；f：蘆丁高劑量組；

圖3-3：實驗例2中a)部分的蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性72h心電圖的影響；x軸：時間ms；y軸：電壓mv；a：正常組；b：吡柔比星組；c：右丙亞胺組；d：蘆丁低劑量組；e：蘆丁中劑量組；f：蘆丁高劑量組；

圖4-1：實驗例2中b)部分的蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性24h左心功能的影響；x軸：時間ms；y軸：電壓mv；a：正常組；b：吡柔比星組；c：右丙亞胺組；d：蘆丁低劑量組；e：蘆丁中劑量組；f：蘆丁高劑量組；

圖4-2：實驗例2中b)部分的蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性48h左心功能的影響；x軸：時間ms；y軸：電壓mv；a：正常組；b：吡柔比星組；c：右丙亞胺組；d：蘆丁低劑量組；e：蘆丁中劑量組；f：蘆丁高劑量組；

圖4-3：實驗例2中b)部分的蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性72h左心功能的影響；x軸：時間ms；y軸：電壓mv；a：正常組；b：吡柔比星組；c：右丙亞胺組；d：蘆丁低劑量組；e：蘆丁中劑量組；f：蘆丁高劑量組；

圖5：實驗例2中e)部分的蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性組織形態(tài)學(xué)變化。

具體實施方式

本發(fā)明通過以下實施例和實驗例進一步闡述本發(fā)明，但不以任何的方式限制本發(fā)明的有效范圍。

實施例及實驗例

不同劑量的蘆丁類藥物與蒽環(huán)類藥物聯(lián)合的制備按以下表1中的比例進行制備。

對于實施例1～32中蘆丁類藥物的液體組合，可以將對應(yīng)濃度的蘆丁類藥物與蒽環(huán)類藥物制備成同一種溶液中，然后施用時直接使用；也可以將它們分別制成相應(yīng)濃度的溶液，然后進行混合并在施用時直接使用；也可以在使用時進行混合后在進行施用，或分別向受試者施用，它們施用的先后順序并不受限制。

對于實施例1～32中蘆丁類藥物經(jīng)胃腸給藥的組合，可以將對應(yīng)質(zhì)量的蘆丁類藥物與蒽環(huán)類藥物直接進行混合，使用同時服用；也可以將它們分別制成單元制劑，在施用時同時向受試者服用，或先后服用，但它們之間使用先后順序并不受限制。

實驗例的方法包括如下

試劑和方法：

試劑：大鼠血清腦鈉素bnp(mexn-r0119)、血清心肌肌鈣蛋白t(mexn-r0994)及肌酸激酶同工酶mb(mexn-r0995)試劑盒均購于上海美軒生物科技有限公司。丙二醛(a003-1)、乳酸脫氫酶ldh(a020-2)及超氧化物歧化酶sod(a001-3)等試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。

動物：清潔級wistar大鼠購自吉林大學(xué)動物實驗中心。飼養(yǎng)于普通級房間里，房間恒溫在20～28℃，自動人工光照明暗各12h，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

細胞：h9c2心肌細胞由吉林大學(xué)再生研究所孫非教授惠贈。

藥物來源：曲克蘆?。簳x城海斯制藥有限公司；表柔比星：浙江海正藥業(yè)股份有限公司；吡柔比星：深圳萬樂藥業(yè)有限公司；注射用右丙亞胺(dzr)：江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司；蘆丁(rutin)：南京景竹醫(yī)藥科技有限公司。

體外實驗方法：細胞培養(yǎng)，mtt實驗篩選蘆丁、曲克蘆丁對心肌細胞最佳的給藥濃度，分別聯(lián)合表柔比星、吡柔比星作用心肌細胞最佳的給藥濃度。

體內(nèi)實驗方法：分別預(yù)先給予蘆丁、曲克蘆丁后，應(yīng)用表柔比星、吡柔比星分別復(fù)制大鼠心臟毒性(損傷)模型，觀察不同給藥組合對大鼠心電圖、左心室收縮壓(lvsp，mmhg)、左心室舒張壓(lvdp，mmhg)、左心室終末舒張壓(lvedp，mmhg)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax，mmhg/s)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax，mmhg/s)、心率(hr)等數(shù)據(jù)；分析心肌酶譜、抗氧化指標(biāo)、ca²⁺及心臟組織形態(tài)學(xué)變化。

表1不同劑量的蘆丁、曲克蘆丁與吡柔比星、表柔比星的組合

實驗例1體外試驗

1.1.1不同比例的蘆丁對h9c2細胞抑制率的影響(mtt法)

試驗方法：

h9c2心肌細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80％時，根據(jù)實驗需要進行不同的處理：(1)分別給予10、30、50、70及100μmol/l不同濃度的蘆丁(rutin)預(yù)處理1h后棄去，pbs洗2次，再用5μmol/l吡柔比星培養(yǎng)24h；(2)rutin預(yù)處理的24后棄去，pbs洗2次，再用5μmol/l吡柔比星培養(yǎng)24h；每個處理因素設(shè)8個復(fù)孔。終止培養(yǎng)后，每孔加入10μlmtt，輕搖，37℃孵育。然后測量細胞抑制率＝(1-實驗組od值/對照組od值)×100％。測量結(jié)果參見表2和圖1。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用spss17.0軟件進行組間單因素方差分析，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2蘆丁對吡柔比星誘導(dǎo)h9c2心臟毒性的保護作用

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與吡柔比星組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺+吡柔比星組比較，^cp＜0.05

結(jié)論：

通過予以吡柔比星處理h9c2心肌細胞，復(fù)制心臟毒性(心肌細胞損傷)模型，結(jié)果顯示，吡柔比星可降低抑制心肌細胞抑制率；吡柔比星聯(lián)合右丙亞胺可減輕吡柔比星所致心肌細胞損傷作用，提高細胞存活率；而30、50及70μmol蘆丁組亦可顯著降低心肌細胞抑制率，且各劑量組單體蘆丁降低心肌細胞抑制率均明顯低于右丙亞胺陽性藥對照組，以50μm蘆丁作用最好。在蘆丁在50μmol以下，隨著單體蘆丁濃度的增加，心肌細胞的保護作用逐漸增強；而在50μmol以上濃度，隨著濃度的增加心肌細胞保護作用反而逐漸下降。因而，在10、100μmol蘆丁組與對照組相比顯著降低心肌細胞抑制率，但與右丙亞胺陽性藥組比較未能降低心肌細胞抑制率。

1.2.1不同比例的曲克蘆丁對表柔比星致h9c2細胞毒性抑制率的影響(mtt法)

試驗方法：

h9c2心肌細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80％時，根據(jù)實驗需要進行不同的處理：(1)分別給予10、35、70、140及280μmol/l不同濃度的曲克蘆丁(pur-rut)預(yù)處理1h后棄去，pbs洗2次，再用5μmol/l表柔比星培養(yǎng)24h；(2)rut預(yù)處理的24后棄去，pbs洗2次，再用5μmol/l表柔比星培養(yǎng)24h；每個處理因素設(shè)8個復(fù)孔。終止培養(yǎng)后，每孔加入10μlmtt，輕搖，37℃孵育。然后測量細胞抑制率，測量結(jié)果參見表3和圖2。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用spss17.0軟件進行組間單因素方差分析，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3曲克蘆丁對表柔比星誘導(dǎo)h9c2心臟毒性的保護作用

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與表柔比星組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺+表柔比星組比較，^cp＜0.05

結(jié)論：

通過予以表柔比星處理h9c2心肌細胞，復(fù)制心臟毒性(心肌細胞損傷)模型，結(jié)果顯示，表柔比星可顯著提高心肌細胞抑制率；表柔比星聯(lián)合右丙亞胺可減輕表柔比星所致心肌細胞損傷作用，提高細胞存活率；而35、70及140μmol曲克蘆丁組亦可顯著降低心肌細胞抑制率，且上述各劑量組曲克蘆丁降低心肌細胞抑制率均明顯優(yōu)于右丙亞胺陽性藥對照組，以70μm曲克蘆丁作用最好。在10、280μmol曲克蘆丁組與表柔比星組、右丙亞胺陽性藥組相比未能降低心肌細胞抑制率，對心肌細胞損傷無明顯保護作用。

實驗例2體內(nèi)試驗

不同比例的蘆丁對吡柔比星致wistar大鼠急性心臟毒性的保護作用

蒽環(huán)類藥物急性心臟毒性模型制備：按照《人類疾病動物模型復(fù)制方法》及《五味子乙素和右丙亞胺對阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性的保護作用》文章中方法進行制備。

藥品、試劑及動物：

藥品：鹽酸吡柔比星(thp，深圳萬樂股份有限公司)、注射用右丙亞胺(dzr，江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司)、蘆丁(rutin，南京景竹醫(yī)藥科技有限公司)。

試劑：大鼠血清腦鈉素bnp(mexn-r0119)、血清心肌肌鈣蛋白t(mexn-r099)及肌酸激酶同工酶mb(mexn-r0995)試劑盒均購于上海美軒生物科技有限公司。鈣離子(c004-2)、丙二醛(a003-1)、乳酸脫氫酶ldh(a020-2)及超氧化物歧化酶sod(a001-3)等試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。

動物：清潔級wistar大鼠購自吉林大學(xué)動物實驗中心。常規(guī)飼養(yǎng)，房間恒溫在20～28℃，自動人工光照明暗各12h，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

實驗方法：

取體重在180～200g的96只wistar大鼠，飼養(yǎng)1周后開始實驗。急性心臟毒性模型的建立將大鼠隨機分為6組，分別為正常對照組(con)、模型對照組(thp)、陽性藥對照組(dzr)及蘆丁低、中、高劑量組rutin[l、m、h]，單體蘆丁給藥劑量分別為36、108、180mg/kg)，具體分組、給藥劑量及給藥后心電圖改變參見表4。

表4實驗動物分組、給藥劑量及給藥后心電圖改變

給藥方式如表5：

表5動物分組及藥物處理方法

大鼠心臟功能的測定大鼠在給予thp72h后，用7％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔麻醉，固定于自制的手術(shù)臺上，在胸鎖骨胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離右頸總動脈，頭端結(jié)扎，向心端插入連有感受器的靜脈留置針，將靜脈留置針緩緩插入，使之通過左側(cè)動脈瓣和房室瓣進入左心室，采集左心室內(nèi)壓曲線，bl-420e生物機能實驗系統(tǒng)會自動采集左心室收縮壓(lvsp，mmhg)、左心室舒張壓(lvdp，mmhg)、左心室終末舒張壓(lvedp，mmhg)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax，mmhg/s)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax，mmhg/s)、心率(hr)等數(shù)據(jù)。心肌酶譜的檢測大鼠在給予thp后24、48及72h，腹主動脈采血，室溫靜置4-6h，3000r/min、4℃離心15min，分裝血清，保存于-80℃冰箱。根據(jù)試劑盒的要求，全自動生化分析儀檢ca²⁺、mda、sod及bnp、ck-mb、ctnt、ldh，統(tǒng)計各組數(shù)據(jù)并分析。結(jié)果參見表6和圖3～4。

實驗結(jié)果

a)不同比例的蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性24、48及72h心電圖的影響；參見圖3-1～3-3。

圖3-1～3-3結(jié)果提示：108mg/kg、180mg/kg蘆丁組對大鼠心臟收縮及舒張功能較右丙亞胺組明顯改善，以180mg/kg蘆丁組效果最佳(p＜0.05)。

b)不同比例的蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性24、48及72h左心功能的影響；參見表6～8和圖4-1～圖4-3。

表6蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性24h心功能的影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05.

表7蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性48h心功能的影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05。

表8蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性72h心功能的影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05。

表6～8和圖4-1～圖4-3結(jié)果提示：大鼠在給予thp造模后24、48及72h引發(fā)左心室收縮壓(lvsp)、左心室舒張壓(lvdp)左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)和心率等下降，左心室終末舒張壓(lvedp)上升。與thp組相比，提前給予rutin或dzr的大鼠，心臟的收縮和舒張功能具有明顯改善，且蘆丁作用效果好于dzr。108mg/kg、180mg/kg蘆丁組較右丙亞胺組心臟收縮及舒張功能明顯改善，以180mg/kg蘆丁組效果最佳(p＜0.05)。

c)蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血24、48及72h心肌酶譜的影響

表9蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血24h心肌酶譜的影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05

表10蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血48h心肌酶譜的影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05

表11蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血72h心肌酶譜的影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05

表9～11結(jié)果顯示，相對于正常對照組，大鼠在給予thp造模24、48及72h后會引起外周血中心肌酶的升高；與thp組相比，大鼠在提前給予蘆丁或dzr后，心肌酶有顯著性降低；中高濃度rutin組的保護心臟作用好于dzr。108mg/kg、180mg/kg蘆丁組較模型組、右丙亞胺組外周血心肌酶譜明顯降低，以180mg/kg蘆丁組效果最佳(p＜0.05)。

d)蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血24、48及72hsod、mda影響

表12蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血24hsod、mda影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05

表13蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血48hsod、mda影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05

表14蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血72hsod、mda影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05

表12～14統(tǒng)計結(jié)果提示與正常對照組相比，大鼠在給予吡柔比星后造成超氧化物歧化酶(sod)等酶活力下降，致使吡柔比星產(chǎn)生的過量自由基不能被及時的清除。過量自由基作用于心肌細胞膜及細胞器的磷脂膜，發(fā)脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，最后產(chǎn)生丙二醛(mda)，其含量的高低間接反映心肌細胞損傷程度。大鼠在提前給予蘆丁后能夠提高心肌細胞抗氧化相關(guān)酶的酶活力，吡柔比星產(chǎn)生的過量自由基被及時清除，mda含量顯著降低；各濃度rutin組的保護心臟作用好于dzr。尤以高濃度蘆丁效果最好。108mg/kg、180mg/kg蘆丁組較模型組及右丙亞胺組sod活性增加及mda明顯降低，以180mg/kg蘆丁組效果最佳(p＜0.05)。

表15蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性外周血ca²⁺24、48及72h的影響

注：與正常對照組比較，^ap＜0.05；與模型組比較，^bp＜0.05；與右丙亞胺組比較，^cp＜0.05

與正常對照組相比，大鼠在給予吡柔比星后造成血清ca²⁺升高，ca²⁺濃度升高作用于心肌細胞膜，導(dǎo)致細胞鈣超載，繼而引發(fā)了一系列細胞損害，影響了心肌細胞的收縮及舒張功能。在提前給予蘆丁的大鼠降低因吡柔比星導(dǎo)致的心肌細胞胞內(nèi)鈣離子水平的升高，從而對心肌細胞產(chǎn)生保護作用。中、高濃度rutin組的保護心臟作用好于dzr。尤以高濃度蘆丁效果最好。108mg/kg、180mg/kg蘆丁組較模型組及右丙亞胺組ca²⁺濃度明顯降低，以180mg/kg蘆丁組效果最佳(p＜0.05)。

e)蘆丁對吡柔比星致大鼠急性心臟毒性組織形態(tài)學(xué)變化(he染色，200×)參見圖5。

由圖5所示，正常對照組(c)：心肌細胞類圓形或多邊形，胞漿均勻呈淡紅色，核圓形，較小，居中。肌纖維排列整齊，肌細胞間連接緊密，心肌細胞間有極少量結(jié)締組織，毛細血管豐富。

模型對照組(thp1-3)：可見數(shù)量不等的、僅涉及幾個心肌細胞的病變。表現(xiàn)為肌漿紅染，部分細胞的細胞核濃染，不規(guī)則，部分細胞核消失；也可見部分細胞空泡變性及脂肪變性。未見肌間水腫及炎細胞浸潤。

右丙亞胺陽性藥組(dzr)：可見數(shù)量不等的、僅涉及幾個心肌細胞的病變。表現(xiàn)為肌漿紅染，小部分細胞的細胞核濃染，不規(guī)則，部分細胞核消失；也可見部分細胞空泡變性及脂肪變性。未見肌間水腫及炎細胞浸潤。

蘆丁低濃度組(rl)：病變基本與dzr組相近。

蘆丁中濃度組(rm)：正常心肌細胞間見散在幾個心肌細胞的病變。表現(xiàn)為肌漿紅染，部分細胞的細胞核濃染，不規(guī)則；未見細胞空泡變性及脂肪變性，肌間水腫及炎細胞浸潤。涉及的病變細胞數(shù)目及病變數(shù)量較模型對照組、陽性藥物有所減少。

蘆丁高濃度組(rh)：可見數(shù)量不等的、僅涉及幾個心肌細胞的病變。表現(xiàn)為肌漿紅染，小部分細胞的細胞核濃染，不規(guī)則，部分細胞核消失；也可見部分細胞空泡變性及脂肪變性。未見肌間水腫及炎細胞浸潤。涉及的病變細胞數(shù)目及病變數(shù)量較模型對照組、陽性藥物有所減少。

結(jié)論：

大鼠尾靜脈給予吡柔比星(18mg/kg)后可誘導(dǎo)外周血中心肌酶升高、ca²⁺濃度升高、抗氧化損傷相關(guān)酶活力下降、心電圖異常及心臟收縮與舒張功能障礙。而預(yù)先給予蘆丁的大鼠，其吡柔比星誘導(dǎo)的上述癥狀都能得到明顯改善或保護，且保護效果好于右丙亞胺。結(jié)果提示，108mg/kg、180mg/kg蘆丁能預(yù)防吡柔比星誘導(dǎo)的大鼠急性心臟毒性。