本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領域，具體涉及中藥單體石蒜堿在制備治療乳腺癌疾病的藥物中的應用。

背景技術(shù)：

乳腺癌(breastcancer)是女性高發(fā)性癌癥，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第一，嚴重危害著女性健康?，F(xiàn)今乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍逐日攀升，根據(jù)美國2015年《臨床腫瘤雜志》最新報導，在美國乳腺癌發(fā)病率在女性癌癥中排名第一，約232,670名女性患有乳腺癌，發(fā)病率約為29％，致死率為15％左右，在女性各類癌癥中排名第二。根據(jù)2015年中國腫瘤年報總結(jié)，2014年里乳腺癌在女性中，發(fā)病率依然是位居第一，致死率排名第四；根據(jù)2014復旦醫(yī)學院新發(fā)表在《柳葉刀》上的數(shù)據(jù)顯示，自二十世紀九十年代，中國女性乳腺癌發(fā)病率就以兩倍的趨勢增加，特別是發(fā)達的城市地區(qū)，在世界上作為生育率很低的城市之一上海和北京，其發(fā)病率也是居高不下。

乳腺癌根據(jù)其發(fā)生發(fā)展過程，可分為原位導管癌、浸潤性導管癌及浸潤性小葉癌等。研究表明，乳腺癌原位腫瘤即原位導管癌的生長并不是腫瘤致死的主要原因，90％以上的乳腺癌患者最終死亡的原因是發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移，如乳腺癌肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移等。伴隨著乳腺癌如此高發(fā)率，治療乳腺癌的手段也一直不斷趨于成熟和完善。針對不同的乳腺癌的類型和發(fā)展階段，主要的治療手段有手術(shù)治療、放療、化療、激素治療及靶向治療等。那么在這些治療手段中，化療一直扮演著十分重要的作用。乳腺癌臨床化療方案的發(fā)展經(jīng)歷了單藥化療和聯(lián)合化療的歷程。美國國立綜合癌癥網(wǎng)在2015年發(fā)表的乳腺癌的治療方案中，蒽環(huán)類，紫衫烷類，烷化劑等這類廣譜化療藥物仍作為一線化療藥物，采用不同方式的聯(lián)合用藥來治療不同階段的乳腺癌病人。但是這類藥物存在兩個很大缺陷，一是毒副作用大，長期使用會導致病人不同程度得心臟毒性、肝毒性及神經(jīng)毒性等；二是易產(chǎn)生耐藥，對多種化療藥物產(chǎn)生抵抗從而無法達到藥效，所以限制了此類藥物的長期使用。因此，開發(fā)出新的安全性高且療效佳的化療藥物刻不容緩。中藥成分在抗腫瘤方面越來越受到重視，中國藥用資源豐富，具有成本低廉、毒副作用小及療效明顯等特征，現(xiàn)今已經(jīng)有不少中草藥單體用于腫瘤治療中，并取得不錯的治療效果。所以從中草藥里開發(fā)具有治療乳腺癌疾病的小分子單體具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種式(i)所示的石蒜堿單體化合物或其水合物或藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體在制備治療乳腺癌惡性腫瘤藥物中的應用，所述石蒜堿單體化合物的結(jié)構(gòu)如式(i)所示；

式(i)所示石蒜堿化合物是一種中草藥單體，英文名：lycorine，分子式：c16h17no4，分子量：287.3，cas登錄號：476-28-8。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物在體外和體內(nèi)具有如下作用：可以抑制乳腺癌細胞株的增殖、可以抑制乳腺癌細胞的克隆形成、抑制乳腺癌細胞的遷移、抑制乳腺癌細胞的侵襲、抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移、促進多種乳腺癌細胞的凋亡、抑制乳腺癌細胞遷移相關(guān)蛋白的表達進而抑制遷移相關(guān)的信號通路。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物可以在體外和體內(nèi)抑制多種乳腺癌細胞株的增殖，包括抑制乳腺癌細胞株mda-mb-231、4t1、mcf-7和t47d的增殖。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物可以在體外和/或體內(nèi)可以抑制乳腺癌細胞的克隆形成。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物可以在體外和/或體內(nèi)抑制乳腺癌細胞mda-mb-231和4t1的遷移。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物可以在體外和/或體內(nèi)抑制乳腺癌細胞mda-mb-231和4t1的侵襲。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物可以在體外和/或體內(nèi)抑制乳腺癌細胞mda-mb-231的轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物可以在體外和/或體內(nèi)促進多種乳腺癌細胞的凋亡，優(yōu)選地，可以在體外和/或體內(nèi)促進mda-mb-231、4t1、mcf-7和t47d乳腺癌細胞的凋亡。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物可以在體外和/或體內(nèi)顯著抑制乳腺癌細胞遷移相關(guān)蛋白的表達，進而抑制遷移相關(guān)的信號通路。具體地，為抑制src/fak信號通路。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物的水合物或藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體等同樣具有與式(i)石蒜堿相同的抑制效果。

本發(fā)明應用中，式(i)石蒜堿化合物可單獨使用或者與其他藥物聯(lián)合使用。

本發(fā)明還提出了式(i)石蒜堿化合物在體外和/或體內(nèi)抑制乳腺癌細胞增殖的方法。如式(i)石蒜堿可以抑制多種乳腺癌細胞株增殖及克隆形成，并在體內(nèi)抑制mda-mb-231和4t1細胞的生長。

本發(fā)明提出式(i)所示的石蒜堿化合物在體外和/或體內(nèi)抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的方法。如式(i)石蒜堿可以體外抑制乳腺癌細胞系mda-mb-231和4t1細胞遷移及mda-mb-231細胞的肺轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明提出式(i)石蒜堿化合物誘導乳腺癌細胞凋亡方法。式(i)石蒜堿通過誘導凋亡相關(guān)蛋白表達如cl.caspase3、cl.parp等，從而促使多種乳腺癌細胞株凋亡。

本發(fā)明通過細胞毒性篩選得到單體式(i)石蒜堿，該單體能夠在體外和體內(nèi)明顯抑制乳腺癌細胞的遷移，并且能夠有效阻斷src/fak介導的信號通路。

本發(fā)明通過高通量的細胞毒性篩選，從多種中草藥單體和小分子化合物中篩選得到了中藥單體石蒜堿(lycorine)。石蒜堿(lycorine，可簡寫為lyc)是從石蒜科植物石蒜的鱗莖中提取分離的一種生物堿，其中石蒜是廣泛分布于我國的一種多年生草本植物。近年來很多研究學者發(fā)現(xiàn)石蒜堿具有很多藥學功能，包括抗炎殺菌、抗瘧疾、抗病毒等，在抗腫瘤方面研究較少，現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明石蒜堿在體外對白血病、前列腺癌及骨肉瘤等細胞中有較好抑制增殖效果，但石蒜堿在體內(nèi)抗乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移效果的一直未曾研究。因為它含有代表性的四環(huán)骨架，且具有良好的生物安全性，越來越多的化學家也在石蒜堿母體上進行改造，且合成多種抗腫瘤的化合物。因此，在藥物化學和生物學研究上都具有深遠的醫(yī)藥研究價值。乳腺癌雖然現(xiàn)階段已經(jīng)有比較成熟的治療方案，但是仍有較多缺陷。本發(fā)明應用中所采用的化合物石蒜堿，實驗證明其通過誘導乳腺癌細胞凋亡從而抑制乳腺腫瘤體內(nèi)和體外的生長；通過阻斷src/fak介導的相關(guān)信號通路進而阻礙乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。因此，石蒜堿化合物在治療乳腺癌方面，具有很大的開發(fā)前景。

本發(fā)明還提出了一種藥物組合物，其包括式(i)石蒜堿化合物或其水合物或藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。

本發(fā)明還提出了式(i)石蒜堿化合物或其水合物或藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體在制備治療增殖和轉(zhuǎn)移能力較強的惡性腫瘤疾病藥物中的應用。

其中，所述惡性腫瘤為肺癌、結(jié)腸癌、腦癌、皮膚癌、膀胱癌、腎癌等惡性腫瘤。

附圖說明

圖1所示為式(i)石蒜堿對各種乳腺癌細胞株增殖活性的抑制效果；圖1(a)表示石蒜堿的分子結(jié)構(gòu)；圖1(b)表示式(i)石蒜堿抑制多種乳腺癌細胞株mda-mb-231、4t1、mcf-7、t47d及人源的正常細胞株mcf-10a(人乳腺上皮細胞株)、haf(人腎上腺成纖維細胞)和l-02(人正常肝細胞)的增殖效果；圖1(c)表示式(i)石蒜堿抑制乳腺癌細胞4t1、mda-mb-231、mcf-7及t47d克隆形成及相應的統(tǒng)計圖。

圖2所示為式(i)石蒜堿對乳腺癌細胞株遷移和侵襲的抑制效果；圖2(a)表示式(i)石蒜堿抑制乳腺癌細胞4t1和mda-mb-231的橫向遷移及統(tǒng)計圖；圖2(b)表示式(i)石蒜堿抑制乳腺癌細胞4t1和mda-mb-231的縱向遷移及統(tǒng)計圖；圖2(c)表示式(i)石蒜堿抑制乳腺癌細胞4t1和mda-mb-231的侵襲及統(tǒng)計圖。

圖3所示為式(i)石蒜堿在體內(nèi)對乳腺癌細胞mda-mb-231皮下生長的抑制效果；圖3(a、b和c)表示式(i)石蒜堿和紫杉醇在小鼠動物模型中抑制乳腺癌細胞mda-mb-231皮下生長效果；圖3(d)表示式(i)石蒜堿和紫杉醇對小鼠體重的影響；圖3(e)表示式(i)石蒜堿在組織切片上對腫瘤的生長的抑制效果。

圖4所示為式(i)石蒜堿在體內(nèi)對乳腺癌細胞4t1原位生長的抑制效果；圖4(a和b)表示式(i)石蒜堿和紫杉醇在小鼠動物模型中抑制乳腺癌細胞4t1原位生長效果；圖4(c)表示式(i)石蒜堿在組織切片上對腫瘤的生長的抑制效果；圖4(d)表示式(i)石蒜堿在組織切片上對小鼠主要臟器的毒性效果。

圖5所示為式(i)石蒜堿在體內(nèi)對乳腺癌細胞mda-mb-231肺轉(zhuǎn)移的抑制效果；圖5(a)表示式(i)石蒜堿在小鼠模型抑制乳腺癌細胞mda-mb-231肺轉(zhuǎn)移的熒光效果圖及相應統(tǒng)計圖；圖5(b)表示式(i)石蒜堿在小鼠模型抑制乳腺癌細胞mda-mb-231肺部結(jié)節(jié)形成的效果及相應統(tǒng)計圖；圖5(c)表示式(i)石蒜堿在組織切片上對小鼠肺部結(jié)節(jié)形成的抑制效果及相應統(tǒng)計圖。

圖6所示為式(i)石蒜堿對多株乳腺癌細胞凋亡的促進效果；圖6(a)表示式(i)石蒜堿促進乳腺癌細胞4t1和mda-mb-231凋亡的效果圖；圖6(b)表示式(i)石蒜堿促進多株乳腺癌細胞凋亡的統(tǒng)計圖；圖6(c)表示式(i)石蒜堿誘導乳腺癌細胞4t1和mda-mb-231凋亡相關(guān)蛋白的表達。

圖7所示為式(i)石蒜堿對遷移相關(guān)信號通路的抑制效果，表示式(i)石蒜堿下調(diào)乳腺癌細胞4t1和mda-mb-231遷移相關(guān)蛋白的表達。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1：石蒜堿對多種乳腺癌細胞的增殖和克隆形成的抑制效果

技術(shù)方法

1.細胞培養(yǎng)

本發(fā)明中所用人乳腺癌細胞mcf-7,t47d,mda-mb-231，鼠乳腺癌細胞4t1，人正常乳腺上皮細胞mcf-10a，人腎上腺成纖維細胞haf和人正常肝細胞l-02均來自于atcc細胞庫。帶有螢火蟲熒光素酶報告基因的乳腺癌細胞mda-mb-231-luc來自上海交通大學醫(yī)學院。mcf-7,t47d,4t1,mcf-10a和l-02培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的rpmi1640，haf培養(yǎng)基為含10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的dmem，mda-mb-231培養(yǎng)基為含10％胎牛血清和非必需氨基酸的mem。細胞培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱(濕度95％，co2濃度5％)中。

2.srb(磺酰羅丹明)法測定細胞增殖

不同的細胞株以5×10³-8×10³個/孔密度接種至96孔板(corning)，24h后，加入不同濃度石蒜堿單體化合物，對照組加入等量的dmso，各組設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，加預冷卻的tca(三氯乙酸，50％，w/v)4℃孵育60min以上固定細胞。固定后，流水沖5遍，風干。每孔加入50μlsrb染液(4％，w/v)，室溫孵育10min染色。后將染液吸出，每孔加入1％醋酸100μl洗5遍，除去未結(jié)合染料。風干后，每孔加入濃度為10mmtris溶液100μl，震蕩溶解結(jié)合的srb染料。將96孔板置于酶標儀(spectramax190)中，在515nm波長下測定od值。實驗獨立重復3次。細胞存活率(％)＝加藥物od值/對照組od值×100％。

3.克隆形成實驗

以每孔1×10³個細胞的密度將乳腺癌細胞接種于六孔板中，待細胞貼壁后加入不用濃度的式(i)石蒜堿，一周后用多聚甲醛將細胞固定，后用2‰結(jié)晶紫染色3min，后用緩慢流動的自來水輕輕清洗，以洗掉未結(jié)合的結(jié)晶紫染液，室溫自然干燥。顯微鏡下拍照并統(tǒng)計克隆數(shù)，每組實驗重復三次?？寺⌒纬墒菣z測乳腺癌細胞增殖能力的有效方法之一。

實驗結(jié)果如圖1(b)所示，式(i)石蒜堿對各株乳腺癌細胞都有顯著的抑制效果。其對乳腺癌細胞株mda-mb-231、4t1、mcf-7和t47d處理48h后的半數(shù)抑制濃度為2μm-8μm。而石蒜堿對人正常乳腺上皮細胞株mcf-10a，人腎上腺成纖維細胞haf和人正常肝細胞l02的增殖的影響較小。

如圖1(c)所示的實驗結(jié)果，式(i)石蒜堿同時也顯著抑制乳腺癌細胞株mda-mb-231、4t1、mcf-7和t47d的克隆形成。

以上實驗表明式(i)石蒜堿能顯著抑制乳腺癌細胞株的增殖。

實施例2：石蒜堿對乳腺癌細胞遷移和侵襲的抑制效果

技術(shù)方法

1.劃線遷移實驗

將mda-mb-231及4t1細胞接種至6孔板，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h，至細胞長至90％的密度便更換無血清培養(yǎng)基，進行適度的饑餓處理。饑餓處理完成后，用100μl的滅菌槍頭對6孔板中的細胞進行劃線，劃線后用pbs洗滌細胞兩次，去除死亡細胞。分別往不同的孔中加入不同濃度的石蒜堿，37℃繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)適當時間。顯微鏡下觀察細胞向劃線部分運動的情況，拍照。統(tǒng)計分析不同劑量藥物組遷移進入劃線區(qū)域的細胞數(shù)量，確定藥物對細胞遷移能力的影響。

2.transwell小室遷移及侵襲實驗

消化并計數(shù)處于對數(shù)生長期的mda-mb-231及4t1細胞，細胞重懸在無血清并溶有不同濃度石蒜堿的基礎培養(yǎng)基中，細胞以6×10⁴個/孔的mda-mb-231細胞或1×10⁵個/孔的4t1細胞(各200μl)接種至transwell小室的上室中。下室中則加入600μl含有對應濃度石蒜堿的完全培養(yǎng)基。置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h-24h。取出transwell小室用棉簽輕輕除去小室上表面未遷移的細胞并用4％的多聚甲醛固定小室下表面細胞15分鐘，接著用2‰結(jié)晶紫染液處理細胞3分鐘，清洗小室，除去未結(jié)合于細胞的結(jié)晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側(cè)，將非特異性結(jié)合于小室上表面的染料擦掉，以便后續(xù)鏡檢。將自然干燥后的小室置于顯微鏡下拍照，統(tǒng)計多個視野的細胞數(shù)目。對于細胞侵襲實驗需提前在小室隔膜上表面鋪上一層基質(zhì)膠，并且接種細胞數(shù)可適當增加。細胞遷移率(％)＝加藥物細胞遷移數(shù)/對照組細胞遷移數(shù)×100％。

實驗結(jié)果如圖2(a)(b)(c)所示，石蒜堿能在較低劑量下就可以有效抑制乳腺癌細胞mda-mb-231及4t1的遷移及侵襲，可見石蒜堿可以作為抗乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的潛在藥物。

實施例3：石蒜堿對小鼠乳腺癌皮下和原位荷瘤生長的抑制效果

技術(shù)方法

1.小鼠皮下荷瘤模型

將2×10⁶個乳腺癌細胞mda-mb-231皮下注射到免疫缺陷雌鼠(blab/c-nude，裸鼠)背部皮下，待皮下腫瘤長到50-100mm³左右時，將小鼠分為4組(每組7只)。低劑量組小鼠每天腹腔注射5mg/kg溶于dmso的石蒜堿，高劑量組小鼠每天腹腔注射10mg/kg溶于dmso的石蒜堿，陽性組每2天注射5mg/kg溶于dmso的紫杉醇，對照組每天注射等體積dmso，每3天測量并記錄小鼠體重以及腫瘤的長與寬，按照公式體積＝長×寬²×0.52計算，統(tǒng)計腫瘤體積，連續(xù)施藥30天后處死小鼠。剝離腫瘤，拍照，并進行h&e染色和免疫組化實驗。

2.小鼠原位荷瘤模型

將1×10⁵個乳腺癌細胞4t1注射到免疫缺陷雌鼠(blab/c-nude，裸鼠)第4對乳房墊上，3天后將小鼠分為4組(每組7只)。低劑量組小鼠每天腹腔注射5mg/kg溶于dmso的石蒜堿，高劑量組小鼠每天腹腔注射10mg/kg溶于dmso的石蒜堿，陽性組每2天注射5mg/kg溶于dmso的紫杉醇，對照組每天注射等體積dmso，每3天測量并記錄小鼠體重以及腫瘤的長與寬，按照公式體積＝長×寬²×0.52計算，統(tǒng)計腫瘤體積，連續(xù)施藥30天后處死小鼠。剝離腫瘤，拍照，并進行h&e染色和免疫組化實驗。解剖出典型的轉(zhuǎn)移性靶器官心、肝、脾、肺、腎進行h&e染色。

實驗結(jié)果如圖3a，3b，3c所示，石蒜堿能顯著抑制小鼠皮下腫瘤的生長，高劑量組效果與陽性組紫杉醇效果相當。圖3d為小鼠體重變化曲線，低劑量組、高劑量組與對照組體重相當，而陽性組紫杉醇處理組小鼠體重明顯減輕，說明石蒜堿對小鼠的毒性影響較紫杉醇小。免疫組化結(jié)果(圖3e)表明，增殖細胞核抗原(pcna)表達量在給藥組中減少，說明石蒜堿與紫杉醇均能抑制腫瘤生長。

圖4a和4b所示，石蒜堿能抑制小鼠原位腫瘤的生長。h&e染色和免疫組化結(jié)果(圖4c和4d)表明，石蒜堿能下調(diào)pcna的表達量，并且對小鼠的主要器官如心肝脾肺腎等沒有毒性傷害。

以上結(jié)果均表明，石蒜堿能在無毒劑量內(nèi)有效抑制小鼠皮下腫瘤及原位腫瘤的生長。

實施例4：石蒜堿對小鼠乳腺癌尾靜脈轉(zhuǎn)移模型的抑制效果

技術(shù)方法

小鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移模型

將1.5×10⁶個mda-mb-231-luc細胞通過尾靜脈注射到免疫缺陷裸鼠體內(nèi)，隔天用活體成像系統(tǒng)xenogenivis2000luminalimager檢測小鼠體內(nèi)熒光含量并且根據(jù)所制定的實驗方案將小鼠隨機分為三組(每組6只)，分別是陰性對照組(dmso)、陽性對照組(紫杉醇)以及實驗組(石蒜堿)。通過腹腔注射對三組小鼠進行給藥，加藥組每天腹腔注射5mg/kg溶于dmso的石蒜堿，陽性組每2天注射5mg/kg溶于dmso的紫杉醇，對照組每天注射等體積dmso。之后每隔一周對小鼠進行熒光檢測并記錄數(shù)據(jù)，每3天測量小鼠體重，連續(xù)給藥三周后處死小鼠。剝離小鼠肺部組織，計算腫瘤結(jié)節(jié)，固定組織用于后續(xù)組織學分析。

實驗結(jié)果如圖5(a)(b)和(c)所示。如圖5(a)所示的用藥21天后對小鼠癌細胞轉(zhuǎn)移抑制的效果圖，通過動物活體成像系統(tǒng)拍攝照片，由于腫瘤細胞中帶有熒光素酶，通過向小鼠體內(nèi)注射熒光素底物后，腫瘤細胞會在轉(zhuǎn)移處發(fā)出熒光，這樣利用動物活體成像系統(tǒng)就可以確定腫瘤轉(zhuǎn)移灶位置和轉(zhuǎn)移程度，圖中陰影代表熒光信號，表明該區(qū)域有腫瘤細胞聚集，熒光強度越強表明腫瘤轉(zhuǎn)移程度越深。圖5(b)是小鼠離體肺組織，說明實驗組與陽性對照組所用藥物均可抑制乳腺癌細胞的肺轉(zhuǎn)移。圖5(c)是小鼠肺組織的h&e染色結(jié)果，可見石蒜堿及紫杉醇能夠抑制肺部腫瘤結(jié)節(jié)的形成。然而經(jīng)過小鼠體重的測量，我們發(fā)現(xiàn)紫杉醇處理組在給藥后期出現(xiàn)小鼠體重明顯下降的現(xiàn)象，而實驗組則未出現(xiàn)該現(xiàn)象，說明石蒜堿在該給藥劑量下對小鼠的毒副作用較小。

實施例5：石蒜堿通過誘導細胞凋亡來抑制乳腺癌細胞生長

技術(shù)方法

1.細胞凋亡(apoptosis)實驗

將細胞接種于6孔板中，24h后加入含有不同濃度石蒜堿化合物的完全培養(yǎng)基，48或72h后，利用凋亡檢測試劑盒進行凋亡檢測。流式細胞凋亡檢測時，細胞分為不染組、單染pi組、單染annexinv組以及pi、annexinv雙染組。收集培養(yǎng)基上清，1mlpbs洗滌細胞并回收。消化細胞，終止消化后收集細胞到對應的離心管中，離心。用milli-q水將4×bindingbuffer稀釋至1×溶液。離心后的細胞用pbs洗2次，每管加入100μl稀釋至1×的結(jié)合緩沖液，用移液槍輕輕吹打，使細胞重懸，不染組不加pi以及annexinv，單染pi組加入pi5μl，單染annexinv組加入annexinv5μl，annexin-v-pi雙染組均加入pi和annexinv各5μl，混勻。室溫避光孵育15分鐘，加入400μl結(jié)合緩沖液混勻并轉(zhuǎn)移到5ml流式管中，流式細胞儀上機檢測。

2.免疫印跡(westernblot)實驗

細胞經(jīng)不同濃度石蒜堿處理后，裂解提取蛋白，蛋白經(jīng)煮沸變性后用聚丙烯酰胺凝膠(sds-page)電泳分離蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，用相應蛋白抗體進行孵育，再用熒光標記的二抗體進行孵育，最后用掃膜儀odyssey檢測該蛋白的表達水平。

實驗結(jié)果圖6a，6b表明，石蒜堿能誘導乳腺癌細胞株凋亡。在50μm石蒜堿處理下，乳腺癌細胞株mcf-7凋亡率達到26.49％(48h)，乳腺癌細胞株4t1凋亡率達到55.61％(48h)，乳腺癌細胞株mda-mb-231到達60.51％(72h)，而乳腺癌細胞株t47d的凋亡率尤其明顯，高達81.67％(48h)。

免疫印跡實驗中，細胞凋亡蛋白表達量的變化也表明石蒜堿可以誘導乳腺癌細胞凋亡。如圖6c所示，凋亡蛋白parp和caspase3表達量隨石蒜堿濃度增加而減少，而cl.parp和cl.caspase3表達量增加。促凋亡蛋白bax和抗凋亡蛋白bcl-2的比值(bax/bcl-2)是細胞凋亡的標志，我們的結(jié)果中bax/bcl-2沒有變化，表明石蒜堿可能是通過外源性途徑來誘導乳腺癌細胞發(fā)生凋亡。

實施例6：石蒜堿抑制src/fak信號通路

技術(shù)方法

免疫印跡(westernblot)實驗方法如前所述。

實驗結(jié)果如圖7所示。石蒜堿能夠劑量依賴性的下調(diào)src/fak信號通路相關(guān)蛋白的表達，包括p-fak，p-src，p-jnk，p-c-jun及mmp-2的表達，從而抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。