本發(fā)明涉及一種法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

法呢基乙酸香葉醇酯即吉法酯，商品名惠加強，為日本大阪生晃榮養(yǎng)藥品株式會社生產(chǎn)的異戊間二烯類化合物胃黏膜保護劑，主要用于急慢性胃炎、消化性潰瘍、非潰瘍性消化不良的治療及預(yù)防其他因素引起的急性胃黏膜損傷。其藥理作用為通過增加內(nèi)源性前列腺素的生成起到黏膜保護作用。另外，法呢基乙酸香葉醇酯可提高氨基己糖含量促進潰瘍修復(fù)愈合；抑制中性粒細胞和單核細胞浸潤及相關(guān)炎癥因子釋放，從而減輕胃黏膜組織充血、水腫、糜爛等炎癥反應(yīng)。除了在胃粘膜方面的應(yīng)用外，國內(nèi)外還有相關(guān)文獻報道了法呢基乙酸香葉醇酯在結(jié)腸炎、干眼癥治療的應(yīng)用。

法呢基乙酸香葉醇酯最初由卷心菜分離得到，后來adami等人通過合成方法得到，結(jié)構(gòu)式如1所示。市售法呢基乙酸香葉醇酯為兩種幾何異構(gòu)體的混合物，分別是(4e/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯[(4e,8e)-5,9,13-三甲基-4,8,12-十四三烯酸-(2’e)-3’,7’-二甲基-2’,6’-辛二烯醇酯]和(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯[(4z,8e)-5,9,13-三甲基-4,8,12-十四三烯酸-(2’e)-3’,7’-二甲基-2’,6’-辛二烯醇酯]，兩者的組成比例日本藥典要求是70％～80％比20％～30％，市售片劑經(jīng)提取后氣相色譜法分析，結(jié)果顯示二者所占比例分別為70％和30％。

現(xiàn)有吉法酯藥物在治療消化系統(tǒng)疾病方面仍存在較多如毒性較高、相對生物利用度低等的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中吉法酯藥物存在的毒性高、消化性潰瘍保護作用弱、相對生物利用度低的問題，提供一種新的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物、其制備方法、用途及劑型，從而提供一種毒性低、消化性潰瘍保護作用強、相對生物利用度高的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物由法呢基乙酸香葉醇酯活性成分和藥學(xué)上可接受的載體組成，并且所述法呢基乙酸香葉醇酯活性成分含(4e/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯和按活性成分總重量計不超過2％的(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯；優(yōu)選地，所述(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的含量為0.1～1％。

本發(fā)明所述的(4e/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯，化學(xué)名為[(4e,8e)-5,9,13-三甲基-4,8,12-十四三烯酸-(2’e)-3’,7’-二甲基-2’,6’-辛二烯醇酯]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如2所示：

本發(fā)明所述的(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯，化學(xué)名為[(4z,8e)-5,9,13-三甲基-4,8,12-十四三烯酸-(2’e)-3’,7’-二甲基-2’,6’-辛二烯醇酯]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如3所示：

可選地，上述的藥物組合物，其特征在于，所述法呢基乙酸香葉醇酯活性成分與藥學(xué)上可接受的載體的重量百分比為1:19～3:7，優(yōu)選為1:10～1:4。

可選地，上述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、粘合劑、填充劑、崩解劑、香味劑、甜味劑中的一種或一種以上。

可選地，上述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括淀粉、微晶纖維素、硬脂酸鎂、鋁硅酸鎂、磷酸氫鈣、植物油、蜂蠟、明膠聚乙二醇、甘油中的一種或一種以上。

可選地，上述的藥物組合物的劑型包括粒劑、粉劑、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射劑、乳劑、酊劑、懸浮液、溶液的形式口服或非口服給藥劑型。

優(yōu)選地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、滴丸。

本發(fā)明還提供制備上述的藥物組合物的方法，其特征在于，包括將法呢基乙酸香葉醇酯活性成分與藥學(xué)上可接受的載體混合的步驟，其中法呢基乙酸香葉醇酯的制備過程中采用l-天冬氨酸作為催化劑。

可選地，上述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以反式橙花叔醇和原乙酸酯為原料，l-天冬氨酸為催化劑，經(jīng)claisen重排反應(yīng)得到法呢基乙酸酯；

(2)將法呢基乙酸酯水解、結(jié)晶、酸化得到法呢基乙酸；

(3)將法呢基乙酸與香葉醇縮合得到法呢基乙酸香葉醇酯活性成分；

(4)將法呢基乙酸香葉醇酯活性成分與藥學(xué)上可接受的載體混合制得所述藥物組合物。

可選地，上述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以反式橙花叔醇和原乙酸酯為原料，l-天冬氨酸為催化劑，在90～150℃下進行反應(yīng)，降溫至60～90℃減壓蒸餾，升溫至90～130℃減壓蒸餾，得到法呢基乙酸酯；

(2)將法呢基乙酸酯與堿混合發(fā)生水解反應(yīng)，反應(yīng)液用有機溶劑(優(yōu)選石油醚)萃取，調(diào)反應(yīng)液ph至3～4，有機溶劑萃取，合并有機相，加堿，濃縮，加入有機溶劑(優(yōu)選乙酸乙酯)，過濾，濾餅加水并調(diào)ph至3～4，有機溶劑(優(yōu)選石油醚)萃取，合并有機相，飽和食鹽水洗滌，干燥得法呢基乙酸；

(3)將法呢基乙酸、香葉醇、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc-hcl)、4-二甲氨基吡啶(dmap)混合反應(yīng)，將反應(yīng)液分別用水、飽和食鹽水洗滌，干燥，過硅膠，濃縮，減壓蒸餾，過硅膠，干燥，制得所述法呢基乙酸香葉醇酯活性成分；

(4)將法呢基乙酸香葉醇酯活性成分與藥學(xué)上可接受的載體混合制得所述藥物組合物。

可選地，上述制備方法的合成路線如圖8所示：

本發(fā)明還提供上述的藥物組合物在制備治療或預(yù)防消化系統(tǒng)疾病藥物中的用途。

本發(fā)明還提供上述的藥物組合物在治療或預(yù)防消化系統(tǒng)疾病中的用途。

可選地，所述消化系統(tǒng)疾病包括急慢性胃粘膜損傷；可選地，所述消化系統(tǒng)疾病包括急慢性胃炎、消化性潰瘍、非潰瘍性消化不良。

本發(fā)明所述的藥物組合物的用藥方式?jīng)]有特別的限制，例如可以通過口服方式施用于需要這種治療的患者。

本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可以存在輔助性的物質(zhì)，例如：粘合劑如淀粉、糊精、蔗糖、纖維素衍生物、明膠、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等；填充劑如乳糖、微晶纖維素、磷酸二氫鈣、磷酸氫鈣、硫酸鈣、、硅酸鈣碳酸鎂、鋁硅酸鎂、鋁碳酸鎂、微粉硅膠等；崩解劑如羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、羧甲基纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉等；另外，還可以在組合物中加入其他輔助劑如香味劑、甜味劑、潤濕劑、乳化劑、ph緩沖物質(zhì)等。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明特定的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物，所述藥物組合物中法呢基乙酸香葉醇酯活性成分中按活性成分重量計(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯不超過2％，具有毒性低、消化性潰瘍保護作用強、相對生物利用度高的優(yōu)點。

當(dāng)(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的含量為0.1％～1.0％時，與(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯含量小于0.1％時相比，所述藥物組合物的毒性更低、消化性潰瘍的保護作用更強、相對生物利用度更高，具有預(yù)料不到的技術(shù)效果。

附圖說明

圖1是法呢基乙酸香葉醇酯對無水乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷的保護作用照片，其中：a為正常組；b為模型組；c為(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯治療組；d為吉法酯治療組；e為本發(fā)明法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物治療組；f為蘭索拉唑?qū)φ战M。

圖2是法呢基乙酸香葉醇酯對無水乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷潰瘍面積比統(tǒng)計柱形圖，其中：model為模型組；4z為(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯治療組；gefarnate為吉法酯治療組，4e為本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物治療組；lansoprazole為蘭索拉唑?qū)φ罩委熃M，*表示與模型組相比，p<0.05。

圖3是法呢基乙酸香葉醇酯對無水乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷潰瘍抑制率統(tǒng)計柱形圖，其中：4z為(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯治療組；gefarnate為吉法酯治療組，4e為本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物治療組；lansoprazole為蘭索拉唑?qū)φ罩委熃M。*表示與模型組相比，p<0.05。

圖4是光鏡下大鼠胃組織病理學(xué)改變圖，其中：a為正常組；b為模型組；c為(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯治療組；d為吉法酯治療組；e為本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物治療組；f為蘭索拉唑?qū)φ罩委熃M。

圖5是不同純度的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物對大鼠胃潰瘍抑制率的柱形圖，其中：縱坐標(biāo)為抑制率，橫坐標(biāo)為不同含量(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物。

圖6是不同純度的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物對大鼠胃潰瘍面積的影響柱形圖，其中：縱坐標(biāo)是胃潰瘍面積比，橫坐標(biāo)為不同含量(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物。

圖7是法呢基乙酸香葉醇酯灌胃給藥后藥物濃度隨時間的變化曲線，其中：4e為本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物組；gefarnate為吉法酯組；4z為(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯治療組。

圖8是(4e/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的合成路線圖，其中，asparticacid為l-天冬氨酸。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

(一)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物的制備

下述實施例中制得的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物中的法呢基乙酸香葉醇酯活性成分的含量通過氣相色譜法檢測得到；幾何構(gòu)型通過氣相色譜法及核磁共振的耦合常數(shù)值進行確定。

實施例1

1)法呢基乙酸乙酯的合成

于2l圓底燒瓶中依次加入反式橙花叔醇500g(2.25mol)、原乙酸三乙酯546g(3.37mol)、l-天冬氨酸30g(0.22mol)，加熱至120℃進行反應(yīng)。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)監(jiān)測反應(yīng)進程，至反式橙花叔醇反應(yīng)完全時停止。使反應(yīng)溫度降至80℃，減壓蒸出反應(yīng)中生成的副產(chǎn)物乙醇；然后升溫至120℃、減壓蒸出未反應(yīng)的原乙酸三乙酯，得到法呢基乙酸乙酯520g，收率80％。

2)法呢基乙酸的制備

于5000ml圓底燒瓶中加入法呢基乙酸乙酯480g(1.60mol)、氫氧化鈉70.4g(1.76mol)、水480ml、乙醇960ml，室溫攪拌過夜，得黃色澄清透明液。停止反應(yīng)，用800ml石油醚萃取反應(yīng)液3次。反應(yīng)液用濃鹽酸調(diào)ph至3～4，然后用320ml石油醚萃取，萃取兩次，合并石油醚層水洗3次，無水硫酸鈉干燥，蒸干得404.8g黃色、澄清透明油狀物，收率96.1％。

于3000ml圓底燒瓶中加入制得的油狀物法呢基乙酸396g(1.5mol)、氫氧化鉀82.5g(1.5mol)、甲醇1000ml，室溫攪拌1h得黃色澄清透明液，停止攪拌，將反應(yīng)液濃縮至干，加入2000ml乙酸乙酯，攪拌2h，析出白色固體，抽濾，濾餅用1000ml水溶解，并用濃鹽酸調(diào)ph至3～4，然后用1000ml石油醚萃取，萃取兩次，合并石油醚層，用飽和食鹽水洗1次，無水硫酸鈉干燥，蒸干得249g淡黃色、澄清透明油狀物，即法呢基乙酸，收率63％。

3)法呢基乙酸香葉醇酯活性成分的制備

于5000ml圓底燒瓶中加入上述得到的法呢基乙酸185g(0.7mol)，香葉醇107g(0.71mol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc-hcl)151g(0.83mol)，dmap12.2g(0.1mol)二氯甲烷2000ml，室溫攪拌反應(yīng)，tlc監(jiān)測約6h時原料反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，反應(yīng)液分別用水、飽和食鹽水洗滌一次，干燥，過硅膠，濃縮得淺黃色、澄清、透明油狀液體；該油狀物經(jīng)減壓蒸餾除去雜質(zhì)，再次過硅膠除去原點處雜質(zhì)，蒸干得無色、澄清、透明、油狀物法呢基乙酸香葉醇酯活性成分229g，收率82％，純度99.5％((4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯含量為0.3％)[氣相色譜法：gc-14b氣相色譜儀(日本島津)，se-54柱(0.53mm×30m)，柱溫：80℃(5min)30℃/min-160℃(3min)30℃/min-260℃(20min)進樣口250℃，檢測器260℃，氮氣流速20ml/min]。

4)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物的制備

(1)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物1

處方組成為：

以制備1000片法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物片劑為例，具體制備方法是：將處方量的上述法呢基乙酸香葉醇酯活性成分溶解于無水乙醇，磷酸氫鈣與鋁硅酸鎂混勻后按照等量遞增法加入法呢基乙酸香葉醇酯乙醇溶液，充分混勻后，加淀粉攪拌均勻，以15％淀粉漿制成軟材，制粒、烘干、整粒，向顆粒中加入處方量微晶纖維素、硬脂酸鎂、滑石粉，壓片，用8％歐巴代乙醇溶液包衣。

(2)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物2

處方組成為：

以制備1000粒法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物軟膠囊為例，具體制備方法是：稱取處方量的上述法呢基乙酸香葉醇酯活性成分溶于等量的大豆油中，攪拌使其充分混勻，加入剩余處方量的大豆油混合均勻，通過膠體磨研磨三次，真空脫氣泡2小時備用。稱取處方量的明膠，以處方量80％的水充分溶脹。將甘油及剩余量的水，加熱至70℃，加入明膠液，攪拌1.5小時至熔融均勻，加入二氧化鈦，攪拌均勻。所制膠液放入保溫箱內(nèi)，溫度保持在80～90℃之間壓制膠片。將膠片及內(nèi)容物藥液通過自動旋轉(zhuǎn)制囊機壓制成軟膠囊，定形、整形、洗擦丸、干燥、包裝。

實施例2

1)法呢基乙酸甲酯的合成

于2l圓底燒瓶中依次加入反式橙花叔醇400g(1.80mol)、原乙酸三甲酯324g(2.70mol)、l-天冬氨酸24g(0.18mol)，加熱至100℃進行反應(yīng)。tlc(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)監(jiān)測反應(yīng)進程，至反式橙花叔醇反應(yīng)完全時停止。使反應(yīng)溫度降至70℃，減壓蒸出反應(yīng)中生成的副產(chǎn)物乙醇；然后升溫至100℃、減壓蒸出未反應(yīng)的原乙酸三乙酯，得到法呢基乙酸甲酯425g，收率85％。

2)法呢基乙酸的制備

于250ml圓底燒瓶中加入法呢基乙酸甲酯50g(0.18mol)、氫氧化鈉7.9g(0.20mol)、水50ml、乙醇100ml，室溫攪拌過夜，得橙色澄清透明液。停止反應(yīng)，用100ml石油醚萃取反應(yīng)液3次。反應(yīng)液用濃鹽酸調(diào)ph至3～4，然后用100ml石油醚萃取，萃取兩次，合并石油醚層水洗3次，無水硫酸鈉干燥，蒸干得45.2g黃色、澄清透明油狀物，即法呢基乙酸，收率95.2％。

于250ml圓底燒瓶中加入制得的法呢基乙酸26g(0.10mol)、氫氧化鉀5.5g(0.1mol)、甲醇80ml，室溫攪拌1h得黃色澄清透明液，停止攪拌，將反應(yīng)液濃縮至干，加入150ml乙酸乙酯，攪拌2h，析出白色固體，抽濾，濾餅用80ml水溶解，并用濃鹽酸調(diào)ph至3～4，然后用80ml石油醚萃取，萃取兩次，合并石油醚層，用飽和食鹽水洗1次，無水硫酸鈉干燥，蒸干得15.6g淡黃色、澄清透明油狀物，即法呢基乙酸，收率60％。

3)法呢基乙酸香葉醇酯活性成分的制備

于250ml圓底燒瓶中加入上述得到的法呢基乙酸12.3g(0.05mol)，香葉醇7.1g(0.047mol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc-hcl)10.1g(0.055mol)，dmap1.22g(0.01mol)二氯甲烷100ml，室溫攪拌反應(yīng)，tlc監(jiān)測約5h時原料反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，反應(yīng)液分別用水、飽和食鹽水洗滌一次，干燥，過硅膠，濃縮得淺黃色、澄清、透明油狀液體；該油狀物經(jīng)減壓蒸餾除去雜質(zhì)，再次過硅膠除去原點處雜質(zhì)，蒸干得無色、澄清、透明、油狀物法呢基乙酸香葉醇酯活性成分16.6g，收率83％，純度99.4％((4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯含量為0.5％)，氣相色譜檢測方法同實施例1。

4)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物的制備

處方組成為：

(a)法呢基乙酸香葉醇酯活性成分5mg/丸

(b)聚乙二醇600045mg/丸

以制備1000粒法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物滴丸為例，具體制備方法是：將處方量聚乙二醇6000置鋁鍋中，于油浴上加熱至90℃～100℃，待全部熔融后，加入處方量的上述法呢基乙酸香葉醇酯活性成分充分?jǐn)嚢杈鶆?，轉(zhuǎn)移至貯液瓶中，密閉并保溫在80℃～90℃，調(diào)節(jié)滴液定量閥門，由上往下，滴入10℃～15℃的甲基硅油中，取出滴丸，吸盡滴丸表面冷卻劑，干燥，即得。

下述(二)、(三)、(五)中的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物是由實施例1制備得到的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物1，其中法呢基乙酸香葉醇酯活性成分的純度為99.5％。

下述(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯：參考文獻(周訓(xùn)蓉，等.吉法酯中幾何異構(gòu)體的研究,化學(xué)試劑,2012,34(3):266-268)方法制備，純度99.8％。

下述吉法酯：參考文獻(周訓(xùn)蓉，等.吉法酯中幾何異構(gòu)體的研究,化學(xué)試劑,2012,34(3):266-268)方法從市售藥片提取(灌胃給藥需要通過提取原料并去除片劑的輔料，以便計算給藥量)。

下述蘭索拉唑為市售原料藥。

(二)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物的毒性試驗

通過文獻《藥理實驗方法學(xué)》(魏偉主編)推薦方法分別對本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物、吉法酯，通過口服、腹腔注射、靜脈注射的方式檢測急性毒性，試驗結(jié)果表明，大鼠口服給藥本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物ld50為12555mg/kg、(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的ld50為3826mg/kg、吉法酯的ld50為8455mg/kg；大鼠腹腔注射給藥本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物ld50為7426mg/kg、(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的ld50為2522mg/kg、吉法酯的ld50為4688mg/kg；大鼠靜脈注射給藥本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物ld50為3894mg/kg、(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的ld50為1498mg/kg、吉法酯的ld50為2855mg/kg。實驗結(jié)果提示本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物的毒性低于(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯及二者7:3比例混合物吉法酯。

(三)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物的消化性潰瘍保護作用試驗

市售吉法酯(主要成分為(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯與(4e/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯按3:7比例混合)作為胃黏膜保護劑，可促進潰瘍修復(fù)愈合，增強胃黏膜屏障，擴張胃黏膜微循環(huán)，改善血流分布。通過文獻(hajrezaiem,salehenn,karimianh,etal.biochaninagastroprotectiveeffectsinethanol-inducedgastricmucosalulcerationinrats.plosone,2015,10(3):e0121529.)推薦的方法，采用無水乙醇誘導(dǎo)大鼠，建立急性胃潰瘍模型，口服灌胃本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物、(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯、吉法酯、蘭索拉唑，通過軟件計算潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率，采用he染色觀察胃組織形態(tài)學(xué)，可反映藥物對無水乙醇致大鼠胃粘膜的保護作用。

1實驗方法

1.1實驗分組與劑量設(shè)計

sd大鼠分為正常對照組，模型組，陽性對照組(蘭索拉唑20mg/kg)，給藥組((4e/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯200mg/kg，(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯200mg/kg，吉法酯200mg/kg)，共5組，每組動物8只。

1.2無水乙醇致大鼠急性胃潰瘍

取sd大鼠40只，體重180～220g。每天灌胃給藥1次，連續(xù)7天。造模前24h，大鼠需禁食不禁水，于末次給藥后1h后，每只大鼠灌胃無水乙醇1ml造成急性胃粘膜損傷。灌胃無水乙醇1h后10％水合氯醛麻醉，使用真空靜脈釆血管由腹主動脈采血5ml，靜置2h后4000r/min離心10min，分離血清，置于-80℃冰箱中保存待測。

1.3胃黏膜潰瘍面積及潰瘍抑制率的測算

大鼠取血后處死，迅速取出鼠胃，沿胃大彎剪開，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈胃內(nèi)殘留物，展開并將胃組織固定于兩塊玻璃板之間供拍照。用imagej圖形分析軟件測算潰瘍面積，并計算抑制率。抑制率(％)＝(對照組潰瘍面積-給藥組潰瘍面積)/對照組潰瘍指數(shù)x100％。

1.4大鼠胃組織病理組織學(xué)觀察

he(haematoxylinandeosin)染色是在不同染液的作用下，將切片中的不同物質(zhì)染成不同顏色而顯示出來，再通過光學(xué)顯微鏡觀察組織中的各種結(jié)構(gòu)，它是最為常規(guī)的染色，可以有助于對胃潰瘍程度做出診斷。胃組織中病理組織學(xué)操作包括取材固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟染色、he染色、脫水透明和封固幾個步驟。

1.5數(shù)據(jù)錄入與處理分析

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±s.e.m.)表示，并采用spss17.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組間差異比較用單因素方差分析(one-wayanova)(不假定方差齊性dunnett'st3)。p<0.05則表示差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2實驗結(jié)果

2.1法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物對無水乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷的保護作用

無水乙醇致大鼠胃黏膜損傷觀察結(jié)果顯示(圖1)，正常組胃黏膜光整完好，呈暗紅色，黏液較多，無充血，水腫、潰瘍及瘢痕組織增生等異常變化。模型組與(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯治療組大鼠胃黏膜有廣泛損傷，水腫、充血、糜爛，呈暗紅色，并見大量散在出血及出血條帶。其余各組出血點及出血條帶有不同程度的減少，其中吉法酯與本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物治療組相比較，前者糜爛情況較嚴(yán)重，出血帶較多；本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物治療組與蘭索拉唑?qū)φ战M胃黏膜呈暗紅色，為點片狀出血，大部分胃黏膜未見炎性反應(yīng)及損傷。

實驗結(jié)果表明本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物對無水乙醇所致的急性胃黏膜損傷的保護作用優(yōu)于(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯和吉法酯，并與陽性對照藥蘭索拉唑相當(dāng)。

2.2法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物對大鼠胃潰瘍面積和潰瘍抑制率的影響

實驗大鼠的潰瘍面積/自身胃面積結(jié)果如圖2所示，其中模型組中胃潰瘍面積損傷最大說明無水乙醇致大鼠胃潰瘍模型成功。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物與對照組蘭索拉唑均能夠明顯抑制無水乙醇對胃黏膜組織造成的潰瘍損傷，降低潰瘍面積，改善病理形態(tài)及炎癥性反應(yīng)。吉法酯組抑制潰瘍損傷效果不夠明顯，而(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯對抗無水乙醇致胃黏膜損傷基本無效果。

實驗大鼠潰瘍抑制率見圖3。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物潰瘍抑制率可達78.20％，而(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯潰瘍抑制率則為35.56％，吉法酯潰瘍抑制率為37.60％，本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物潰瘍抑制率明顯，與對照組蘭索拉唑(潰瘍抑制率為81.10％)相差不大。

2.3光鏡下大鼠胃組織病理學(xué)改變

病理組織學(xué)分析如圖4顯示，大鼠正常胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜表面胃小凹清晰可見，黏膜內(nèi)腺體排列緊密規(guī)則，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層未見出血及炎細胞浸潤(0度損傷)；模型組與(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯治療組胃黏膜損傷較深，面積較大，胃小凹結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)水腫及炎性浸潤，大量上皮細胞變性，脫落、糜爛，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，有的缺失，固有層見中度出血(iv度損傷)；吉法酯處理組胃黏膜保持比較完整，腺體損傷程度較小(iii度損傷)；本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物處理組對上述病理損傷有較明顯改善作用，胃黏膜胃粘膜輕度損傷，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層少見出血及炎細胞浸潤(i度損傷-ii度損傷)；陽性組胃黏膜輕度損傷，上皮未見脫落，腺體未見損傷，固有層未見出血及炎細胞浸潤(i度損傷-ii度損傷)。

(四)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物的消化性潰瘍保護作用研究

通過文獻(hajrezaiem,salehenn,karimianh,etal.biochaninagastroprotectiveeffectsinethanol-inducedgastricmucosalulcerationinrats.plosone,2015,10(3):e0121529.)推薦的方法，采用無水乙醇誘導(dǎo)大鼠，建立急性胃潰瘍模型，口服灌胃法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物，通過軟件計算潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率。

1.1供試藥品制備

由實施例1和參考文獻(周訓(xùn)蓉，等.吉法酯中幾何異構(gòu)體的研究,化學(xué)試劑,2012,34(3):266-268)方法所制備的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物、(4e/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯及(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯，經(jīng)混合制備(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯含量為0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、10％的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物供試品。

1.2實驗及檢測方法同(三)中所述。

1.3實驗結(jié)果

1.3.1不同純度的(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯對大鼠胃潰瘍抑制率的影響結(jié)果見圖5。

1.3.2不同純度的(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯對大鼠胃潰瘍面積的影響結(jié)果見圖6。

由圖5和圖6可知：當(dāng)(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的濃度小于等于2％且大于等于0.1％時，本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物，潰瘍抑制率明顯，能夠明顯抑制無水乙醇對胃黏膜組織造成的潰瘍損傷，降低潰瘍面積，改善病理形態(tài)及炎癥性反應(yīng)，具有較一致的預(yù)料不到的技術(shù)效果；但是當(dāng)(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的濃度大于2％或者小于0.1％時，法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物對胃潰瘍抑制率明顯降低，對抑制無水乙醇對胃粘膜組織造成的損傷方面效果較差。

(五)法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物藥動學(xué)特征考察

本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物、吉法酯、(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯對無水乙醇致大鼠胃粘膜的保護作用存在明顯差異。本發(fā)明建立超高液-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法研究三者通過灌胃給藥后進入大鼠體內(nèi)后的差異，考察三者的藥動學(xué)特征。

儀器：watersacquityhuplc，watersxevog2-xsqtof

色譜條件：色譜柱(watersbehc18(2.1mm×50mm,1.7μmm)柱，柱溫40℃)；流動相(0.1％甲酸水-甲醇-乙腈(1:54:45)等度洗脫，流速0.3ml·min^-1)；進樣量2μl；進樣時間6min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(esi)；正模式采集(negativemode)；毛細管電壓2kv，離子源120℃，脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流量800l·h^-1，錐孔氣流量50l·h^-1；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件masslynxv4.1工作站，掃描方式ms模式。

線性：取標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成20、40、80、200、400、1000、2000ng·ml的系列標(biāo)準(zhǔn)液。取空白血漿100μl，置于2mlep管中，依次加入上述標(biāo)準(zhǔn)液100μl，加入400μl甲醇再加入800μl乙酸乙酯，渦旋混合15min，10000r·min^-1離心10min，吸取上層有機層，氮氣吹干，殘渣加入100μl甲醇溶解，13000r·min^-1離心10min進樣測定。以質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo)、樣品峰面積(y)為縱坐標(biāo)用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/c，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得(4e/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝256.5086c-11.0039(r²＝0.9989)，gefarnate標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝224.c-10.0189(r²＝0.9978)，(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝188.4582c-6.8258(r²＝0.9981)結(jié)果表明，檢測質(zhì)量濃度的線性范圍均為20～2000ng·ml，定量限均為20ng·ml。

樣品測定：取大鼠18只雌雄各半，體質(zhì)量200-230g，分為三組每組6只，實驗前禁食12h，正常飲水。大鼠稱質(zhì)量后按常用劑量換算灌胃給予灌胃溶液，劑量均為200mg/kg，于灌胃給藥后0.25、0.5、1、2.5、3.5、4.5、6、7.5、9、10.5、12、14、24、30h斷尾取血0.3ml，置于肝素化1.5ml離心管中，4500r/min離心10min，取血漿樣品100μl置于2mlep管中，加入400μl甲醇再加入800μl乙酸乙酯，渦旋混合15min，10000r·min^-1離心10min，吸取上層有機層，氮氣吹干，殘渣加入100μl甲醇溶解，13000r·min^-1離心10min進樣測定。

實驗結(jié)果：本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物、吉法酯、(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯分別灌胃給藥后藥-時曲線如圖7所示。由藥動學(xué)參數(shù)可知，大鼠灌胃給藥后本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物、吉法酯、(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯達峰時間約為6小時，但是本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物、吉法酯、(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯的auc0-t分別為19126.58(ng·h/ml)、14656.05(ng·h/ml)、8785.62(ng·h/ml)。說明本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物的相對生物利用度大于(4z/8e)-法呢基乙酸香葉醇酯以及吉法酯。

綜上可知，本發(fā)明的法呢基乙酸香葉醇酯藥物組合物具有毒性低、消化性潰瘍保護作用強、相對生物利用度高的優(yōu)點。

以上結(jié)合附圖詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這種簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。