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工程菌及其在制備(r)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用

文檔序號(hào):8355713閱讀:384來(lái)源:國(guó)知局
工程菌及其在制備(r)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥領(lǐng)域,尤其設(shè)及工程菌及其在制備佩-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 他汀類藥物是一類哲甲基戊二酷輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑藥物, 是目前臨床上應(yīng)用較廣泛的降血脂藥物。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA還原成3-甲基-3, 5-二哲基戊酸的反應(yīng)是膽固醇的生物合成途徑,他汀類藥物通過(guò)抑制HMG-CoA還原酶的 合成,來(lái)抑制體內(nèi)膽固醇的合成,降低低密度脂蛋白膽固醇(LDkC)水平,對(duì)W膽固醇升 高為主的高血脂癥和冠屯、病有較好的療效。在結(jié)構(gòu)上,他汀類藥物通常由憎水性的剛性 平面結(jié)構(gòu)母核和具有雙手性中屯、的(3R,5S/R)-雙哲基己酸醋組成。其中,阿托伐他汀 (Atorvastatin)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)是全新第S代、全合成、高純化、高選擇性 的HMG-CoA還原酶抑制劑,多年來(lái)占據(jù)降血脂藥物的主要市場(chǎng)份額。(3R,5R) -6-氯基-3, 5-二哲基己酸叔了醋是合成阿托伐他汀的關(guān)鍵手性中間體,其可W通過(guò)已經(jīng)建立了一個(gè) 手性中屯、的(S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋脫面上氯基得到(時(shí)-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋,再通過(guò)幾基還原酶的作用得到。因此,開展對(duì)((時(shí)-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋的合成改進(jìn),阿托伐他汀類藥物的制備方法研究均具有十分重要的 作用。
[000引 目前,報(bào)道的制備佩-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋的方法主要有;種, 兩種為化學(xué)酶法,其中之一是由美國(guó)Codexis公司開發(fā)出來(lái),先采用兩步=酶[游離酶]全 生物催化法合成4-氯基-3-哲基了酸己醋,另外一種是膳水解酶不對(duì)稱水解4-氯基-3-哲 基了酸錠得到4-氯基-3-哲基了酸己醋,由法國(guó)的Diversa Co巧oration研發(fā),兩者都是再 通過(guò)克萊森反應(yīng)與醋酸叔了醋縮合加長(zhǎng)碳鏈來(lái)合成(時(shí)-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔 了醋,該過(guò)程中需要裡催化劑和無(wú)水無(wú)氧反應(yīng),反應(yīng)條件較為苛刻,無(wú)法大面積推廣生產(chǎn); 另一種是一步化學(xué)法,W (S) -6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋為底物,與化CN在堿性條 件下反應(yīng)生成(時(shí)-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋,但底物和產(chǎn)物在強(qiáng)堿性的反應(yīng) 條件下通常是不穩(wěn)定的。因此,與化學(xué)法相比,生物法反應(yīng)更溫和,費(fèi)用相對(duì)低,過(guò)程更綠色 化,區(qū)域和立體選擇性好,更值得深入研究。
[0004]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種工程菌,包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的目的基因,其特征在于,所述目的基因 為堿基序列如SEQ ID NO. 3所示的鹵代醇脫鹵酶基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的工程菌在以(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物制 備(R) -6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。
3. -種(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的制備方法,其特征在于,包括: (1) 制備包含堿基序列如SEQ ID No. 3所示的鹵代醇脫鹵酶基因的工程菌; (2) 制備所述工程菌的靜息細(xì)胞懸液; (3) 將靜息細(xì)胞懸液與底物(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、氰化物混合,反 應(yīng)制得(R)_6_氛基-5-羥基-3-幾基己酸叔丁醋。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述反應(yīng)的溫度為18~40°C,反應(yīng)液 的pH值為7.0~9.0。
5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述靜息細(xì)胞懸液的制備方法包括:將 所述工程菌活化后,擴(kuò)大培養(yǎng)至〇D_達(dá)到0. 6~1. 2,加入誘導(dǎo)劑,繼續(xù)培養(yǎng),離心收集細(xì) 胞,用緩沖液重懸,獲得靜息細(xì)胞懸液。
6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,所述誘導(dǎo)劑為IPTG ;誘導(dǎo)劑的濃度為 0? 1 ~0? 5mM〇
7. 如權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,所述緩沖液為HEPES緩沖液。
8. 如權(quán)利要求7所述的制備方法,其特征在于,所述緩沖液在反應(yīng)液中的濃度為1~ 100mM〇
9. 如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述氰化物為NaCN。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種工程菌及其在制備(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用,該工程菌包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的目的基因,所述目的基因?yàn)閴A基序列如SEQ ID N 0.3所示的鹵代醇脫鹵酶基因。本發(fā)明將SEQ ID N 0.3所示的鹵代醇脫鹵酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞構(gòu)建的工程菌可表達(dá)鹵代醇脫鹵酶HHDH,通過(guò)該酶的催化作用可實(shí)現(xiàn)將(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯催化成(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯。該反應(yīng)條件溫和,操作簡(jiǎn)便,提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和純度。
【IPC分類】C12N1-21, C12P13-00, C12N15-60, C12R1-19
【公開號(hào)】CN104673733
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510067574
【發(fā)明人】楊立榮, 王金玉, 陳少云, 吳堅(jiān)平, 徐剛
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年2月10日
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