本公開涉及呈至結(jié)合至cd25的抗體的接頭的形式的具有不穩(wěn)定性c2或n10保護基的吡咯并苯并二氮雜(pbd)的特定用途。

背景

吡咯并苯并二氮雜

一些吡咯并苯并二氮雜(pbd)具有識別和結(jié)合至dna的特定序列的能力；優(yōu)選的序列是pugpu。在1965年發(fā)現(xiàn)第一種pbd抗腫瘤抗生素，氨茴霉素(leimgruber,等,j.am.chem.soc.,87,5793-5795(1965)；leimgruber,等,j.am.chem.soc.,87,5791-5793(1965))。自此以后，報道了許多天然存在的pbd，并且已開發(fā)了多種類似物的超過10個合成途徑(thurston,等,chem.rev.1994,433-465(1994)；antonow,d.和thurston,d.e.,chem.rev.2011111(4),2815-2864)。家族成員包括赤霉素(hochlowski,等,j.antibiotics,40,145-148(1987))、奇卡霉素(konishi,等,j.antibiotics,37,200-206(1984))、dc-81(日本專利58-180487；thurston,等,chem.brit.,26,767-772(1990)；bose,等,tetrahedron,48,751-758(1992))、甲基氨茴霉素(kuminoto,等,j.antibiotics,33,665-667(1980))、新茴霉素a和b(takeuchi,等,j.antibiotics,29,93-96(1976))、泊羅霉素(tsunakawa,等,j.antibiotics,41,1366-1373(1988))、普拉卡素(shimizu,等,j.antibiotics,29,2492-2503(1982)；langley和thurston,j.org.chem.,52,91-97(1987))、柴野霉素(dc-102)(hara,等,j.antibiotics,41,702-704(1988)；itoh,等,j.antibiotics,41,1281-1284(1988))、西伯利亞霉素(leber,等,j.am.chem.soc.,110,2992-2993(1988))和托馬霉素(arima,等,j.antibiotics,25,437-444(1972))。pbd具有一般結(jié)構(gòu)：

它們的不同之處在于取代基的數(shù)目、類型和位置，它們的芳香族a環(huán)和吡咯并c環(huán)兩者以及c環(huán)飽和度。在b-環(huán)中，在為負責烷基化dna的親電子中心的n10-c11位置處存在亞胺(n＝c)、甲醇胺(nh-ch(oh))或甲醇胺甲醚(nh-ch(ome))。所有已知的天然產(chǎn)物在手性c11a位置處具有(s)-構(gòu)型，當從c環(huán)朝向a環(huán)觀察時，其為它們提供右手扭曲。這給予它們適用于與b型dna的小溝具有相同螺旋(isohelicity)的三維形狀，導致在結(jié)合位點處的密配合(snugfit)(kohn,在antibioticsiii.springer-verlag,newyork,第3-11頁(1975)；hurley和needham-vandevanter,acc.chem.res.,19,230-237(1986)中)。它們在小溝中形成加成物的能力使得它們能夠干擾dna加工，因此它們用作抗癌劑。

特別有利的吡咯并苯并二氮雜化合物由gregson等(chem.commun.1999,797-798)描述為化合物1，并且由gregson等(j.med.chem.2001,44,1161-1174)描述為化合物4a。該化合物，也被稱為sg2000，在下文中顯示：

wo2007/085930描述了具有用于連接至細胞結(jié)合劑(諸如抗體)的接頭基團的二聚體pbd化合物的制備。接頭存在于二聚體的連接單體pbd單元的橋中。

具有用于連接至細胞結(jié)合劑(諸如抗體)的接頭基團的二聚體pbd化合物描述于wo2011/130613和wo2011/130616中。將在這些化合物中的接頭經(jīng)由c2位置連接至pbd核，并且通常通過接頭基團上的酶的作用裂解。在wo2011/130598中，將這些化合物中的接頭連接至pbd核上可用的n10位置之一，并且通常通過接頭基團上的酶的作用裂解。

抗體-藥物綴合物

已經(jīng)建立抗體療法用于靶向治療患有癌癥、免疫病癥和血管生成病癥的患者(carter,p.(2006)naturereviewsimmunology6:343-357)。使用抗體-藥物綴合物(adc)(即免疫綴合物)局部遞送細胞毒性劑或細胞抑制劑(即，在癌癥治療中殺死或抑制腫瘤細胞的藥物)靶向藥物部分遞送至腫瘤并在其中胞內(nèi)累積，而全身施用這些未綴合的藥劑可導致對正常細胞不可接受水平的毒性(xie等(2006)expert.opin.biol.ther.6(3):281-291；kovtun等(2006)cancerres.66(6):3214-3121；law等(2006)cancerres.66(4):2328-2337；wu等(2005)naturebiotech.23(9):1137-1145；lambertj.(2005)currentopin.inpharmacol.5:543-549；hamannp.(2005)expertopin.ther.patents15(9):1087-1103；payne,g.(2003)cancercell3:207-212；trail等(2003)cancelimmunol.immunother.52:328-337；syrigos和epenetos(1999)anticancerresearch19:605-614)。

在此尋求具有最小毒性的最大功效。設計和精制adc的努力集中于單克隆抗體(mab)的選擇性以及藥物作用機制、藥物-連接、藥物/抗體比(載量)和藥物釋放性質(zhì)(junutula,等,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932；dornan等(2009)blood114(13):2721-2729；us7521541；us7723485；w02009/052249；mcdonagh(2006)proteineng.design&sel.19(7):299-307；doronina等(2006)bioconj.chem.17:114-124；erickson等(2006)cancerres.66(8):1-8；sanderson等(2005)clin.cancerres.11:843-852；jeffrey等(2005)j.med.chem.48:1344-1358；hamblett等(2004)clin.cancerres.10:7063-7070)。

wo2014/57119公開了綴合至抗-cd25抗體的pbd二聚體。

公開內(nèi)容

如下文更詳細地描述，本發(fā)明人已證明如本文所定義的adc當靶向cd-25陽性細胞時，另外地具有針對cd25-陰性細胞的強有力的旁觀者效應。

這一發(fā)現(xiàn)結(jié)果提供用于此類adc的另外的用途，從而暗示了新的治療背景，例如涉及存在cd25+ve和cd25-ve細胞兩者的腫瘤或其它贅生物時，所述腫瘤或其它贅生物(作為非限制性實例)可為其中贅生性cd-25陽性細胞群是異質(zhì)的淋巴瘤或者缺乏cd25但被cd-25陽性激活的t-細胞浸潤的贅生物。

因此，本公開的優(yōu)選的第一方面提供治療受試者中的增生性疾病的方法，所述疾病的特征在于存在包含cd25+ve和cd25-ve細胞兩者的贅生物，

所述方法包括向受試者施用式l-(d^l)p的綴合物，其中d^l具有式i或ii：

其中：

l是結(jié)合至cd25的抗體(ab)；

p是1至20的整數(shù)；

當在c2’與c3’之間存在雙鍵時，r¹²選自由以下組成的組：

(ia)c5-10芳基基團，被選自包括以下的基團的一個或多個取代基任選地取代：鹵基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、c1-7烷基、c3-7雜環(huán)基和雙-氧基-c1-3亞烷基；

(ib)c1-5飽和脂肪族烷基；

(ic)c3-6飽和環(huán)烷基；

(id)其中r²¹、r²²和r²³的每一個獨立地選自h、c1-3飽和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和環(huán)丙基，其中r¹²基團中的碳原子總數(shù)不超過5；

(ie)其中r^25a和r^25b之一是h且另一個選自：苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基，和

(if)其中r²⁴選自：h；c1-3飽和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；環(huán)丙基；苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；

當在c2’與c3’之間存在單鍵時，

r¹²是其中r^26a和r^26b獨立地選自h、f、c1-4飽和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基團被選自c1-4烷基酰氨基和c1-4烷基酯的基團任選地取代；或者，當r^26a和r^26b之一是h時，另一個選自腈和c1-4烷基酯；

r⁶和r⁹獨立地選自h、r、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nrr’、硝基、me3sn和鹵基；

其中r和r’獨立地選自任選取代的c1-12烷基、c3-20雜環(huán)基和c5-20芳基基團；

r⁷選自h、r、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nhrr’、硝基、me3sn和鹵基；

r"是c3-12亞烷基基團，其鏈可被一個或多個雜原子(如o、s、nrⁿ²(其中rⁿ²是h或c1-4烷基)和/或芳香族環(huán)(如苯或吡啶))中斷；

y和y’選自o、s或nh；

r^6'、r^7'、r^9'選自分別與r⁶、r⁷和r⁹相同的基團；

[式i]

r^l1’是用于連接至抗體(ab)的接頭；

r^11a選自oh、or^a(其中r^a是c1-4烷基)和sozm(其中z是2或3且m是單價藥學上可接受的陽離子)；

r²⁰和r²¹在它們結(jié)合的氮與碳原子之間一起形成雙鍵；或

r²⁰選自h和r^c，其中r^c是封端基團；

r²¹選自oh、or^a和sozm；

當在c2與c3之間存在雙鍵時，r²選自由以下組成的組：

(ia)c5-10芳基基團，被選自包括以下的基團的一個或多個取代基任選地取代：鹵基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、c1-7烷基、c3-7雜環(huán)基和雙-氧基-c1-3亞烷基；

(ib)c1-5飽和脂肪族烷基；

(ic)c3-6飽和環(huán)烷基；

(id)其中r¹¹、r¹²和r¹³的每一個獨立地選自h、c1-3飽和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和環(huán)丙基，其中r²基團中碳原子的總數(shù)不超過5；

(ie)其中r^15a和r^15b之一是h且另一個選自：苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；和

(if)其中r¹⁴選自：h；c1-3飽和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；環(huán)丙基；苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；

當在c2與c3之間存在單鍵時，

r²是其中r^16a和r^16b獨立地選自h、f、c1-4飽和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基團被選自c1-4烷基酰氨基和c1-4烷基酯的基團任選地取代；或者，當r^16a和r^16b之一是h時，另一個選自腈和c1-4烷基酯；

[式ii]

r²²具有式iiia、式iiib或式iiic：

(a)

其中a是c5-7芳基基團，且

(i)q¹是單鍵，且q²選自單鍵和-z-(ch2)n-，其中z選自單鍵、o、s和nh且n為1至3；或

(ii)q¹是-ch＝ch-且q²是單鍵；

(b)

其中；

r^c1、r^c2和r^c3獨立地選自h和未取代的c1-2烷基；

(c)

其中q選自o-r^l2’、s-r^l2’和nrⁿ-r^l2’，且rⁿ選自h、甲基和乙基

x選自包括以下的基團：o-r^l2’、s-r^l2’、co2-r^l2’、co-r^l2’、nh-c(＝o)-r^l2’、nhnh-r^l2'、conhnh-r^l2'、nrⁿr^l2'，其中rⁿ選自包括h和c1-4烷基的基團；

r^l2'是用于連接至抗體(ab)的接頭；

r¹⁰和r¹¹在它們結(jié)合的氮與碳原子之間一起形成雙鍵；或

r¹⁰是h且r¹¹選自oh、or^a和sozm；

r³⁰和r³¹在它們結(jié)合的氮與碳原子之間一起形成雙鍵；或

r³⁰是h且r³¹選自oh、or^a和sozm。

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在本公開的另一方面，提供治療受試者中的增生性疾病的方法，所述疾病的特征在于存在包含cd25+ve和cd25-ve細胞兩者的贅生物，

所述方法包括向受試者施用式a的綴合物：

其中：

d表示基團d1或d2：

虛線指示在c2與c3之間任選存在雙鍵；

當在c2與c3之間存在雙鍵時，r²選自由以下組成的組：

(ia)c5-10芳基基團，被選自包括以下的基團的一個或多個取代基任選地取代：鹵基、硝基、氰基、醚、羧基、酯、c1-7烷基、c3-7雜環(huán)基和雙-氧基-c1-3亞烷基；

(ib)c1-5飽和脂肪族烷基；

(ic)c3-6飽和環(huán)烷基；

(id)其中r³¹、r³²和r³³的每一個獨立地選自h、c1-3飽和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和環(huán)丙基，其中r²基團中碳原子的總數(shù)不超過5；

(ie)其中r^35a和r^35b之一是h且另一個選自：苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；和

(if)其中r³⁴選自：h；c1-3飽和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；環(huán)丙基；苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；

(ig)鹵基；

當在c2與c3之間存在單鍵時，

r²是其中r^36a和r^36b獨立地選自h、f、c1-4飽和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基團被選自c1-4烷基酰氨基和c1-4烷基酯的基團任選地取代；或者，當r^16a和r^16b之一是h時，另一個選自腈和c1-4烷基酯；

d’表示基團d’1或d’2：

其中虛線指示在c2’與c3’之間任選存在雙鍵；

r⁶和r⁹獨立地選自h、r、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nrr’、no2、me3sn和鹵基；

r⁷獨立地選自h、r、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nrr’、no2、me3sn和鹵基；

y選自式a1、a2、a3、a4、a5和a6：

l是連接至細胞結(jié)合劑的接頭；

cba是結(jié)合至cd25的抗體(ab)；

n是選自于0至48范圍內(nèi)的整數(shù)；

r^a4是c1-6亞烷基基團；

(a)r¹⁰是h且r¹¹是oh、or^a，其中r^a是c1-4烷基；或

(b)r¹⁰和r¹¹在它們結(jié)合的氮與碳原子之間形成氮-碳雙鍵；或

(c)r¹⁰是h且r¹¹是osozm，其中z是2或3且m是單價藥學上可接受的陽離子；

r和r’各自獨立地選自任選取代的c1-12烷基、c3-20雜環(huán)基和c5-20芳基基團，并且任選地涉及基團nrr’時，r和r’連同它們連接的氮原子一起形成任選取代的4-、5-、6-或7-元雜環(huán)環(huán)；

其中r¹⁶、r¹⁷、r¹⁹、r²⁰、r²¹和r²²分別如針對r⁶、r⁷、r⁹、r¹⁰、r¹¹和r²那樣定義；

其中z是ch或n；

其中t和t’^'獨立地選自單鍵或c1-9亞烷基，其鏈可被一個或多個雜原子(如o、s、n(h)、nme)中斷，前提是x與x’之間最短的原子鏈中原子數(shù)是3至12個原子；

x和x’獨立地選自o、s和n(h)。

a的其它結(jié)構(gòu)(其當cba是結(jié)合至cd25的抗體(ab)時可與本公開內(nèi)容一起使用)描述于wo2014/140862和wo2014/159981中。

在本公開的該可替代方面的優(yōu)選實施方案中，l具有式：

-l^a-(ch2)m-，其中m是0至6(l1)；

-l^a-(ch2)m-o-，其中m是0至6(l2)；或

-l^a-(ch2)q-o-c(＝o)-nh-(ch2)p-，其中q是1至3，且p是1至3(l3)；

其中l(wèi)^a選自：

其中ar表示c5-6亞芳基基團，如亞苯基。

其它可用作連接y基團的剩余部分與細胞結(jié)合劑的l的基團描述于wo2014/140862和wo2014/159981中。

實施方案

在一些實施方案中，本公開提供治療受試者中增生性疾病的方法，所述疾病的特征在于存在包含cd25+ve和cd25-ve細胞兩者的贅生物，所述方法包括向受試者施用具有選自包括以下的組的式的綴合物：

綴合物f

綴合物g

綴合物h

和綴合物i

其中cba是結(jié)合至cd25的抗體(ab)。

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因此，綴合物包含結(jié)合至通過接頭單元共價連接至至少一個藥物單元的cd25的抗體(ab)。

載藥量由p(每抗體的藥物分子數(shù))表示。載藥量的范圍可為每抗體1至20個藥物單位(d^l)。對于組合物，p表示組合物中綴合物的平均載藥量，且p在1至20的范圍內(nèi)。

在本公開的實踐中，藥物部分可在由所述cd25+ve細胞內(nèi)化之前或之后體內(nèi)裂解諸如以釋放pbd，其中所述pbd滲透所述cd25+ve和cd25-ve細胞兩者，從而引起對其的細胞毒性。

優(yōu)選地，細胞毒性引起細胞死亡。

在本公開的另一方面，提供引起對cd25+ve細胞附近的贅生性cd25-ve細胞的細胞毒性(更優(yōu)選地，cd25+ve細胞附近的贅生性cd25-ve細胞的細胞死亡)的方法，所述方法包括使用如本公開的第一方面所定義的綴合物。該第二方面的方法可根據(jù)第一方面進行。所述方法可包括確認對cd25-ve細胞的細胞毒性的步驟。cd25+ve和cd25-ve細胞均可為贅生性細胞，例如共定位于淋巴瘤中。

cd25+ve細胞可為腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)且cd25-ve細胞可為贅生性細胞，例如共定位于淋巴瘤或非血液癌中。

在本公開的另一方面，提供選擇受試者用于用如本公開的第一方面所定義的綴合物治療的方法，所述方法包括篩選所述受試者以鑒定包含cd25+ve和cd25-ve細胞兩者的贅生物的存在。選擇其中存在此類贅生物的患者。

如上，cd25+ve細胞可在組織學上由贅生物構(gòu)成，或可為浸潤性細胞諸如til。

在本公開的另一方面，提供治療受試者中的增生性疾病的方法，所述方法包括：

(i)鑒定受試者中包含cd25+ve和cd25-ve細胞兩者的贅生物的存在；

(ii)向受試者施用如本公開的第一方面所定義的綴合物。

還提供用于本公開的任一種方法的本文所述的任何綴合物和此類綴合物用于制備本公開的任一種方法所用的藥劑的此類綴合物的用途。

適用于本公開的實踐的疾病、贅生物和抗體的非限制性實例在下文更詳細地描述。

詳述

在本公開中，pbd二聚體與抗體之間的特定連接優(yōu)選地在胞外穩(wěn)定。在轉(zhuǎn)運或遞送至細胞中之前，抗體-藥物綴合物(adc)優(yōu)選地是穩(wěn)定的且保持完整，即抗體保持連接至藥物部分。接頭在靶細胞之外是穩(wěn)定的，且可以某個有效速率在細胞內(nèi)裂解。有效接頭將：(i)維持抗體的特異性結(jié)合性質(zhì)；(ii)允許胞內(nèi)遞送綴合物或藥物部分；(iii)保持穩(wěn)定和完整，即未裂解，直到綴合物已被遞送或轉(zhuǎn)運至其靶向位點；和(iv)維持pbd藥物部分的細胞毒性、細胞殺傷作用或細胞抑制作用。adc的穩(wěn)定性可通過標準分析技術(shù)(諸如質(zhì)譜、hplc和分離/分析技術(shù)lc/ms)測量。

結(jié)合至cd25的抗體

cd25也被稱為：il2ra、rp11-536k7.1、iddm10、il2r、tcgfr、fil-2受體亞基α；il-2-ra；il-2r亞基α；il2-ra；tac抗原；白細胞介素-2受體亞基α；p55

cd25多肽對應于genbank登錄號np_000408，版本號np_000408.1gi:4557667，記錄更新日期：2012年9月09日，04:59pm。在一個實施方案中，編碼cd25多肽的核酸對應于genbank登錄號nm_000417，版本號nm_000417.2gi:269973860，記錄更新日期：2012年9月09日，04:59pm。在一些實施方案中，cd25多肽對應于uniprot/swiss-prot登錄號p01589。

結(jié)合cd25的抗體描述于：

us6,383,487(novartis/ucl：巴利昔單抗(baxilisimab)[simulect])

us6,521,230(novartis/ucl：巴利昔單抗[simulect])

例如，具有抗原結(jié)合位點的抗體包含至少一個結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含具有seq.id.no:7中的氨基酸序列的cdr1，具有seq.id.no:8中的氨基酸序列的cdr2和具有seq.id.no:9中的氨基酸序列的cdr3；或收進序列中作為整體的所述cdr1、cdr2和cdr3包含與收進序列中作為整體的seq.id.no:7、8和9至少90％相同的氨基酸序列。

達利珠單抗-rechaj.,等annnyacadsci.2009年9月；1174:99-106(roche)

用于區(qū)別cd25+ve細胞與cd25-ve細胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。示例性技術(shù)包括通過對患者免疫組織化學(strauchen等,am.jpathol.126:506-512,1987、facs(gaikwad等,int.j.clin.exppathol.7:6225-6230,2014)或成像(使用spect/pet，然后施用對cd25具有特異性的放射標記的探針)(vandort等,curr.comput.aideddrugdes.4:46-53,2008)。此類類似的方法可用于鑒定具有適用于通過本公開的方法靶向的贅生物的患者。

在一方面，抗體是結(jié)合至cd25的抗體，所述抗體包含：vh結(jié)構(gòu)域，其包含具有seqidno.3的氨基酸序列的vhcdr1、具有seqidno.4的氨基酸序列的vhcdr2和具有seqidno.5的氨基酸序列的vhcdr3。在一些實施方案中，抗體包含具有根據(jù)seqidno.1的序列的vh結(jié)構(gòu)域。

抗體還可包含：vl結(jié)構(gòu)域，其包含具有seqidno.6的氨基酸序列的vlcdr1、具有seqidno.7的氨基酸序列的vlcdr2和具有seqidno.8的氨基酸序列的vlcdr3。在一些實施方案中，抗體還包含具有根據(jù)seqidno.2的序列的vl結(jié)構(gòu)域。

在一些實施方案中，抗體包含vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域，所述vh和vl結(jié)構(gòu)域具有與seqidno.2配對的seqidno.1的序列。

vh和vl結(jié)構(gòu)域可配對以形成結(jié)合cd25的抗體抗原結(jié)合位點。

在一些實施方案中，抗體是包含vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域的完整抗體，所述vh和vl結(jié)構(gòu)域具有seqidno.1和seqidno.2的序列。

在一些實施方案中，抗體是完全人單克隆igg1抗體，優(yōu)選igg1,κ。

在一些實施方案中，抗體是wo2004/045512(genmaba/s)中所述的ab12抗體，另外被稱為humax-tac。

在另一方面，抗體是如本文所述的如下所述修飾(或進一步修飾)的抗體。在一些實施方案中，抗體是如本文公開的抗體的人源化、去免疫化或表面重塑形式。

術(shù)語

本文的術(shù)語“抗體”以最廣泛意義使用且特別涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)、完整抗體(也被稱為“全長”抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性，所述所需生物活性是結(jié)合cd25的能力(miller等(2003)jour,ofimmunology170:4854-4861)。抗體可為鼠、人、人源化、嵌合或源自其它物種?？贵w是由能夠識別和結(jié)合至特異性抗原的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,第5版,garlandpublishing,newyork)。靶抗原通常具有數(shù)個結(jié)合位點，也被稱為表位，由多個抗體上的cdr識別。特異性結(jié)合至不同表位的每個抗體具有不同的結(jié)構(gòu)。因此，一個抗原可具有超過一個相應的抗體?？贵w包括全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結(jié)合感興趣的靶的抗原或其部分的抗原結(jié)合位點的分子，此類靶包括但不限于癌細胞或產(chǎn)生與自身免疫疾病相關(guān)的自身免疫抗體的細胞。免疫球蛋白可為免疫球蛋白分子的任何類型(如igg、ige、igm、igd和iga)、類別(如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亞類，或同種異型(如人g1m1、g1m2、g1m3、非-g1m1[即除g1m1之外的任何同種異型]、g1m17、g2m23、g3m21、g3m28、g3m11、g3m5、g3m13、g3m14、g3m10、g3m15、g3m16、g3m6、g3m24、g3m26、g3m27、a2m1、a2m2、km1、km2和km3)。免疫球蛋白可源自任何物種，包括人、鼠或兔來源。

如本文所用，“結(jié)合cd25”用于意指抗體以比非特異性伴侶(諸如牛血清白蛋白(bsa，genbank登錄號caa76847，版本號caa76847.1gi:3336842，記錄更新日期：2011年1月7日，02:30pm))高的親和力結(jié)合cd25。在一些實施方案中，當在生理條件下測量時，抗體以比抗體對bsa的締合常數(shù)高至少2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10⁴、10⁵或10⁶-倍的締合常數(shù)(ka)結(jié)合cd25。本公開的抗體可以高親和力結(jié)合cd25。例如，在一些實施方案中，抗體可以等于或小于約10^-6m，諸如1x10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13或10^-14的kd結(jié)合cd25。

“抗體片段”包含一部分的全長抗體，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2和scfv片段；雙鏈抗體；直鏈抗體；由fab表達文庫產(chǎn)生的片段、抗-獨特性(抗-id)抗體、cdr(互補決定區(qū))和免疫特異性結(jié)合至癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的任何以上抗體的表位-結(jié)合片段、單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。

如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體，即包含群體的各個抗體是相同的除了可以小量存在的可能天然存在的突變。單克隆抗體是高度特異性的，定向針對單一抗原位點。此外，與包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相比，每個單克隆抗體定向針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體有利之處在于它們可未被其它抗體污染地合成。修飾語“單克隆”指示抗體的特征為從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得，并且不被理解為需要通過任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，待根據(jù)本公開使用的單克隆抗體可通過首先由kohler等(1975)nature256:495描述的雜交瘤方法制備，或可通過重組dna方法制備(參見us4816567)。單克隆抗體還可從噬菌體抗體文庫使用clackson等(1991)nature,352:624-628；marks等(1991)j.mol.biol.,222:581-597中所述的技術(shù)分離，或者從攜帶完全人免疫球蛋白系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠分離(lonberg(2008)curr.opinion20(4):450-459)。

本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的相應的序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類抗體中的相應序列以及此類抗體的片段相同或同源，只要它們展現(xiàn)出所需的生物活性(us4816567；和morrison等(1984)proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855)。嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，其包含源自非人靈長類動物(如舊大陸猴或猿)的可變結(jié)構(gòu)域抗原-結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。

本文的“完整抗體”是包含vl和vh結(jié)構(gòu)域以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(cl)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可為天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。完整抗體可具有一種或多種“效應子功能”，其是指歸因于抗體的fc區(qū)域(天然序列fc區(qū)域或氨基酸序列變體fc區(qū)域)的那些生物活性?？贵w效應子功能的實例包括c1q結(jié)合；補體依賴性細胞毒性；fc受體結(jié)合；抗體-依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)；吞噬；和下調(diào)細胞表面受體諸如b細胞受體和bcr。

根據(jù)它們重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可將完整抗體指定為不同“類別”。存在五種主要類別的完整抗體：iga、igd、ige、igg和igm，并且這些中若干種可被進一步分為“亞類”(同種型)，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。對應于不同類別的抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。

抗體的修飾

可修飾本文公開的抗體，例如以使它們對人受試者更不具有免疫原性。這可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的多種技術(shù)中任一種實現(xiàn)。這些技術(shù)中的一些在下文中更詳述。

人源化

減少非人抗體或抗體片段的體內(nèi)免疫原性的技術(shù)包括被稱為“人源化”的那些。

“人源化抗體”是指包含人抗體的經(jīng)修飾的可變區(qū)的至少一部分的多肽，其中可變區(qū)的一部分、優(yōu)選基本上小于完整人可變結(jié)構(gòu)域的一部分已經(jīng)被來自非人物種的相應的序列取代且其中經(jīng)修飾的可變區(qū)連接至至少另一部分的另一蛋白質(zhì)、優(yōu)選人抗體的恒定區(qū)。表達“人源化抗體”包括人抗體，其中一個或多個互補決定區(qū)(“cdr”)氨基酸殘基和/或一個或多個框架區(qū)(“fw”或“fr”)氨基酸殘基被來自嚙齒類動物或其它非人抗體中的類似位點的氨基酸殘基取代。表達"人源化抗體"還包括免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段，所述變體或其片段包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的fr和基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的cdr。

非人(如鼠)抗體的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體?；蛘撸粤硪环N方式看，人源化抗體是還含有來自非人(如鼠)抗體的所選序列來替換人序列的人抗體。人源化抗體可包含不顯著改變其結(jié)合和/或生物活性的來自相同或不同物種的保守的氨基酸取代或非天然殘基。此類抗體是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。

存在一系列人源化技術(shù)，包括‘cdr接枝’、‘導向選擇’、‘去免疫化’、‘表面重塑’(也稱為‘鑲飾’)、‘復合抗體’、‘人字符串含量優(yōu)化(humanstringcontentoptimisation)’和框架改組。

cdr接枝

在該技術(shù)中，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者抗體的互補決定區(qū)(cdr)的殘基被來自具有所需性質(zhì)的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、駱駝、?？苿游?、山羊或兔)的cdr的殘基替代(實際上，非人cdr被‘接枝’至人框架上)。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(fr)殘基被相應的非人殘基替代(這可當例如特定fr殘基對抗原結(jié)合具有顯著影響時發(fā)生)。

此外，人源化抗體可包含既不在接受者抗體中存在也不在導入的cdr或框架序列中存在的殘基。進行這些修飾以進一步改善和最大化抗體性能。因此，通常，人源化抗體都將包含至少一個且在一方面兩個可變結(jié)構(gòu)域中的所有，其中所有或所有高變環(huán)對應于非人免疫球蛋白的高變環(huán)并且所有或基本上所有fr區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)的至少一部分，或人免疫球蛋白的至少一部分。

導向選擇

該方法由合并對特定表位有特異性的給定的非人抗體的vh或vl結(jié)構(gòu)域與人vh或vl文庫組成，并且針對感興趣的抗原選擇特異性人v結(jié)構(gòu)域。然后將該選擇的人vh與vl文庫合并以產(chǎn)生完全人vhxvl組合。該方法描述于naturebiotechnology(n.y.)12,(1994)899-903中。

復合抗體

在該方法中，將來自人抗體的氨基酸序列的兩個或更多個區(qū)段合并在最終抗體分子內(nèi)。它們通過將多個人vh和vl序列區(qū)段合并在組合中來構(gòu)建，其限制或避免最終復合抗體v區(qū)中的人t細胞表位。當需要時，t細胞表位通過交換有助于t細胞表位或編碼t細胞表位的v區(qū)區(qū)段與避免t細胞表位的可替代的區(qū)段來限制或避免。該方法描述于us2008/0206239a1中。

去免疫化

該方法涉及從治療性抗體(或其它分子)的v區(qū)去除人(或其它第二物種)t-細胞表位。例如，通過與mhc-結(jié)合基序的數(shù)據(jù)庫(諸如“基序”數(shù)據(jù)庫，托管于www.wehi.edu.au)比較，來分析治療性抗體v-區(qū)序列中mhcii類-結(jié)合基序的存在?？商鎿Q地，可以使用計算線程方法諸如由altuvia等(j.mol.biol.249244-250(1995))所設計的那些方法，來鑒定mhcii類-結(jié)合基序；在這些方法中，測試來自v-區(qū)序列的連續(xù)重疊肽的與mhcii類蛋白質(zhì)的結(jié)合能。然后可將該數(shù)據(jù)與關(guān)于其它序列特征的信息結(jié)合，所述其它序列特征涉及成功呈現(xiàn)的肽，諸如兩親性、rothbard基序和用于組織蛋白酶b和其它加工酶的切割位點。

一旦已鑒定潛在的第二物種(如人)t細胞表位，通過改變一個或多個氨基酸來消除它們。修飾的氨基酸通常是在t細胞表位本身內(nèi)，但就蛋白質(zhì)的一級或二級結(jié)構(gòu)而言也可以是相鄰于表位(因此，在一級結(jié)構(gòu)中，可能并不是相鄰的)。最典型地，改變是通過取代的方式，但在一些情況下，氨基酸添加或缺失將是更合適的。

可以通過重組dna技術(shù)來完成所有改變，使得通過使用充分確立的方法(諸如定向誘變)從重組宿主表達，來制備最終分子。然而，使用蛋白質(zhì)化學或分子改變的任何其它方式也是可能的。

表面重塑

該方法涉及：

(a)通過構(gòu)建非人抗體可變區(qū)的三維模型，確定非人(如嚙齒類動物)抗體(或其片段)的可變區(qū)的構(gòu)象結(jié)構(gòu)；

(b)使用來自足夠數(shù)量的非人和人抗體可變區(qū)重鏈和輕鏈的x-射線結(jié)晶學結(jié)構(gòu)的相對可達性分布，產(chǎn)生序列比對，以產(chǎn)生一組重鏈和輕鏈框架位置，其中在98％的足夠數(shù)量的非人抗體重鏈和輕鏈中比對位置是相同的；

(c)使用在步驟(b)中產(chǎn)生的一組框架位置，將非人抗體定義為人源化的、一組重鏈和輕鏈表面暴露的氨基酸殘基；

(d)根據(jù)人抗體氨基酸序列鑒定一組重鏈和輕鏈表面暴露的氨基酸殘基，其與在步驟(c)中定義的表面暴露的氨基酸殘基的組最密切相同，其中來自人抗體的重鏈和輕鏈是或不是天然配對的；

(e)在待人源化的非人抗體的氨基酸序列中，用在步驟(d)中鑒定的重鏈和輕鏈表面暴露的氨基酸殘基組取代在步驟(c)中定義的重鏈和輕鏈表面暴露的氨基酸殘基組；

(f)構(gòu)建產(chǎn)生自在步驟(e)中指定的取代的非人抗體的可變區(qū)的三維模型；

(g)通過比較在步驟(a)和(f)中構(gòu)建的三維模型，根據(jù)在步驟(c)或(d)中鑒定的組，鑒定在待人源化的非人抗體的互補決定區(qū)的任何殘基的任何原子的5埃內(nèi)的任何氨基酸殘基；以及

(h)將在步驟(g)中鑒定的任何殘基從人改變到原來非人氨基酸殘基，從而定義表面暴露的氨基酸殘基的非人抗體人源化組；前提條件是，無需首先進行步驟(a)，但必須在步驟(g)以前進行。

超人源化

該方法比較非人序列與功能性人種系基因庫。選擇了編碼與非人序列相同或密切相關(guān)的規(guī)范結(jié)構(gòu)(canonicalstructure)的那些人基因。在cdr內(nèi)具有最高同源性的那些選擇的人基因被選作fr供體。最后，將非人cdr接枝到這些人fr上。這種方法描述于專利wo2005/079479a2。

人字符串含量優(yōu)化

這種方法比較了非人(如小鼠)序列與人種系基因庫并且差異被評定為人字符串含量(hsc)，其在潛在的mhc/t-細胞表位的水平上量化序列。然后通過最大化它的hsc而不是使用全局同一性措施來人源化靶序列以產(chǎn)生多種不同的人源化變體(描述于molecularimmunology,44,(2007)1986-1998)。

框架改組

將非人抗體的cdr框內(nèi)稠合于涵蓋所有已知的重鏈和輕鏈人種系基因框構(gòu)的cdna匯集物。然后通過如淘選噬菌體展示抗體庫來選擇人源化抗體。這描述于methods36,43-60(2005)中。

定義

藥學上可接受的陽離子

藥學上可接受的單價和二價陽離子的實例討論于berge,等,j.pharm.sci.,66,1-19(1977)中，其通過引用并入本文。

藥學上可接受的陽離子可為無機的或有機的。

藥學上可接受的單價無機陽離子的實例包括但不限于堿金屬離子，諸如na⁺和k⁺。藥學上可接受的二價無機陽離子的實例包括但不限于堿土陽離子，諸如ca²⁺和mg²⁺。藥學上可接受的有機陽離子的實例包括但不限于銨離子(即nh4⁺)和取代的銨離子(如nh3r⁺、nh2r2⁺、nhr3⁺、nr4⁺)。一些適合取代的銨離子的實例是源自以下的那些：乙胺、二乙胺、二環(huán)己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、芐胺、苯基芐胺、膽堿、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，諸如賴氨酸和精氨酸。常見的季銨離子的實例是n(ch3)4⁺。

取代基

如本文所用的短語“任選取代的”涉及母體基團，其可以是未取代的或其可以是取代的。

除非另外說明，否則如本文所用的術(shù)語“取代的”涉及母體基團，其攜帶一個或多個取代基。術(shù)語“取代基”在本文中在常規(guī)意義上使用并且是指化學部分，其共價連接于或者(如果適當)稠合于母體基團。各種各樣的取代基是熟知的，以及它們的形成和引入各種母體基團的方法也是熟知的。

取代基的實例更詳細地描述于下文中。

c1-12烷基：如本文所用的術(shù)語“c1-12烷基”涉及通過從具有1至12個碳原子的烴化合物的碳原子去除氫原子所獲得的單價部分，其可以是脂肪族或脂環(huán)族的并且其可以是飽和或不飽和的(如部分不飽和的，完全不飽和的)。如本文所用的術(shù)語“c1-4烷基”涉及通過從具有1至4個碳原子的烴化合物的碳原子去除氫原子所獲得的單價部分，其可以是脂肪族或脂環(huán)族的并且其可以是飽和或不飽和的(如部分不飽和，完全不飽和的)。因此，術(shù)語“烷基”包括下文所討論的亞類烯基、炔基、環(huán)烷基等。

飽和烷基基團的實例包括但不限于甲基(c1)、乙基(c2)、丙基(c3)、丁基(c4)、戊基(c5)、己基(c6)和庚基(c7)。

飽和直鏈烷基基團的實例包括但不限于甲基(c1)、乙基(c2)、正丙基(c3)、正丁基(c4)、正戊基(戊基)(c5)、正己基(c6)和正庚基(c7)。

飽和支鏈烷基基團的實例包括異丙基(c3)、異丁基(c4)、仲丁基(c4)、叔丁基(c4)、異戊基(c5)和新戊基(c5)。

c2-12烯基：如本文所用的術(shù)語“c2-12烯基”涉及具有一個或多個碳-碳雙鍵的烷基基團。

不飽和的烯基基團的實例包括但不限于乙烯基(乙烯基)(乙烯基(vinyl)，-ch＝ch2)、1-丙烯基(-ch＝ch-ch3)、2-丙烯基(烯丙基，-ch-ch＝ch2)、異丙烯基(1-甲基乙烯基，-c(ch3)＝ch2)、丁烯基(c4)、戊烯基(c5)和己烯基(c6)。

c2-12炔基：如本文所用的術(shù)語“c2-12炔基”涉及具有一個或多個碳-碳三鍵的烷基基團。

不飽和的炔基基團的實例包括但不限于乙炔基(-c≡ch)和2-丙炔基(炔丙基，-ch2-c≡ch)。

c3-12環(huán)烷基：如本文所用的術(shù)語“c3-12環(huán)烷基”涉及也是環(huán)基基團的烷基基團；即，通過從環(huán)烴(碳環(huán))化合物的脂環(huán)族環(huán)原子去除氫原子所獲得的單價部分，該部分具有3至7個碳原子，包括3至7個環(huán)原子。

環(huán)烷基基團的實例包括但不限于來源于以下的那些：

飽和的單環(huán)烴化合物：

環(huán)丙烷(c3)、環(huán)丁烷(c4)、環(huán)戊烷(c5)、環(huán)己烷(c6)、環(huán)庚烷(c7)、甲基環(huán)丙烷(c4)、二甲基環(huán)丙烷(c5)、甲基環(huán)丁烷(c5)、二甲基環(huán)丁烷(c6)、甲基環(huán)戊烷(c6)、二甲基環(huán)戊烷(c7)和甲基環(huán)己烷(c7)；

不飽和的單環(huán)烴化合物：

環(huán)丙烯(c3)、環(huán)丁烯(c4)、環(huán)戊烯(c5)、環(huán)己烯(c6)、甲基環(huán)丙烯(c4)、二甲基環(huán)丙烯(c5)、甲基環(huán)丁烯(c5)、二甲基環(huán)丁烯(c6)、甲基環(huán)戊烯(c6)、二甲基環(huán)戊烯(c7)和甲基環(huán)己烯(c7)；和

飽和多環(huán)烴化合物：

降蒈烷(c7)、降蒎烷(c7)、降冰片烷(c7)。

c3-20雜環(huán)基：如本文所用的術(shù)語“c3-20雜環(huán)基”涉及通過從雜環(huán)化合物的環(huán)原子去除氫原子所獲得的單價部分，所述部分具有3至20個環(huán)原子，其中1至10個是環(huán)雜原子。優(yōu)選地，每個環(huán)具有3至7個環(huán)原子，其中1至4個是環(huán)雜原子。

在這種情況下，前綴(如c3-20、c3-7、c5-6等)表示環(huán)原子的數(shù)目或環(huán)原子的數(shù)目范圍，無論是碳原子還是雜原子。例如，如本文所用的術(shù)語“c5-6雜環(huán)基”涉及具有5或6個環(huán)原子的雜環(huán)基基團。

單環(huán)雜環(huán)基基團的實例包括但不限于源自以下的那些：

n1：氮雜環(huán)丙烷(c3)、氮雜環(huán)丁烷(c4)、吡咯烷(四氫吡咯)(c5)、吡咯啉(如3-吡咯啉、2,5-二氫吡咯)(c5)、2h-吡咯或3h-吡咯(異吡咯、異唑)(c5)、哌啶(c6)、二氫吡啶(c6)、四氫吡啶(c6)、氮雜(c7)；

o1：環(huán)氧乙烷(c3)、氧雜環(huán)丁烷(c4)、氧雜環(huán)戊烷(四氫呋喃)(c5)、氧雜環(huán)戊二烯(二氫呋喃)(c5)、噁烷(四氫吡喃)(c6)、二氫吡喃(c6)、吡喃(c6)、氧雜(c7)；

s1：硫雜環(huán)丙烷(c3)、硫雜環(huán)丁烷(c4)、硫雜環(huán)戊烷(四氫噻吩)(c5)、硫雜環(huán)己烷(四氫硫代吡喃)(c6)、硫雜環(huán)庚烷(c7)；

o2：二氧雜環(huán)戊烷(c5)、二噁烷(c6)和二氧雜環(huán)庚烷(c7)；

o3：三噁烷(c6)；

n2：咪唑烷(c5)、吡唑烷(二唑烷)(c5)、咪唑啉(c5)、吡唑啉(二氫吡唑)(c5)、哌嗪(c6)；

n1o1：四氫噁唑(c5)、二氫噁唑(c5)、四氫異噁唑(c5)、二氫異噁唑(c5)、嗎啉(c6)、四氫噁嗪(c6)、二氫噁嗪(c6)、噁嗪(c6)；

n1s1：噻唑啉(c5)、噻唑烷(c5)、硫代嗎啉(c6)；

n2o1：噁二嗪(c6)；

o1s1：氧硫雜環(huán)戊二烯(c5)和氧硫雜環(huán)己烷(噻噁烷)(c6)；和，

n1o1s1：噁噻嗪(c6)。

取代的單環(huán)雜環(huán)基基團的實例包括源自以下的呈環(huán)狀形式的那些：例如，呋喃糖(c5)，諸如阿拉伯呋喃糖、來蘇呋喃糖、呋喃核糖和呋喃木糖，以及吡喃糖(c6)，諸如別吡喃糖(allopyranose)、吡喃阿草糖(altropyranose)、吡喃葡萄糖、吡喃甘露糖、吡喃古洛糖(gulopyranose)、吡喃艾杜糖(idopyranose)、吡喃半乳糖和吡喃塔羅糖(talopyranose)。

c5-20芳基：如本文所使用的術(shù)語“c5-20芳基”涉及通過從芳香族化合物的芳香族環(huán)原子去除氫原子所獲得的單價部分，該部分具有3至20個環(huán)原子。如本文所用的術(shù)語“c5-7芳基”涉及通過從芳香族化合物的芳香族環(huán)原子去除氫原子所獲得的單價部分，該部分具有5至7個環(huán)原子，并且如本文所用的術(shù)語“c5-10芳基”涉及通過從芳香族化合物的芳香族環(huán)原子去除氫原子所獲得的單價部分，該部分具有5至10個環(huán)原子。

優(yōu)選地，每個環(huán)具有5至7個環(huán)原子。

在這種情況下，前綴(如c3-20、c5-7、c5-6、c5-10等)表示環(huán)原子數(shù)或環(huán)原子數(shù)的范圍，無論是碳原子還是雜原子。例如，如本文所用的術(shù)語“c5-6芳基”涉及具有5或6個環(huán)原子的芳基基團。

環(huán)原子可為如在“碳芳基基團”中的所有碳原子。

碳芳基基團的實例包括但不限于源自以下的那些：苯(即苯基)(c6)、萘(c10)、甘菊環(huán)(c10)、蒽(c14)、菲(c14)、并四苯(c18)和芘(c16)。

包含稠環(huán)(其中至少一個稠環(huán)是芳香族環(huán))的芳基基團的實例包括但不限于源自以下的基團：二氫化茚(如2,3-二氫-1h-茚)(c9)、茚(c9)、異茚(c9)、四氫萘(1,2,3,4-四氫萘(c10)、苊(c12)、芴(c13)、非那烯(c13)、醋菲(c15)和醋蒽(c16)。

可替代地，環(huán)原子可包括如在“雜芳基基團”中的一個或多個雜原子。單環(huán)雜芳基基團的實例包括但不限于源自以下的那些：

n1：吡咯(唑)(c5)、吡啶(嗪)(c6)；

o1：呋喃(氧雜環(huán)戊二烯)(c5)；

s1：噻吩(硫雜環(huán)戊二烯)(c5)；

n1o1：噁唑(c5)、異噁唑(c5)、異噁嗪(c6)；

n2o1：噁二唑(呋咱)(c5)；

n3o1：噁三唑(c5)；

n1s1：噻唑(c5)、異噻唑(c5)；

n2：咪唑(1,3-二唑)(c5)、吡唑(1,2-二唑)(c5)、噠嗪(1,2-二嗪)(c6)、嘧啶(1,3-二嗪)(c6)(如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(c6)；

n3：三唑(c5)、三嗪(c6)；和，

n4：四唑(c5)。

包含稠環(huán)的雜芳基的實例包括但不限于：

c9(具有2個稠環(huán))源自苯并呋喃(o1)、異苯并呋喃(o1)、吲哚(n1)、異吲哚(n1)、吲嗪(n1)、二氫吲哚(n1)、二氫異吲哚(n1)、嘌呤(n4)(如腺嘌呤、鳥嘌呤)、苯并咪唑(n2)、吲唑(n2)、苯并噁唑(n1o1)、苯并異噁唑(n1o1)、苯并二氧雜環(huán)戊二烯(o2)、苯并呋咱(n2o1)、苯并三唑(n3)、苯并噻吩(s1)、苯并噻唑(n1s1)、苯并噻二唑(n2s)；

c10(具有2個稠環(huán))源自色烯(o1)、異色烯(o1)、色滿(o1)、異色滿(o1)、苯并二噁烷(o2)、喹啉(n1)、異喹啉(n1)、喹嗪(n1)、苯并噁嗪(n1o1)、苯并二嗪(n2)、吡啶并吡啶(n2)、喹喔啉(n2)、喹唑啉(n2)、噌啉(n2)、酞嗪(n2)、萘啶(n2)、蝶啶(n4)；

c11(具有2個稠環(huán))源自苯并二氮雜(n2)；

c13(具有3個稠環(huán))源自咔唑(n1)、二苯并呋喃(o1)、二苯并噻吩(s1)、咔啉(n2)、呸啶(n2)、吡啶并吲哚(n2)；和

c14(具有3個稠環(huán))源自吖啶(n1)、呫噸(o1)、噻噸(s1)、噁蒽烯(o2)、吩氧硫雜環(huán)己二烯(o1s1)、吩嗪(n2)、吩噁嗪(n1o1)、吩噻嗪(n1s1)、噻蒽烯(s2)、菲啶(n1)、鄰二氮雜菲(n2)、吩嗪(n2)。

上述基團，無論是單獨地還是另一取代基的一部分，可以本身任選地被一個或多個基團取代，所述基團選自本身和以下列出的另外的取代基。

鹵基：-f、-cl、-br和-i。

羥基：-oh。

醚：-or，其中r是醚取代基，例如c1-7烷基基團(也被稱為下文討論的c1-7烷氧基基團)、c3-20雜環(huán)基基團(也被稱為c3-20雜環(huán)基氧基基團)或c5-20芳基基團(也被稱為c5-20芳氧基基團)，優(yōu)選c1-7烷基基團。

烷氧基：-or，其中r是烷基基團，例如c1-7烷基基團。c1-7烷氧基基團的實例包括但不限于-ome(甲氧基)、-oet(乙氧基)、-o(npr)(正丙氧基)、-o(ipr)(異丙氧基)、-o(nbu)(正丁氧基)、-o(sbu)(仲丁氧基)、-o(ibu)(異丁氧基)和-o(tbu)(叔丁氧基)。

縮醛：-ch(or¹)(or²)，其中r¹和r²獨立地為縮醛取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團，或者在“環(huán)狀”縮醛基團的情況下，r¹和r²連同它們所連接的兩個氧原子和它們所連接的碳原子一起形成具有4至8個環(huán)原子的雜環(huán)環(huán)?？s醛基團的實例包括但不限于-ch(ome)2、-ch(oet)2和-ch(ome)(oet)。

半縮醛：-ch(oh)(or¹)，其中r¹是半縮醛取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。半縮醛基團的實例包括但不限于-ch(oh)(ome)和-ch(oh)(oet)。

縮酮：-cr(or¹)(or²)，其中r¹和r²如針對縮醛所定義，且r是除氫以外的縮酮取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。示例性縮酮基團包括但不限于-c(me)(ome)2、-c(me)(oet)2、-c(me)(ome)(oet)、-c(et)(ome)2、-c(et)(oet)2和-c(et)(ome)(oet)。

半縮酮：-cr(oh)(or¹)，其中r¹如針對半縮醛所定義，且r是除氫以外的半縮酮取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。半縮醛基團的實例包括但不限于-c(me)(oh)(ome)、-c(et)(oh)(ome)、-c(me)(oh)(oet)和-c(et)(oh)(oet)。

氧基(酮基，-酮)：＝o。

硫酮(thione)(硫酮(thioketone))：＝s。

亞氨基(亞胺)：＝nr，其中r是亞氨基取代基，例如氫、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選氫或c1-7烷基基團。酯基團的實例包括但不限于＝nh、＝nme、＝net和＝nph。

甲酰基(甲醛(carbaldehyde)、甲醛(carboxaldehyde))：-c(＝o)h。

?；?酮基)：-c(＝o)r，其中r是?；〈?，例如c1-7烷基基團(也被稱為c1-7烷基?；騝1-7烷?；?、c3-20雜環(huán)基基團(也被稱為c3-20雜環(huán)基?；?或c5-20芳基基團(也被稱為c5-20芳基?；?，優(yōu)選c1-7烷基基團。?；鶊F的實例包括但不限于-c(＝o)ch3(乙?；?、-c(＝o)ch2ch3(丙酰基)、-c(＝o)c(ch3)3(叔丁?；?和-c(＝o)ph(苯甲酰基，苯酮)。

羧基(羧酸)：-c(＝o)oh。

硫代羧基(硫代羧酸)：-c(＝s)sh。

硫羥羧基(硫羥羧酸)：-c(＝o)sh。

硫酮代羧基(硫酮代羧酸)：-c(＝s)oh。

亞胺酸：-c(＝nh)oh。

異羥肟酸：-c(＝noh)oh。

酯(羧酸酯(carboxylate)、羧酸酯(carboxylicacidester)、氧基羰基)：-c(＝o)or,其中r是酯取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。酯基團的實例包括但不限于-c(＝o)och3、-c(＝o)och2ch3、-c(＝o)oc(ch3)3和-c(＝o)oph。

酰氧基(反向酯)：-oc(＝o)r，其中r是酰氧基取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。

酰氧基的實例包括但不限于-oc(＝o)ch3(乙酰氧基)、-oc(＝o)ch2ch3、-oc(＝o)c(ch3)3、-oc(＝o)ph和-oc(＝o)ch2ph。

氧基羰氧基(oxycarboyloxy)：-oc(＝o)or，其中r是酯取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。酯基團的實例包括但不限于-oc(＝o)och3、-oc(＝o)och2ch3、-oc(＝o)oc(ch3)3和-oc(＝o)oph。

氨基：-nr¹r²，其中r¹和r²獨立地是氨基取代基，例如氫、c1-7烷基基團(也被稱為c1-7烷基氨基或二-c1-7烷基氨基)、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選h或c1-7烷基基團，或者，在“環(huán)狀”氨基基團的情況下，r¹和r²連同它們所連接的氮原子一起形成具有4至8個環(huán)原子的雜環(huán)環(huán)。氨基基團可以是伯(-nh2)、仲(-nhr¹)或叔(-nhr¹r²)，以及在陽離子形式中，可以是季(-⁺nr¹r²r³)。氨基基團的實例包括但不限于-nh2、-nhch3、-nhc(ch3)2、-n(ch3)2、-n(ch2ch3)2和-nhph。環(huán)狀氨基基團的實例包括但不限于氮丙啶基(aziridino)、氮雜環(huán)丁烷基(azetidino)、吡咯烷子基(pyrrolidino)、哌啶子基(piperidino)、哌嗪子基(piperazino)、嗎啉代和硫代嗎啉代。

酰氨基(氨基甲酰基、氨基甲酰、氨基羰基、甲酰胺)：-c(＝o)nr¹r²，其中r¹和r²獨立地是氨基取代基，如針對氨基基團所定義的。酰氨基基團的實例包括但不限于-c(＝o)nh2、-c(＝o)nhch3、-c(＝o)n(ch3)2、-c(＝o)nhch2ch3和-c(＝o)n(ch2ch3)2以及酰氨基基團，其中r¹和r²連同它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)結(jié)構(gòu)，如在例如哌啶子基羰基(piperidinocarbonyl)、嗎啉代羰基、硫代嗎啉代羰基和哌嗪子基羰基中。

硫代酰氨基(硫代氨基甲?；?：-c(＝s)nr¹r²，其中r¹和r²獨立地是氨基取代基，如針對氨基基團所定義的。酰氨基基團的實例包括但不限于-c(＝s)nh2、-c(＝s)nhch3、-c(＝s)n(ch3)2和-c(＝s)nhch2ch3。

酰氨基(acylamido)(?；被?acylamino))：-nr¹c(＝o)r²，其中r¹是酰胺取代基，例如氫、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選氫或c1-7烷基基團，且r²是?；〈?，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選氫或c1-7烷基基團。酰基酰胺基基團的實例包括但不限于-nhc(＝o)ch3、-nhc(＝o)ch2ch3和-nhc(＝o)ph。r¹和r²可以一起形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)如在例如，琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基和鄰苯二甲酰亞胺基中：

氨基羰氧基：-oc(＝o)nr¹r²，其中r¹和r²獨立地是氨基取代基，如針對氨基基團所定義。氨基羰氧基基團的實例包括但不限于-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nhme、-oc(＝o)nme2和-oc(＝o)net2。

脲基：-n(r¹)conr²r³，其中r²和r³獨立地是氨基取代基，如針對氨基基團所定義的，且r¹是脲基取代基，例如氫、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選氫或c1-7烷基基團。脲基基團的實例包括但不限于-nhconh2、-nhconhme、-nhconhet、-nhconme2、-nhconet2、-nmeconh2、-nmeconhme、-nmeconhet、-nmeconme2和-nmeconet2。

胍基：-nh-c(＝nh)nh2。

四唑基：具有四個氮原子和一個碳原子的五元芳香族環(huán)，

亞氨基：＝nr，其中r是亞氨基取代基，例如，如氫、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選h或c1-7烷基基團。亞氨基基團的實例包括但不限于＝nh、＝nme和＝net。

脒(脒基)：-c(＝nr)nr2，其中每個r是脒取代基，例如氫、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選h或c1-7烷基基團。脒基團的實例包括但不限于-c(＝nh)nh2、-c(＝nh)nme2和-c(＝nme)nme2。

硝基：-no2。

亞硝基：-no。

疊氮基：-n3。

氰基(腈，甲腈)：-cn。

異氰基：-nc。

氰氧基：-ocn。

異氰氧基：-nco。

硫代氰基(硫代氰氧基)：-scn。

異硫代氰基(異硫代氰氧基)：-ncs。

巰基(sulfhydryl)(硫醇、巰基(mercapto))：-sh。

硫醚(硫化物)：-sr，其中r是硫醚取代基，例如c1-7烷基基團(也被稱為c1-7烷基硫基基團)、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。c1-7烷基硫基基團的實例包括但不限于-sch3和-sch2ch3。

二硫化物：-ss-r，其中r是二硫化物取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團(在本文中被稱為c1-7烷基二硫化物)。c1-7烷基二硫化物基團的實例包括但不限于-ssch3和-ssch2ch3。

亞磺酰(sulfine)(亞磺酰基(sulfinyl)、亞砜)：-s(＝o)r，其中r是亞磺酰取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。亞磺?；鶊F的實例包括但不限于-s(＝o)ch3和-s(＝o)ch2ch3。

砜(sulfone)(磺酰基)：-s(＝o)2r，其中r為砜取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團，包括例如氟化或全氟化的c1-7烷基基團。砜基團的實例包括但不限于-s(＝o)2ch3(甲磺?；谆酋；?、-s(＝o)2cf3(三氟甲磺?；?、-s(＝o)2ch2ch3(乙磺?；?、-s(＝o)2c4f9(九氟甲磺?；?nonaflyl))、-s(＝o)2ch2cf3(三氟乙基磺?；?、-s(＝o)2ch2ch2nh2(?；酋；?、-s(＝o)2ph(苯磺酰基(phenylsulfonyl)，苯磺?；?besyl))、4-甲基苯基磺?；?甲苯磺?；?、4-氯苯基磺酰基(氯苯磺?；?closyl))、4-溴苯基磺?；?對溴苯磺?；?、4-硝基苯基(硝基苯磺?；?nosyl))、2-萘磺酸酯(萘磺?；?napsyl))和5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺?；?dansyl))。

亞磺酸(亞磺基)：-s(＝o)oh、-so2h。

磺酸(磺基)：-s(＝o)2oh、-so3h。

亞磺酸酯(sulfinate)(亞磺酸酯(sulfinicacidester))：-s(＝o)or；其中r是亞磺酸酯取代基，例如，c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。亞磺酸酯基團的實例包括但不限于-s(＝o)och3(甲氧基亞硫?；?；亞磺酸甲酯)和-s(＝o)och2ch3(乙氧基亞硫?；?；亞磺酸乙酯)。

磺酸酯(sulfonate)(磺酸酯(sulfonicacidester))：-s(＝o)2or，其中r是磺酸酯取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團?；撬狨セ鶊F的實例包括但不限于-s(＝o)2och3(甲氧基磺?；?；磺酸甲酯)和-s(＝o)2och2ch3(乙氧基磺?；?；磺酸乙酯)。

亞磺?；趸?os(＝o)r，其中r為亞磺?；趸〈?，c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。亞磺?；趸鶊F的實例包括但不限于-os(＝o)ch3和-os(＝o)ch2ch3。

磺?；趸?os(＝o)2r，其中r是磺?；趸〈鏲1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選地c1-7烷基基團?；酋；趸鶊F的實例包括但不限于-os(＝o)2ch3(甲磺酸酯)和-os(＝o)2ch2ch3(乙磺酸酯)。

硫酸酯：-os(＝o)2or；其中r是硫酸酯取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。硫酸酯基團的實例包括但不限于-os(＝o)2och3和-so(＝o)2och2ch3。

氨磺?；?sulfamyl)(氨磺酰基(sulfamoyl)；亞磺酸酰胺；亞磺酰胺)：-s(＝o)nr¹r²，其中r¹和r²獨立地為如對氨基基團所定義的氨基取代基。氨磺?；膶嵗ǖ幌抻?s(＝o)nh2、-s(＝o)nh(ch3)、-s(＝o)n(ch3)2、-s(＝o)nh(ch2ch3)、-s(＝o)n(ch2ch3)2和-s(＝o)nhph。

磺酰胺基(胺亞磺?；?sulfinamoyl)；磺酸酰胺；磺酰胺)：-s(＝o)2nr¹r²，其中r¹和r²獨立地為如對氨基基團所定義的氨基取代基?；酋０坊鶊F的實例包括但不限于-s(＝o)2nh2、-s(＝o)2nh(ch3)、-s(＝o)2n(ch3)2、-s(＝o)2nh(ch2ch3)、-s(＝o)2n(ch2ch3)2和-s(＝o)2nhph。

磺氨基(sulfamino)：-nr¹s(＝o)2oh，其中r¹為如對氨基基團所定義的氨基取代基?；前被鶊F的實例包括但不限于-nhs(＝o)2oh和-n(ch3)s(＝o)2oh。

磺酰氨基(sulfonamino)：-nr¹s(＝o)2r，其中r¹是如對氨基基團所定義的氨基取代基，并且r為磺酰氨基取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。磺酰氨基基團的實例包括但不限于-nhs(＝o)2ch3和-n(ch3)s(＝o)2c6h5。

亞磺酰氨基(sulfinamino)：-nr¹s(＝o)r，其中r¹是如對氨基基團所定義的氨基取代基，并且r是亞磺酰氨基取代基，例如c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團。亞磺酰氨基基團的實例包括但不限于-nhs(＝o)ch3和-n(ch3)s(＝o)c6h5。

膦基(膦)：-pr2，其中r為膦基取代基，例如-h、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選-h、c1-7烷基基團或c5-20芳基基團。膦基基團的實例包括但不限于-ph2、-p(ch3)2、-p(ch2ch3)2、-p(t-bu)2和-p(ph)2。

磷基：-p(＝o)2。

氧膦基(氧化膦)：-p(＝o)r2，其中r為氧膦基取代基，例如，c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選c1-7烷基基團或c5-20芳基基團。氧膦基基團的實例包括但不限于-p(＝o)(ch3)2、-p(＝o)(ch2ch3)2、-p(＝o)(t-bu)2和-p(＝o)(ph)2。

膦酸(膦?；?：-p(＝o)(oh)2。

膦酸酯(膦酰酯)：-p(＝o)(or)2，其中r為膦酸酯取代基，例如-h、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選-h、c1-7烷基基團或c5-20芳基基團。膦酸酯基團的實例包括但不限于-p(＝o)(och3)2、-p(＝o)(och2ch3)2、-p(＝o)(o-t-bu)2和-p(＝o)(oph)2。

磷酸(膦酰氧基)：-op(＝o)(oh)2。

磷酸酯(膦酰氧基酯)：-op(＝o)(or)2，其中r是磷酸酯取代基，例如，-h、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選-h、c1-7烷基基團或c5-20芳基基團。磷酸酯基團的實例包括但不限于-op(＝o)(och3)2、-op(＝o)(och2ch3)2、-op(＝o)(o-t-bu)2和-op(＝o)(oph)2。

亞磷酸：-op(oh)2。

亞磷酸酯：-op(or)2，其中r是亞磷酸酯取代基，例如-h、c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選-h、c1-7烷基基團或c5-20芳基基團。亞磷酸酯基團的實例包括但不限于-op(och3)2、-op(och2ch3)2、-op(o-t-bu)2和-op(oph)2。

亞磷酰胺：-op(or¹)-nr²2，其中r¹和r²為亞磷酰胺取代基，例如-h、(任選取代的)c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選-h、c1-7烷基基團或c5-20芳基基團。亞磷酰胺基團的實例包括但不限于-op(och2ch3)-n(ch3)2、-op(och2ch3)-n(i-pr)2和-op(och2ch2cn)-n(i-pr)2。

氨基磷酸酯：-op(＝o)(or¹)-nr²2，其中r¹和r²是氨基磷酸酯取代基，例如-h、(任選取代的)c1-7烷基基團、c3-20雜環(huán)基基團或c5-20芳基基團，優(yōu)選-h、c1-7烷基基團或c5-20芳基基團。氨基磷酸酯基團的實例包括但不限于-op(＝o)(och2ch3)-n(ch3)2、-op(＝o)(och2ch3)-n(i-pr)2和-op(＝o)(och2ch2cn)-n(i-pr)2。

亞烷基

c3-12亞烷基：如本文所用的術(shù)語“c3-12亞烷基”涉及通過從具有3至12個碳原子(除非另外指明)的烴化合物上除去兩個氫原子(兩個氫原子均來自相同碳原子或一個氫原子來自兩個不同碳原子的每一個)而獲得的二齒部分，所述烴化合物為脂肪族或脂環(huán)族的，并且其可為飽和、部分不飽和或完全不飽和。因此，術(shù)語“亞烷基”包括下文討論的亞類亞烯基、亞炔基、亞環(huán)烷基等。

直鏈飽和c3-12亞烷基基團的實例包括但不限于-(ch2)n-，其中n是3至12的整數(shù)，例如，-ch2ch2ch2-(亞丙基)、-ch2ch2ch2ch2-(亞丁基)、-ch2ch2ch2ch2ch2-(亞戊基)和-ch2ch2ch2ch-2ch2ch2ch2-(亞庚基)。

支鏈飽和c3-12亞烷基基團的實例包括但不限于-ch(ch3)ch2-、-ch(ch3)ch2ch2-、-ch(ch3)ch2ch2ch2-、-ch2ch(ch3)ch2-、-ch2ch(ch3)ch2ch2-、-ch(ch2ch3)-、-ch(ch2ch3)ch2-和-ch2ch(ch2ch3)ch2-。

直鏈部分不飽和c3-12亞烷基基團(c3-12亞烯基和亞炔基基團)的實例包括但不限于-ch＝ch-ch2-、-ch2-ch＝ch2-、-ch＝ch-ch2-ch2-、-ch＝ch-ch2-ch2-ch2-、-ch＝ch-ch＝ch-、-ch＝ch-ch＝ch-ch2-、-ch＝ch-ch＝ch-ch2-ch2-、-ch＝ch-ch2-ch＝ch-、-ch＝ch-ch2-ch2-ch＝ch-和-ch2-c≡c-ch2-。

支鏈部分不飽和c3-12亞烷基基團(c3-12亞烯基和亞炔基基團)的實例包括但不限于-c(ch3)＝ch-、-c(ch3)＝ch-ch2-、-ch＝ch-ch(ch3)-和-c≡c-ch(ch3)-。

脂環(huán)族飽和c3-12亞烷基基團(c3-12亞環(huán)烷基)的實例包括但不限于亞環(huán)戊基(如環(huán)戊-1,3-亞基)和亞環(huán)己基(如環(huán)己-1,4-亞基)。

脂環(huán)族部分不飽和c3-12亞烷基基團(c3-12亞環(huán)烷基)的實例包括但不限于亞環(huán)戊烯基(如4-環(huán)戊烯-1,3-亞基)、亞環(huán)己烯基(如2-環(huán)己烯-1,4-亞基；3-環(huán)己烯-1,2-亞基；2,5-環(huán)己二烯-1,4-亞基)。

氨基甲酸酯氮保護基：術(shù)語“氨基甲酸酯氮保護基”涉及掩蓋亞胺鍵中的氮的部分，并且這些是本領(lǐng)域熟知的。這些基團具有以下結(jié)構(gòu)：

其中r^’10是如上所定義的r。大量的適合的基團描述于greene,t.w.和wuts,g.m.,protectivegroupsinorganicsynthesis,第3版,johnwiley&sons,inc.,1999的第503頁至第549頁(其通過參考并入本文)。

縮醛胺氮保護基：術(shù)語“縮醛胺氮保護基”涉及具有以下結(jié)構(gòu)的基團：

其中r^’10是如上所定義的r。大量的適合的基團于greene,t.w.和wuts,g.m.,protectivegroupsinorganicsynthesis,第3版,johnwiley&sons,inc.,1999的第633頁至第647頁描述為酰胺保護基(其通過參考并入本文)。

基團氨基甲酸酯氮保護基和縮醛胺氮保護基可共同被稱為“用于合成的氮保護基”。

綴合物

本公開涉及包含經(jīng)由接頭單元連接至抗體的pbd化合物的綴合物。

在本公開的優(yōu)選的第一方面，接頭是如本文所述的可裂解的接頭。例如，可裂解的接頭可為胞外穩(wěn)定的，但以某個有效速率在細胞內(nèi)裂解。

在本公開的另一方面，接頭是不可裂解的接頭。不可裂解的接頭通常在胞外是穩(wěn)定的，并且在胞內(nèi)是穩(wěn)定的。示例性不可裂解的接頭包括本公開的另一方面所述的那些，諸如具有接頭l1、l2或l3的那些。不可裂解的的接頭通常對由酶作用導致的裂解耐受，并且還可對的ph(如酸或堿不穩(wěn)定)、溫度、輻射(如光不穩(wěn)定)或者還原或氧化條件的變化耐受。

在一個實施方案中，綴合物包含連接至間隔連接基團的抗體，連接至觸發(fā)劑的間隔子、連接至自分解性接頭的觸發(fā)劑及連接至pbd化合物的n10位置的自分解性接頭。此類綴合物在下文說明:

其中ab是如上所定義的抗體且pbd是如上所述的吡咯并苯并二氮雜化合物(d)。該說明顯示在本公開的某些實施方案中對應于r^l’、a、l¹和l²的部分。r^l’可為r^l1’或r^l2'。d是去除r^l1’或r^l2’的d^l。

在優(yōu)選的實施方案中，綴合物允許釋放不保留接頭的任何部分的活性pbd化合物。不存在可影響pbd化合物的反應性的短突。

接頭通過共價鍵連接抗體至pbd藥物部分d。接頭是可用于連接一個或多個藥物部分(d)和抗體單元(ab)以形成抗體-藥物綴合物(adc)的雙官能或多官能部分。接頭(r^l’)在細胞外即胞外可能是穩(wěn)定的，或其可通過酶促活性、水解或其它代謝條件可裂解?？贵w-藥物綴合物(adc)可使用具有反應官能團的接頭用于結(jié)合至藥物部分和抗體來方便地制備?？贵w(ab)的半胱氨酸硫醇或胺，如n-端或氨基酸側(cè)鏈諸如賴氨酸，可與接頭或間隔子試劑、pbd藥物部分(d)或藥物-接頭試劑(d^l、d-r^l)的官能團形成鍵，其中r^l可為r^l1或r^l2。

adc的接頭優(yōu)選地防止adc分子的聚集并使adc保持易溶于水性介質(zhì)中并呈單體狀態(tài)。

優(yōu)選地，adc的接頭在胞外是穩(wěn)定的。在轉(zhuǎn)運或遞送至細胞中之前，抗體-藥物綴合物(adc)優(yōu)選地是穩(wěn)定的，并且保持完整，即抗體保持連接至藥物部分。接頭在靶細胞外是穩(wěn)定的，且可以某個有效速率在細胞內(nèi)裂解。有效接頭將：(i)維持抗體的特異性結(jié)合性質(zhì)；(ii)允許胞內(nèi)遞送綴合物或藥物部分；(iii)保持穩(wěn)定和完整，即不裂解，直到綴合物已被遞送或轉(zhuǎn)運至其靶向位點；和(iv)維持pbd藥物部分的細胞毒性、細胞殺傷作用或細胞抑制作用。adc的穩(wěn)定性可通過標準分析技術(shù)(諸如質(zhì)譜、hplc和分離/分析技術(shù)lc/ms)測量。

抗體和藥物部分的共價連接需要接頭具有兩個反應性官能團，即在反應性意義上是二價?？捎糜谶B接兩個或更多個官能部分或生物活性部分(諸如肽、核酸、藥物、毒素、抗體、半抗原和報道基團)的二價接頭試劑是已知的，并且方法已描述了它們所得的綴合物(hermanson,g.t.(1996)bioconjugatetechniques；academicpress:newyork,第234-242頁)。

在另一個實施方案中，接頭可被調(diào)節(jié)聚集、溶解性或反應性的基團取代。例如，磺酸酯取代基可增加試劑的水溶性并促進接頭試劑與抗體或藥物部分偶聯(lián)反應，或促進ab-l與d^l的偶聯(lián)反應或者d^l-l與ab的偶聯(lián)反應，這取決于制備adc所采用的合成途徑。

在一個實施方案中，l-r^l'是基團：

其中星號指示藥物單元(d)的連接點，ab是抗體(l)，l¹是接頭，a是連接l¹至抗體的連接基團、l²是共價鍵或與-oc(＝o)-一起形成自分解性接頭，并且l¹或l²是可裂解的接頭。

l¹優(yōu)選地是可裂解的接頭，并且可被稱為用于激活接頭以裂解的觸發(fā)劑。

l¹和l²的性質(zhì)當存在時可變化很大。基于它們的裂解特征選擇這些基團，其可根據(jù)遞送綴合物的位點處的條件指示。通過酶的作用裂解的那些接頭是優(yōu)選的，盡管還可使用可通過ph(如酸或堿不穩(wěn)定)變化、溫度變化、輻射(如光不穩(wěn)定)后裂解的接頭。可在還原或氧化條件下裂解的接頭還可用于本公開中。

l¹可包含氨基酸的連續(xù)序列。氨基酸序列可為用于酶促裂解的靶底物，從而允許從n10位置釋放l-r^l'。

在一個實施方案中，l¹可通過酶作用裂解。在一個實施方案中，酶是酯酶或肽酶。

在一個實施方案中，l²是存在的且與-c(＝o)o-一起形成自分解性接頭。在一個實施方案中，l²是用于酶促活性的底物，從而允許從n10位置釋放l-r^l'。

在一個實施方案中，其中l(wèi)¹可通過酶作用裂解且l²是存在的，酶裂解l¹與l²之間的鍵。

l¹和l²當存在時可通過選自以下的鍵連接：

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-和

-nhc(＝o)nh-。

連接至l²的l¹的氨基基團可為氨基酸的n-端，或可源自氨基酸側(cè)鏈(如賴氨酸氨基酸側(cè)鏈)的氨基基團。

連接至l²的l¹的羧基基團可為氨基酸的c-端或可源自氨基酸側(cè)鏈(如谷氨酸氨基酸側(cè)鏈)的羧基基團。

連接至l²的l¹的羥基基團可源自氨基酸側(cè)鏈(如絲氨酸氨基酸側(cè)鏈)的羥基基團。

術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈”包括存在于以下的那些基團：(i)天然存在的氨基酸，諸如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；(ii)次要氨基酸，諸如鳥氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然存在的氨基酸的合成類似物和衍生物；和(iv)所有對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、同分異構(gòu)富含的、同位素標記的(如²h、³h、¹⁴c、¹⁵n)、保護形式和其外消旋混合物。

在一個實施方案中，-c(＝o)o-和l²一起形成基團：

其中星號指示與n10位置的連接點，波浪線指示與接頭l¹的連接點，y是-n(h)-、-o-、-c(＝o)n(h)-或-c(＝o)o-且n是0至3。亞苯基環(huán)被如本文所述的一個、兩個或三個取代基任選地取代。在一個實施方案中，亞苯基基團被鹵基、no2、r或or任選地取代。

在一個實施方案中，y是nh。

在一個實施方案中，n是0或1。優(yōu)選地，n是0。

其中y是nh且n是0，自分解性接頭可被稱為對氨基芐基羰基接頭(pabc)。

當激活遠端位點時，自分解性接頭將允許釋放經(jīng)保護的化合物，沿著下文顯示的線前進(對于n＝0)：

其中l(wèi)^*是接頭的剩余部分的激活形式。這些基團具有分離激活位點與被保護的化合物的優(yōu)勢。如上所述，亞苯基基團可被任選地取代。

在本文所述的一個實施方案中，基團l^*是如本文所述的接頭l¹，其可包括二肽基團。

在另一個實施方案中，-c(＝o)o-和l²一起形成選自以下的基團：

其中星號、波浪線、y和n如上所定義。每個亞苯基環(huán)被如上所述的一個、兩個或三個取代基任選地取代。在一個實施方案中，具有y取代基的亞苯基環(huán)被任選地取代且未具有y取代基的亞苯基環(huán)未被取代。在一個實施方案中，具有y取代基的亞苯基環(huán)是未取代的且不具有y取代基的亞苯基環(huán)被任選地取代。

在另一個實施方案中，-c(＝o)o-和l²一起形成選自以下的基團：

其中星號、波浪線、y和n如上所定義，e是o、s或nr，d是n、ch或cr，且f是n、ch或cr。

在一個實施方案中，d是n。

在一個實施方案中，d是ch。

在一個實施方案中，e是o或s。

在一個實施方案中，f是ch。

在一個優(yōu)選的實施方案中，接頭是組織蛋白酶不穩(wěn)定性接頭。

在一個實施方案中，l¹包含二肽。二肽可表示為-nh-x1-x2-co-，其中-nh-和-co-分別表示氨基酸基團x1和x2的n-和c-末端。二肽中的氨基酸可為天然氨基酸的任何組合。當接頭是組織蛋白酶不穩(wěn)定性接頭時，二肽可為用于組織蛋白酶-介導的裂解的作用位點。

此外，對于具有羧基或氨基側(cè)鏈官能團的那些氨基酸基團(如分別是glu和lys)，co和nh可表示此側(cè)鏈官能團。

在一個實施方案中，二肽-nh-x1-x2-co-中的基團-x1-x2-選自：

-phe-lys-、

-val-ala-、

-val-lys-、

-ala-lys-、

-val-cit-、

-phe-cit-、

-leu-cit-、

-ile-cit-、

-phe-arg-、

-trp-cit，其中

cit是瓜氨酸。

優(yōu)選地，二肽-nh-x1-x2-co-中的基團-x1-x2-選自：

-phe-lys-、

-val-ala-、

-val-lys-、

-ala-lys-、

-val-cit-。

最優(yōu)選地，二肽-nh-x1-x2-co-中的基團-x1-x2-是-phe-lys-或-val-ala-。

可使用其它二肽組合，包括由dubowchik等,bioconjugatechemistry,2002,13,855-869(其通過引用并入本文)描述的那些，其通過引用并入本文。

在一個實施方案中，在適當時氨基酸側(cè)鏈被衍生化。例如，氨基酸側(cè)鏈的氨基基團或羧基基團可被衍生化。在一個實施方案中，側(cè)鏈氨基酸(諸如賴氨酸)的氨基基團nh2是選自由nhr和nrr’組成的組的衍生化形式。

在一個實施方案中，側(cè)鏈氨基酸(諸如天冬氨酸)的羧基基團cooh是選自由coor、conh2、conhr和conrr’組成的組的衍生化形式。

在一個實施方案中，在適當時氨基酸側(cè)鏈被化學保護。側(cè)鏈保護基可為如下就基團r^l而言討論的基團。本發(fā)明人已經(jīng)確定經(jīng)保護的氨基酸序列可由酶裂解。例如，已經(jīng)確定包含boc側(cè)鏈-保護的lys殘基的二肽序列可由組織蛋白酶裂解。

氨基酸側(cè)鏈的保護基是本領(lǐng)域熟知的且描述于novabiochemcatalog中。另外的保護基策略在protectivegroupsinorganicsynthesis,greene和wuts中闡述。

以下示出了具有反應性側(cè)鏈官能團的那些氨基酸的可能的側(cè)鏈保護基：

arg：z，mtr，tos；

asn：trt，xan；

asp：bzl，t-bu；

cys：acm，bzl，bzl-ome，bzl-me，trt；

glu：bzl，t-bu；

gln：trt，xan；

his：boc，dnp，tos，trt；

lys：boc，z-cl，fmoc，z，alloc；

ser：bzl，tbdms，tbdps；

thr：bz；

trp：boc；

tyr：bzl，z，z-br。

在一個實施方案中，選擇側(cè)鏈保護與基團正交，所述基團作為封端基團或封端基團的一部分(當存在時)提供。因此，去除側(cè)鏈保護基不去除封端基團或為封端基團的一部分的任何保護基官能團。

在本公開的其它實施方案中，所選的氨基酸是不具有反應性側(cè)鏈官能團的那些。例如，氨基酸可選自：ala、gly、ile、leu、met、phe、pro和val。

在一個實施方案中，與自分解性接頭組合使用二肽。自分解性接頭可連接至-x2-。

其中自分解性接頭存在，-x2-直接連接至自分解性接頭。優(yōu)選地，基團-x2-co-連接至y，其中y是nh，從而形成基團-x2-co-nh-。

-nh-x1-直接連接至a。a可包含官能團-co-從而與-x1-形成酰胺連接。

在一個實施方案中，與-oc(＝o)-一起的l¹和l²包含基團nh-x1-x2-co-pabc-。pabc基團直接連接至n10位置。

優(yōu)選地，自分解性接頭和二肽一起形成基團-nh-phe-lys-co-nh-pabc-，其在下文中示出：

其中星號指示與n10位置的連接點且波浪線指示與接頭l¹的剩余部分的連接點或與a的連接點。優(yōu)選地，波浪線指示與a的連接點。lys氨基酸的側(cè)鏈可例如用如上所述的boc、fmoc或alloc保護。

可替代地，自分解性接頭和二肽一起形成基團-nh-val-ala-co-nh-pabc-，其在下文中示出：

其中星號和波浪線如上所定義。

可替代地，自分解性接頭和二肽一起形成基團-nh-val-cit-co-nh-pabc-，其在下文中示出：

其中星號和波浪線如上所定義。

在一個實施方案中，a是二價鍵。因此，l¹和抗體直接連接。例如，其中l(wèi)¹包含連續(xù)氨基酸序列，該序列的n-端可直接連接至抗體。

因此，其中a是共價鍵，抗體與l¹之間的連接可選自：

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh-、

-c(＝o)nhc(＝o)-、

-s-、

-s-s-、

-ch2c(＝o)-和

＝n-nh-。

連接至抗體的l¹的氨基基團可為氨基酸的n-端或可源自氨基酸側(cè)鏈(如賴氨酸氨基酸側(cè)鏈)的氨基基團。

連接至抗體的l¹的羧基基團可為氨基酸的c-端或可源自氨基酸側(cè)鏈(如谷氨酸氨基酸側(cè)鏈)的羧基基團。

連接至抗體的l¹的羥基基團可源自氨基酸側(cè)鏈(如絲氨酸氨基酸側(cè)鏈)的羥基基團。

連接至抗體的l¹的硫醇基團可源自氨基酸側(cè)鏈(如絲氨酸氨基酸側(cè)鏈)的硫醇基團。

就l¹的氨基、羧基、羥基和硫醇基團而言的以上評論也適用于抗體。

在一個實施方案中，l²與-oc(＝o)-一起表示：

其中星號指示與n10位置的連接點，波浪線指示與l¹的連接點，n是0至3，y是共價鍵或官能團，且e是例如通過酶促作用或光可活化的基團，從而產(chǎn)生自分解性單元。亞苯基環(huán)被如本文所述的一個、兩個或三個取代基進一步任選地取代。在一個實施方案中，亞苯基基團被鹵基、no2、r或or進一步任選地取代。優(yōu)選地，n是0或1，最優(yōu)選0。

選擇e使得基團易受通過光或通過酶作用激活。e可為-no2或葡萄糖醛酸。前者可易受硝基還原酶的作用，后者可易受β-葡萄糖醛酸酶的作用。

在該實施方案中，當激活e時，自分解性接頭將允許釋放經(jīng)保護的化合物，沿著下文顯示的線前進(對于n＝0)：

其中星號指示與n10位置的連接點，e^*是e的激活形式且y如上所述。這些基團具有分離激活位點與經(jīng)保護的化合物優(yōu)勢。如上所述，亞苯基基團可被任選地進一步取代。

基團y可共價鍵合至l¹。

基團y可為選自以下的官能團：

-c(＝o)-

-nh-

-o-

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh、

-c(＝o)nhc(＝o)-和

-s-。

其中l(wèi)¹是二肽，優(yōu)選的是y是-nh-或-c(＝o)-，從而在l¹與y之間形成酰胺鍵。在該實施方案中，二肽序列不需要用于酶促活性的底物。

在另一個實施方案中，a是間隔子基團。因此，l¹和抗體間接連接。

l¹和a可通過選自以下的鍵連接：

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-和

-nhc(＝o)nh-。

在一個實施方案中，基團a是：

其中星號指示與l¹的連接點，波浪線指示與抗體的連接點，且n是0至6。在一個實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a是：

其中星號指示與l¹的連接點，波浪線指示與抗體的連接點，且n是0至6。在一個實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a是：

其中星號指示與l¹的連接點，波浪線指示與抗體的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1，并且m是0至10、1至8，優(yōu)選4至8，且最優(yōu)選4或8。在另一個實施方案中，m是10至30且優(yōu)選為20至30?？商娲?，m是0至50。在該實施方案中，m優(yōu)選為10-40且n是1。

在一個實施方案中，基團a是：

其中星號指示與l¹的連接點，波浪線指示與抗體的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1，并且m是0至10、1至8，優(yōu)選4至8，且最優(yōu)選4或8。在另一個實施方案中，m是10至30且優(yōu)選為20至30。可替代地，m是0至50。在該實施方案中，m優(yōu)選為10-40且n是1。

在一個實施方案中，抗體與a之間的連接是通過抗體的硫醇殘基與a的馬來酰亞胺基團。

在一個實施方案中，抗體與a之間的連接是：

其中星號指示與a的剩余部分的連接點且波浪線指示與抗體的剩余部分的連接點。在該實施方案中，s原子通常源自抗體。

在以上的每個實施方案中，可替代的官能團可用于替代以下顯示的馬來酰亞胺來源的基團：

其中波浪線指示與如前的抗體的連接點，并且星號指示與a基團的剩余部分的鍵。

在一個實施方案中，馬來酰亞胺來源的基團被以下基團替代：

其中波浪線指示與抗體的連接點，并且星號指示與a基團的剩余部分的鍵。

在一個實施方案中，馬來酰亞胺來源的基團被任選地與抗體一起選自以下的基團取代：

-c(＝o)nh-、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh-、

-nhc(＝o)nh、

-c(＝o)nhc(＝o)-、

-s-、

-s-s-、

-ch2c(＝o)-

-c(＝o)ch2-、

＝n-nh-和

-nh-n＝。

在一個實施方案中，馬來酰亞胺來源的基團被任選地與抗體一起選自以下的基團取代：

其中波浪線指示與抗體的連接點或與a基團的剩余部分的鍵，并且星號指示與抗體的另一個連接點或與a基團的剩余部分的鍵。

其它適用于連接l¹至抗體的基團描述于wo2005/082023中。

在一個實施方案中，連接基團a存在，觸發(fā)劑l¹存在且自分解性接頭l²不存在。因此，l¹和藥物單元經(jīng)由鍵直接連接。等效地，在該實施方案中，l²是鍵。當d^l具有式ii時，這可能特別相關(guān)。

l¹和d可通過選自以下的鍵連接：

-c(＝o)n<、

-c(＝o)o-、

-nhc(＝o)-、

-oc(＝o)-、

-oc(＝o)o-、

-nhc(＝o)o-、

-oc(＝o)n<和

-nhc(＝o)n<，

其中n<或o-是d的一部分。

在一個實施方案中，l¹和d優(yōu)選地通過選自以下的鍵連接：

-c(＝o)n<，和

-nhc(＝o)-。

在一個實施方案中，l¹包含二肽且二肽的一端連接至d。如上所述，二肽中的氨基酸可為天然氨基酸和非天然氨基酸的任何組合。在一些實施方案中，二肽包含天然氨基酸。當接頭是組織蛋白酶不穩(wěn)定性接頭時，二肽是用于組織蛋白酶-介導的裂解的作用位點。然后，二肽是組織蛋白酶的識別位點。

在一個實施方案中，二肽-nh-x1-x2-co-中的基團-x1-x2-選自：

-phe-lys-、

-val-ala-、

-val-lys-、

-ala-lys-、

-val-cit-、

-phe-cit-、

-leu-cit-、

-ile-cit-、

-phe-arg-和

-trp-cit-；

其中cit是瓜氨酸。在此類二肽中，-nh-是x1的氨基基團且co是x2的羰基基團。

優(yōu)選地，二肽-nh-x1-x2-co-中的基團-x1-x2-選自：

-phe-lys-、

-val-ala-、

-val-lys-、

-ala-lys-和

-val-cit-。

最優(yōu)選地，二肽-nh-x1-x2-co-中的基團-x1-x2-是-phe-lys-或-val-ala-。

其它感興趣的二肽組合包括：

-gly-gly-、

-pro-pro-和

-val-giu-。

可使用其它二肽組合，包括上述的那些。

在一個實施方案中，l¹-d是：

其中-nh-x1-x2-co是二肽，-n<是藥物單元的一部分，星號指示與藥物單元的剩余部分的連接點，且波浪線指示與l¹的剩余部分的連接點或與a的連接點。優(yōu)選地，波浪線指示與a的連接點。

在一個實施方案中，二肽是纈氨酸-丙氨酸且l¹-d是：

其中星號、-n<和波浪線如上所定義。

在一個實施方案中，二肽是苯丙氨酸-賴氨酸且l¹-d是：

其中星號、-n<和波浪線如上所定義。

在一個實施方案中，二肽是纈氨酸-瓜氨酸。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的連接點且n是0至6。在一個實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的連接點且n是0至6。在一個實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至8，優(yōu)選為4至8，最優(yōu)選為4或8。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至7，優(yōu)選為3至7，最優(yōu)選為3或7。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的連接點，且n是0至6。在一個實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的連接點，且n是0至6。在一個實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至8，優(yōu)選為4至8，最優(yōu)選為4或8。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至8，優(yōu)選為4至8，最優(yōu)選為4或8。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，s是配體單元的硫基團，波浪線指示與配體單元的剩余部分的連接點且n是0至6。在一個實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，s是配體單元的硫基團，波浪線指示與配體單元的剩余部分的連接點且n是0至6。在一個實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a¹-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，s是配體單元的硫基團，波浪線指示與配體單元的剩余部分的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至8，優(yōu)選為4至8，最優(yōu)選為4或8。

在一個實施方案中，基團a¹-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示配體單元的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至7，優(yōu)選為4至8，最優(yōu)選為4或8。

在一個實施方案中，基團a¹-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的剩余部分的連接點，且n是0至6。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a¹-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的剩余部分的連接點，且n是0至6。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是5。

在一個實施方案中，基團a¹-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的剩余部分的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至8，優(yōu)選為4至8，最優(yōu)選為4或8。

在一個實施方案中，基團a¹-l¹是：

其中星號指示與l²或d的連接點，波浪線指示與配體單元的剩余部分的連接點，n是0或1，且m是0至30。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至8，優(yōu)選為4至8，最優(yōu)選為4或8。

基團r^l'可源自基團r^l。基團r^l可通過連接抗體至r^l的官能團轉(zhuǎn)化為基團r^l'?？刹扇∑渌襟E以轉(zhuǎn)化r^l為r^l'。這些步驟可包括去除保護基(在存在時)或安裝適當?shù)墓倌軋F。

r^l

接頭可包含含一個或多個氨基酸單元的蛋白酶-可裂解的肽部分。肽接頭試劑可通過肽化學領(lǐng)域熟知的固相或液相合成方法在自動化合成儀(諸如raininsymphony肽合成儀(raininsymphonypeptidesynthesizer)(proteintechnologies,inc.,tucson,az)或模型433(appliedbiosystems,fostercity,ca))上制備(e.和k.lübke,thepeptides,第1卷,第76-136頁(1965)academicpress)，所述方法包括t-boc化學(geiser等"automationofsolid-phasepeptidesynthesis"macromolecularsequencingandsynthesis,alanr.liss,inc.,1988,第199-218頁)和fmoc/hbtu化學(fields,g.和noble,r.(1990)"solidphasepeptidesynthesisutilizing9-fluoroenylmethoxycarbonylaminoacids",int.j.peptideproteinres.35:161-214)。

示例性氨基酸接頭包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯基丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-纈氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接頭組分的氨基酸殘基包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物(諸如瓜氨酸)。氨基酸接頭組分可針對特定酶(如，腫瘤相關(guān)的蛋白酶，組織蛋白酶b、c和d或纖維蛋白溶酶蛋白酶)進行酶促裂解的選擇性設計和優(yōu)化。

氨基酸側(cè)鏈包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物(諸如瓜氨酸)。氨基酸側(cè)鏈包括氫、甲基、異丙基、異丁基、仲丁基、芐基、對羥基芐基、-ch2oh、-ch(oh)ch3、-ch2ch2sch3、-ch2conh2、-ch2cooh、-ch2ch2conh2、-ch2ch2cooh、-(ch2)3nhc(＝nh)nh2、-(ch2)3nh2、-(ch2)3nhcoch3、-(ch2)3nhcho、-(ch2)4nhc(＝nh)nh2、-(ch2)4nh2、-(ch2)4nhcoch3、-(ch2)4nhcho、-(ch2)3nhconh2、-(ch2)4nhconh2、-ch2ch2ch(oh)ch2nh2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、環(huán)己基以及以下結(jié)構(gòu)：

當氨基酸側(cè)鏈包含除了氫之外的(甘氨酸)時，連接氨基酸側(cè)鏈的碳原子是手性的。氨基酸側(cè)鏈連接的每個碳原子獨立地呈(s)或(r)構(gòu)型或者外消旋混合物。藥物-接頭試劑可因此為對映異構(gòu)體純的、外消旋的或非對映異構(gòu)體的。

在示例性實施方案中，氨基酸側(cè)鏈選自天然或非天然氨基酸的那些，包括丙氨酸、2-氨基-2-環(huán)己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸、α,α-二甲基γ-氨基丁酸、β,β-二甲基γ-氨基丁酸、鳥氨酸和瓜氨酸(cit)。

可用于構(gòu)建具有對-氨基芐基氨基甲?；?pab)自分解性間隔子的接頭-pbd藥物部分中間體以綴合至抗體的示例性纈氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接頭試劑具有結(jié)構(gòu)：

其中q是c1-c8烷基、-o-(c1-c8烷基)、-鹵素、-no2或-cn；且m是在0-4范圍內(nèi)的整數(shù)。

具有對氨基芐基基團的示例性phe-lys(mtr)二肽接頭試劑可根據(jù)dubowchik,等(1997)tetrahedronletters,38:5257-60制備，且具有結(jié)構(gòu)：

其中mtr是單-4-甲氧基三苯甲基，q是c1-c8烷基、-o-(c1-c8烷基)、-鹵素、-no2或-cn；且m是在0-4范圍內(nèi)的整數(shù)。

“自分解性接頭”pab(對氨基芐基氧基羰基)連接藥物部分至抗體藥物綴合物中的抗體(carl等(1981)j.med.chem.24:479-480；chakravarty等(1983)j.med.chem.26:638-644；us6214345；us20030130189；us20030096743；us6759509；us20040052793；us6218519；us6835807；us6268488；us20040018194；wo98/13059；us20040052793；us6677435；us5621002；us20040121940；wo2004/032828)。除了pab之外的自分解性間隔子的其它實例包括但不限于：(i)芳香族化合物，其在電子上類似于pab基團，諸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(hay等(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237)、噻唑(us7375078)、多個延長的pab單元(degroot等(2001)j.org.chem.66:8815-8830)；和鄰或?qū)?氨基芐基縮醛；和(ii)同系的(homologated)苯乙烯基pab類似物(us7223837)。可使用在酰胺鍵水解后經(jīng)歷環(huán)化的間隔子，諸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(rodrigues等(1995)chemistrybiology2:223)、適當取代的雙環(huán)[2.2.1]和雙環(huán)[2.2.2]環(huán)系統(tǒng)(storm等(1972)j.amer.chem.soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(amsberry,等(1990)j.org.chem.55:5867)。消除在甘氨酸處被取代的含胺藥物(kingsbury等(1984)j.med.chem.27:1447)也是可用于adc中的自分解性間隔子的實例。

在一個實施方案中，纈氨酸-瓜氨酸二肽pab類似物試劑具有2,6二甲基苯基基團，并具有結(jié)構(gòu)：

可用于本公開的抗體藥物綴合物的接頭試劑包括但不限于：bmpeo、bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb，及svsb(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)和雙-馬來酰亞胺試劑：dtme、bmb、bmdb、bmh、bmoe、1,8-雙-馬來酰亞胺二乙二醇(bm(peo)2)和1,11-雙-馬來酰亞胺三乙二醇(bm(peo)3)，其可從piercebiotechnology,inc.、thermoscientific、rockford,il和其它試劑供應商商購獲得。雙-馬來酰亞胺試劑允許以連續(xù)或同時的方式連接抗體的半胱氨酸殘基的游離硫醇基團至含硫醇的藥物部分、標簽或接頭中間體。除了馬來酰亞胺之外的與抗體、pbd藥物部分或接頭中間體的硫醇基團反應的其它官能團包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯和異硫氰酸酯。

接頭試劑的其它實施方案是：n-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(spp)、n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(spdp,carlsson等(1978)biochem.j.173:723-737)、琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧基酯(smcc)、亞氨基硫雜環(huán)戊烷(it)、亞氨基酯的雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯hcl)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙-二氮鎓衍生物(諸如雙-(對二氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。有用的接頭試劑還可經(jīng)由其它商業(yè)來源(諸如molecularbiosciencesinc.(boulder,co))獲得或根據(jù)toki等(2002)j.org.chem.67:1866-1872；us6214345；wo02/088172；us2003130189；us2003096743；wo03/026577；wo03/043583；和wo04/032828中所述的程序合成。

接頭可為用于通過分支的多官能接頭部分共價連接超過一個藥物部分至抗體的樹枝狀類型接頭(us2006/116422；us2005/271615；degroot等(2003)angew.chem.int.ed.42:4490-4494；amir等(2003)angew.chem.int.ed.42:4494-4499；shamis等(2004)j.am.chem.soc.126:1726-1731；sun等(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768；king等(2002)tetrahedronletters43:1987-1990)。樹枝狀接頭可增加藥物與抗體的摩爾比，即負載，其與adc的效力相關(guān)。因此，當抗體僅攜帶一個反應性半胱氨酸硫醇基團時，大量的藥物部分可通過樹枝狀或支鏈接頭連接。

樹枝狀類型接頭的一個示例性實施方案具有結(jié)構(gòu)：

其中星號指示與pbd部分的n10位置的連接點。

r^c，封端基團

本公開的第一方面的綴合物可在n10位置(r²⁰)處具有封端基團r^c。

基團r^c可從pbd部分的n10位置去除以留下n10-c11亞胺鍵、甲醇胺、經(jīng)取代的甲醇胺，其中qr¹¹是oso3m、亞硫酸氫鹽加合物、硫代甲醇胺、經(jīng)取代的硫代甲醇胺或經(jīng)取代的甲醇胺(carbinalamine)。

在一個實施方案中，r^c可為保護基，其可去除以留下n10-c11亞胺鍵、甲醇胺、經(jīng)取代的甲醇胺，或者其中qr¹¹是oso3m、亞硫酸氫鹽加合物。在一個實施方案中，r^c是可移除以留下n10-c11亞胺鍵的保護基。

基團r^c預期在與去除基團r¹⁰所需的那些條件相同的條件下可去除，例如以產(chǎn)生n10-c11亞胺鍵、甲醇胺等。封端基團用作n10位置處的預期官能團的保護基。封端基團預期針對抗體不具有反應性。例如，r^c與r^l1’不同。

在一個實施方案中，基團r^c在裂解接頭r^l1’的條件下可去除。因此，在一個實施方案中，封端基團可通過酶作用裂解。

r^c可為n10保護基，諸如本發(fā)明人的早期申請wo00/12507中所述的那些基團。在一個實施方案中，r^c是治療上可去除的氮保護基，如本發(fā)明人的早期申請wo00/12507中所定義。

在一個實施方案中，r^c是氨基甲酸酯保護基。

在一個實施方案中，氨基甲酸酯保護基選自：

alloc、fmoc、boc、troc、teoc、psec、cbz和pnz。

任選地，氨基甲酸酯保護基另外選自moc。

在一個實施方案中，r^c是缺乏用于連接至抗體的官能團的接頭基團r^l1’。

本申請?zhí)貏e涉及那些為氨基甲酸酯的r^c基團。

在一個實施方案中，r^c是基團：

其中星號指示與n10位置的連接點，g²是終止基團，l³是共價鍵或可裂解的接頭l¹，l²是共價鍵或與oc(＝o)一起形成自分解性接頭。

當l³和l²均為共價鍵時，g²和oc(＝o)一起形成如上所定義的氨基甲酸酯保護基。

l²就r^l1’而言如上所定義。

各種終止基團在下文中描述，包括基于熟知的保護基的那些。

在一個實施方案中，l³是可裂解的接頭l¹，且l²與oc(＝o)一起形成自分解性接頭。在該實施方案中，g²是ac(乙酰基)或moc，或選自以下的氨基甲酸酯保護基：

alloc、fmoc、boc、troc、teoc、psec、cbz和pnz。

任選地，氨基甲酸酯保護基另外選自moc。

在另一個實施方案中，g²是?；鶊F-c(＝o)g³，其中g(shù)³選自烷基(包括環(huán)烷基、烯基和炔基)、雜烷基、雜環(huán)基和芳基(包括雜芳基和碳芳基)。這些基團可被任選地取代。在適當時，?；鶊F與l³或l²的氨基基團一起可形成酰胺鍵。在適當時，?；鶊F與l³或l²的羥基基團一起可形成酯鍵。

在一個實施方案中，g³是雜烷基。雜烷基基團可包含聚乙二醇。雜烷基基團可具有與?；鶊F相鄰的雜原子諸如o或n，從而在適當時與基團l³或l²中存在的雜原子在適當時形成氨基甲酸酯或碳酸酯基團。

在一個實施方案中，g³選自nh2、nhr和nrr’。優(yōu)選地，g³是nrr’。

在一個實施方案中，g²是基團：

其中星號指示與l³的連接點，n是0至6且g⁴選自oh、or、sh、sr、coor、conh2、conhr、conrr’、nh2、nhr、nrr’、no2和鹵基?；鶊Foh、sh、nh2和nhr經(jīng)保護。在一個實施方案中，n是1至6，且優(yōu)選地，n是5。在一個實施方案中，g⁴是or、sr、coor、conh2、conhr、conrr’和nrr’。在一個實施方案中，g⁴是or、sr和nrr’。優(yōu)選地，g⁴選自or和nrr’，最優(yōu)選地，g⁴是or。最優(yōu)選地，g⁴是ome。

在一個實施方案中，基團g²是：

其中星號指示與l³的連接點，并且n和g⁴如上所定義。

在一個實施方案中，基團g²是：

其中星號指示與l³的連接點，n是0或1，m是0至50且g⁴選自oh、or、sh、sr、coor、conh2、conhr、conrr’、nh2、nhr、nrr’、no2和鹵基。在一個優(yōu)選的實施方案中，n是1且m是0至10、1至2，優(yōu)選4至8，且最優(yōu)選4或8。在另一個實施方案中，n是1且m是10至50，優(yōu)選20至40?；鶊Foh、sh、nh2和nhr經(jīng)保護。在一個實施方案中，g⁴是or、sr、coor、conh2、conhr、conrr’和nrr’。在一個實施方案中，g⁴是or、sr和nrr’。優(yōu)選地，g⁴選自or和nrr’，最優(yōu)選地，g⁴是or。

優(yōu)選地，g⁴是ome。

在一個實施方案中，基團g²是：

其中星號指示與l³的連接點，且n、m和g⁴如上所定義。

在一個實施方案中，基團g²是：

其中n是1-20，m是0-6且g⁴選自oh、or、sh、sr、coor、conh2、conhr、conrr’、nh2、nhr、nrr’、no2和鹵基。在一個實施方案中，n是1-10。在另一個實施方案中，n是10至50，優(yōu)選20至40。在一個實施方案中，n是1。在一個實施方案中，m是1?；鶊Foh、sh、nh2和nhr經(jīng)保護。在一個實施方案中，g⁴是or、sr、coor、conh2、conhr、conrr’和nrr’。在一個實施方案中，g⁴是or、sr和nrr’。優(yōu)選地，g⁴選自or和nrr’，最優(yōu)選地，g⁴是or。

優(yōu)選地，g⁴是ome。

在一個實施方案中，基團g²是：

其中星號指示與l³的連接點，且n、m和g⁴如上所定義。

在以上的每一個實施方案中，g⁴可為oh、sh、nh2和nhr。這些基團優(yōu)選地經(jīng)保護。

在一個實施方案中，oh用bzl、tbdms或tbdps保護。

在一個實施方案中，sh用acm、bzl、bzl-ome、bzl-me或trt保護。

在一個實施方案中，nh2或nhr用boc、moc、z-ci、fmoc、z或alloc保護。

在一個實施方案中，基團g²與基團l³組合存在，所述基團是二肽。

封端基團并非預期連接至抗體。因此，二聚體中存在的另一種單體用作經(jīng)由接頭與抗體的連接點。

因此，優(yōu)選的是封端基團中存在的官能團不可用于與抗體反應。因此，反應性官能團諸如oh、sh、nh2、cooh優(yōu)選地被避免。然而，如上所述，此類官能團可存在于封端基團(如果經(jīng)保護)中。

實施方案

在一些實施方案中，d^l選自包括以下的組：

綴合物a

綴合物b

綴合物c:

綴合物d

和

綴合物e:

載藥量

載藥量是每抗體的pbd藥物的平均數(shù)，如抗體。當本公開的化合物結(jié)合至半胱氨酸時，載藥量的范圍可為每抗體1至8個藥物(d^l)，即其中1、2、3、4、5、6、7和8個藥物部分共價連接至抗體。綴合物的組合物包括與多種(1至8種)藥物綴合的抗體的集合。當本公開的化合物結(jié)合至賴氨酸時，載藥量的范圍可為每抗體1至20個藥物(d^l)，盡管可能優(yōu)選10或8個的上限。綴合物的組合物包括與多種(1至20種、1至10種或1至8種)藥物綴合的抗體的集合。

在從綴合物反應制備adc中每抗體藥物的平均數(shù)可能特征在于常規(guī)方法，諸如uv、反相hplc、hic、質(zhì)譜、elisa測定和電泳。也可以根據(jù)p確定adc的數(shù)量分布。通過elisa，可確定adc的特定制備中p的平均值(hamblett等(2004)clin.cancerres.10:7063-7070；sanderson等(2005)clin.cancerres.11:843-852)。然而，p(藥物)值的分布不可通過抗體-抗原結(jié)合和elisa的檢測限辨別。此外，用于檢測抗體-藥物綴合物的elisa測定不確定在何處藥物部分連接至抗體，諸如重鏈或輕鏈片段或特定的氨基酸殘基。在一些情況下，同質(zhì)adc(其中p是來自具有其它載藥量的adc的某一個值)的分離、純化和表征可通過諸如反相hplc或電泳的方法實現(xiàn)。此類技術(shù)也可適用于其它類型的綴合物。

對于一些抗體-藥物綴合物，p可受到抗體上多個連接位點的限制。例如，抗體僅可具有一個或若干個半胱氨酸硫醇基團，或僅可具有一個或多個具有足夠反應性的硫醇基團，通過所述基團可連接接頭。較高載藥量(如p>5)可能導致聚集、不溶性、毒性或喪失某些抗體-藥物綴合物的細胞滲透性。

通常，在綴合反應期間少于理論最大值的藥物部分綴合至抗體?？贵w可含有例如不與藥物-接頭中間體(d-l)或接頭試劑反應的許多賴氨酸殘基。僅最具有反應性的賴氨酸基團可與胺-反應性接頭試劑反應。此外，僅最具有反應性的半胱氨酸硫醇基團可與硫醇-反應性接頭試劑反應。通常，抗體不含許多(如果存在)可連接至藥物部分的游離且具有反應性的半胱氨酸硫醇基團。該化合物的抗體中的大部分半胱氨酸硫醇殘基作為二硫橋存在且必須在部分或完全還原條件下用還原劑(諸如二硫蘇糖醇(dtt)或tcep)還原。adc的載量(藥物/抗體比)可以若干種不同的方式控制，包括：(i)限制藥物-接頭中間體(d-l)或接頭試劑相對于抗體的摩爾過量，(ii)限制綴合反應時間或溫度，和(iii)部分或限制半胱氨酸硫醇修飾的還原條件。

某些抗體具有可還原的鏈間二硫化物，即半胱氨酸橋?？贵w可通過用諸如dtt(二硫蘇糖醇)的還原劑處理制備為對于與接頭試劑綴合有反應性。理論上，每個半胱氨酸橋?qū)⒁虼诵纬蓛蓚€反應性硫醇親核體?？梢酝ㄟ^使賴氨酸與2-亞胺硫雜環(huán)戊烷(特勞特試劑(traut’sreagent))反應，將另外的親核基團引入抗體，導致胺轉(zhuǎn)化為硫醇。也可以通過工程化一個、兩個、三個、四個或更多個半胱氨酸殘基(如，制備包含一個或多個非天然半胱氨酸氨基酸殘基的變體抗體)將反應性硫醇基團引入抗體(或其片段)。us7521541教導通過引入反應性半胱氨酸氨基酸來工程化抗體。

半胱氨酸氨基酸可在抗體中的反應性位點處工程且不形成鏈內(nèi)或分子間二硫鍵(junutula,等,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932；dornan等(2009)blood114(13):2721-2729；us7521541；us7723485；wo2009/052249)。經(jīng)工程化的半胱氨酸硫醇可與本公開的含具有硫醇反應性親電基團(諸如馬來酰亞胺或α-鹵代酰胺)的接頭試劑或藥物-接頭試劑反應以形成具有半胱氨酸工程化的抗體和pbd藥物部分的adc。藥物部分的位置可因此經(jīng)設計、控制并知曉。可控制載藥量，因為經(jīng)工程化的半胱氨酸硫醇基團通常與高產(chǎn)率的硫醇-反應性接頭試劑或藥物-接頭試劑反應。工程化igg抗體以通過重鏈或輕鏈上的單個位點處取代引入半胱氨酸氨基酸，得到在對稱抗體上的兩個新的半胱氨酸。接近2的載藥量可用綴合產(chǎn)物adc的近乎同質(zhì)實現(xiàn)。

可替代地，如axup等((2012),procnatlacadsciusa.109(40)：16101-16116)所述，位點特異性綴合可通過工程化抗體以在它們的重鏈和/或輕鏈中含有非天然氨基酸實現(xiàn)。非天然氨基酸提供另外的優(yōu)勢：正交化學物質(zhì)可經(jīng)設計以連接接頭試劑和藥物。

如果抗體的不止一個親核基團或親電基團與藥物-接頭中間體或接頭試劑、之后與藥物部分試劑反應，那么所得產(chǎn)物是adc化合物與連接至抗體的藥物部分的分布(抗體,如1、2、3等)的混合物。液相色譜法諸如聚合反相(plrp)和疏水相互作用(hic)可通過載藥量值分離混合物中的化合物?？煞蛛x具有單一載藥量值(p)的adc的制劑，然而這些單一載量值adc可能仍為異質(zhì)混合物，因為藥物部分可經(jīng)由接頭連接在抗體上的不同位點處。

因此，本公開的抗體-藥物綴合物組合物包括抗體-藥物綴合物化合物的混合物，其中抗體具有一個或多個pbd藥物部分且其中藥物部分可在各個氨基酸殘基處連接至抗體。

在一個實施方案中，每抗體的二聚體吡咯并苯并二氮雜基團的平均數(shù)在1至20的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，范圍選自1至8、2至8、2至6、2至4和4至8。

在一些實施方案中，每抗體存在一個二聚體吡咯并苯并二氮雜基團。

包括其它形式

除非另外說明，否則上文包括這些取代基的熟知的離子、鹽、溶劑合物和受保護形式。例如，提到羥酸(-cooh)還包括其陰離子(羧酸根)形式(-coo^-)、鹽或溶劑合物以及常規(guī)受保護形式。類似地，提到氨基基團包括氨基基團的質(zhì)子化形式(-n⁺hr¹r²)、鹽或溶劑合物，例如鹽酸鹽，以及氨基基團的常規(guī)受保護形式。類似地，提到羧基基團還包括其陰離子形式(-o^-)、鹽或溶劑合物，以及常規(guī)受保護形式。

鹽

制備、純化和/或處理活性化合物的相應鹽，例如藥學上可接受的鹽可能是方便或理想的。藥學上可接受的鹽的實例討論于berge,等,j.pharm.sci.,66,1-19(1977)中。

例如，如果化合物為陰離子或具有可為陰離子的官能團(如，-cooh可為-coo^-)，那么鹽可用合適的陽離子形成。適合的無機陽離子的實例包括但不限于堿金屬離子諸如na⁺和k⁺、堿土陽離子諸如ca²⁺和mg²⁺以及其它陽離子如al⁺³。適合的有機陽離子的實例包括但不限于銨離子(即，nh4⁺)和取代的銨離子(如nh3r⁺、nh2r2⁺、nhr3⁺、nr4⁺)。一些適合的取代銨離子的實例為源自以下的那些：乙胺、二乙胺、二環(huán)己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、芐胺、苯基芐胺、膽堿、葡甲胺和氨基丁三醇以及氨基酸諸如賴氨酸和精氨酸。常見季銨離子的實例為n(ch3)4⁺。

如果化合物為陽離子或具有可為陽離子的官能團(如，-nh2可為-nh3⁺)，那么鹽可用適合的陰離子形成。適合的無機陰離子的實例包括但不限于源自以下無機酸的那些：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、磷酸和亞磷酸。

適合的有機陰離子的實例包括但不限于源自以下有機酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、依地酸、乙二磺酸、乙磺酸、富馬酸、葡萄庚酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羥基馬來酸、羥基萘羧基、羥基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來酸、蘋果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕櫚酸、帕莫酸、泛酸、苯基乙酸、苯基磺酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、對氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸和戊酸。

適合的聚合有機陰離子的實例包括但不限于源自以下聚合酸的那些：鞣酸、羧甲基纖維素。

溶劑合物

可方便或可期望制備、純化和/或處理活性化合物的相應溶劑合物。本文在常規(guī)意義上使用的術(shù)語“溶劑合物”是指溶質(zhì)(如活性化合物、活性化合物的鹽)和溶劑的復合物。如果溶劑為水，那么溶劑合物可合宜地指水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。

本公開包括其中溶劑添加跨越pbd部分的亞胺鍵的化合物，其在下文中說明，其中溶劑是水或醇(r^aoh，其中r^a是c1-4烷基)：

這些形式可被稱為pbd的甲醇胺和甲醇胺醚形式(如在涉及上述的r¹⁰的章節(jié)中描述)。這些平衡狀態(tài)的平衡取決于化合物存在的條件以及部分本身的性質(zhì)。

這些特定的化合物可例如通過凍干以固體形式分離。

異構(gòu)體

本公開的某些化合物可以一種或多種特定的幾何形式、光學形式、對映異構(gòu)形式、非對映異構(gòu)形式、差向異構(gòu)形式、阿托異構(gòu)(atropic)形式、立體異構(gòu)形式、互變異構(gòu)形式、構(gòu)象形式或異頭形式存在，包括但不限于順式(cis)形式和反式(trans)形式；e-形式和z-形式；c-形式、t-形式和r-形式；內(nèi)向形式和外向形式；r-形式、s-形式和內(nèi)消旋形式；d-形式和l-形式；d-形式和l-形式；(+)形式和(-)形式；酮基形式、烯醇形式和烯醇化物形式；順(syn)形式和反(anti)形式；向斜形式和背斜形式；α-形式和β-形式；軸向形式和平伏形式；船式、椅式、扭轉(zhuǎn)式、信封式和半椅式；及其組合，在下文中總稱為“異構(gòu)體”(“異構(gòu)體形式”)。

術(shù)語“手性”是指具有鏡像伴侶的不可重疊(non-superimposability)特性的分子，而術(shù)語“非手性”是指在其鏡像伴侶上可重疊的分子。

術(shù)語“立體異構(gòu)體”是指具有相同化學組成，但是關(guān)于原子或基團在空間上的排列不同的化合物。

“非對映異構(gòu)體”是指具有兩個或更多個手性中心并且其分子不是彼此的鏡像的立體異構(gòu)體。非對映異構(gòu)體具有不同的物理特性，如熔點、沸點、光譜特性和反應性?？稍诟叻直媛史治龀绦?諸如電泳和色譜)下可分離非對映異構(gòu)體的混合物。

“對映異構(gòu)體”是指化合物的彼此為不可重疊的鏡像的兩個立體異構(gòu)體。

本文使用的立體化學定義和慣例一般遵循s.p.parker,編輯,mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；及eliel,e.和wilen,s.,“stereochemistryoforganiccompounds”,johnwiley&sons,inc.,newyork,1994。本公開的化合物可含有不對稱中心或手性中心，且因此以不同的立體異構(gòu)形式存在。預期包括但不限于非對映異構(gòu)體、對映異構(gòu)體和阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體以及其混合物例如外消旋混合物的本公開的化合物的所有立體異構(gòu)形式，形成本公開的一部分。許多有機化合物以光學活性形式存在，即它們能夠旋轉(zhuǎn)平面偏振光的平面。在描述光學活性化合物時，前綴d和l，或r和s，用于表示分子關(guān)于其手性中心的絕對構(gòu)型。前綴d和l或(+)和(-)用于表示化合物的平面偏振光的旋轉(zhuǎn)標記，其中用(-)或l表示化合物是左旋的。具有(+)或d前綴的化合物是右旋的。對于給定的化學結(jié)構(gòu)，這些立體異構(gòu)體是相同的，不同之處在于它們?yōu)楸舜说溺R像。還可以將特定的立體異構(gòu)體稱為對映異構(gòu)體，以及此類異構(gòu)體的混合物經(jīng)常被稱為對映異構(gòu)體混合物。50:50的對映異構(gòu)體混合物被稱為外消旋混合物或外消旋物，其可以出現(xiàn)在化學反應或過程中一直沒有立體選擇性或立體特異性的情況下。術(shù)語“外消旋混合物”和“外消旋物”是指兩種沒有光學活性的對映異構(gòu)體種類的等摩爾混合物。

應注意，除了如下對于互變異構(gòu)體形式所討論，確切地從如本文所使用的術(shù)語“異構(gòu)體”中排除的是結(jié)構(gòu)(或構(gòu)成)異構(gòu)體(即原子之間的連接不同的異構(gòu)體，而不是僅原子在空間中的位置不同)。例如，提到甲氧基-och3不被解釋為提到其結(jié)構(gòu)異構(gòu)體羥甲基基團-ch2oh。類似地，提到鄰-氯苯基不被解釋為提到其結(jié)構(gòu)異構(gòu)體間-氯苯基。然而，提到一類結(jié)構(gòu)很可能包括在所述種類內(nèi)的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體形式(如c1-7烷基包括正丙基和異丙基；丁基包括正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧基苯基包括鄰-甲氧基苯基、間-甲氧基苯基和對-甲氧基苯基)。

以上排除不涉及互變異構(gòu)體形式，例如酮基形式、烯醇形式和烯醇化物形式，例如如在以下互變異構(gòu)體對中：酮/烯醇(以下說明)、亞胺/烯胺、酰胺/亞氨基醇、脒/脒、亞硝基/肟、硫酮/烯硫醇、n-亞硝基/羥基偶氮基和硝基/異硝基。

術(shù)語“互變異構(gòu)體”或“互變異構(gòu)形式”是指可經(jīng)由低能量屏障來互相轉(zhuǎn)化的不同能量的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。例如，質(zhì)子互變異構(gòu)體(也稱為質(zhì)子移變互變異構(gòu)體)包括經(jīng)由質(zhì)子遷移的互相轉(zhuǎn)化，諸如酮-烯醇和亞胺-烯胺異構(gòu)化。原子價互變異構(gòu)體包括通過使一些鍵合電子重組來互相轉(zhuǎn)化。

注意，確切地包括在術(shù)語“異構(gòu)體”中的是具有一個或多個同位素取代的化合物。例如，h可處于任何同位素形式，包括¹h、²h(d)和³h(t)；c可處于任何同位素形式，包括¹²c、¹³c和¹⁴c；o可處于任何同位素形式，包括¹⁶o和¹⁸o；等。

可以并入本公開的化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，諸如但不限于²h(氘，d)、³h(氚)、¹¹c、¹³c、¹⁴c、¹⁵n、¹⁸f、³¹p、³²p、³⁵s、³⁶cl和¹²⁵i。本公開的各種同位素標記的化合物，例如摻入放射性同位素(諸如3h、13c和14c)的那些。此類經(jīng)同位素標記的化合物可用于代謝研究、反應動力學研究、檢測或成像技術(shù)，諸如正電子發(fā)射斷層掃描(pet)或單光子發(fā)射計算機斷層掃描(spect)，包括藥物或物質(zhì)組織分布測定，或患者的放射性治療中。本公開的氘標記或取代的治療性化合物可具有與分布、代謝和分泌(adme)相關(guān)的改善的dmpk(藥物代謝和藥代動力學)性質(zhì)。用更重的同位素諸如氘取代可提供由更佳的代謝穩(wěn)定性產(chǎn)生的某些治療優(yōu)勢(如體內(nèi)半衰期增加或劑量需求減少)。18f標記的化合物可用于pet或spect研究。本公開的同位素標記的化合物及其前藥可通常通過進行方案或?qū)嵤├泄_的程序制備，和如下所述通過取代容易獲得的同位素標記的試劑非同位素標記的試劑制備。此外，用更重的同位素(特別是氘(即2h或d))取代可提供由更佳的代謝穩(wěn)定性產(chǎn)生的某些治療優(yōu)勢，例如體內(nèi)半衰期增加或劑量需求減少或治療指數(shù)改善。應理解，在該背景中，氘被認為是取代基。此類更重的同位素(特別是氘)的濃度可被同位素濃集系數(shù)定義。在本公開的化合物，不特別指定為特定同位素的任何原子意在表示此原子的任何穩(wěn)定的同位素。

除非另外說明，否則提到具體化合物包括所有所述異構(gòu)體形式，包括(全部或部分)其外消旋混合物和其它混合物。用于制備(如不對稱合成)和分離(如分級結(jié)晶和色譜手段)此類異構(gòu)體形式的方法為本領(lǐng)域中已知的或通過以已知的方式調(diào)整本文所教導的方法或已知的方法而容易獲得。

生物活性

體外細胞增殖測定

通常，抗體-藥物綴合物(adc)的細胞毒性或細胞抑制活性可通過以下測量或確認：在細胞培養(yǎng)基中暴露哺乳動物細胞(包括具有和缺乏受體蛋白質(zhì)的那兩個)至adc的抗體；培養(yǎng)細胞持續(xù)約6個小時至約5天的時間段；并且測量細胞活力?；诩毎捏w外測定用于測量本公開的adc的活力(增殖)、細胞毒性和誘導凋亡(半胱天冬酶活化)。

抗體-藥物綴合物的體外效力可通過細胞增殖測定測量。celltiter-發(fā)光細胞存活力測定(celltiter-luminescentcellviabilityassay)可商購獲得(promegacorp.,madison,wi)，基于鞘翅目(coleoptera)熒光素酶的重組表達的同質(zhì)測定方法(美國專利no.5583024；5674713和5700670)。該細胞增殖測定基于存在的atp的定量(代謝活性細胞的指標)測定了培養(yǎng)中的活細胞的數(shù)目(crouch等(1993)j.immunol.meth.160:81-88；us6602677)。以96孔格式進行celltiter-測定，使得其適用于自動高通量篩選(hts)(cree等(1995)anticancerdrugs6:398-404)。同質(zhì)測定程序涉及向于補充有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞直接添加單一試劑(celltiter-試劑)。不需要細胞洗滌、去除培養(yǎng)基和多次吹打步驟。該系統(tǒng)在10分鐘內(nèi)在添加試劑和混合后以384-孔形式檢測少至15個細胞/孔?？捎胊dc連續(xù)處理細胞，或可處理它們并與adc分離。通常，經(jīng)簡單處理(即3小時)的細胞相似與連續(xù)處理的細胞相同的效力作用。

同質(zhì)“加入-混合-測量(add-mix-measure)”模式導致細胞裂解并產(chǎn)生與存在的atp的量成比例的熒光信號。atp的量與在培養(yǎng)物中存在的細胞數(shù)成正比。celltiter-測定產(chǎn)生“輝光型”熒光信號(由熒光素酶反應產(chǎn)生)，其具有通常大于五小時的半衰期，這取決于細胞類型和所使用的培養(yǎng)基。活細胞以相對熒光單位(rlu)反映。底物，甲蟲熒光素，通過重組的螢火蟲熒光素酶氧化地脫羧，伴隨的是atp轉(zhuǎn)化為amp并且產(chǎn)生光子。

抗體-藥物綴合物的體外效力還可通過細胞毒性測定測量。將培養(yǎng)的粘附細胞用pbs洗滌、用胰蛋白酶脫附、在含10％fcs的完全培養(yǎng)基中稀釋、離心、重懸浮于新鮮培養(yǎng)基中并用血球計計數(shù)。將懸浮液培養(yǎng)物直接計數(shù)。適用于計數(shù)的單分散細胞懸浮液可需要通過重復吸取攪動懸浮液以打碎細胞團。

將細胞懸浮液稀釋至所需的接種密度，并分配(100μl/孔)至黑色96孔板中。將粘附的細胞系的板孵育過夜以允許粘附。懸浮細胞培養(yǎng)可以在接種當天使用。

在適當?shù)募毎囵B(yǎng)基中制備adc(20μg/ml)的原液(1ml)。通過連續(xù)轉(zhuǎn)移100μl至900μl的細胞培養(yǎng)基在15ml離心管中制備連續(xù)10倍稀釋的儲存adc。

將每個adc稀釋液(100μl)的四個重復孔分配在預先鋪有細胞懸浮液(100μl)的96孔黑板中，導致終體積為200μl。對照孔接受細胞培養(yǎng)基(100μl)。

如果細胞系的倍增時間大于30小時，則adc孵育5天，否則進行四天孵育。

在孵育期結(jié)束時，用阿拉瑪藍(alamarblue)測定評估細胞活力。將阿拉瑪藍(invitrogen)分配在整個板上(每孔20μl)并孵育4小時。在570nm激發(fā)下在585nm發(fā)射下在varioskan閃光讀板儀上測量阿拉瑪藍熒光。百分比細胞存活率是由adc處理的孔中的平均熒光與對照孔中的平均熒光相比計算出的。

用途

本公開的綴合物可用于在靶位置處提供pbd化合物。

靶位置優(yōu)選為增殖細胞群?？贵w是增殖細胞群上存在的抗原(本文，cd25)的抗體。然而，如本文所解釋，在本公開的實踐中，在至少一些細胞中，在靶位置(通常贅生物)處，抗原不存在或以顯著量存在于細胞表面上。例如，在靶贅生物中，僅如少于80、70、60、50、30、20％、10％或5％的細胞可為陽性的。

靶贅生物或贅生性細胞可為實體腫瘤的所有或一部分。

本文的“實體瘤”將被理解為包括實體血液學癌癥，諸如淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin’slymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma))，其在下文中更詳細地討論。

其它實體瘤可為贅生物，包括被cd-25陽性t-細胞浸潤的非-血液學癌癥。

靶贅生物或贅生性細胞可為惡性的。

靶贅生物或贅生性細胞可為轉(zhuǎn)移性的。

在靶位置處，接頭可經(jīng)裂解以釋放化合物rela、relb、relc、reld或rele。因此，綴合物可用于選擇性提供化合物rela、relb、relc、reld或rele至靶位置。

接頭可被存在于靶位置的酶裂解。

靶位置可為體外、體內(nèi)或離體。

本公開的抗體-藥物綴合物(adc)化合物包括具有抗癌活性用途的那些。特別地，該化合物包括綴合至(即由接頭共價連接)至pbd藥物部分(即毒素)的抗體。當藥物不綴合至抗體時，pbd藥物具有細胞毒性作用。pbd藥物部分的生物活性因此通過綴合至抗體調(diào)節(jié)。公開的抗體-藥物綴合物(adc)選擇性遞送有效劑量的細胞毒性劑至腫瘤組織，從而可獲得更佳的選擇性，即更低的有效劑量。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地能夠確定候選綴合物是否治療任何特定細胞類型的增生性疾患。例如，可以方便地用于評估由特定化合物提供的活性的測定在下面的實施例中描述。

術(shù)語“增生性疾病”涉及不需要的或不受控制的過量或異常細胞的細胞增殖，其是不期望的，諸如贅生性或過度生長，無論是體外還是體內(nèi)。

增生性疾患的實例包括但不限于良性、惡性前和惡性細胞增殖，包括但不限于贅生物和腫瘤(如組織細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、骨瘤)、癌癥(如肺癌、小細胞肺癌、胃腸癌、腸癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤(kaposi'ssarcoma)、黑素瘤)、淋巴瘤、白血病、銀屑病、骨病、(如結(jié)締組織的)纖維增生性病癥和動脈粥樣硬化。特別感興趣的癌癥包括但不限于白血病和卵巢癌。

可以治療任何類型的細胞，包括但不限于肺、胃腸(包括，如腸、結(jié)腸)、乳房(乳腺)、卵巢、前列腺、肝(肝的)、腎(腎的)、膀胱、胰腺、腦和皮膚。

特別感興趣的病癥包括但不限于霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，包括彌漫性大b細胞淋巴瘤(dlbcl)、濾泡淋巴瘤(fl)、套細胞淋巴瘤(mcl)、慢性淋巴細胞性淋巴瘤(cll)和白血病，諸如毛細胞性白血病(hcl)、毛細胞性白血病變體(hcl-v)、急性骨髓性白血病(aml)和急性成淋巴細胞性白血病(all)，諸如費城染色體陽性all(ph+all)或費城染色體陰性all(ph-all)[fieldinga.,haematologica.2010年1月；95(1):8-12]，

優(yōu)選的血液學靶包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，后者選自外周t細胞淋巴瘤；皮膚t細胞淋巴瘤；濾泡淋巴瘤(fl)、dlblc、套細胞淋巴瘤(mcl)和cll，

如上所述，其他實體瘤可以是被cd-25陽性t-細胞浸潤的贅生物，包括非-血液學癌癥。

預期本公開的抗體-藥物綴合物(adc)可用于治療各種疾病或病癥，如特征在于腫瘤抗原的過表達。示例性疾患或過度增生性病癥包括良性或惡性腫瘤；白血病、血液學惡性腫瘤和淋巴樣惡性腫瘤。其它包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、下丘腦、腺體、巨噬細胞、上皮、基質(zhì)、囊胚腔、炎性、血管生成和免疫學，包括自身免疫病癥和移植物抗宿主病(gvhd)。

通常，待治療的疾病或病癥是過度增生性疾病，諸如癌癥。本文中待治療的癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體的實例包括鱗狀細胞癌(如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌)、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌或胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃腸癌)、胰腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌或腎癌(kidneyorrenalcancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌以及頭頸癌。

adc化合物可用于治療的自身免疫性疾病包括風濕病(諸如，例如類風濕關(guān)節(jié)炎、舍格倫綜合征(syndrome)、硬皮病、狼瘡(諸如sle合狼瘡性腎炎)、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血癥、抗磷脂抗體綜合征和銀屑病性關(guān)節(jié)炎)、骨關(guān)節(jié)炎、自身免疫性胃腸和肝臟病癥(諸如，例如炎性腸病(如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病(crohn'sdisease))、自身免疫性胃炎和惡性貧血、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎和乳糜瀉)、血管炎(諸如，例如，anca相關(guān)的血管炎，包括丘-施二氏血管炎(churg-straussvasculitis)，韋格納肉芽腫病(wegener'sgranulomatosis)和多發(fā)性動脈炎)、自身免疫性神經(jīng)障礙(諸如，例如，多發(fā)性硬化癥、囊性肌陣攣綜合征、重癥肌無力、眼神經(jīng)性脊髓炎、帕金森病(parkinson’sdisease)、阿爾茨海默氏病(alzheimer’sdisease)和自身免疫性多發(fā)性神經(jīng)病)、腎臟病癥(諸如，例如腎小球性腎炎、古德帕斯特綜合征(goodpasture’ssyndrome)和伯杰氏病(berger’sdisease))、自身免疫性皮膚病(諸如，例如，銀屑病、蕁麻疹、麻疹、尋常天皰瘡、大皰性類天皰瘡和天皮膚紅斑狼瘡(諸如，例如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血后紫癜和自身免疫性溶血性貧血)、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自身免疫性聽力疾病(諸如，例如，內(nèi)耳疾病和聽力損失)、貝切特氏病(behcet'sdisease)、雷諾綜合征(raynaud'ssyndrome)、器官移植、移植物抗宿主病(gvhd)和自身免疫性內(nèi)分泌障礙(諸如，例如糖尿病相關(guān)的自身免疫疾病，諸如胰島素依賴性糖尿病(iddm)、愛迪生病(addison’sdisease)和自身免疫性甲狀腺疾病(如，格雷夫斯病(graves’disease)和甲狀腺炎))。更優(yōu)選地，此類疾病包括例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、anca相關(guān)的血管炎、狼瘡、多發(fā)性硬化、舍格倫綜合征、格雷夫斯病、iddm、惡性貧血、甲狀腺炎和腎小球性腎炎。

治療方法

本公開的綴合物可用于治療方法中。還提供了治療方法，其包括向需要治療的受試者施用治療有效量的本公開的綴合物化合物。術(shù)語“治療有效量”是足以顯示對患者的益處的量。此類益處可能至少改善至少一種癥狀。施用的實際量，以及施用的速度和時程將取決于所治療的性質(zhì)和嚴重程度。治療處方，如劑量的決定，由全科醫(yī)生和其它醫(yī)師負責。

本公開的化合物可以單獨施用或與其它治療組合同時或依序施用，著取決于待治療的疾患。治療和療法的實例包括但不限于化療(包括藥物、諸如化療藥物的活性物質(zhì)的施用)；手術(shù)；和放射療法。

“化療劑”是用于治療癌癥的化合物，不論其作用機理如何?；焺┑念悇e包括但不限于：烷基化劑、抗代謝物、紡錘毒植物生物堿、細胞毒性/抗腫瘤抗生素、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、抗體、光敏劑和激酶抑制劑?；焺┌ㄓ糜凇鞍邢虔煼ā焙统Ｒ?guī)化療的化合物。

化學治療劑的實例包括：厄洛替尼(genentech/osipharm.)、多西他賽(sanofi-aventis)、5-fu(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，cas號51-21-8)，吉西他濱lilly)、pd-0325901(cas號391210-10-9,pfizer)、順鉑(順式二胺，二氯鉑(ii)，cas號15663-27-1)、卡鉑(cas號41575-94-4)、紫杉醇(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)、曲妥珠單抗(genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，cas號85622-93-1,scheringplough)、他莫昔芬((z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-n,n-二甲基乙胺、)和多柔比星akti-1/2、hppd和雷帕霉素。

化療劑的更多實例包括：奧沙利鉑(sanofi)、硼替佐米(millenniumpharm.)、索坦(su11248,pfizer)、來曲唑(novartis)、甲磺酸伊馬替尼(novartis)、xl-518(mek抑制劑，exelixis,wo2007/044515)、arry-886(mek抑制劑，azd6244,arraybiopharma,astrazeneca)、sf-1126(pi3k抑制劑，semaforepharmaceuticals)、bez-235(pi3k抑制劑，novartis)、xl-147(pi3k抑制劑，exelixis)、ptk787/zk222584(novartis)、氟維司群(astrazeneca)、甲酰四氫葉酸(亞葉酸)，雷帕霉素(西羅莫司，wyeth)、拉帕替尼(gsk572016,glaxosmithkline)、洛那法尼(sarasar^tm,sch66336,scheringplough)、索拉非尼(bay43-9006,bayerlabs)、吉非替尼(astrazeneca)、伊立替康(cpt-11,pfizer)、替吡法尼(zarnestra^tm，johnson&johnson)，abraxane^tm(不含cremophor)、紫杉醇白蛋白工程納米粒子制劑(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,ii)、凡德他尼(rinn,zd6474,astrazeneca)、瘤可寧、ag1478、ag1571(su5271；sugen)、替西羅莫司(wyeth)、帕唑帕尼(glaxosmithkline)、莰佛胺(telik)、噻替派和環(huán)磷酰胺)；烷基磺酸鹽諸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶諸如苯并多巴、卡泊酮、美妥多巴和脲多巴；乙烯亞胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺、三乙烯磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三輕甲蜜胺；多聚乙酰(特別是牛油菌素和泡番枝辛)；喜樹堿(包括合成類似物拓撲替康)；苔蘚抑素；海綿他?。籧c-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；念珠藻素(特別是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他??；倍癌霉素(包括合成類似物，kw-2189和cb1-tm1)；五加素；水鬼蕉堿；匍枝珊瑚醇；海綿抑素；氮芥，諸如氯氮芥、氯萘嗪、氯磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、甲二氯二乙胺、鹽酸甲氧氮芥、美法侖、新恩比興、苯芥膽甾醇、潑尼昔維汀、曲洛磷胺、烏拉莫司汀；亞硝基脲，諸如卡莫司汀、氯脲霉素、氟托西汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司他啶；抗生素，諸如烯二炔抗生素(如卡里奇霉素、卡里奇霉素gamma1l、卡里奇霉素omegal1(angewchem.intl.ed.engl.(1994)33:183-186)；達內(nèi)霉素、達內(nèi)霉素a；二膦酸鹽，諸如氯膦酸鹽；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素發(fā)色團和相關(guān)的發(fā)色蛋白烯二炔抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素、放線菌素、氨茴霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素c、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道諾霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、嗎啉代-多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊達比星、奈莫柔比星、麻西羅霉素、絲裂霉素(諸如絲裂霉素c)、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、卟霉素、泊非霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈球菌素、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，諸如卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯、睪丸醇、前列腺素、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺素，諸如氨魯米特、米托坦、三氟烷；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍他布群(bestrabucil)；比生群；依達曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鳥氨酸；依利醋銨；埃博霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；類美登素，諸如美登素和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidanmol)；尼曲吖啶；噴司他??；苯來美特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖復合物(jhsnaturalproducts,eugene,or)；雷佐生；利索新；西索菲蘭；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；單端孢菌烯(特別是t-2毒素、弗納庫林a、桿孢菌素a和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；環(huán)磷酰胺；噻替派；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春花堿；依托泊苷(vp-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱諾消靈(novantrone)；替尼泊苷；依達曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；卡培他濱(roche)；伊班膦酸鹽；cpt-11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；類視色素，諸如視黃酸；及以上任一種的藥學上可接受的鹽、酸和衍生物。

“化療劑”的定義中還包括了：(i)用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(serm)，包括例如他莫昔芬(包括檸檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、ly117018、奧那司酮和(檸檬酸托瑞米芬)；(ii)抑制酶芳香化酶的芳香化酶抑制劑，其調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素產(chǎn)生，諸如，例如，4(5)-咪唑、氨魯米特、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦；pfizer)、福美坦、法倔唑、(伏氯唑)、(來曲唑；novartis)和(阿那曲唑；astrazeneca)；(iii)抗雄激素，諸如氟他米特、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他濱(1,3-二氧雜環(huán)戊烷核苷胞嘧啶類似物)；(iv)蛋白質(zhì)激酶抑制劑，諸如mek抑制劑(wo2007/044515)；(v)脂質(zhì)激酶抑制劑；(vi)反義寡核苷酸，特別是抑制異常細胞增殖中涉及的信號傳導途徑中的基因表達的那些，例如，pkc-α、raf和h-ras，諸如奧利默森(gentainc.)；(vii)核酸代酶，諸如vegf表達抑制劑(如)和her2表達抑制劑；(viii)疫苗，諸如基因療法疫苗，例如，和ril-2；拓撲異構(gòu)酶1抑制劑，諸如rmrh；(ix)抗血管生成劑，諸如貝伐單抗(genentech)；及以上任一種的藥學上可接受的鹽、酸和衍生物。

“化療劑”的定義中還包括了治療性抗體，諸如阿侖單抗(campath)、貝伐單抗(genentech)；西妥昔單抗(imclone)；帕尼單抗(amgen)、利妥昔單抗(genentech/biogenidec)、奧法木單抗(gsk)、帕妥珠單抗(perjeta^tm,omnitarg^tm,2c4,genentech)、曲妥珠單抗(genentech)、托西莫單抗(bexxar,corixia)和抗體藥物綴合物吉妥珠單抗奧唑米星(wyeth)。

具有于本公開的化合物組合作為化療劑潛力的人源化單克隆抗體包括：阿侖單抗、阿泊珠單抗、阿塞珠單抗、阿利珠單抗、巴匹珠單抗、貝伐單抗、比伐珠單抗美登素(bivatuzumabmertansine)、莫坎妥珠單抗美登素(cantuzumabmertansine)、西賴珠單抗、聚乙二醇化賽妥珠單抗、cidfusituzumab、西妥珠單抗、達利珠單抗、依庫麗單抗、依法利珠單抗、依帕珠單抗、厄利珠單抗、非維珠單抗、芳妥珠單抗、吉妥珠單抗奧佐米星、奧英妥珠單抗奧佐米星、伊匹單抗、拉貝珠單抗、林妥珠單抗、馬妥珠單抗、美泊利單抗、莫維珠單抗、莫妥維珠單抗、那他珠單抗、尼妥珠單抗、諾洛維珠單抗、努馬維珠單抗、奧美珠單抗、奧馬珠單抗、帕利珠單抗、帕考珠單抗、帕氟珠單抗、帕妥珠單抗、帕妥珠單抗、培克珠單抗、ralivizumab、蘭尼單抗、瑞利珠單抗、瑞利珠單抗、熱西維珠單抗、羅維珠單抗、魯利珠單抗、西羅珠單抗、希普利珠單抗、索土珠單抗、他珠單抗替坦司(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠單抗(tadocizumab)、他利珠單抗、替非珠單抗、托珠單抗、托利珠單抗、曲妥珠單抗、圖考珠單抗西莫白介素、圖庫斯珠單抗、烏嗎維珠單抗、烏珠單抗和維西珠單抗。

根據(jù)本公開的藥物組合物和根據(jù)本公開的用途，除了活性成分(即綴合物化合物)之外還可包含藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它物質(zhì)。此類材料應無毒，且不應干擾活性成分的功效。載體或其它材料的精確性質(zhì)將取決于施用途徑，其可以是經(jīng)口，或通過注射，如皮膚、皮下或靜脈內(nèi)。

用于經(jīng)口施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊劑、粉劑或液體形式。片劑可包含固體載體或佐劑。液體藥物組合物通常包含液體載體，諸如水、石油、動物油或植物油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇(諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。膠囊劑可以包括固體載體，諸如明膠。

對于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射或在痛苦部位注射，活性成分將呈胃腸外可接受的無熱原且具有適合的ph、等滲性和穩(wěn)定性的水溶液形式。本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員完全能夠使用例如等滲媒介物(氯化鈉注射液、林格氏注射液(ringer'sinjection)、乳酸化林格氏注射液等)制備適合的溶液。根據(jù)需要，可以包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。

制劑

盡管可能單獨使用(如施用)綴合物化合物，但通常優(yōu)選將其呈現(xiàn)為組合物或制劑。

在一個實施方案中，該組合物是包含如本文所述的綴合物化合物和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物(如制劑、制備物、藥劑)。

在一個實施方案中，該組合物是包含如本文所述的至少一種綴合物化合物連同本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的一種或多種其它藥學上可接受的成分的藥物組合物，所述藥學上可接受的成分包括但不限于藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑、佐劑、填充劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、表面活性劑(如潤濕劑)、掩蔽劑、著色劑、調(diào)味劑和甜味劑。

在一個實施方案中，該組合物還包含其它活性劑，例如其它治療劑或預防劑。

適合的載體、稀釋劑、賦形劑等可見于標準藥物文本中。參見，例如，handbookofpharmaceuticaladditives.第2版(編輯m.ash和i.ash),2001(synapseinformationresources,inc.,endicott,newyork,usa).remington'spharmaceuticalsciences.第20版,pub.lippincott,williams&wilkins,2000；和handbookofpharmaceuticalexcipients.第2版,1994。

如本文所用的術(shù)語“藥學上可接受的”涉及化合物、成分、材料、組合物、劑型等，其在合理的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)，適用于與正在考慮的受試者(如人)的組織接觸而沒有過多的毒性、刺激性、過敏反應或其它問題或并發(fā)癥，與合理的效益/風險比相稱。在與制劑的其它成分相容的意義上，每種載體、稀釋劑、賦形劑等也必須是“可接受的”。

制劑可以通過藥學領(lǐng)域熟知的任何方法制備。此類方法包括使活性化合物與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體締合的步驟。通常，制劑通過將活性化合物與載體(如液體載體、細分散固體載體等)均勻且緊密地締合且然后如果有必要將產(chǎn)物成型來制備。

可制備制劑以提供快速或緩慢釋放；立即、延遲、定時或持續(xù)釋放；或其組合。

適用于胃腸外施用(如通過注射)的制劑包括水性或非水性、等滲、無熱原的無菌液體(如溶液，懸浮液)，其中活性成分溶解、懸浮或以其他方式提供(如，在脂質(zhì)體或其它微粒中)。此類液體可另外含有其它藥學上可接受的成分，諸如抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、助懸劑、增稠劑和使制劑與預期接受者的血液(或其它相關(guān)體液)等滲的溶質(zhì)。賦形劑的實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于此類制劑的適合的等滲載體的實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液或乳酸化林格氏溶液。通常，液體中活性成分的濃度為約1ng/ml至約10μg/ml，例如約10ng/ml至約1μg/ml。制劑可存在于單位劑量或多劑量密封容器(如，安瓿和小瓶)中，并且可以儲存在(凍干)條件下冷凍干燥，僅需要在使用之前立即加入無菌液體載體(如注射用水)。臨時注射溶液和懸浮液可以由無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備。

劑型

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，綴合物化合物和包含綴合物化合物的組合物的適當劑量可以隨患者而變化。確定最佳劑量通常將涉及平衡治療益處的水平與任何風險或有害副作用。所選擇的劑量水平將取決于多種因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用途徑，施用時間，化合物排泄速率，治療持續(xù)時間，其它組合使用的藥物、化合物和/或材料，疾患的嚴重程度，以及患者的物種、性別、年齡、體重、情況、一般健康情況和先前的病史?；衔锏牧亢褪┯猛緩阶罱K將由醫(yī)師、獸醫(yī)或臨床醫(yī)生決定，盡管通常將選擇劑量以在實現(xiàn)所需效果的位點獲得局部濃度而不引起實質(zhì)性的有害或不利的副作用。

在整個治療過程中，可以以一個劑量連續(xù)或間歇地(如以適當間隔分開的劑量)實現(xiàn)施用。確定最有效的施用方式和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且將隨著用于治療的制劑、治療目的、被治療的靶細胞和待治療的受試者。單次或多次施用可以由治療醫(yī)師、獸醫(yī)或臨床醫(yī)生選擇的劑量水平和模式進行。

通常，適合的劑量的活性化合物的范圍為每天每千克體重受試者約100ng至約25mg(更典型地約1μg至約10mg)。當活性化合物為鹽、酯、酰胺、前藥等時，所施用的量基于母體化合物計算，因此所使用的實際重量按比例增加。

在一個實施方案中，根據(jù)以下劑量方案向人患者施用活性化合物：約100mg，每天3次。

在一個實施方案中，根據(jù)以下劑量方案向人患者施用活性化合物：約150mg，每天2次。

在一個實施方案中，根據(jù)以下劑量方案向人患者施用活性化合物：約200mg，每天2次。

然而，在一個實施方案中，根據(jù)以下劑量方案向人患者施用綴合物化合物：約50或約75mg，每天3次或4次。

在一個實施方案中，根據(jù)以下劑量方案向人患者施用綴合物化合物：約100或約125mg，每天2次。

上述劑量量可以適用于綴合物(包括pbd部分和抗體的接頭)或所提供的pbd化合物的有效量，例如在接頭裂解后可釋放的化合物的量。

為了預防或治療疾病，本公開的adc的適當劑量將取決于如上定義的待治療的疾病的類型、疾病的嚴重程度和過程、是否施用分子用于預防或治療目的、以前的療法、患者的臨床史和對抗體的響應，以及主治醫(yī)師的決定。該分子一次性或經(jīng)一系列治療適合地施用給患者。根據(jù)疾病的類型和嚴重程度，約1μg/kg至15mg/kg(如0.1-20mg/kg)分子是施用給患者的初始候選劑量，無論例如通過一次或多次單獨施用，或通過連續(xù)輸注。根據(jù)上述因素，典型的日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更高的范圍內(nèi)。待施用的患者的adc的示例性劑量在約0.1至約10mg/kg患者體重的范圍內(nèi)。對于數(shù)天或更久期間的反復施用，根據(jù)情況，治療持續(xù)直至發(fā)生疾病癥狀的所需抑制。示例性的給藥方案包括施用約4mg/kg的初始載量劑量，然后每周、每兩周、每三周的額外劑量的adc的療程。其它劑量方案可能是有用的。這種療法的進展可以通過常規(guī)技術(shù)和測定來容易地監(jiān)測。

治療

如本文中在治療疾患的情況下使用的術(shù)語“治療”通常涉及治療和療法，無論是人還是動物(如在獸醫(yī)應用中)，其中實現(xiàn)了一些期望的治療效果，例如抑制病情進展，并且包括進展速度的下降、進展速度的停止、疾患的消退、疾患的改善和疾患的治愈。還包括作為預防措施(即預防、防止)的治療。

如本文所用的術(shù)語“治療有效量”涉及當根據(jù)期望的治療方案施用時活性化合物或物質(zhì)、包含活性化合物的組合物或劑型的可有效產(chǎn)生與合理的效益/風險比相稱的一些期望的治療效果的量。

類似地，如本文所用的術(shù)語“預防有效量”涉及當根據(jù)期望的治療方案施用時活性化合物或物質(zhì)、包含活性化合物的組合物或劑型的可有效產(chǎn)生與合理的效益/風險比相稱的一些期望的預防效果的量。

受試者/患者

受試者/患者可以是動物、哺乳動物、胎盤哺乳動物、有袋類動物(如袋鼠、袋熊)、單孔類動物(如鴨嘴獸)、嚙齒類動物(如豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠)、鼠類動物(如小鼠)、兔類動物(如兔子)、禽類(如鳥)、犬科動物(如狗)、貓科動物(如貓)、馬科動物(如馬)、豬科動物(如豬)、綿羊科動物(如綿羊)、?？苿游?如牛)、靈長類動物、類人猿(如猴或猿)、猴(如狨猴、狒狒)、猿(如大猩猩、黑猩猩、猩猩、長臂猿)或人。

此外，受試者/患者可以是其發(fā)育形式的任一種，例如胎兒。在一個優(yōu)選的實施方案中，受試者/患者是人。

另外的偏好

以下偏好可以適用于如上所述的本公開的所有方面，或者可以涉及單個方面。偏好可以以任何組合組合在一起。

在一些實施方案中，r⁶’、r⁷’、r⁹’和y’優(yōu)選地分別與r⁶、r⁷、r⁹和y相同。

二聚體連接

y和y’優(yōu)選為o。

r”優(yōu)選為無取代基的c3-7亞烷基基團。更優(yōu)選地，r”是c3、c5或c7亞烷基。最優(yōu)選地，r”是c3或c5亞烷基。

r⁶至r⁹

r⁹優(yōu)選為h。

r⁶優(yōu)選選自h、oh、or、sh、nh2、硝基和鹵基，且更優(yōu)選h或鹵基，且最優(yōu)選h。

r⁷優(yōu)選選自h、oh、or、sh、sr、nh2、nhr、nrr’和鹵基，且更優(yōu)選地獨立地選自h、oh和or，其中r優(yōu)選選自經(jīng)任選取代的c1-7烷基、c3-10雜環(huán)基和c5-10芳基基團。r可更優(yōu)選為可經(jīng)取代或可不經(jīng)取代的c1-4烷基基團。感興趣的取代基是c5-6芳基基團(如苯基)。在7-位處特別優(yōu)選的取代基是ome和och2ph。其它特別感興趣的取代基是二甲基氨基(即-nme2)；-(oc2h4)qome，其中q是0至2；含氮c6雜環(huán)基，包括嗎啉代、哌啶基和n-甲基-哌嗪基。

這些偏好分別適用于r^9'、r^6'和r^7'。

r¹²

當在c2’與c3’之間存在雙鍵時，r¹²選自：

(a)c5-10芳基基團，其被選自包括以下的基團的一個或多個取代基任選地取代：鹵基、硝基、氰基、醚、c1-7烷基、c3-7雜環(huán)基和雙-氧基-c1-3亞烷基；

(b)c1-5飽和脂肪族烷基；

(c)c3-6飽和環(huán)烷基；

(d)其中r²¹、r²²和r²³的每一個獨立地選自h、c1-3飽和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和環(huán)丙基，其中r¹²基團中的碳原子的總數(shù)不超過5；

(e)其中r^25a和r^25b之一是h且另一個選自：苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵代甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基；和

(f)其中r²⁴選自：h；c1-3飽和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；環(huán)丙基；苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵代甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基。

當r¹²是c5-10芳基基團時，其可為c5-7芳基基團。c5-7芳基基團可為苯基基團或c5-7雜芳基基團，例如呋喃基、噻吩基和吡啶基。在一些實施方案中，r¹²優(yōu)選為苯基。在其它實施方案中，r¹²優(yōu)選為噻吩基，例如噻吩-2-基和噻吩-3-基。

當r¹²是c5-10芳基基團時，其可為c8-10芳基，例如喹啉基或異喹啉基基團。喹啉基或異喹啉基基團可以通過任何可用的環(huán)位結(jié)合到pbd核上。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基和喹啉-8-基。在這些中，喹啉-3-基和喹啉-6-基可以是優(yōu)選的。異喹啉基可以是異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4-基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基和異喹啉-8-基。在這些中，可優(yōu)選異喹啉-3-基和異喹啉-6-基。

當r¹²是c5-10芳基基團時，它可攜帶任何數(shù)量的取代基基團。優(yōu)選地，它攜帶1至3個取代基基團，更優(yōu)選1個和2個，且最優(yōu)選單取代的基團。取代基可以是任何位置。

當r¹²是c5-7芳基基團時，單一取代基優(yōu)選在不與化合物其余部分的鍵相鄰的環(huán)原子上，即其優(yōu)選為化合物其余部分的鍵的β或γ。因此，當c5-7芳基基團是苯基時，取代基優(yōu)選在間位或?qū)ξ?，且更?yōu)選在對位。

當r¹²是c8-10芳基基團例如喹啉基或異喹啉基時，其可以在喹啉環(huán)或異喹啉環(huán)的任何位置處攜帶任何數(shù)目的取代基。在一些實施方案中，其攜帶一個、兩個或三個取代基，并且這些取代基可以在近端和遠環(huán)或兩者上(如果多于一個取代基)。

r¹²取代基，當r¹²是c5-10芳基基團時

如果當r¹²是c5-10芳基基團時r¹²上的取代基是鹵基，其優(yōu)選為f或cl，更優(yōu)選cl。

如果當r¹²是c5-10芳基基團時r¹²上的取代基是醚，其在一些實施方案中可為烷氧基基團，例如c1-7烷氧基基團(如甲氧基、乙氧基)，或者其在一些實施方案中可為c5-7芳氧基基團(如苯氧基、吡啶基氧基、呋喃基氧基)。烷氧基基團本身可例如被氨基基團(如二甲基氨基)進一步取代。

如果當r¹²是c5-10芳基基團時r¹²上的取代基是c1-7烷基，其可優(yōu)選為c1-4烷基基團(如甲基、乙基、丙基、丁基)。

如果當r¹²是c5-10芳基基團時r¹²上的取代基是c3-7雜環(huán)基，其在一些實施方案中可為c6含氮雜環(huán)基基團，如嗎啉代、硫代嗎啉代、哌啶基、哌嗪基。這些基團可經(jīng)由氮原子結(jié)合至pbd部分的剩余部分。這些基團可被例如c1-4烷基基團進一步取代。如果c6含氮雜環(huán)基基團是哌嗪基，所述另外的取代基可在第二氮環(huán)原子上。

如果當r¹²是c5-10芳基基團時r¹²上的取代基是雙-氧基-c1-3亞烷基，這優(yōu)選為雙-氧基-亞甲基或雙-氧基-亞乙基。

如果當r¹²是c5-10芳基基團時r¹²上的取代基是酯，這優(yōu)選為甲酯或乙酯。

當r¹²是c5-10芳基基團時，特別優(yōu)選的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉代和甲基-噻吩基。r¹²的其它特別優(yōu)選的取代基是二氨基丙基氧基和羧基。

當r¹²是c5-10芳基基團時，特別優(yōu)選的經(jīng)取代的r¹²基團包括但不限于4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧基亞甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基和喹啉-6-基、異喹啉-3-基和異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基和萘基。另一個可能的經(jīng)取代的r¹²基團是4-硝基苯基。特別感興趣的r¹²基團包括4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基和3,4-雙氧基亞甲基-苯基。

當r¹²是c1-5飽和脂肪族烷基時，其可為甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。在一些實施方案中，其可為甲基、乙基或丙基(正戊基或異丙基)。在這些實施方案的一些中，其可為甲基。在其它實施方案中，其可為丁基或戊基，其可為直鏈或支鏈。

當r¹²是c3-6飽和環(huán)烷基時，其可為環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。在一些實施方案中，其可為環(huán)丙基。

當r¹²是時，r²¹、r²²和r²³的每一個獨立地選自h、c1-3飽和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和環(huán)丙基，其中r¹²基團中的碳原子的總數(shù)不超過5。在一些實施方案中，r¹²基團中的碳原子的總數(shù)不超過4或不超過3。

在一些實施方案中，r²¹、r²²和r²³之一是h，且另兩個基團選自h、c1-3飽和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和環(huán)丙基。

在其它實施方案中，r²¹、r²²和r²³中的兩者是h，且另一個基團選自h、c1-3飽和烷基、c2-3烯基、c2-3炔基和環(huán)丙基。

在一些實施方案中，并非為h的基團選自甲基和乙基。在這些實施方案的一些中，并非為h的基團是甲基。

在一些實施方案中，r²¹是h。

在一些實施方案中，r²²是h。

在一些實施方案中，r²³是h。

在一些實施方案中，r²¹和r²²是h。

在一些實施方案中，r²¹和r²³是h。

在一些實施方案中，r²²和r²³是h。

特別感興趣的r¹²基團是：

當r¹²是時，r^25a和r^25b之一是h且另一個選自：苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵基、甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基。在一些實施方案中，并非為h的基團為經(jīng)任選取代的苯基。如果苯基任選的取代基是鹵基，其優(yōu)選為氟。在一些實施方中，苯基基團未經(jīng)取代。

當r¹²是時，r²⁴選自：h；c1-3飽和烷基；c2-3烯基；c2-3炔基；環(huán)丙基；苯基，所述苯基被選自以下的基團任選地取代：鹵代甲基、甲氧基；吡啶基；和噻吩基。如果苯基任選的取代基是鹵基，其優(yōu)選為氟。在一些實施方中，苯基基團未經(jīng)取代。

在一些實施方案中，r²⁴選自h、甲基、乙基、乙烯基和乙炔基。在這些實施方案的一些中，r²⁴選自h和甲基。

當在c2’與c3’之間存在單鍵時，

r¹²是其中r^26a和r^26b獨立地選自h、f、c1-4飽和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基團被選自c1-4烷基酰氨基和c1-4烷基酯的基團任選地取代；或者，當r^26a和r^26b之一是h時，另一個選自腈和c1-4烷基酯。

在一些實施方案中，優(yōu)選地r^26a和r^26b都是h。

在其它實施方案中，優(yōu)選地r^26a和r^26b都是甲基。

在另外的實施方案中，優(yōu)選地r^26a和r^26b之一是h且另一個選自c1-4飽和烷基、c2-3烯基，所述烷基和烯基基團經(jīng)任選地取代。在這些另外的實施方案中，可能進一步優(yōu)選的是并非為h的基團選自甲基和乙基。

r²

r¹²的以上偏好同樣適用于r²。

r²²

在一些實施方案中，r²²具有式iia。

當其具有式iia時，r²²中的a可為苯基基團或c5-7雜芳基基團，例如呋喃基、噻吩基和吡啶基。在一些實施方案中，a優(yōu)選為苯基。

q²-x可在c5-7芳基基團的任何可用環(huán)原子上，但優(yōu)選在不與化合物剩余部分的鍵相鄰的環(huán)原子上，即其優(yōu)選為與化合物的剩余部分的鍵的β或γ。因此，當c5-7芳基基團(a)是苯基時，取代基(q²-x)優(yōu)選在間位或?qū)ξ?，且更?yōu)選在對位。

在一些實施方案中，q¹是單鍵。在這些實施方案中，q²選自單鍵和-z-(ch2)n-，其中z選自單鍵、o、s和nh且為1至3。在這些實施方案的一些中，q²是單鍵。在其它實施方案中，q²是-z-(ch2)n-。在這些實施方案中，z可為o或s且n可為1或n可為2。在這些實施方案的其它中，z可為單鍵且n可為1。

在其它實施方案中，q¹是-ch＝ch-。

在其它實施方案中，r²²具有式iib。在這些實施方案中，r^c1、r^c2和r^c3獨立地選自h和未取代的c1-2烷基。在一些優(yōu)選的實施方案中，r^c1、r^c2和r^c3都為h。在其它實施方案中，r^c1、r^c2和r^c3都為甲基。在某些實施方案中，r^c1、r^c2和r^c3獨立地選自h和甲基。

x是選自包括以下的列表的基團：o-r^l2’、s-r^l2’、co2-r^l-2’、co-r^l2’、nh-c(＝o)-r^l2'、nhnh-r^l2'、conhnh-r^l2'、nrⁿr^l2'，其中rⁿ選自包括h和c1-4烷基的基團。x可優(yōu)選為：oh、sh、co2h、-n＝c＝o或nhrⁿ，且可更優(yōu)選：o-r^l2'、s-r^l2'、co2-r^l2'、-nh-c(＝o)-r^l2'或nh-r^l2'。特別優(yōu)選的基團包括：o-r^l2’、s-r^l2’和nh-r^l2'，且nh-r^l2'為最優(yōu)選的基團。

在一些實施方案中、r²²具有式iic。在這些實施方案中，優(yōu)選地q是nrn-r^l2’。在其它實施方案中，q是o-r^l2’。在另外的實施方案中，q是s-r^l2’。rⁿ優(yōu)選選自h和甲基。在一些實施方中，rⁿ是h。在其它實施方案中，rⁿ是甲基。

在一些實施方案中，r²²可為-a-ch2-x和-a-x。在這些實施方案中，x可為o-r^l2'、s-r^l2’、co2-r^l2’、co-r^l2’和nh-r^l2’。在特別優(yōu)選的實施方案中，x可為nh-r^l2’。

r¹⁰、r¹¹

在一些實施方案中，r¹⁰和r¹¹在它們結(jié)合的氮與碳原子之間一起形成雙鍵。

在一些實施方案中，r¹¹是oh。

在一些實施方案中，r¹¹是ome。

在一些實施方案中，r¹¹是sozm，其中z是2或3且m是單價藥學上可接受的陽離子。

r^11a

在一些實施方案中，r^11a是oh。

在一些實施方案中，r^11a是ome。

在一些實施方案中，r^11a是sozm，其中z是2或3且m是單價藥學上可接受的陽離子。

r²⁰、r²¹

在一些實施方案中，r²⁰和r²¹在它們結(jié)合的氮與碳原子之間一起形成雙鍵。

在一些實施方案中，r²⁰是h。

在一些實施方案中，r²⁰是r^c。

在一些實施方案中，r²¹是oh。

在一些實施方案中，r²¹是ome。

在一些實施方案中，r²¹是sozm，其中z是2或3且m是單價藥學上可接受的陽離子。

r³⁰、r³¹

在一些實施方案中，r³⁰和r³¹在它們結(jié)合的氮與碳原子之間一起形成雙鍵。

在一些實施方案中，r³¹是oh。

在一些實施方案中，r³¹是ome。

在一些實施方案中，r³¹是sozm，其中z是2或3且m是單價藥學上可接受的陽離子。

m和z

優(yōu)選地m是單價藥學上可接受的陽離子且更優(yōu)選na⁺。

z優(yōu)選為3。

本公開的第一方面的優(yōu)選的綴合物可具有式ia的d^l：

其中

r^l1’、r²⁰和r²¹如上所定義；

n是1或3；

r^1a是甲基或苯基；且

r^2a選自：

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)和

(h)

本公開的第一方面的優(yōu)選的綴合物可具有式ib的d^l：

其中

r^l1’、r²⁰和r²¹如上所定義；

n是1或3；且

r^1a是甲基或苯基。

本公開的第一方面的優(yōu)選的綴合物可具有式ic的d^l：

其中r^l2’、r¹⁰、r¹¹、r³⁰和r³¹如上所定義

n是1或3；

r^12a選自：

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)和

(h)

氨基基團處于苯基基團的間位或?qū)ξ弧?/p>

本公開的第一方面的優(yōu)選的綴合物可具有式id的d^l：

其中r^l2’、r¹⁰、r¹¹、r³⁰和r³¹如上所定義

n是1或3；

r^1a是甲基或苯基；

r^12a選自：

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)和

(h)

本公開的第一方面的優(yōu)選的綴合物可具有式ie的d^l：

其中r^l2’、r¹⁰、r¹¹、r³⁰和r³¹如上所定義

n是1或3；

r^1a是甲基或苯基；

r^12a選自：

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)和

(h)

附圖

圖1.通過流式細胞術(shù)在伴刀豆球蛋白-a激活的cd25陽性人pbmc上測定adct-301對人cd25的親和力。通過在通道fl1h中測量中值熒光強度(mfi)，在整個稀釋系列的cd25-pe(藻紅蛋白)門中評估adct-301-fitc結(jié)合。同型非靶向adc-fitc用作非結(jié)合adc對照。ec50為≈0.03μg/ml(180pm)。

圖2.如通過mts細胞增殖測定測量，在六個淋巴瘤細胞系上adct-301的體外細胞毒性。將細胞用增加濃度的adct-301孵育96小時。數(shù)據(jù)表示為平均值±sd

圖3.用1或10ng/ml的adct-301處理cd25陰性伯基特淋巴瘤(burkittlymphoma)ramos細胞和cd25陽性karpas299細胞的單一培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物96小時。直方圖描述了如通過流式細胞術(shù)測量的活細胞類群的百分比。

圖4.描繪用1或10ng/ml的adct-301(圖4a)或非結(jié)合adc(圖4b)處理的cd25-陰性伯基特淋巴瘤ramos細胞和cd25陽性karpas299的單一培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物孔中活細胞％的直方圖。

圖5.通過體外條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移證實cd25-ve旁觀者細胞毒性。如通過mts細胞增殖測定測定adct-301對cd25陰性伯基特淋巴瘤ramos細胞和cd25陽性karpas299細胞的體外細胞毒性。數(shù)據(jù)表示為平均值±sd。圖5a顯示adct-301的細胞毒性或者與ramos或karpas細胞的非結(jié)合性adc。圖5b顯示轉(zhuǎn)移adct-301條件培養(yǎng)基后cd25陰性伯基特淋巴瘤ramos細胞的細胞毒性。圖5c顯示轉(zhuǎn)移非結(jié)合性adc條件培養(yǎng)基后cd25-陰性伯基特淋巴瘤ramos細胞的細胞毒性。

圖6.通過體外條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移用可裂解的接頭對比不可裂解的接頭觀察的cd25-ve旁觀者細胞毒性的比較。發(fā)現(xiàn)cd25陽性sudhl-1細胞對用adct-301(可裂解的接頭)和nc-1(具有不可裂解的接頭的ant-cd25adc)治療同樣敏感。圖6顯示轉(zhuǎn)移adct-301條件培養(yǎng)基后cd25陰性伯基特淋巴瘤ramos細胞的細胞毒性，但不是nc-1條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移后的細胞毒性。誤差條表示3個獨立重復的細胞活力％±sd

實施例

實施例1：adc的旁觀者效應

血液學惡性腫瘤中的il2r-a

白細胞介素-2受體-α(il2r-α,cd25)是組成il2r的異三聚體之一。它在自身免疫性和移植排斥的發(fā)病中涉及的信號轉(zhuǎn)導途徑中起關(guān)鍵作用(burchill等immunollett2007)。

cd25在許多血液學惡性腫瘤(srivastava等leuklymphoma1994)中表達，包括b和t細胞淋巴瘤、atll和毛細胞白血病。

在整個腫瘤細胞群體中，惡性腫瘤中cd25的表達通常不同質(zhì)。其中已知cd25表達異質(zhì)的贅生性疾病的非限制性實例包括外周t細胞淋巴瘤；皮膚t細胞淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤；彌漫性大b細胞淋巴瘤和濾泡淋巴瘤；急性骨髓性白血病(aml)；慢性淋巴細胞性白血病等。(參見cerny,jan,等"expressionofcd25independentlypredictsearlytreatmentfailureofacutemyeloidleukaemia(aml)."britishjournalofhaematology160.2(2013):262-266；fujiwara,shin-ichiro,等"clinicalfeaturesofdenovocd25-positivefollicularlymphoma."leukemia&lymphoma55.2(2014):307-313；intlekofer,andrewm.和anasyounes."fromempirictomechanism-basedtherapyforperipheraltcelllymphoma."internationaljournalofhematology99.3(2014):249-262；olsen,elise,等"pivotalphaseiiitrialoftwodoselevelsofdenileukindiftitoxforthetreatmentofcutaneoust-celllymphoma."journalofclinicaloncology19.2(2001):376-388；shvidel,lev,等"cellsurfaceexpressionofcd25antigen(surfaceil-2receptoralpha-chain)isnotaprognosticmarkerinchroniclymphocyticleukemia:resultsofaretrospectivestudyof281patients."annalsofhematology91.10(2012):1597-1602；strauchen,j.a.和basbreakstone."il-2receptorexpressioninhumanlymphoidlesions.immunohistochemicalstudyof166cases."theamericanjournalofpathology126.3(1987):506。

cd25表達增加與不良預后之間的關(guān)系(yoshida等plosone2013)已得到明確，并且提出了使用抗cd25抗體將細胞毒素遞送給患者中的這些細胞的可能性。cd25陽性惡性腫瘤治療概念的臨床證據(jù)以前使用利用抗體巴利昔單抗和達利珠單抗的放射免疫綴合物(dancey等clincancerres2009)和免疫毒素(kreitman等jclinoncol2000)確認。

此外，已知在許多類型的腫瘤(包括非血液學來源的腫瘤)中，存在激活的t細胞，包括cd25+vet細胞(參見，通過非限制性實例來說，galon,等"type,density,andlocationofimmunecellswithinhumancolorectaltumorspredictclinicaloutcome."science313.5795(2006):1960-1964.；zhang,lin,等"intratumoraltcells,recurrence,andsurvivalinepithelialovariancancer."newenglandjournalofmedicine348.3(2003):203-213)。在至少一些情況下，據(jù)信這些所謂的“腫瘤浸潤性淋巴細胞”(til)影響預后，但是無論如何，本申請的發(fā)現(xiàn)證明公開的化合物在這些適應癥中的用途。

在該實施例中，我們表征了由重組人igg1組成的“adct-301”、針對連接至吡咯并苯并二氮雜pbd彈頭的人cd25的-tac的體外作用機制及體內(nèi)功效和耐受性。藥物-抗體比為2.3±0.3。adct-301是wo2014/57119的humax-tac-e

通過對伴刀豆球蛋白a-激活的cd25陽性淋巴細胞的流式細胞術(shù)，測量adct-301的相對結(jié)合親和力。表面等離子體共振(spr,biacore)用于測量-tac和adct-301對連接到金表面的重組scd25胞外域的結(jié)合親和力和結(jié)合動力學。

通過流式細胞術(shù)測定測定各種淋巴瘤細胞系的cd25和cd30的細胞表面蛋白質(zhì)拷貝數(shù)。通過細胞增殖測定(mts)測定這些細胞系上adct-301的細胞毒性，以確定cd25拷貝數(shù)與體外細胞毒性效應之間是否存在相關(guān)性。

為了確定adct-301是否具有對非cd25表達細胞的旁觀者效應，在存在或不存在adct-301或非靶向?qū)φ誥dc的情況下，將cd25陽性karpas299細胞與pkh26標記的cd25陰性ramos細胞共培養(yǎng)96小時。讀出是karpas299和ramos細胞數(shù)和這些細胞的活力，這兩者都是通過流式細胞術(shù)測定的。

使用adct-301和自由彈頭進行單細胞凝膠電泳(comet)測定，以確認adct-301的作用模式并確定dna交聯(lián)的動力學。將細胞暴露2小時，洗滌，然后在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間?？商娲兀瑸榱嗽u價劑量響應，將細胞用adct-301或游離彈頭處理2小時，洗滌并在新鮮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24小時。

在體內(nèi)，證實的adct-301作為單次劑量在su-dhl-1和karpas299異種移植物及轉(zhuǎn)移模型中作為單劑量施用，并與單次和重復的adcetris^tm給藥方案進行比較。在未攜帶腫瘤的scid小鼠中測定mtd。

結(jié)果

adct-301對人cd25的親和力

來自流式細胞術(shù)和spr的數(shù)據(jù)表明激活的人pbmc和人重組cd25胞外域?qū)β泱w抗體及其相應的adc具有高親和力(圖1)

表1.在整個具有固定在其表面上的可溶性cd25胞外域的cm3芯片上運行數(shù)次adct-301和-tac的稀釋系列數(shù)次。使用軟件計算兩種分子的平衡解離常數(shù)kd。adct-301顯示對scd25胞外域具有極其高的(皮摩爾)親和力

adct-301的靶向細胞毒性

adct-301針對cd25表達的間變性大細胞淋巴瘤系和霍奇金氏淋巴瘤細胞系具有有效的細胞毒性。雖然cd25表達為對adct-301的敏感性所必需的，但gi50與拷貝數(shù)僅弱負相關(guān)(皮爾森相關(guān)系數(shù)(pearson’scorrelationcoefficient)r＝-0.37)(圖2)。

表2.對六個細胞系的adct-301的gi50及其與拷貝數(shù)的關(guān)系。

旁觀者效應

當與對單獨培養(yǎng)的ramos相同的暴露相比時，cd25陽性karpas299和cd25陰性細胞ramos共培養(yǎng)物的96小時adct-301暴露證明了特異性旁路殺傷ramos細胞(圖3；圖4)。ramos細胞是伯基特淋巴瘤的人b淋巴細胞。

旁觀者細胞毒性也在條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移實驗中觀察到。在這些實驗中，進行(a)cd25陰性細胞ramos細胞或(b)cd25陽性karpas299與adct-301的前48小時培養(yǎng)。當該第一次培養(yǎng)完成時，將培養(yǎng)物離心并將50μl上清液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到50μl新鮮制備的(a)cd25陰性細胞ramos細胞或(b)c025-陽性karpas299的培養(yǎng)物中。該第二次培養(yǎng)進行96小時，然后通過mts測定評估細胞毒性。

圖5b顯示對通過用adct-301培養(yǎng)cd25+vekarpas299細胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的cd25-veramos細胞的有效細胞毒性；通過用adct-301培養(yǎng)cd25-veramos細胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基不導致任何可觀察到的細胞毒性增加高于圖5a所示的細胞毒性。

接頭可裂解性的影響

在條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移實驗中研究了接頭可裂解性的影響。在這些實驗中，使用(1)adct-301(可裂解的接頭)或(2)nc-1(由重組人lgg1、針對連接至吡咯并苯并二氮雜pbd彈頭的人cd25的-tac與根據(jù)本公開的可替代方面的不可裂解的的接頭組成)進行cd25-陽性sudhl-1細胞的前48小時培養(yǎng)。

當?shù)谝淮闻囵B(yǎng)完成后，將培養(yǎng)物離心并將50μl上清液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到50μl新鮮制備的cd25陰性細胞ramos細胞培養(yǎng)物中。進行該第二次培養(yǎng)96小時，然后通過mts測定評估細胞毒性。

圖6顯示轉(zhuǎn)移adct-301(可裂解的接頭)條件培養(yǎng)基后cd25-陰性伯基特淋巴瘤ramos細胞的細胞毒性，但不是在nc-1(不可裂解的接頭)條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移后的細胞毒性。誤差條表示3個獨立重復的細胞活力％±sd

序列

seqidno.1(ab12vh):

qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfsryiinvwrqapgqglewmgriipilgvenya

qkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarkdwfdywgqgtlvtvssastkgpsvfpla

seqidno.2(ab12vl):

eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrf

sgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspltfgggtkveikrtvaapsvfifp

seqidno.3(vhcdr1):

ryiin

seqidno.4(vhcdr2):

riipilgvenyaqkfqg

seqidno.5(vhcdr3):

kdwfdy

seqidno.6(vlcdr1):

rasqsvssyla

seqidno.7(vlcdr2):

gassrat

seqidno.8(vlcdr3):

qqygssplt

sequencelisting

<110>adctherapeuticssarl

medimmunelimited

<120>吡咯并苯并二氮雜卓-抗體綴合物

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servallysvalsercyslysalaserglyglythrpheserargtyr

202530

ileileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet

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glyargileileproileleuglyvalgluasntyralaglnlysphe

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glnglyargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr

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metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys

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valserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala

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gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr

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leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile

354045

tyrglyalaserserargalathrglyileproaspargphesergly

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serglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglupro

65707580

gluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglyserserproleu

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