本發(fā)明涉及用于改善皮膚狀態(tài)的化妝品組合物，其含有細(xì)胞培養(yǎng)基、表皮生長(zhǎng)因子和牛血清白蛋白；通過(guò)使用所述化妝品組合物來(lái)改善皮膚狀態(tài)的方法；以及預(yù)防或治療皮膚疾病的方法。

背景技術(shù)：

表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor，egf)是促進(jìn)膠原蛋白合成的通常組分，因此其表現(xiàn)出改善皺紋的效果。然而，由于過(guò)度使用egf會(huì)造成刺激癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的問(wèn)題，所以為了安全起見(jiàn)，egf的用量受到了限制。因此，需要開(kāi)發(fā)即使具有少量egf也能使其效果最大化的組合物。

同時(shí)，構(gòu)成皮膚細(xì)胞的細(xì)胞為某種動(dòng)物細(xì)胞，例如角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte)和成纖維細(xì)胞(fibroblast)。用于培養(yǎng)以上細(xì)胞的培養(yǎng)基的典型組合物包含dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，杜氏改良的伊氏培養(yǎng)基)和胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)。

已知血清在細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)、營(yíng)養(yǎng)供給和保護(hù)細(xì)胞免受氧化和毒素中發(fā)揮作用。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)中不含血清時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)本身幾乎不能實(shí)現(xiàn)，因此血清公認(rèn)是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖必不可少的組分。此外，已知血清含有的血清白蛋白占總血清蛋白質(zhì)的約55％至60％，并且白蛋白吸引水分以維持血液中的水含量，從而提高皮膚彈性。目前，使用最廣泛的血清組分是fbs和fcs(fetalcalfserum，胎牛血清)。

然而，最近報(bào)道fbs可引起人瘋牛病。這可能威脅測(cè)試者的安全，并且因?yàn)橹苯訌呐Ｌ喝〉醚?，所以還存在動(dòng)物保護(hù)方面的問(wèn)題。此外，由于fbs價(jià)格昂貴，因此存在增加培養(yǎng)基成本的缺點(diǎn)。

因此，持續(xù)需要開(kāi)發(fā)不含fbs的對(duì)活體安全并且表現(xiàn)出改善皮膚狀態(tài)(例如，改善皺紋、皮膚再生和創(chuàng)傷愈合)的優(yōu)異效果的組合物。

發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容

技術(shù)問(wèn)題

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)活體安全并且表現(xiàn)出改善皮膚狀態(tài)(例如，改善皺紋、皮膚再生和創(chuàng)傷愈合)的優(yōu)異效果的化妝品組合物，以及用于使用所述化妝品組合物改善皮膚狀態(tài)的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有與以上化妝品組合物相同組成的藥物組合物，以及使用所述藥物組合物預(yù)防或治療皮膚疾病的方法。

技術(shù)方案

根據(jù)本發(fā)明的目的，提供了用于改善皮膚狀態(tài)的化妝品組合物，其包含以下有效成分：

a)細(xì)胞培養(yǎng)基；

b)0.4至0.8ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(egf)；和

c)10至1,000μg/ml牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目的，提供了用于使用以上化妝品組合物改善皮膚狀態(tài)的方法。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目的，提供了所述化妝品組合物在制備用于改善皮膚狀態(tài)的化妝品中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目的，提供了用于預(yù)防或治療皮膚疾病的藥物組合物，其包含：

a)細(xì)胞培養(yǎng)基；

b)0.4至0.8ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(egf)；和

c)10至1,000μg/ml牛血清白蛋白(bsa)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目的，提供了用于使用所述藥物組合物預(yù)防或治療皮膚疾病的方法。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目的，提供了所述藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療皮膚疾病的藥物中的用途。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的組合物不僅對(duì)改善皮膚狀態(tài)如改善皺紋、皮膚再生和創(chuàng)傷愈合等有效，而且還可用于預(yù)防或治療皮膚疾病如特應(yīng)性皮炎、變態(tài)反應(yīng)等。

附圖說(shuō)明

從以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的描述中，本發(fā)明的以上和其他目的和特征將變得明顯。

圖1是示出人成纖維細(xì)胞用實(shí)施例1以及比較例1和2的組合物進(jìn)行處理之后的根據(jù)時(shí)間的細(xì)胞增殖率的圖。

圖2是示出人成纖維細(xì)胞用實(shí)施例1以及比較例1和2的組合物進(jìn)行處理之后的iii型膠原蛋白合成能力的圖。

圖3和4分別提供人成纖維細(xì)胞用實(shí)施例1以及比較例1和2的組合物進(jìn)行處理之前和之后的細(xì)胞圖像，以及示出量化為細(xì)胞遷移速率的創(chuàng)傷愈合能力的圖。

圖5和6分別提供人成纖維細(xì)胞用實(shí)施例6以及比較例3和4的組合物進(jìn)行處理之前和之后的細(xì)胞圖像，以及示出量化為細(xì)胞遷移速率的創(chuàng)傷愈合能力的圖。

圖7和8分別提供人成纖維細(xì)胞用實(shí)施例7以及比較例5和6的組合物進(jìn)行處理之前和之后的細(xì)胞圖像，以及示出量化為細(xì)胞遷移速率的創(chuàng)傷愈合能力的圖。

圖9和10分別提供人成纖維細(xì)胞用實(shí)施例1至3以及比較例1和2的組合物進(jìn)行處理之前和之后的細(xì)胞圖像，以及示出量化為細(xì)胞遷移速率的創(chuàng)傷愈合能力的圖。

圖11和12分別提供人成纖維細(xì)胞用實(shí)施例1、4和5以及比較例1和2的組合物進(jìn)行處理之前和之后的細(xì)胞圖像，以及示出量化為細(xì)胞遷移速率的創(chuàng)傷愈合能力的圖。

本發(fā)明最佳實(shí)施方式

下文中，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

本發(fā)明提供用于改善皮膚狀態(tài)的化妝品組合物，其包含：a)細(xì)胞培養(yǎng)基；b)0.4至0.8ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(egf)；和c)10至1,000μg/ml牛血清白蛋白(bsa)。

當(dāng)施用至人皮膚時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的組合物激活或促進(jìn)皮膚中存在的成纖維細(xì)胞增加，并且促進(jìn)膠原蛋白合成以改善皮膚狀態(tài)，表現(xiàn)出改善皺紋、抑制皮膚老化、改善皮膚彈性、創(chuàng)傷(如疤痕)愈合、皮膚再生等的效果。

本發(fā)明的化妝品組合物可以用于保護(hù)皮膚免于功能退化或皮膚細(xì)胞損失，或用于改善皮膚狀態(tài)；或者預(yù)防或治療皮膚疾病。

這樣的保護(hù)皮膚免于功能退化或皮膚細(xì)胞損失或者改善皮膚狀態(tài)可包括抑制皺紋產(chǎn)生、抑制皮膚老化、改善皮膚彈性、皮膚再生、損傷或創(chuàng)傷愈合、角膜再生等。

所述皮膚疾病可包括炎性皮膚疾病，例如特應(yīng)性皮炎、變態(tài)反應(yīng)、皮膚濕疹、痤瘡、銀屑病等。

因此，本發(fā)明提供了用于使用這樣的化妝品組合物改善皮膚狀態(tài)的方法。

此外，本發(fā)明提供了該化妝品組合物在制備用于改善皮膚狀態(tài)的化妝品中的用途。

所述方法可包括將化妝品組合物施用至需要改善皮膚狀態(tài)的對(duì)象的皮膚的步驟。

本發(fā)明的化妝品組合物包含細(xì)胞培養(yǎng)基。

細(xì)胞培養(yǎng)基可以是能夠培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、生殖細(xì)胞和免疫細(xì)胞)的培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，可使用選自以下的細(xì)胞培養(yǎng)基：dmem/f-12、dmem和memα。

細(xì)胞培養(yǎng)基可以為不含fbs的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，其可以在不含昂貴并且可引起安全問(wèn)題的fbs作為營(yíng)養(yǎng)成分的情況下促進(jìn)優(yōu)異的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。

本發(fā)明的化妝品組合物包含作為細(xì)胞因子的egf。

可以包含如下量的egf：0.4至0.8ng/ml，優(yōu)選0.4至0.6ng/ml，0.6至0.8ng/ml，0.4至0.5ng/ml，0.5至0.8ng/ml，0.6至0.7ng/ml或0.5至0.7ng/ml。

與常規(guī)的含有血清的培養(yǎng)基相比，通過(guò)向細(xì)胞培養(yǎng)基添加egf，本發(fā)明的組合物使細(xì)胞培養(yǎng)能夠具有優(yōu)異的細(xì)胞生長(zhǎng)速率。

特別地，即使包含0.4至0.8ng/ml的少量的egf，本發(fā)明的組合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也無(wú)任何不利影響。此外，本發(fā)明的組合物可以促進(jìn)膠原蛋白合成并且顯示出皮膚再生效果，如創(chuàng)傷愈合。這是包含egf和bsa的本發(fā)明的化妝品組合物共同的協(xié)同效應(yīng)。

本發(fā)明的化妝品組合物包含作為營(yíng)養(yǎng)成分的bsa。

可以包含如下量的bsa：10至1,000μg/ml，優(yōu)選10至100μg/ml，10至500μg/ml，100至500μg/ml，500至1,000μg/ml，50至200μg/ml或80至120μg/ml。

本發(fā)明的化妝品組合物還可包含選自以下的成分：氨基酸、維生素、碳源、無(wú)機(jī)鹽，及其組合。

氨基酸可以為常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的氨基酸成分，并且可選自，例如：甘氨酸、l-丙氨酸、l-精氨酸鹽酸鹽、l-天冬酰胺-一水合物、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸鹽酸鹽-一水合物、l-半胱氨酸2hcl、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-組氨酸鹽酸鹽-一水合物、l-異亮氨酸、l-亮氨酸、l-賴(lài)氨酸鹽酸鹽、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、l-蘇氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二鈉二水合物、l-纈氨酸、l-組氨酸、l-酪氨酸二鈉鹽，及其混合物。

在本發(fā)明中，氨基酸作為待用于細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)合成的來(lái)源。

基于組合物的總重量，包含的氨基酸的量可以為0.111至0.161wt％，例如1.110至1.606g/l。通過(guò)包含以上范圍內(nèi)的氨基酸，組合物可以幫助細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持并且提高制劑的穩(wěn)定性。

維生素可以為常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的維生素成分，并且可選自，例如：生物素、d-泛酸鈣、葉酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素b12、氯化膽堿、無(wú)旋光肌醇(i-inositol)、抗壞血酸，及其混合物。

在本發(fā)明中，維生素發(fā)揮維持細(xì)胞活性的作用。

基于組合物的總重量，包含的維生素的量可以為0.0027至0.0060wt％，例如0.027至0.060g/l。通過(guò)包含以上范圍內(nèi)的維生素，組合物可以幫助維持細(xì)胞活性。

碳源可以為常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的碳源成分，并且可選自例如：d-葡萄糖(右旋糖)、丙酮酸鈉、次黃嘌呤na、胸苷、亞油酸、硫辛酸、腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、尿苷、2′-脫氧腺苷、2′-脫氧胞苷hcl、2′-脫氧鳥(niǎo)苷，及其混合物。

在本發(fā)明中，碳源作為能量來(lái)源，并且特別地，在碳酸氫鈉的情況下可以發(fā)揮維持培養(yǎng)基的ph的作用。

基于組合物的總重量，包含的碳源的量可以為0.120至0.463wt％，例如1.201至4.625g/l。通過(guò)包含以上范圍內(nèi)的碳源，組合物不缺乏能量來(lái)源并且因此可以幫助細(xì)胞生長(zhǎng)，并且可以提高制劑穩(wěn)定性。

無(wú)機(jī)鹽可以為常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的無(wú)機(jī)鹽成分，并且可選自，例如：氯化鈣(cacl2)(無(wú)水)、硫酸銅五水合物(cuso4-5h2o)、硫酸亞鐵七水合物(feso4-7h2o)、氯化鎂(無(wú)水)、硫酸鎂(mgso4)(無(wú)水)、氯化鉀(kcl)、氯化鈉(nacl)、無(wú)水磷酸氫二鈉(na2hpo4)、磷酸氫鈉一水合物(nah2po4-h2o)、硫酸鋅七水合物(znso4-7h2o)、硝酸鐵九水合物(fe(no3)3·9h2o)、碳酸氫鈉(nahco3)，及其混合物。

在本發(fā)明中，無(wú)機(jī)鹽發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用。

基于組合物的總重量，包含的無(wú)機(jī)鹽的量可以為0.984至1.092wt％，例如9.838至10.923g/l。通過(guò)包含以上范圍內(nèi)的無(wú)機(jī)鹽，組合物可以幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞功能并且不會(huì)在配置成藥物或化妝品中造成困難。

為了改善皮膚狀態(tài)的目的，可將本發(fā)明的化妝品組合物直接施用至皮膚。

可將化妝品組合物配置成本領(lǐng)域常規(guī)制備的化妝品制劑?？蓪⒒瘖y品組合物配置成例如溶液、混懸劑、乳劑、糊劑、凝膠、霜?jiǎng)⑾磩?、粉末、肥皂、含有表面活性劑的清潔劑、油劑、粉?powderfoundation)、乳劑底(emulsionfoundation)、蠟底(waxfoundation)和噴霧等，但本發(fā)明不限于此。更具體地，可將化妝品組合物配置成軟洗液(softlotion)、營(yíng)養(yǎng)洗液、營(yíng)養(yǎng)霜、按摩霜、香精、眼霜、清潔霜、清潔泡沫、清潔水、面膜(pack)、噴霧或粉末。

當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型為糊劑、霜?jiǎng)┗蚰z時(shí)，其可包含選自以下的載體成分：動(dòng)物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤(rùn)土、硅石、滑石、氧化鋅，及其混合物。

當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型為粉末或噴霧時(shí)，其可包含選自以下的載體成分：乳糖、滑石、硅石、氫氧化鋁、硅酸鈣、聚酰胺粉末，及其混合物。特別地，當(dāng)劑型為噴霧時(shí)，其還可包含氟氯烴、丙烷/丁烷、二甲醚等。

當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型為溶液或乳液時(shí)，其可包含選自以下的載體成分：溶劑、溶劑合物、乳化劑，及其混合物。其實(shí)例包括水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油(1，3-butylglycoloil)、甘油脂肪族酯、聚乙二醇、山梨聚糖脂肪酸酯，及其混合物。

當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型為混懸劑時(shí)，其可包含選自以下的載體成分：稀釋液(例如水、乙醇或丙二醇)、混懸劑(例如，乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯山梨聚糖酯)、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminummetahydroxide)、膨潤(rùn)土、瓊脂、黃芪膠，及其混合物。

當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型為含有表面活性劑的清潔劑時(shí)，其可包含選自以下的載體成分：脂肪族醇硫酸酯、脂肪族醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸單酯、羥乙磺酸鹽(isethionate)、咪唑啉鹽衍生物、甲基?；撬?、肌氨酸鹽/酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺基甜菜堿(alkylamidobetaine)、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯，及其混合物。

本發(fā)明的化妝品組合物中的術(shù)語(yǔ)“載體成分”是指可包含在化妝品制劑中的已知化合物或組合物，并且無(wú)毒、與皮膚接觸時(shí)無(wú)超過(guò)人體可以適應(yīng)的水平的不穩(wěn)定或刺激性。

除載體成分之外，本發(fā)明的化妝品組合物還可包含選自以下的輔助劑：抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、增濕劑(moisturizer)、色素、芳香劑、uv阻隔劑、著色劑、表面活性劑、及其組合。輔助劑沒(méi)有限制，只要其為常規(guī)用于制備化妝品組合物的輔助劑即可。

此外，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療皮膚疾病的藥物組合物，其包含：a)細(xì)胞培養(yǎng)基；b)0.4至0.8ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(egf)；和c)10至1,000μg/ml牛血清白蛋白(bsa)。

本發(fā)明的藥物組合物的有效成分與上述化妝品組合物相同。

本發(fā)明的藥物組合物可預(yù)防或治療選自以下的炎性皮膚疾?。禾貞?yīng)性皮炎、變態(tài)反應(yīng)、皮膚濕疹、痤瘡、銀屑病、及其組合。

因此，本發(fā)明提供了使用所述藥物組合物來(lái)預(yù)防或治療皮膚疾病的方法。

此外，本發(fā)明提供了所述藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療皮膚疾病的藥物中的用途。

所述方法可包括將本發(fā)明的藥物組合物施用至有此需要的對(duì)象的皮膚的步驟。對(duì)象可以為哺乳動(dòng)物，具體地為人。

除有效成分之外，本發(fā)明的藥物組合物還可根據(jù)需要包含可藥用載體。

可藥用載體可為常規(guī)用于制藥中的載體，其可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、橡膠阿拉伯膠(rubberacacia)、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥甲基苯甲酸酯、羥丙基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等，但是不限于此。

此外，本發(fā)明的藥物組合物還可包含選自以下的一種或更多種可藥用添加劑：潤(rùn)滑劑、保濕劑、甜味劑、芳香劑、乳化劑、助懸劑、防腐劑，及其組合。

基于本發(fā)明的藥物組合物的總重量，包含的載體的量可以為約1wt％至約99.99wt％，優(yōu)選約90wt％至約99.99wt％，并且包含的可藥用添加劑的量可以為約0.1wt％至約20wt％。

本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)口施用或胃腸外施用，并且優(yōu)選地，以表面方式直接施用至皮膚。

本發(fā)明的藥物組合物的劑型可以為皮膚外用制劑的形式，例如，經(jīng)皮施用的注射劑、軟膏劑、溶液劑、霜?jiǎng)?、噴霧劑、貼劑等。

考慮到多種因素來(lái)確定本發(fā)明的藥物組合物的合適劑量，例如配制方法，施用方法，患者的年齡、體重、性別、病理狀況，食物，施用時(shí)間，施用途徑，排泄速率和響應(yīng)性。因此，劑量不應(yīng)被解釋為在任何方面限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明的方式

下文中，將基于以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。雖然以下實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明的范圍不限于此。

實(shí)施例1

通過(guò)將0.8ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基(其具有下表1所示的組成)中來(lái)制備用于改善皮膚狀態(tài)的組合物。

實(shí)施例2

通過(guò)將0.4ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基(其具有下表1所示的組成)中來(lái)制備用于改善皮膚狀態(tài)的組合物。

實(shí)施例3

通過(guò)將0.6ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基(其具有下表1所示的組成)中來(lái)制備用于改善皮膚狀態(tài)的組合物。

實(shí)施例4

通過(guò)將0.8ng/ml的egf和10μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基(其具有下表1所示的組成)中來(lái)制備用于改善皮膚狀態(tài)的組合物。

實(shí)施例5

通過(guò)將0.8ng/ml的egf和1,000μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基(其具有下表1所示的組成)中來(lái)制備用于改善皮膚狀態(tài)的組合物。

[表1]

不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的組成

實(shí)施例6

通過(guò)將0.8ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的dmem培養(yǎng)基(其具有下表2所示的組成)中來(lái)制備用于改善皮膚狀態(tài)的組合物。

[表2]

不含fbs的dmem培養(yǎng)基的組成

實(shí)施例7

通過(guò)將0.8ng/ml的egf和100μg/ml的bsa添加至不含fbs的memα培養(yǎng)基(其具有下表3所示的組成)來(lái)制備用于改善皮膚狀態(tài)的組合物。

[表3]

不含fbs的memα培養(yǎng)基的組成

比較例1和2

通過(guò)分別僅將1ng/ml或20ng/ml的egf添加至不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基(其具有如表1所示的組成)來(lái)制備組合物。

比較例3和4

通過(guò)分別僅將1ng/ml或20ng/ml的egf添加至不含fbs的dmem培養(yǎng)基(其具有如表2所示的組成)來(lái)制備組合物。

比較例5和6

通過(guò)分別僅將1ng/ml或20ng/ml的egf添加至不含fbs的memα培養(yǎng)基(其具有如表3所示的組成)來(lái)制備組合物。

根據(jù)以上實(shí)施例和比較例的組合物總結(jié)在下表4中。

[表4]

實(shí)驗(yàn)例1：細(xì)胞增殖率的對(duì)比

將在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞(韓國(guó)細(xì)胞系庫(kù))用0.05％(w/v)胰蛋白酶進(jìn)行處理并且從培養(yǎng)皿分離。將3x10³分離的人真皮成纖維細(xì)胞與100μl的不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基(其具有表1所示的組成)混合，然后置于96孔板的各個(gè)孔中。在37℃和5％co2的條件下于恒溫箱中培養(yǎng)一天之后，當(dāng)細(xì)胞完全附著在96孔板的底部時(shí)，將存在的培養(yǎng)基移除。然后，分別用實(shí)施例1、比較例1或比較例2的組合物處理孔。使用無(wú)egf和bsa的不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

將混合物在37℃和5％co2的條件下于恒溫箱中孵育24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，然后使用抽吸機(jī)將添加劑移除，并且用無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(phosphatebufferedsaline，pbs)將剩余培養(yǎng)液從96孔板中完全移除。

為驗(yàn)證細(xì)胞增殖，將10μl的cck-8反應(yīng)溶液(dojindo)添加至各個(gè)孔并且在37℃下反應(yīng)2小時(shí)。此后，使用model680微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(bio-rad，ca，美國(guó))在450nm處測(cè)量吸光度。

基于在不含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基(即陰性對(duì)照)中生長(zhǎng)的細(xì)胞的吸光度值的各個(gè)孔的吸光度值的對(duì)比結(jié)果示于圖1中。

如圖1所示，經(jīng)實(shí)施例1的組合物處理的組未顯示細(xì)胞毒性，表明細(xì)胞增殖率優(yōu)異。特別地，驗(yàn)證了在培養(yǎng)72小時(shí)之后，該細(xì)胞增殖率的提高超過(guò)了經(jīng)比較例2的組合物(向其中添加了20ng/ml高濃度的egf)處理的組。

實(shí)驗(yàn)例2：膠原蛋白合成效果的評(píng)估

將從人皮膚組織中分離的人真皮成纖維細(xì)胞(韓國(guó)細(xì)胞系庫(kù))在含有10％fbs和1％青霉素-鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基(gibco)中在5％co2條件下培養(yǎng)，然后將經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的3×10⁵個(gè)細(xì)胞接種到6孔板。第二天，用pbs洗滌經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞一次，然后用不含fbs的dmem/f12培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。用實(shí)施例1、比較例1或比較例2的組合物處理細(xì)胞并且培養(yǎng)24小時(shí)。

反應(yīng)完成之后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液并且進(jìn)行iii型膠原蛋白的elisa分析(cusabiobiotechco.，中國(guó)，武漢)以測(cè)定各自膠原蛋白的合成濃度。根據(jù)試劑盒中包含的該公司提供的指導(dǎo)進(jìn)行elisa分析。結(jié)果示于圖2中。

如圖2所示，經(jīng)實(shí)施例1的組合物處理的組顯示出最佳的膠原蛋白合成能力，其類(lèi)似于經(jīng)比較例2的組合物(向其中添加了20ng/ml的高濃度的egf)處理的組。

實(shí)驗(yàn)例3：人真皮成纖維細(xì)胞遷移的驗(yàn)證

為了研究本發(fā)明的組合物的創(chuàng)傷愈合能力，驗(yàn)證了人真皮成纖維細(xì)胞的遷移能力。

首先，將6×10⁴細(xì)胞/ml人真皮成纖維細(xì)胞(韓國(guó)細(xì)胞系庫(kù))接種至ibidi培養(yǎng)插管(ibidigmbh，m，德國(guó))室(由通過(guò)70μm隔膜分隔的兩個(gè)儲(chǔ)存器組成)。然后，將室中的細(xì)胞在5％co2和37℃的條件下培養(yǎng)12小時(shí)。

經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞分別用實(shí)施例1、比較例1和比較例2的組合物進(jìn)行處理。圖3提供通過(guò)倒置顯微鏡(olympus)獲得的拍攝圖像，其示出了組合物處理之前與9小時(shí)之后的細(xì)胞遷移度。

使用t-scratch軟件(computationalscience&engineeringlaboratory，ethzurich，瑞士)對(duì)圖像進(jìn)行分析以計(jì)算各個(gè)處理組的細(xì)胞遷移速率，其為基于設(shè)置為100％的陰性對(duì)照結(jié)果的細(xì)胞覆蓋區(qū)的比率(％)。結(jié)果示于圖4中。

如圖3和4所示，經(jīng)實(shí)施例1的組合物處理的組顯示出最佳的創(chuàng)傷愈合能力，其類(lèi)似于經(jīng)比較例2的組合物(其中添加20ng/ml的高濃度的egf)處理的組。

此外，使用實(shí)施例6以及比較例3和4的組合物以如上述的相同方式進(jìn)行的創(chuàng)傷愈合能力的驗(yàn)證結(jié)果示于圖5和6中。此外，使用實(shí)施例7以及比較例5和6的組合物以如上述的相同方式進(jìn)行的創(chuàng)傷愈合能力的驗(yàn)證結(jié)果示于圖7和8中。

如圖5和6以及圖7和8所示，分別經(jīng)實(shí)施例6和7的組合物(通過(guò)將egf和bsa同時(shí)添加至不含fbs的dmem培養(yǎng)基或不含fbs的memα培養(yǎng)基制備)處理的組顯示出最佳的創(chuàng)傷愈合能力，其類(lèi)似于經(jīng)比較例4和6的組合物(其中單獨(dú)添加20ng/ml的egf)處理的組。

同時(shí)，為了驗(yàn)證依賴(lài)于本發(fā)明的組合物中egf的量的創(chuàng)傷愈合能力，使用實(shí)施例1至3以及比較例1和2的組合物以如上述相同的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于圖9和10中。如圖9和10所示，與陰性對(duì)照組相比，分別經(jīng)含有0.4至0.8ng/ml的egf的實(shí)施例1至3的組合物處理的所有組顯示出高達(dá)50％的改善效果，其類(lèi)似于經(jīng)比較例2的組合物(其中單獨(dú)添加20ng/ml的egf)處理的組。

此外，為了驗(yàn)證依賴(lài)于本發(fā)明的組合物中bsa的量的創(chuàng)傷愈合能力，使用實(shí)施例1、4和5以及比較例1和2的組合物以如上述相同的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于圖11和12中。如圖11和12所示，與陰性對(duì)照組相比，分別經(jīng)含有10至1,000μg/ml的bsa的實(shí)施例1、4和5的組合物處理的所有組顯示出高達(dá)40％的改善效果，其類(lèi)似于經(jīng)比較例2的組合物(其中單獨(dú)添加20ng/ml的過(guò)量的egf)處理的組。

這些結(jié)果證明，與含有單獨(dú)過(guò)量egf的組合物相比，含有egf與bsa組合的本發(fā)明的組合物顯示出更優(yōu)異的膠原蛋白合成效果和細(xì)胞再生效果。

因此，本發(fā)明的組合物未顯示細(xì)胞毒性，并且即使當(dāng)含有少量egf時(shí)也提高了膠原蛋白合成。這樣的組合物通過(guò)提高的創(chuàng)傷愈合能力和皺紋改善效果而顯示出優(yōu)異的皮膚再生效果。此外，這樣的組合物不僅通過(guò)降低生產(chǎn)成本至約1/20而具有更優(yōu)異的價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)性，而且顯著降低由過(guò)量使用egf引起的癌癥發(fā)生率，并且因此其可以安全地施用至活體。