專利名稱：無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)。更具體地，本發(fā)明涉及用于飼養(yǎng)細(xì)胞非依賴型細(xì)胞培養(yǎng)系 統(tǒng)的培養(yǎng)基、系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
人胚胎干(hES)細(xì)胞來源于胚囊(4-5天大的早期胚胎)的內(nèi)層細(xì)胞團(ICM)。hES 細(xì)胞是多能細(xì)胞類型，其能夠產(chǎn)生三種主要的胚層，即外胚層、內(nèi)胚層和中胚層[1，2]。換言 之，當(dāng)給予必要的分化刺激時，這些細(xì)胞可發(fā)育成成人體內(nèi)的超過200種細(xì)胞類型?；蛘撸?當(dāng)不給予分化刺激時，這些細(xì)胞將自我更新，產(chǎn)生多能子代細(xì)胞。有鑒于此，認(rèn)為可以操縱hES細(xì)胞的多能行為以便更加有效地產(chǎn)生用于治療適應(yīng) 癥的細(xì)胞和組織例如用于治療帕金森氏病[3]、糖尿病[4]或脊髓損傷[5]。不過，這些潛 在用途并不僅僅限于產(chǎn)生用于移植的組織。最近，已經(jīng)操縱hES細(xì)胞形成特定組織類型以 便測試新的藥物和化合物[6]?？杀M管有這些進展，在建立安全的培養(yǎng)方法之前，hES細(xì)胞 仍不具有治療活性。1998年首次成功實現(xiàn)對hES細(xì)胞的衍生化[1]。Thomson等(1998)發(fā)現(xiàn)，采用有 絲分裂滅活型飼養(yǎng)層和胎牛血清(FBS)可成功繁殖hES細(xì)胞。不過，使用異基因產(chǎn)物，例如 人或動物血清和小鼠成纖維細(xì)胞，可能會在培養(yǎng)系統(tǒng)中引入污染產(chǎn)物，例如牛綿狀腦病[7，
8]。后來，還證明加入這些動物成分可引入免疫原性物(例如，N-羥乙酰神經(jīng)氨酸，Neu5Ac) (Martin等2005 ；Heiskanen等2007)，提示生長于這些條件下，細(xì)胞的表型會受到微環(huán)境的 調(diào)控。顯然，需要建立改進的hES細(xì)胞培養(yǎng)方法，同時又能為hES細(xì)胞的體外擴增提供必要 的條件。有鑒于此，許多研究者在研究使用人飼養(yǎng)細(xì)胞，包括人包皮成纖維細(xì)胞[9，10]和 成人骨髓細(xì)胞[11]。已經(jīng)證明這兩種細(xì)胞均支持hES細(xì)胞生長，由此可消除動物衍生的飼 養(yǎng)細(xì)胞造成污染的危險。不過，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)長期增殖后會出現(xiàn)分化率升高和異常核型[12，
9]。例如，經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析，一些hES細(xì)胞出現(xiàn)非整倍型[12]，包括獲得染色體17q[13] 和20三體[14]。為解決這一問題，許多研究者一直嘗試建立完全每不含動物產(chǎn)物的hES細(xì)胞培養(yǎng) 條件。具體而言，Xu等(2005)鑒定到堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)信號對于hES細(xì)胞 自我更新是至關(guān)重要的[15]，而其他研究者則推測調(diào)變轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-i3信號途徑 對于防止默認(rèn)分化是必需的[16]。后來，Ludwig等(2006)使用復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物和大量 的純化人血清白蛋白成功實現(xiàn)對hES細(xì)胞的物飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)[17]。不過，這一研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) hES細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)月后出現(xiàn)了 47XXY核型。盡管這已經(jīng)取得了顯著的進步，但hES細(xì)胞的成功 增殖顯然仍需要飼養(yǎng)細(xì)胞。有趣的是，Xu等(2001)證實，來自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF) 的條件培養(yǎng)基(CM)可支持hES細(xì)胞生長達130代倍增，而仍保持細(xì)胞的正常核型[18]。另一種需要依賴小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞才能存活并擴增的細(xì)胞類型是原代人 角化細(xì)胞。實際上，用于增殖hES細(xì)胞的許多培養(yǎng)技術(shù)，即血清和飼養(yǎng)細(xì)胞，均與角化細(xì)胞培養(yǎng)類似。已經(jīng)證實，原代角化細(xì)胞需要依賴小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞才能進行體外非分 化擴增(Dawson 等 2006)。目前還不了解MEF對hES細(xì)胞培養(yǎng)物具有何種功能。不過已經(jīng)證實這些飼養(yǎng)細(xì)胞 提供了多種對hES細(xì)胞以及角化細(xì)胞維持非分化狀態(tài)而言至關(guān)重要的蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)依賴于無有絲分裂活性的飼養(yǎng)細(xì)胞層為細(xì)胞生長和/或增殖 提供生長和條件因子，這些細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)在治療用途中具有嚴(yán)重的潛在缺陷。更具體地，使 用異基因產(chǎn)物可引入污染和感染因子，例如BSE和HIV。因此，本發(fā)明人認(rèn)為需要一種新的改進的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其能夠消除或至少降低 對飼養(yǎng)細(xì)胞的需求。不僅如此，本發(fā)明人出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，包含IGF-I氨基酸序列和成熟玻 連蛋白的第1至64位氨基酸殘基的合成嵌合蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)基這展現(xiàn)出更高的活性，且特 別是能夠刺激細(xì)胞遷移和/或增殖達到高水平。寬泛而言，本發(fā)明涉及用于取代或替代飼養(yǎng)細(xì)胞的無血清非條件細(xì)胞培養(yǎng)基，其 包含一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子。預(yù)期所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子可以 是任何蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段，其通常由飼養(yǎng)細(xì)胞分泌和/或產(chǎn)生，以促進飼養(yǎng)細(xì)胞 依賴型細(xì)胞的生長。在第一個方面，本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含(i)合成嵌合蛋白，其包含胰島素樣生長因子(IGF)氨基酸序列和玻連蛋白(VN) 氨基酸序列；(ii)選自以下一組中的一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子人生長激素(hGH)、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白15ΦΜΡ-15)、生長分化因子9(GDF-9)、巨核細(xì)胞集落刺激因子、分泌型卷 曲相關(guān)蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝細(xì)胞生 長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α (TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β )、神經(jīng)生長因子、 血小板衍生的生長因子-β (PDGF-β)，PC-衍生的生長因子(progranulin)、白細(xì)胞介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 和激活素-A(Activin-A)；和(iii)不含血清或含有明顯減少量的血清，所述明顯減少量的血清在缺乏IGF時 不能支持細(xì)胞的生長。優(yōu)選地，所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子選自以下一組hGH、BMP-15、 ⑶P-9、巨核細(xì)胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關(guān)蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子和激 活素-A。甚至更優(yōu)選地，所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子是激活素-A。在優(yōu)選的實施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含選自以下一組的一或多種額外的生 物學(xué)活性蛋白堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、IGF-I、IGF-II和層 粘連蛋白。在更優(yōu)選的實施方式中，所述一或多種額外的生物學(xué)活性蛋白選自bFGF和層粘 連蛋白。優(yōu)選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。
在優(yōu)選的實施方式中，所述VN氨基酸序列是成熟玻連蛋白的第1至64位氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述合成嵌合蛋白還包含接頭序列，所述接頭序列為一或多個甘氨酸殘 基，且在特別優(yōu)選的實施方式中，所述接頭序列還包含一或多個絲氨酸殘基。更優(yōu)選地，所述接頭序列為(Gly4Ser)4t5在另一優(yōu)選的實施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含分離的含IGF的復(fù)合物，其中 IGF 選自 IGF-I 禾口 IGF-II。在另一優(yōu)選的實施方式中，其中所述分離的含IGF的復(fù)合物包含IGF-I，所述細(xì)胞 培養(yǎng)基還包含胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)和VN。在另一優(yōu)選的實施方式中，其中所述存在于所述分離的含IGF的復(fù)合物中的IGF 是IGF-II，所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含VN。優(yōu)選地，所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃度在大約0. lng/ml和50 μ g/ml之 間。更優(yōu)選地，所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃度在大約5ng/ml和1500ng/ml之 間。甚至更優(yōu)選地，所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃度在大約25ng/ml和 1000ng/ml 之間。進一步更優(yōu)選地，所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃度在大約150ng/ml和 600ng/ml 之間。進一步甚至更優(yōu)選地，所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃度在大約250ng/ml 和400ng/ml之間。合適地，所述細(xì)胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞?？梢匀菀椎乩斫?，飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞是任何需要飼養(yǎng)細(xì)胞進行增殖的細(xì)胞。非 限制性的實例包括小鼠和人胚胎干細(xì)胞、人胚胎生殖細(xì)胞、人胚胎癌細(xì)胞和角化細(xì)胞。優(yōu)選地，所述飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞選自人胚胎干細(xì)胞和角化細(xì)胞。在第二方面，本發(fā)明提供胚胎細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含大約250ng/ml和lOOOng/ml之 間的包含IGF氨基酸序列和VN氨基酸序列的合成嵌合蛋白，大約50ng/ml和lOOng/ml之 間的bFGF，大約25ng/ml和50ng/ml之間的激活素-A和大約10 μ g/ml和50 μ g/ml之間的 層粘連蛋白。優(yōu)選地，所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基包含大約lOOOng/ml的所述合成嵌合蛋白，大約 100ng/ml的bFGF，大約35ng/ml激活素-A和大約40 μ g/ml的層粘連蛋白。優(yōu)選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方式中，所述VN氨基酸序列是成熟玻連蛋白的第1至64位氨基酸殘基。在第三方面，本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含培養(yǎng)容器以及第一方面的細(xì)胞培 養(yǎng)基或第二方面的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。在第四方面，本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括在第一方面的細(xì)胞培養(yǎng)基、第二方 面的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和/或第三方面的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)一或多種細(xì)胞的步驟。
優(yōu)選地，所述一或多種細(xì)胞是飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞類型。更優(yōu)選地，所述一或多種細(xì)胞是hES細(xì)胞或角化細(xì)胞。在第五方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含一或多種根據(jù)第四方面的方法產(chǎn)生 的細(xì)胞以及藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在優(yōu)選的實施方式中，所述藥物組合物包含一或多種選自以下一組的細(xì)胞hES 細(xì)胞、角化細(xì)胞和角化細(xì)胞前體細(xì)胞。在第六方面，本發(fā)明提供輸送根據(jù)第四方面培養(yǎng)的一或多種細(xì)胞的方法，其包括 將第五方面的藥物組合物輸送給個體以便促進所述個體中的一或多種細(xì)胞的更新、細(xì)胞遷 移和/或增殖。可以理解，在上述個方面中，一或多種飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子包括其生物學(xué)活性片段。在說明書全文中，除非另有說明，否則“包含”應(yīng)被理解為指的是包括所述的元素 或元素的組，但并不排出任何其他元素或元素的組。


為了使得本發(fā)明易于理解并易于付諸實施，以下通過參考所附附圖通過舉例的方 式描述優(yōu)選的實施方式，在附圖中，相同的附圖標(biāo)號指的是相同的部分，其中圖1 剔除血清替換(KSR) (Invitrogen)培養(yǎng)基與玻連蛋白 IGFBP3 IGF-I bFGF (VN GF-hES)培養(yǎng)基 SDS-PAGE 分析。用于比較 VN GF-hES 培養(yǎng)基與 KSR 培養(yǎng)基的10%梯度聚丙烯酰胺凝膠。泳道含有M)250kDa標(biāo)記物；1)0. 1 μ L KSR ；2) IOyL VN:GF-hES培養(yǎng)基。分子量標(biāo)記物來自Amersham Biosciences。圖2 生長于KSR和VN:GF-hES培養(yǎng)條件中的hES細(xì)胞和MEF細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。使 用含A)KSR和E) VN:GF-hES的培養(yǎng)基增殖MEF細(xì)胞。使用含B) KSR和F) VN:GF-hES的培養(yǎng) 基增殖hES細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)于含C) KSR和G) VN:GF-hES的培養(yǎng)基中時，hES細(xì)胞表達小鼠抗 Oct-4抗體識別的標(biāo)記物。當(dāng)培養(yǎng)于含D)KSR和H) VN:GF-hES的培養(yǎng)基中時，hES細(xì)胞表達 小鼠抗Tra 1-81抗體識別的標(biāo)記物(標(biāo)度線= 200um)。圖3 =RT-PCR分析分離自hES細(xì)胞的mRNA，所述hES細(xì)胞生長于KSR和VN:GF-hES 培養(yǎng)條件。(A) RT-PCR分析來自生長于KSR培養(yǎng)條件的hES細(xì)胞的mRNA。泳道含有M) IOObp DNA 梯；l)18sRNA 內(nèi)標(biāo)(151bp 條帶)；2) ISsRNA 陰性對照；3) AP (177bp 條帶)；4) AP 陰性對 照；5)0ct-4(169bp條帶)；和6) Oct-4陰性對照。(B)RT-PCR分析來自生長于VN: GF-hES 培養(yǎng)條件的hES細(xì)胞的mRNA。泳道含有M) IOObp DNA梯；1) 18sRNA內(nèi)標(biāo)(151bp條帶)； 2) ISsRNA 陰性對照；3)AP(177bp 條帶)；4)AP 陰性對照；5)0ct_4(169bp 條帶)；6)和 0ct_4 陰性對照。圖4 二維分離僅收集自MEF細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。(A)收集自MEF細(xì)胞的條件培養(yǎng) 基(CM)的第一維分離。第一維分離包括注入濃縮自MEF CM的0. 8mg蛋白質(zhì)并使用0_500mM NaCl梯度分離。(B)然后收集隨后的級份并進行使用0-100%ACN梯度的第二維分離，如材 料和方法部分所述。所示數(shù)據(jù)代表所進行的一式三份的分析。圖5 二維分離收集自MEF:hES細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基。(A)收集自MEF:hES細(xì) 胞的CM的第一維分離。第一維分離包括注入濃縮自MEF:hES細(xì)胞CM的0. 8mg蛋白質(zhì)并使 用0-500mM NaCl梯度分離。(B)然后收集隨后的級份并進行使用0-100% ACN梯度的第二維分離，如材料和方法部分所述。所示數(shù)據(jù)代表所進行的一式三份的分析。圖6 使用玻連蛋白IGFBP3:IGF-I:EGF(VN:GF -KC)培養(yǎng)基增殖用于蛋白質(zhì)
組學(xué)分析的第二代角化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)記物表達。無血清分離原代角化細(xì)胞， 隨后使用(A)含有血清的培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細(xì)胞層增殖，或(B)使用VN:GF-Kc培養(yǎng)基并結(jié)合飼 養(yǎng)細(xì)胞層進行無血清分離。第4天，以針對(C)角蛋白6和(D)角蛋白14的抗體探測角化 細(xì)胞，以評價使用VN:GF-Kc增殖的原代角化細(xì)胞是否仍然是未分化的。每兩天自三份不同 的患者樣品收集條件培養(yǎng)基(標(biāo)度線=IOOum) (η = 3，圖像來自所分析的3個不同患者樣 品這的代表性培養(yǎng)物)。圖7 二維分離條件培養(yǎng)基。培養(yǎng)基收集自(A)僅飼養(yǎng)細(xì)胞和(B)飼養(yǎng)細(xì)胞角化 細(xì)胞培養(yǎng)物。第一維分離包括將濃縮自條件培養(yǎng)基的Img蛋白質(zhì)注入到0-500mMNaCl梯度 上。隨后，收集級份并進行使用0-100% ACN梯度的第二維分離，如材料和方法部分所述。 (匯集了來自3個不同患者培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基)。圖8 無飼養(yǎng)細(xì)胞和血清的hES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和標(biāo)記物分析。hES細(xì)胞增殖15 代，并通過以下指標(biāo)監(jiān)測細(xì)胞分化=A)形態(tài)學(xué)、B)DAPI, C)SSEA-4、D)0ct4、Ε) SSEAl和F) TRA1-60。圖9 實時PCR分析表達于未分化的干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄物。hES細(xì)胞增殖15代，針對 以下指標(biāo)進行實時 PCR :Dppa、REX、TERT, UTF1、S0X2、F0XD4、Nanog 和 0ct4。發(fā)明詳述通過對飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型系統(tǒng)中的旁分泌相互作用進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析而產(chǎn)生本 發(fā)明。更具體地，本發(fā)明人假設(shè)對飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型系統(tǒng)的體外微環(huán)境進行表征可能會鑒定 到由飼養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞生長所需的因子。這種蛋白組學(xué)方法的關(guān)鍵在于 使用VN:GF培養(yǎng)基檢測條件培養(yǎng)基，所述VN:GF培養(yǎng)基成分清楚并具有最小的蛋白含量。使 用這種細(xì)胞培養(yǎng)基消除了外源性蛋白質(zhì)對飼養(yǎng)細(xì)胞所分泌的關(guān)鍵因子的“掩蓋”，所述關(guān)鍵 因子對飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞生長可能具有重要作用。利用這種分析方法，本發(fā)明人在上述體外微環(huán)境中鑒定到由飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的一些 因子。因此，可使用這些因子來配制出明確定義的非細(xì)胞條件培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞，由此消除 了對飼養(yǎng)細(xì)胞的需求。因此本發(fā)明使得對細(xì)胞生長所用的飼養(yǎng)細(xì)胞非依賴型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 和培養(yǎng)基的研發(fā)取得的重大進展。本領(lǐng)域人員可以理解，本發(fā)明可廣泛用于任何細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，用于生長來自人類 和非人類細(xì)胞的細(xì)胞，使之能夠以飼養(yǎng)細(xì)胞非依賴型方式生長。僅舉例而言，本發(fā)明可用于 鼠ES細(xì)胞。在本發(fā)明中，“飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子”指的是這樣的蛋白質(zhì)，當(dāng)其被納入細(xì)胞培養(yǎng)基 中時，其模擬、取代或代替飼養(yǎng)細(xì)胞的一或多種功能和/或特性。更具體地，感興趣的功能 包括促進飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞的粘附、增殖和/或保持其活力，但不限于此。本發(fā)明也預(yù)期飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的生物學(xué)活性片段的用途。術(shù)語“蛋白質(zhì)”指的是氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，D-或 L-氨基酸，這是本領(lǐng)域人員所熟知的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括并涵蓋“肽”和“多肽”，“肽”通常用于描述不超過五十(50)個 氨基酸的蛋白質(zhì)，“多肽”通常用于描述超過五十(50)個氨基酸的蛋白質(zhì)。
在一個實施方式中，所述“生物學(xué)活性片段”的生物學(xué)活性不低于衍生出該片段的 蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的10%、優(yōu)選地不低于25%、更優(yōu)選地不低于50%且甚至更優(yōu)選地不 低于 75、80、85、90 或 95%。部分由于飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型系統(tǒng)旁分泌相互作用的復(fù)雜性，對在此所述的條件培養(yǎng) 基的蛋白組學(xué)分析證實，存在大量適合用作飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的蛋白質(zhì)。僅舉例而言，合適 的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)類、生長因子、細(xì)胞信號和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和生 長因子受體，但不限于此。在優(yōu)選的實施方式中，所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子選自以下一組人 生長激素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15、生長分化因子9(GDF_9)、巨核細(xì)胞集落刺激因子、分泌型卷 曲相關(guān)蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝細(xì)胞生 長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGF-a)、TGF-i3、神經(jīng)生長因子、血小板衍生的生長因 子-β (PDGF-β)、PC-衍生的生長因子(progranulin)、白細(xì)胞介素(IL)-U IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 和激活素-A。更優(yōu)選地，所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子選自以下一組人生長激素、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白15、生長分化因子9、巨核細(xì)胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關(guān)蛋白2、 Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子和激活素-A。甚至更優(yōu)選地，所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子是激活素-A。在其他通用的實施方式中，所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子可選自表1、表 2、表3、表4和表5中所列的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明提出將一或多種上述飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子納入細(xì)胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)飼 養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞。預(yù)期基于使用一或多種(本文所述的)飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子或其他分離 的和/或合成的蛋白質(zhì)成分配制本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，術(shù)語“分離的”指的是物質(zhì)已經(jīng)從其天然狀態(tài)中取出或已經(jīng)以其他方 式進行人工處理。分離的物質(zhì)可以基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含那些天然狀態(tài)下通常與其伴隨的成 分，或者可以被操控使得其與那些天然狀態(tài)下通常與其伴隨的成分一起處于人工狀態(tài)。分 離的物質(zhì)可以是天然或重組形式的。在本發(fā)明中，術(shù)語"合成的"指的是非天然存在的，而是通過人工技術(shù)干預(yù)制備 的。就合成的蛋白質(zhì)而言，這包括通過重組或化學(xué)合成以及本領(lǐng)域人員熟知的組合技術(shù)而 產(chǎn)生的分子。本發(fā)明的一個特別的優(yōu)勢在于，在優(yōu)選的實施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基和系統(tǒng)可 以添加生長因子而非所述一或多種飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子。有利地，此類生長因子在缺乏血清的情況下刺激離體(ex vivo)原代細(xì)胞培養(yǎng)物 產(chǎn)生顯著的增殖應(yīng)答。在通用的方面中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基包含合成嵌合蛋白通過結(jié)合并共活化生長 因子受體(例如IGF-I受體)和VN-結(jié)合整聯(lián)蛋白受體而刺激細(xì)胞遷移和/或增殖。在優(yōu) 選的實施方式中，所述合成嵌合蛋白包含IGF氨基酸序列和VN氨基酸序列。典型地，但不 限于此，所述合成嵌合蛋白包含成熟VN的結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的結(jié)構(gòu)域以及IGF或至少可結(jié) 合的IGF受體的IGF結(jié)構(gòu)域。國際公開文本W(wǎng)004/069871給出了合適的合成嵌合蛋白的非 限制性實例，通過引用將該文獻并入本申請。
優(yōu)選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。在優(yōu)選的通用實施方式中，VN氨基酸序列是VN(且特別是成熟VN)上能夠結(jié)合 αν整聯(lián)蛋白的任何部分或結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實施方式中，所述VN氨基酸序列是成熟VN的1至64位氨基酸殘基。本發(fā)明還預(yù)期將接頭序列納入上述合成嵌合蛋白(但不限于此)，如國際公開文 本TO04/069871所描述的那樣，其提供了合適的接頭序列的通用實例，通過引用將該文獻 并入本申請。優(yōu)選地，所述接頭序列包含一或多個甘氨酸殘基。更優(yōu)選地，所述接頭序列還包含一或多個絲氨酸殘基。在優(yōu)選的實施方式中，所述接頭序列包含Gly4Sert5在特別優(yōu)選的實施方式中，所述接頭序列為(Gly4Ser)4。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述合成嵌合蛋白包含IGF-I、(Gly4Ser)4接頭序列和 成熟玻連蛋白的第1至64位氨基酸殘基(以下稱為IGF-I/1-64VN)。在特別優(yōu)選的實施方 式中，IGF-I/1-64VN是單一的連續(xù)的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含分離的含IGF的蛋白質(zhì)復(fù) 合物形式的生長因子，其中IGF選自IGF-I和IGF-II。在另一優(yōu)選的實施方式中，其預(yù)期加入分離的含IGF的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中IGF是 IGF-II，所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含玻連蛋白。在另一優(yōu)選的實施方式中，預(yù)期加入IGF-I，所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含IGFBP和VN。適當(dāng)?shù)?，IGFBP選自 IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 和 IGFBP-6。優(yōu)選地，所述IGFBP 是 IGFBP-3 或 IGFBP-5。在存在IGF-II和VN或IGF-I、IGFBP和VN的實施方式中，這些蛋白質(zhì)可被納入蛋 白質(zhì)復(fù)合物中，例如見國際公開文本W(wǎng)002/24219所述的那樣。根據(jù)上述內(nèi)容可以容易地理解，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以是非共價結(jié)合 的寡蛋白復(fù)合物形式，或寡蛋白復(fù)合物已經(jīng)被共價交聯(lián)(可逆性或不可逆性)，但不限于 此。適當(dāng)?shù)?，所述一或多種飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子以促進細(xì)胞生長和增殖的濃度存在于細(xì) 胞培養(yǎng)基中。在通用的優(yōu)選實施方式中，所述或每一分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃度適合 于支持細(xì)胞活力、維持、再生和/或增殖且優(yōu)選地在0. lng/ml和50μ g/ml之間。更優(yōu)選 地，所述或每一分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃度可以在0. lng/ml和50 μ g/ml之間，且 更優(yōu)選地為 lng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、25ng/ml、30ng/ ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、lOOng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ ml、350ng/ml、400ng/ml 500ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、lOOOng/ml、1500ng/ml ,且甚至更 優(yōu)選地為 2 μ g/ml>3 μ g/ml>4 μ g/ml>5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml、25 μ g/ml、 30 μ g/ml>35 μ g/ml、40 μ g/ml, 45 μ g/ml 禾口 50 μ g/ml?？梢匀菀椎乩斫?，本發(fā)明適合用于依賴飼養(yǎng)細(xì)胞或其他飼養(yǎng)細(xì)胞替代技術(shù)(例 如，基質(zhì)膠或高細(xì)胞外基質(zhì)濃度)而增殖的任何細(xì)胞類型。
通常，此類飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞需要復(fù)雜的營養(yǎng)，其生長需要血清，并需要來自飼 養(yǎng)細(xì)胞的分泌和可溶性因子才能生長和增殖。例如參照多能細(xì)胞或原代細(xì)胞培養(yǎng)物，其還 希望將細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)用于進一步的用途，特別是治療用途。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。在另一優(yōu)選的實施方式中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞是角化細(xì)胞。本發(fā)明的一個特別的優(yōu)勢是飼養(yǎng)細(xì)胞非依賴型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其不需要血清或僅 需要極少的血清。因此在特定方面中，本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)基和系統(tǒng)，其包含一或多種飼養(yǎng)細(xì)胞替 代因子，由此不需要外源性的動物來源的因子，例如飼養(yǎng)細(xì)胞和血清，或者對其需求僅為顯 著降低的水平，由此仍維持細(xì)胞生長和/或活力。因此可以理解，“不含血清或血清的量在缺乏IGF時不能支持細(xì)胞的生長〃指的 是沒有血清，或血清的量或濃度顯著低于細(xì)胞體外生長和/或增殖通常所需的最佳的量或 濃度。術(shù)語"血清"指的是來自血液的成分，其包含大量的大分子、脂類物質(zhì)和微量元 素的載體蛋白、細(xì)胞粘附和擴散因子、小分子量營養(yǎng)物以及激素和生長因子。在操作上，血 清可被定義為是去除紅細(xì)胞、血小板和血漿中的凝結(jié)成分之后所剩的蛋白質(zhì)性無細(xì)胞血液 成分。細(xì)胞培養(yǎng)最常用的血清成分是胎牛血清，即FBS，不過也可使用成體牛血清、馬血清及 其蛋白質(zhì)成分(例如Fraction V血清白蛋白)。典型地，哺乳動物細(xì)胞需要5-10%之間的血清，這取決于細(xì)胞類型、培養(yǎng)時間、是 否存在飼養(yǎng)細(xì)胞和/或培養(yǎng)系統(tǒng)的其他細(xì)胞成分以及本領(lǐng)域人員已知的其他因素。因此，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明預(yù)期了低于5%的血清，更優(yōu)選地低于2%的 血清，甚至更優(yōu)選地低于的血清或有利地不超過0. 5%、0. 4%、0. 3%或0. 2%的血清 (ν/ν)。在特別有利的實施方式中，本發(fā)明預(yù)期了無血清或不超過0.5%或0.25%的血清 (ν/ν)。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的培養(yǎng)基可包含其他明確的成分。非限制性的且在一些情況中任 選的成分包括一些熟知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如DMEM或Ham' s培養(yǎng)基，抗生素例如鏈霉素或青 霉素、人血清白蛋白(HSA)、磷脂類(例如，磷脂酰膽堿)、鞘磷脂、激活素-A、氨基酸補充物 例如L-谷氨酰胺、抗氧化劑例如β -巰基乙醇、緩沖液例如碳酸鹽緩沖液、HEPES和二氧化 碳源，后者通常由細(xì)胞培養(yǎng)箱提供。本發(fā)明也預(yù)期使用額外的生物學(xué)活性蛋白或其片段，它們可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、 存活和/或遷移，例如胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、胰島素樣生長因子-II (IGF-II)、層 粘連蛋白、表皮生長因子(EGF;Heldin等，1981，Science 41122-1123)、成纖維細(xì)胞生長 因子(FGF ；Nurcombe 等，2000，J. Biol. Chem. 275 30009-30018)、堿性成纖維細(xì)胞生長因 子(bFGF ；Taraboletti 等，1997，細(xì)胞生長.Differ. 8471-479)、骨橋蛋白(Nam 等，2000， Endocrinol. 141 1100)、凝血酶敏感蛋白(Nam等，2000，見上文)、腱糖蛋白-C(Arai 等，1996，J. Biol. Chem. 2716099)、PAI-I (Nam 等，1997，Endocrinol. 1382972)、纖溶酶原 (Campbell 等，1998，Am. J. Physiol. 275E321)、纖維蛋白原(Campbell 等，1999，J. Biol. Chem 27430215)、纖維蛋白(Campbell 等，1999，見上文)或轉(zhuǎn)鐵蛋白(Weinzimer 等，2001，J. Clin. Endocrinol. Metab. 861806)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)基還包含選自以下一組的一或多種額外的生物學(xué)活 性蛋白EGF、bFGF、IGF-I、IGF-II和層粘連蛋白。更優(yōu)選地，所述一或多種額外的生物學(xué)活性蛋白選自bFGF和層粘連蛋白。本領(lǐng)域人員了解層粘連蛋白是真核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白家族，它們由至少三種 不完全相同的鏈(α、β、和Y鏈)組成，并通過α、β、和Y鏈的不同組合而產(chǎn)生一些不 同的亞型。不同層粘連蛋白亞型的非限制性實例包括層粘連蛋白-1、層粘連蛋白_2、層粘 連蛋白_3、層粘連蛋白_4、層粘連蛋白-5、層粘連蛋白-5Β、層粘連蛋白-6、層粘連蛋白-7、 層粘連蛋白_8、層粘連蛋白-9、層粘連蛋白-10、層粘連蛋白-12、層粘連蛋白-13、層粘連蛋 白-14和層粘連蛋白-15、但不限于此。也預(yù)期在優(yōu)選的實施方式中，所述層粘連蛋白是前 述層粘連蛋白亞型的組合。還應(yīng)進一步理解，層粘連蛋白可以是任何來源的，但要合適納入 細(xì)胞培養(yǎng)基中，特別是具有治療用途的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基，例如來源于小鼠、豬、人、羊，但不 限于此。在特別優(yōu)選的實施方式中，層粘連蛋白是來自Millipore的CatalogueNo. CC095。在優(yōu)選的實施方式中，所述一或多種額外的生物學(xué)活性蛋白的終濃度可以在 0. lng/ml 直至 50μ g/ml、60y g/ml、70y g/ml、80y g/ml、90y g/ml 或 ΙΟΟμ g/ml 之間。優(yōu) 選地，所述一或多種額外的生物學(xué)活性蛋白的終濃度可以在0. lng/ml和50μ g/ml之間， 且更優(yōu)選地為 50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、lOOOng/ml、1500ng/ml 和甚至更優(yōu) 選地為 2 μ g/ml>5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml、25 μ g/ml、30 μ g/ml、35 μ g/ml、 40 μ g/ml 禾口 45 μ g/ml。在包括層粘連蛋白的特別優(yōu)選的實施方式中，層粘連蛋白的濃度可達50 μ g/ ml (或有利地每IOcm2細(xì)胞培養(yǎng)皿面積25-100 μ g)，且優(yōu)選地在10 μ g/ml和40 μ g/ml之 間。在通用的方面中，本發(fā)明提供胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。具體而言，所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng) 基包含大約250ng/ml和lOOOng/ml之間的包含IGF氨基酸序列和VN氨基酸序列的合成嵌 合蛋白，大約50ng/ml和100ng/ml之間的bFGF，大約25ng/ml和50ng/ml之間的激活素-A 和大約10和大約50 μ g/ml之間的層粘連蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基包含大約lOOOng/ml的IGF氨基酸序 列與VN氨基酸序列的合成嵌合蛋白，大約lOOng/ml的bFGF，大約35ng/ml激活素-A和大 約40 μ g/ml層粘連蛋白。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述合成嵌合蛋白是IGF-I/1-64VN。根據(jù)前述內(nèi)容，本領(lǐng)域人員可容易地理解，可通過本領(lǐng)域人員熟知的任何合適方 法產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)，且特別是所述分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子。本發(fā)明也預(yù)期所述分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的變體。在一個實施方式中，“變體” 的一或多個氨基酸已經(jīng)被不同的氨基酸取代。本領(lǐng)域人員熟知，可以將一些氨基酸改變?yōu)?具有大體相似特性的其他氨基酸，而不改變蛋白質(zhì)的活性的性質(zhì)(保守性取代)。在一個實施方式中，變體與在此所述的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、優(yōu) 選地至少80 %、更優(yōu)選地至少90 %且有利地至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的序列相同 性。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的合成蛋白質(zhì)的至少60%、更優(yōu)選地至少75%、甚至更優(yōu)選地 至少90%和有利地在本發(fā)明的合成蛋白質(zhì)的基本上全長范圍測量序列相同性。為了確定百分比序列相同性，可通過計算機化運行的算法(Geneworksprogram by Intelligenetics ；GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in theffisconsin Genetics Software Package Release 7. 0, Genetics Computer Group,575Science Drive Madison, WI, USA, 通過引用將其并入本申請)或通過觀察而進行氨基酸和/或核苷酸序列的最佳比對，并通 過所選擇的任一方法產(chǎn)生最佳比對(即，在比較窗上產(chǎn)生最高的百分比同源性)?？蓞⒖?BLAST程序，例如Altschul等，1997，Nucl. Acids Res. 253389，通過引用將其并入本申請。在另一實例中，“序列相同性”可以理解為指的是通過DNASIS計算機程序 (Version 2. 5for windows ；可獲自 Hitachi Software engineering Co. , Ltd. , South San Francisco, California, USA)計算出的“匹配百分比”。有關(guān)序列分析的詳細(xì)討論可參見Unit 19. 3of CURRENT PR0T0C0LSIN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel 等(John Wiley & Sons Inc NY，1995-1999)。本發(fā)明還預(yù)期在此所述的任何蛋白質(zhì)的衍生物且特別是飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的衍 生物。在本發(fā)明中，“衍生物”已經(jīng)通過例如添加、綴合其他化學(xué)部分或與之復(fù)合或通過 本領(lǐng)域人員已知的翻譯后修飾技術(shù)而改變?！疤砑印卑被峥砂ㄅc其他肽或多肽融合。其他肽或多肽例如可以輔助該蛋白質(zhì) 的純化。例如這包括多組氨酸標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)、A蛋白或谷胱甘 肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。本發(fā)明預(yù)期的其他衍生物包括，但不限于，修飾側(cè)鏈、加入非天然氨基酸和/或蛋 白質(zhì)合成過程中的其他衍生物以及使用交聯(lián)劑和其他對蛋白質(zhì)造成構(gòu)象限制的方法。本發(fā) 明預(yù)期的側(cè)鏈修飾的非限制性實例包括修飾氨基酸，例如通過乙酸酐進行?；灰远《?和四氫鄰苯二甲酸酐對氨基進行?；?；以乙酰亞氨基甲酯進行脒基化；以氰酸鹽對氨基進 行氨甲酰化；以5-磷酸吡哆醛對賴氨酸進行pyridoxylation，隨后以NaBH4還原；通過與 醛反應(yīng)隨后以NaBH4還原進行還原烷基化；以及以2，4，6_三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基進 行三硝基芐化作用?？赏ㄟ^多種方法修飾氫硫基，例如以過甲酸氧化為磺基丙氨酸；使用4-氯汞基苯 磺酸、4-氯汞苯甲酸、2-chloromercuri-4-nitrophenol、氯化苯汞和其他汞制劑形成汞衍 生物；與其他巰基化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其他取代的馬來 酰亞胺反應(yīng)；以碘乙酸或碘乙酰胺進行羧甲基化；和以氰酸鹽在堿性PH進行氨甲酰化。通過以焦碳酸二乙酯進行N-乙氧甲酰基化或通過以碘乙酸衍生物進行烷基化而 修飾組氨酸殘基的咪唑環(huán)。在肽合成過程中摻入非天然氨基酸和衍生物的實例包括但不限于使用4-氨基丁 酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、叔丁甘氨酸、 正亮氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu) 體。對蛋白質(zhì)進行化學(xué)衍生化的其他實例參見Chapter 15of CURRENTPR0T0C0LS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan 等，John Wiley & Sons NY(1995-2001)。
根據(jù)本發(fā)明，可通過本領(lǐng)域人員已知的任何合適的方法制備蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是基本上純的天然形式。在其他實施方式中，可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)?；瘜W(xué)合成技術(shù)是本領(lǐng)域人 員已知的，合適的方法學(xué)的實例可參見Chapter 18 of CURRENTPR0T0C0LS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan 等，John Wiley & Sons NY(1995-2001)。在其他實施方式中，制備的蛋白質(zhì)可以是重組蛋白。本領(lǐng)域人員熟知如何產(chǎn)生重組蛋白，標(biāo)準(zhǔn)方案的實例例如可參見Sambrook等， MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold SpringHarbor Press，1989)，通過引用 將其并入本申請，特別是 16 和 17 節(jié)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel等，(Johnffiley & Sons, Inc. 1995-1999)，通過引用將其并入本申請，特別是10和 16章；和CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan等，(John Wiley & Sons， Inc. 1995-1999)，通過引用將其并入本申請，特別是第1、5和6章。重組蛋白可還包含融合配偶體。熟知的融合配偶體的實例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，人IgG的 Fc部分、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和六組氨酸(HIS6),它們對于通過親和層析來分離融合蛋 白特別有用。為了通過親和層析純化融合蛋白，有關(guān)的親和層析基質(zhì)分別為以谷胱甘肽_、 直鏈淀粉_、和鎳_或鈷_綴合的樹脂。許多此類基質(zhì)可以“試劑盒”的形式獲得，例如使用 (HIS6)融合配偶體的QIAexpress 系統(tǒng)(Qiagen)以及Pharmacia GST純化系統(tǒng)。在一些情況中，融合配偶體還具有蛋白酶裂解位點，例如因子Xa或凝血酶的位點， 這允許通過相關(guān)的蛋白酶對本發(fā)明的融合蛋白進行部分消化，由此從中釋放出重組蛋白。 經(jīng)隨后的層析分離可從融合配偶體分離釋放出的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的融合配偶體還包括“表位標(biāo)簽”，它們通常是短肽序列，具有相應(yīng)的特異 性抗體。熟知的表位標(biāo)簽的實例包括c-myc、血細(xì)胞凝集素和FLAG標(biāo)簽，可容易地獲得針對 它們的特異性單克隆抗體。適合用于表達的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，例如大腸桿菌 (Escherichia coli)(例如DH5 α )、酵母細(xì)胞、利用桿狀病毒表達系統(tǒng)的Sf9細(xì)胞、CHO細(xì) 胞、COS、CV-I、NIH 3T3和HEK293細(xì)胞，但不限于此?？赏ㄟ^向飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞中弓I入表達構(gòu)建體而實現(xiàn)重組蛋白表達。典型地，表達構(gòu)建體包含可操作地連接于啟動子的待表達核酸(編碼重組蛋白)。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。組成型或誘導(dǎo)型包括，例如，四環(huán)素-阻抑型、蛻皮激素-誘導(dǎo)型、酒精-誘導(dǎo)型和 金屬硫蛋白-誘導(dǎo)型啟動子。啟動子可以是天然存在的啟動子(例如α晶狀體蛋白啟動 子、ADH啟動子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、人延伸因子α啟動子和病毒啟動子例如SV40、 CMV, HTLV-衍生的啟動子)，或是合成的雜合啟動子，它們組合了一種以上啟動子的元件 (例如SRa啟動子)。在優(yōu)選的實施方式中，所述表達載體包含選擇標(biāo)記物基因。選擇標(biāo)記物可用于選 擇轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如bla、kanR和tetR)或轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞(例如潮霉素、G418和嘌 呤霉素)?？赏ㄟ^熟知的技術(shù)將表達構(gòu)建體引入飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞，且特別是哺乳動物細(xì)胞，例如電穿孔、微粒轟擊、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、磷酸鈣沉淀、DEAE-Dextran、陽離子脂質(zhì) 體、脂轉(zhuǎn)、陽離子脂質(zhì)體(lipofectamine)等等，但不限于此?？捎糜趯⒑怂彷斔椭羑ES的技術(shù)的非限制性實例可參見Kobayashi等，2005， Birth Defects Research Part C Embryo Today :Reviews,7510—18。適合于在角化細(xì)胞中表達重組生長因子蛋白的方法的非限制性具體實例可參見 Supp 等，2000，J. Invest. Dermatol. 1145 和 Supp 等，2000，WoundRepair Regen. 826—35。藥物組合物本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含使用本發(fā)明的培養(yǎng)基和/或系統(tǒng)產(chǎn)生的一或多 種細(xì)胞，例如hES細(xì)胞和角化細(xì)胞，但不限于此，以及藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可用于促進或有助于細(xì)胞遷移、組織更新和傷口愈合。通常，本發(fā)明的組合物可按需用于治療或預(yù)防用途。例如，可施用治療或美容制劑 形式的包含hES細(xì)胞、角化細(xì)胞或角化細(xì)胞前體細(xì)胞的藥物組合物用于修復(fù)皮膚、傷口愈 合、燒傷愈合和其他皮膚病治療。優(yōu)選地，所述藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑適合用于施用給哺乳動物，優(yōu)選 地施用給人。在具體的實施方式中，藥物組合物包含按照本發(fā)明培養(yǎng)的自體或同種基因hES細(xì) 胞或角化細(xì)胞。術(shù)語“藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”指的是固體或液體填充物、稀釋劑或 包囊化物質(zhì)，它們可安全地用于全身施用。根據(jù)具體的施用途徑，可使用本領(lǐng)域人員已知的 多種載體。這些載體可選自蔗糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽瓊脂、明膠、滑石粉、硫酸 鈣、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸緩沖液、乳化劑、等滲鹽水和鹽例如礦物鹽(包括 鹽酸鹽、溴化物和硫酸鹽)、有機酸例如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽以及無熱源的水。描述藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的參考文獻可見 Remington' sPharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991),通過弓|用將 其并入本申請。可采用任何合適的施用途徑給患者提供本發(fā)明的組合物。例如，可采用口服、直 腸、胃腸外、舌下、含服、靜脈、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹腔內(nèi)腦室內(nèi)、經(jīng)皮 等途徑。劑量形式包括片劑、分散劑、混懸劑、注射劑、溶液、糖漿、含片、膠囊、栓劑、氣霧 劑、經(jīng)皮貼片等等。這些劑量形式還可包括專用的注射或植入式控釋裝置或在此基礎(chǔ)上改 進的其他植入形式?？赏ㄟ^包衣實現(xiàn)控釋制劑，例如，使用疏水性聚合物，包括丙烯酸樹脂、石蠟、高碳 脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸，以及某些纖維素衍生物，例如羥丙基甲基纖維素?？赏ㄟ^采用 其他聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球體而實現(xiàn)控釋?？蒯屩苿┖洼斔脱b置的非限制性實例 包括滲透泵、基于聚丙交酯共乙交酯(PLG)聚合物的微球體、基于水凝膠的聚合物、化學(xué)交 聯(lián)的葡聚糖凝膠例如OctoDEX 和dex-lactate-HEMA?？刹捎眠m合劑量配制品的施用方式和藥用有效量來施用上述組合物。在本發(fā)明 中，給患者施用的劑量應(yīng)該足以使得患者在合適的時間段內(nèi)產(chǎn)生有益的應(yīng)答。藥物施用的 量取決于待治療的個體，包括其年齡、性別、體重和一般健康狀況、以及從業(yè)者所要考慮的因素。就用于傷口愈合的藥物組合物而言，可具體參考美國專利5，936，064和國際公開 文本W(wǎng)099/62536，通過引用將它們并入本申請。在涉及角化細(xì)胞的一個具體實施方式
中，本發(fā)明的組合物適合于原位噴霧施用。術(shù)語〃噴霧〃涵蓋并包括例如〃氣溶膠〃或〃霧〃或〃冷凝物〃等通常描述小 滴形式的液體混懸物的術(shù)語。治療用途本發(fā)明的用于增殖飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基、系統(tǒng)和方法的一個漢族要 用途是治療用途。在特定方面，本發(fā)明預(yù)期用于輸送根據(jù)前述方法培養(yǎng)產(chǎn)生的一或多種細(xì)胞的方 法，其包括給個體輸送前述藥物組合物的步驟。本方法特別用于治療哺乳動物且特別是人。不過，本領(lǐng)域人員可以理解本發(fā)明也 可用于獸醫(yī)領(lǐng)域，用于治療寵物、家畜和表演動物。按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)的hES細(xì)胞的治療用途包括，但不限于，組織再生、組織移 植或組織更新，但不包括產(chǎn)生有可能被認(rèn)為是人類的實體的方法。此類方法的非限制性實 例包括使卵子受精的方法、通過分裂在4細(xì)胞階段進行克隆的方法以及通過置換核DNA進 行克隆的方法。ES細(xì)胞且特別是hES細(xì)胞的治療用途的非限制性實例包括Shufaro等，2004, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 18(6) :909_27。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供用于離體增殖原代角化細(xì)胞的培養(yǎng)基、培 養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法，根據(jù)本發(fā)明，可將所述細(xì)胞施用于個體。在具體的實施方式中，所述角化細(xì)胞是按照本發(fā)明培養(yǎng)的自體或同種基因角化細(xì) 胞。此類方法包括施用前述藥物組合物，可以通過微針注射至特定組織部位，例如參 見美國專利6，090, 790，以局部乳劑、洗劑或密封敷料的形式施用于創(chuàng)傷、燒傷或潰瘍處， 例如參見美國專利6，054，122，或是釋放所述組合物的植入物，例如參見國際公開文本 W09/47070。還可通過其他方法對皮膚細(xì)胞進行遺傳學(xué)修飾以便產(chǎn)生皮膚替代物，例如通過對 所需生長因子表達進行遺傳工程化(Supp等，2000，J. Invest. Dermatol. 1145)。這一領(lǐng)域 的綜述例如參見 Bevan 等，Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16231。還預(yù)期將轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞“種植”于受者，例如參見國際公開文本W(wǎng)099/11789。還可使用這些方法刺激細(xì)胞遷移并由此促進或加快傷口和燒傷愈合、修復(fù)皮膚病 變例如潰瘍、組織替代和移植例如通過體外培養(yǎng)自體皮膚、內(nèi)部器官例如腎臟和肺的上皮 重新生成以及修復(fù)損傷的神經(jīng)組織。皮膚替代治療已經(jīng)為本領(lǐng)域人員所知，其可采用共培養(yǎng)上皮/角化細(xì)胞細(xì)胞系， 例如參見Kehe等，1999，Arch. Dermatol. Res. 291600，或體外培養(yǎng)原代(通常是自體)表 皮、真皮和/或角化細(xì)胞。這些技術(shù)也使用工程化的生物材料和合成的聚合物“支架”。這一領(lǐng)域的綜述例如可參見Terskikh & Vasiliev, 1999, Int. Rev. Cytol. 18841 禾口 Eaglestein & Falanga, 1998, Cutis 621。
更具體地，Izumi等，2000，J. Dent. Res. 79 798描述了如何產(chǎn)生可用于顱面手術(shù) 的替代口腔粘膜?？审w外擴增胎角化細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生用于移植的皮膚來治療皮 膚病變，例如參見Fauza等，J. Pediatr. Surg. 33 357，同時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)于透明質(zhì)酸 衍生的生物材料上的來自真皮和表皮皮膚元件的皮膚替代物可用于治療燒傷(Zacchi等， 1998，J. Biomed. Mater. Res. 40187)。聚合物支架也可用于促進替代皮膚工程化，例如參見Sheridan等，2000， J. Control Release 14 91和Fauza等，1998，見上文，例如使用微球體作為將皮膚細(xì)胞輸 送至傷口和燒傷處的藥劑(LaFrance & Armstrong，1999，TissueEng. 5153)。通常為治療目的而產(chǎn)生的角化細(xì)胞皮片負(fù)責(zé)燒傷創(chuàng)面的最后閉合。這種皮片移植 技術(shù)適合于所有部分皮層燒傷，且最適合用于治療大面積傷口，在該情況中沒有外界的幫 助幾乎不可能使得傷口和供者部位實現(xiàn)早期永久性閉合。這種類型的損傷是造成不久前巴 厘島爆炸案中燒傷患者死亡的原因。目前無法從來自患者的5角硬幣大小的皮膚活檢樣品生長出足以覆蓋成人全身 的皮膚。這一培養(yǎng)給出需要17天。不過，降低患者創(chuàng)傷、感染風(fēng)險、結(jié)痂以及當(dāng)前需要在永 久皮膚移植之前進行昂貴的臨時皮膚替代等問題均急需進行早期皮膚替代。此外，培養(yǎng)皮 膚的皮片包含多種皮膚細(xì)胞，有效是成熟的，而有些不成熟。單純讓培養(yǎng)的角化細(xì)胞達到匯 合(這是產(chǎn)生皮片所必需的)導(dǎo)致細(xì)胞提前喪失其原始特征，即發(fā)生分化。當(dāng)施加培養(yǎng)的 皮膚皮片時，僅那些未成熟的細(xì)胞能夠粘附并在患者上存活。由于粘附面積小，皮片極易于 因患者的摩擦或運動而損傷，有時可造成整個移植物的脫落，皮片上成熟皮膚細(xì)胞越多，移 植物越有可能不成功，而細(xì)胞本身在創(chuàng)面上將無法增殖和遷移。因此，早期使用不成熟的細(xì) 胞顯然可導(dǎo)致更好的移植物存活并降低疤痕形成。本發(fā)明因此提供噴霧或氣溶膠輸送方法將離體培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞輸送至患者的燒 傷、潰瘍或損傷皮膚處，與現(xiàn)有的皮片移植技術(shù)相比，可使得患者有更多的面積被更多的不 成熟皮膚細(xì)胞所覆蓋。這最早可以在7天時實現(xiàn)。這將顯著降低疤痕形成、休克和熱損失， 并能夠快速恢復(fù)部分皮層燒傷乃至全皮層燒傷的皮膚功能。本發(fā)明所預(yù)期的另一種治療是治療燒傷患者以實現(xiàn)全皮層傷口的早期閉合，因為 同時失去皮膚的表面(表皮)和深層(真皮)的傷口對培養(yǎng)皮膚的接受性很差。本發(fā)明預(yù) 期通過噴霧于皮膚上而使用真皮替代物以便實現(xiàn)早期永久閉合這些最為可怕的損傷。同時 預(yù)期生物學(xué)真皮替代物和合成的真皮替代物。例如，可在包含本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合 物的來自尸體的去表皮化、去細(xì)胞化真皮支架上覆蓋合成的表皮(敷料)。大約7天后，本 發(fā)明人假設(shè)這種真皮將被自體的內(nèi)皮細(xì)胞大量浸潤。此時，去除合成的真皮，并將患者自身 的離體擴增成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞施加到異體真皮(allo-dermis)上。預(yù)期噴霧于皮膚上會獲得成功，而表皮皮片不能，這是因為真皮替代物會起到營 養(yǎng)穩(wěn)定化支架的作用，促進皮膚細(xì)胞和正常出現(xiàn)于皮膚中的其他重要細(xì)胞的遷移和錨定。 這將導(dǎo)致全層皮膚損傷處更好地接受培養(yǎng)的細(xì)胞。因此，本領(lǐng)域人員能夠容易地理解并實施本發(fā)明。以下為非限制性實施例。 實施例實施例1 分析人胚胎干細(xì)胞體外微環(huán)境
材料和方法小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物MEF(SCRC-1046 細(xì)胞系，Cryosite, Lane Cove, Sydney, NSW, AUS)在 80cm2 培養(yǎng) 瓶中擴增 6 代(Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA)，使用 85% Dulbecco' s Modification of Eagle' s 培養(yǎng)基(DMEM) (Invitrogen,MountWaverley, VIC,Australia), 添加了 10%胎牛血清(FBS) (Invitrogen)，2xl(T3M L-谷氨酰胺(Invitrogen)和 1000IU/ mL青霉素/鏈霉素(Invitrogen)，5% C02，37°C。隨后向含有MEF的瓶中加入絲裂霉 素-C(Sigma-Aldrich, CastleHill, NSW, AUS)，將細(xì)胞在 37°C,5% CO2 培養(yǎng) 2. 5 至 3 小時。 給培養(yǎng)皿(10cm2) (Nalge Nunc International)覆蓋 0· 明膠(Sigma-Aldrich)，至少 1 小時后加入MEF。MEF細(xì)胞以20，000細(xì)胞/cm2接種于0. 明膠(Sigma-Aldrich)覆蓋的 IOcm2 (Nalge Nunc International)組織培養(yǎng)皿中，每孔 2. 5mL MEF 培養(yǎng)基。使預(yù)粘附的MEF細(xì)胞血清饑餓2小時，隨后改變?yōu)闊o血清培養(yǎng)基，VN:GF_hES。 該培養(yǎng)基的組成為:K0-DMEM (Invitrogen)，含有 0. 6 μ g/mLVN (Promega, Annandale, NSW, AUS),0. 6μ g/mL IGFBP-3(Tissue TherapiesLtd, Brisbane, QLD, AUS)，0. 2 μ g/ mL IGF-I (GroPep, Adelaide, SA, AUS)，0. 02 μ g/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) (Chemicon，Boronia，VIC，AUS)，2xl(T3M L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1000IU/mL 青 霉素 / 鏈霉素(Invitrogen)，1 μ L/mL β -巰基乙醇(Sigma-Aldrich)和 12ng/mL 白血病抑制因子(LIF) (Chemicon)。培養(yǎng)的MEF細(xì)胞總共為5個IOcm2/孔培養(yǎng)皿 (NalgeNunc-International)，添加了 2. 5mL VN:GF_hES/ 孔，培養(yǎng)于 5% C02，37°C。接種細(xì) 胞后48小時后每日更換培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)96小時后，收集到大約150ml的CM。人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物將BGOlV hES細(xì)胞(ATTC，Manassa, VA, USA)培養(yǎng)于第6代絲裂霉素-C滅活的 MEF上，培養(yǎng)基為 hES 細(xì)胞培養(yǎng)基，含有K0-DMEM，0. 02 μ g/uLbFGF (Chemicon)，2xl(T3M L-谷 氨酰胺，1000IU/mL青霉素/鏈霉素，1 μ L/mL β-巰基乙醇，12ng/mL LIF和剔除血清替換 (KSR) (Invitrogen)。根據(jù)hES細(xì)胞的生長速度和匯合程度，按1 1至1 6將其分至 IOcm2培養(yǎng)皿中，其中使用了 0.05%胰蛋白酶/EDTA (Invitrogen)消化30秒，37 °C，5 % CO2。 然后將細(xì)胞重懸于hES細(xì)胞培養(yǎng)基中，500-600g離心5分鐘，并轉(zhuǎn)移至IOcm2培養(yǎng)皿，培養(yǎng) 皿以0. 1 %明膠預(yù)包被，含有第6代絲裂霉素-C滅活的MEF飼養(yǎng)層。從轉(zhuǎn)移后48小時開 始，每天給hES細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞換液。hES細(xì)胞的無血清培養(yǎng)涉及使用預(yù)先鋪板于IOcm2培養(yǎng)皿 (NalgeNunc-International)中的前述滅活的MEF細(xì)胞，使用前血清饑餓2小時。然后將 hIES細(xì)胞轉(zhuǎn)移至前述2. 5mL VN:GF_hES培養(yǎng)基中的血清饑餓的MEF中。生長培養(yǎng)物，37°C， 5% C02，從最初轉(zhuǎn)移后48小時開始每天換液。待細(xì)胞匯合后收集到大約75ml的CM。凝膠分析KSR與VN GF-hES培養(yǎng)基使用10%恒組成聚丙烯酰胺凝膠比較含有KSR的培養(yǎng)基與含有VN:GF_hES的培 養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量。簡言之，將樣品稀釋至其合適的濃度，與樣品緩沖液(50mL甘油/5g SDS，溶于45mL TRIS-HCl/溴酚藍(lán))混合，100°C變性10分鐘。泳道中加入250kDa Amersham 分子量標(biāo)記(AmershamBiosciences, Piscataway, New Jersey, USA), 0. IuL KSR 培養(yǎng)基 (Invitrogen)和 10 μ L VN:GF_hES 培養(yǎng)基。使用 IX 電泳緩沖液(25mM Tris/200mM 甘氨酸)100伏分離蛋白質(zhì) 1-1.5小時。使用0610)(!6 SilverSNAP Stain Kit II (Pierce, Rockford，IL, USA)將凝膠銀染30分鐘直至條帶顯現(xiàn)，然后使用G =BOX chemi (Syngene， Fredrick, Massachusetts, USA)觀察。免疫熒光階段特異性胚胎抗原-1 (SSEA-I)、腫瘤抑制抗原1_81 (Tra 1-81)和八聚體結(jié)合 轉(zhuǎn)錄因子-4(0ct-4)是hES細(xì)胞全能性的標(biāo)記物[1，2]。監(jiān)測這些標(biāo)記物的存在以確保 CM是從未分化hES細(xì)胞中收集的。以2%多聚甲醛/提取緩沖液(0. 5% triton X-100， 0. IM Pipes緩沖液，5mM MgCl2禾Π ImM EGTA, ρΗ 7. 0)固定hES細(xì)胞培養(yǎng)物10分鐘。去除 固定劑，將培養(yǎng)物在Dulbecco' s磷酸緩沖鹽水(PBS) (Sigma-Aldrich)中洗滌3次，每次 5分鐘，以去除多余的多聚甲醛。將培養(yǎng)物在4%山羊血清中溫育1小時，25°C。去除該溶 液，并將以1 50稀釋于4%山羊血清中的針對SSEA-I、Tra 1-81和0ct_4的初級抗體 (Chemicon)與培養(yǎng)物在25°C溫育1小時。去除初級抗體并重復(fù)洗滌步驟。然后將抗小鼠第 二抗體(Chemicon)以1 100稀釋于PBS并溫育1小時。去除第二抗體，重復(fù)洗滌步驟， 以 Nikon TE-2000 熒光顯微鏡(Nikon，Lidcombe, NSW, AUS)采集集落圖像。RT-PCR 分析進行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析以檢測Oct-4和堿性磷酸酶 (AP)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以進一步分析hES細(xì)胞的分化狀態(tài)。使用tri-reagent及其 方案(Sigma-Aldrich)自hES細(xì)胞集落分離RNA。RNA樣品與寡dT 18聚體雜交以產(chǎn) 生 cDNAo Oct-4 引物為有義，5，-CTTGCTGCAGAAGTGGGTG-GAGGAA-3，(SEQ ID NO 1)； 反義，5’ -CTGCAGTGT-GGGTTTCGGG-CA-3’ (SEQ ID NO :2)。堿性磷酸酶引物為有義， 5，-TCAGAAGCTCAACACCAACG-3，(SEQ ID NO 3)；反義，5，-TTGTACGTCTTGGAG-AGGGC-3，(SEQ ID NO 4) ο 18sRNA 內(nèi)標(biāo)引物為有義，5’ -TTCGGAACTGAGGCCATGA-T-3，(SEQ ID NO 5)；反 義，5，-CGAACCTCCGACTTTC-GTTCT-3，(SEQ ID NO :6)。將 1 μ g 的 cDNA 加至這 4 個引物組 中的每一組，進行最初的變性步驟94°C，5分鐘，隨后是35個循環(huán)的94°C變性30秒，55°C 退火30秒和72°C延伸30秒，隨后在72°C最后延伸5分鐘。然后在2%瓊脂糖凝膠上分析 10 μ L的RT-PCR產(chǎn)物，100伏，1小時。然后使用溴乙啶(Sigma-Adlrich)顯現(xiàn)產(chǎn)物。二維液相層析蛋白組學(xué)分析采用二維液相層析對CM樣品進行分級，其中使用BioLogic Duo-flow系 統(tǒng)(Bio-rad，Hercules, California, USA)進行第一維分離，第二階段使用 Beckman Coulter，s ProteomeLab PF 2D(Beckman Coulter, Gladesville, NSW, AUS)平臺進行第 二維分離。首先，使用1. 2mL的100%乙酸將CM酸化至ρΗ 4，并使用體相SPE苯基硅吸 附劑(Alltech-Australia, Dandenong South, VIC, AUS)濃縮。簡言之，將基質(zhì)在 100% 甲醇預(yù)處理并傾倒至IOcm3自流柱(Bio-radLaboratories)中，并使用3倍柱體積的含 有0. 乙酸的超純水平衡。隨后將樣品加至柱上(Bio-rad Laboratories)，通過疏水 性相互作用將蛋白質(zhì)結(jié)合于樹脂。蛋白質(zhì)洗脫使用2倍柱體積的溶于含0. 三氟乙 酸(TFA) (Sigma-Aldrich)的超純水中的80 %乙腈(ACN)。然后使用eppendorf離心機 5301 (Eppendorf South Pacific, North Ryde, NSW, AUS)將洗脫的樣品凍干。使用 20mM Tris-HCl重建濃縮的樣品，并使用Coomassie Plus Protein分析試劑(Pierce)估計蛋白 質(zhì)濃度。然后使用結(jié)合于BioLogic DuoFIow高效液相層析系統(tǒng)(Bio-rad Laboratories)的UNO-Q(Bi0-rad Laboratories)陰離子交換層析柱對蛋白質(zhì)樣品進行第一維解析。簡言 之，使用鹽梯度(20mM Tris-HCL至500mM NaCl含有的20mM Tris-HCL)對多肽進行分級， 每2分鐘收集ImL級份，流速為0. 5mL/分鐘第一維分離完成后，含有蛋白質(zhì)的陰離子交換級份在第二維中被進一步分離，其 中在30x 4. 2mm無孔硅C18柱上進行高效反相液相層析。將來自每一級份的200 μ L樣品 注入 ProteomeLab PF 2D (Beckman Coulter)進行反相層析。使用 0-100 % ACN/0. 1 % TFA梯度在30分鐘內(nèi)獨立地將注入的樣品級份化，在4到24分鐘之間收集每1分鐘的樣 品。對于所有分離，流速和柱溫度均分別維持在0. 75mL/分鐘和50°C。使用ProteoVue軟 件(Eprogen, Darien, Illinois, USA)為 MEF CM 和 MEF:hES 細(xì)胞 CM 樣品產(chǎn)生二維圖像。樣品制備和MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜樣品在2D層析工作流分級后，自其相應(yīng)的第二維96孔板中收集400 μ L每一級 份，如前述凍干。然后將凍干樣品還原、烷基化并胰蛋白酶消化。通過將凍干蛋白重懸 于100 μ L的還原緩沖液(0. IM NH4C03/20mM DTT pH7. 9)中，然后在56°C溫育樣品1小時 進行還原。通過向還原的樣品中加入IOyL的50mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)并37°C 避光溫育樣品30分鐘進行烷基化。使用2.2yL測序級改良的胰蛋白酶(Promega)消化 蛋白質(zhì)并37°C溫育過夜。樣品以微C18ZipTips(Millipore，Bedford, MA, USA)脫鹽，直 接以5mg/ml的溶于60% ACN/0. 1 % TFA的α -氰基-4-羥基桂皮酸(CHCA)將肽洗脫至 Matrix-Associated Laser Desorption Ionization (MALDI) |&巾。i^ffi 10白勺fe 準(zhǔn)校正混合物作為以胰蛋白酶消化的樣品點樣的MALDI板的校準(zhǔn)物。使用的樣品基質(zhì)為 CHCA,濃度為5mg/ml，溶于5mM磷酸銨和0. 1 % TFA (Sigma-Aldrich)中的50 %乙腈中。使用 4700Proteomics AnalyserMALDI—TOF—TOF(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)在 Institute forMolecular Bioscience (St Lucia, QLD, Australia)分豐斤樣品。激光能量為 3200 μ J/脈沖，以正反射模式記錄所有質(zhì)譜(MS)譜。對于MS數(shù)據(jù)，對每一獲自4700T0F-T0F MS/MS的譜累積1000個點。使用默認(rèn)的IkV MS/MS方法以4500 μ J/脈沖的激光能量獲取 來自T0F-T0F的所有MS數(shù)據(jù)。使用來自未解釋的TOF-MS和T0F-T0F MS/MS數(shù)據(jù)的信息在 MSDB數(shù)據(jù)庫中查詢哺乳動物輸入項，并以GPS Explorer (Applied Biosystems)自動化詢 問MASCOT數(shù)據(jù)庫進行。當(dāng)搜索肽質(zhì)量時，設(shè)置以下參數(shù)不完全酶解位點數(shù)目=2 ；肽質(zhì)量 誤差=+/-0. 5 ；酶=胰蛋白酶；變量修飾包括甲硫氨酸氧化；固定修飾包括半胱氨酸的脲 甲基化。選擇最大命中數(shù)，并利用蛋白質(zhì)評分、蛋白質(zhì)評分可信限、總離子評分(TIS)和總 離子評分可信限來分析蛋白質(zhì)。簡言之，首先通過TIS將蛋白質(zhì)分級。評分代表該蛋白質(zhì)與獲自MS/MS分析的序 列數(shù)據(jù)基礎(chǔ)匹配程度，評分> 38被認(rèn)為具有顯著意義(該蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)隨機匹配的ρ < 0. 05)。評分彡38的蛋白質(zhì)匹配，納入進一步分析，不過，當(dāng)沒有獲得MS/MS數(shù)據(jù)時，基于 蛋白質(zhì)評分來分級蛋白質(zhì)。這一評分代表肽質(zhì)量與預(yù)測的胰蛋白酶裂解的肽序列的皮片程 度，評分>60被認(rèn)為具有顯著意義(該質(zhì)量隨機匹配的ρ <0.05)?；谧罡叩鞍踪|(zhì)評分 選擇蛋白質(zhì)，不過，報告了大量蛋白質(zhì)評分<60。這些級份仍被納入進一步分析。此外，使 用 Swiss-Prot，PubMed 禾口 Online Medelian Inheritance in Man (OMIM)搜索來檢查每一 蛋白質(zhì)的被報道的功能。 樣品制備和使用LC/ESI/MS和LC-MALDI分析的LC/MS
首先，使用印pendorf離心機5301 (Eppendorf South Pacific)將第一維級份和 原始樣品(濃縮條件培養(yǎng)基)凍干，分別用于LC/ESI/MS和LC/MS。如前所述將凍干樣品 還原、烷基化并以胰蛋白酶消化。然后將用于液相層析(LC)的樣品溶解于50/50溶劑A/ B中(溶劑A 0. 甲酸)(溶劑B 90%乙腈，溶于0. 甲酸)。樣品加載于C18300A柱 (150mmx0. 5mmx5 μ m 粒徑)(Vydac, Hesperia, California, USA)，使用 40/60 溶劑 Α/Β,流 速為 300 μ L/分鐘。使用 Agilent IlOOBinary HPLC 系統(tǒng)(Agilent，Inc Santa Clara, California, USA)實現(xiàn)溶劑遞送。電噴射質(zhì)譜在 Institute of Molecular Biosciences 進行，使 用了 4000ESI_QqLIT質(zhì)譜儀(Applied Biosystems),其裝備有大氣電離源 (AppliedBiosystems)。使用 Analyst 1. 4. 1 軟件(Applied Biosystems)獲取數(shù)據(jù)。如前 所述使用MASCOT數(shù)據(jù)庫GPS Explorer 軟件(version 4.0)進行蛋白質(zhì)分析，從MS和MS/ MS譜均獲得質(zhì)量/離子峰信息。簡言之，評分是_10*Log(P)，其中P觀察到的匹配屬于隨 機事件的可能性。各個離子評分> 38代表相同或廣泛同源(ρ < 0. 05)?；蛘?，將收集自LC相的樣品點樣于MS板上，其中使用1 1體積的5mg/ ml 的 CHCA(Sigma-Aldrich)蛋白質(zhì)樣品用于 LC-MALDI 分析。使用 4700Proteomics Analyser (Applied Biosystems)在 Institute for Molecular Bioscience對板進行分析。 使用MS/MS Mass Standards試劑盒(Sigma-Aldrich)所含的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品對MS和MS/MS數(shù) 據(jù)進行板寬校正。如前所述使用GPS Explorer 蛋白質(zhì)分析軟件(version 4.0)自動化搜 索MASCOT數(shù)據(jù)庫鑒定可能的蛋白質(zhì)匹配，從MS和MS/MS譜中均獲得了質(zhì)量/離子峰信息。 如前所述檢查每一蛋白質(zhì)的功能。結(jié)果VN:GF-hES培養(yǎng)基與含KSR的培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量首先從凍存儲備中復(fù)蘇hES細(xì)胞，然后培養(yǎng)于MEF細(xì)胞上，使用含20 % KSR的培養(yǎng) 基。不過，認(rèn)識到血清中的高豐度蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，可通過掩蓋重要的因子而影響 所計劃的蛋白組學(xué)分析。因此，使用無血清培養(yǎng)基，即VN:GF-hES，來培養(yǎng)細(xì)胞。為了比較 KSR與VN:GF-hES的總蛋白質(zhì)含量，使用10%恒組成聚丙烯酰胺凝膠進行PAGE分析。該分 析發(fā)現(xiàn)VN:GF-hES(圖1泳道2)含有極少的蛋白，而與之相比KSR(圖1泳道1)顯然含有 大量未鑒定的蛋白質(zhì)。生長于VN:GF_hES培養(yǎng)基中的hES細(xì)胞和MEF細(xì)胞的形態(tài)學(xué)已經(jīng)證實，當(dāng)使用VN:GF_hES培養(yǎng)基作用無血清培養(yǎng)基時，hES細(xì)胞可以未分化狀 態(tài)粘附、擴增并存活(Richards 2003，數(shù)據(jù)未發(fā)表)。為了確保待分析的條件培養(yǎng)基(CM) 是收集自未分化的hES細(xì)胞，對細(xì)胞進行了形態(tài)學(xué)檢查。本實驗發(fā)現(xiàn)，VN:GF-hES中增殖的 hES細(xì)胞保持了致密的集落，類似于生長在含KSR的培養(yǎng)基的細(xì)胞的情況(分別為圖2F和 2B)。此外，在無血清培養(yǎng)基中增殖的MEF細(xì)胞表現(xiàn)出與KSR中增殖的細(xì)胞具有相似的形態(tài) 學(xué)(分別為圖2E和2A)。生長于VN:GF_hES培養(yǎng)基中的hES細(xì)胞的標(biāo)記物表達目前尚無用于表征hES細(xì)胞的多能性的確定標(biāo)記物。不過，hES細(xì)胞表達多種標(biāo)記 物，例如SSEA-4、0ct-4和TRA1-81，它們均是未分化hES細(xì)胞所特有的。這些標(biāo)記物一起被 常規(guī)用來驗證hES細(xì)胞在表型上是未分化的[29]。為了確定生長于VN:GF-hES培養(yǎng)基中的細(xì)胞是未分化的，選擇針對TRA1-81和Oct-4的抗體來分析hES細(xì)胞的分化狀態(tài)。Oct-4 (綠 色)和TRA1-81 (紅色)均顯示在KSR條件和VN:GF-hES條件下培養(yǎng)的hES細(xì)胞上有高水平 的蛋白質(zhì)表達(分別為圖2C和2G以及圖2D和2H)。此外，選擇熒光標(biāo)記的針對SSEA-4 (未 分化細(xì)胞表達)的第二抗體以及熒光標(biāo)記的針對SSEA-I (未分化細(xì)胞不表達)的第二抗體 來進一步分析hES細(xì)胞的分化狀態(tài)。這一分析發(fā)現(xiàn)SSEA-4表達于在KSR或VN:GF_hES培 養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。類似地，SSEA-I不表達于在KSR或VN:GF-hES培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)hES細(xì)胞僅與第二抗體溫育時未觀察到免疫反應(yīng) 性(數(shù)據(jù)未顯示)。對生長于VN GF-hES中的hES細(xì)胞進行RT-PCR分析TRA l-81、0ct_4和SSEA-4 —起表達并不確定是未分化的hES細(xì)胞集落。因此，對 Oct-4和AP (堿性磷酸酶)這兩種基因的表達進行RT-PCR分析以進一步驗證hES細(xì)胞的分 化狀態(tài)。為了確定樣品沒有被互補性脫氧核糖核酸(cDNA)或基因組脫氧核糖核酸(gDNA) 污染，在一系列陰性對照中省卻了模板(數(shù)據(jù)未顯示)。設(shè)計引物使得它們與基因內(nèi)部的 不同外顯子退火，這樣一來，PCR反應(yīng)中存在的任何基因組脫氧核糖核酸(gDNA)污染將會 導(dǎo)致出現(xiàn)大于cDNA的分子量條帶。該分析顯示，生長于KSR(圖3A)和VN:GF_hES培養(yǎng)基 (圖3B)中的hES細(xì)胞集落表達Oct-4、AP和18sRNA (作為內(nèi)標(biāo)對照)的mRNA。該實驗進 一步證實所收集的用于蛋白組學(xué)分析的CM是收集自未分化的hES細(xì)胞。僅收集自MEF和收集自MEF:hES細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基的二維分離采用新型二維液相層析分離法分離來自MEF細(xì)胞(圖4A和4B)和MEF:hES細(xì) 胞(圖5A和5B)的CM中存在的蛋白質(zhì)。該方法涉及在第一維中通過鹽梯度分離蛋白 質(zhì)。然后以采用H2O ACN梯度的第二維分離方法分析第一維級份含有的蛋白質(zhì)。然后使用 ProteomeLab 軟件包ProteoVue顯示蛋白質(zhì)。僅有MEF細(xì)胞的CM(圖4B)與MEF:hES細(xì) 胞的CM(圖5B)之間顯然在蛋白質(zhì)譜上有明顯區(qū)別。通過這種蛋白組學(xué)方法在CM中觀察 到多種蛋白質(zhì)，不過，在此僅討論那些可能與hES細(xì)胞體外微環(huán)境有關(guān)的蛋白質(zhì)。從3份二 維層析譜中總共鑒定到來自僅有MEF細(xì)胞的192種蛋白質(zhì)和來自MEF:hES細(xì)胞的247種蛋 白質(zhì)(分別為圖4B和5B)。然后分離、消化這些蛋白質(zhì)并進行MALDI-T0F-T0F分析。此外， 從第一維分離中分離出來自MEFCM的35級份和來自MEF:hES細(xì)胞CM的38級份，經(jīng)消化后 轉(zhuǎn)移至LC/ESI/MS (分別為圖4A和5A)。此外，處理來自MEF CM的1份原始樣品(濃縮、凍 干并胰蛋白酶消化)和來自MEF:hES細(xì)胞CM的1份原始樣品并進行LC-MALDI。自MEF細(xì)胞和MEF:hES細(xì)胞條件培養(yǎng)基中鑒定的蛋白質(zhì)采用三種方法分析MEF CM和MEF:hES細(xì)胞CM中的蛋白質(zhì)，MALDI-TOF-TOF、LC/ ESI/MS和LC-MALDI。使用Mascot數(shù)據(jù)庫分析CM中存在的蛋白質(zhì)，結(jié)果被歸納為7種蛋白 質(zhì)ECM、膜、核、分泌型、分化和生長因子、和來源于血清。此外，利用登錄號、分子量、蛋白質(zhì) 評分和離子評分將蛋白質(zhì)分離。使MALDI-T0F-T0F與蛋白質(zhì)評分相關(guān)聯(lián)。MEFCM培養(yǎng)基的 MALDI-T0F-T0F結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 3種ECM蛋白、3種膜蛋白、3種核蛋白、1種細(xì)胞漿蛋白、4種分泌 型蛋白和7種分化和生長因子蛋白(表1)。此外，
發(fā)現(xiàn)4種膜蛋白、4種核蛋白和6種分泌型蛋白(表2)。所有MALDI-T0F-T0F結(jié)果，除了核 蛋白外源性核核糖核蛋白M(表2)之外，通過測定它們的蛋白質(zhì)評分沒有被證實。LC/ESI/ MS結(jié)果與離子評分相關(guān)聯(lián)。MEF CM的 /ESI/MS結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 11種ECM蛋白、4種膜蛋白、5種核蛋白、1種細(xì)胞漿蛋白、3種分泌型蛋白和3來自血清的蛋白(表1)。此外，MEF:hES細(xì) 胞CM的LC/ESI/MS結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 12種ECM蛋白、4種膜蛋白、6種核蛋白、6種細(xì)胞漿蛋白、1 種分泌型蛋白和2來自血清的蛋白(表2)。LC-MALDI結(jié)果也與離子評分相關(guān)聯(lián)。MEF CM 的LC-MALDI結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 1種ECM蛋白、1種膜蛋白、2種細(xì)胞漿蛋白和1種分泌型蛋白(表 1)。此外，MEFihES細(xì)胞CM的LC-MALDI的結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 1種細(xì)胞漿蛋白和2種分泌型蛋白 (表2)。通過LC/ESI/MS分析發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)均被通過它們的離子評分確定為被證實或 表現(xiàn)出廣泛的同源性。進行所有上述三種分析以便增加所得結(jié)果的正確性。討論自1998年首次獲得之后[1]，hES細(xì)胞已經(jīng)成為最有希望的組織替代和修復(fù)的體 外細(xì)胞來源。不過，這些“原始的”細(xì)胞需要外來的成分，例如MEF細(xì)胞和牛血清，來維持未 分化增殖。這帶來了嚴(yán)重的問題，因為接受來自這些細(xì)胞的產(chǎn)物的患者可能無意中感染一 些疾病，例如“新變體Creutzfeldt-Jakob病”，其可能存在于這些不能明確定義的和/或外 來的培養(yǎng)成分中。不僅如此，Dr. Ajit Varki證實在這些異基因培養(yǎng)條件下增殖的hES細(xì) 胞系獲得了非人類唾液酸Neu5Gc，其被認(rèn)為是來源于MEF飼養(yǎng)細(xì)胞[30]。這一發(fā)現(xiàn)無疑證 明hES細(xì)胞十分容易受到存在于其體外微環(huán)境中的因素的影響。因此，如果要實現(xiàn)這些細(xì) 胞的治療潛能，顯然需要將外來成分從現(xiàn)有的培養(yǎng)系統(tǒng)中清除。有鑒于此，許多研究人員在嘗試建立完全定義的無異基因的培養(yǎng)系統(tǒng)。近來， Ludwig等(2006)發(fā)現(xiàn)了一種方法，即TeSRl，可用于無飼養(yǎng)細(xì)胞衍生和增殖hES細(xì)胞系 [17]。盡管TeSRl方法被證明可成功體外增殖hES細(xì)胞，但其仍需要大量的蛋白質(zhì)，例如 13mg/ml HAS和23 μ g/ml的胰島素。這是非常不理想的，因為高濃度的生長因子可誘導(dǎo) hES細(xì)胞具有腫瘤性。此外，鑒于白蛋白是載體蛋白，因此高濃度的純化HSA很可能攜帶其 他的未知蛋白質(zhì)。因此，這種TeSRl技術(shù)并未在商業(yè)上達到規(guī)模增殖hES細(xì)胞的能力。此 外，Ludwig等(2006)發(fā)現(xiàn)當(dāng)hES細(xì)胞在TeSRl培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)5個月后出現(xiàn)了 47XXY核 型，這使得這些細(xì)胞在治療上不具有活力[17]。用于連續(xù)增殖hES細(xì)胞的完全定義的無血 清培養(yǎng)基，即VN:GF-hES，能夠以未分化狀態(tài)長期增殖hES細(xì)胞[31]。不過，hES細(xì)胞的自 我更新仍需要MEF，足見這些細(xì)胞對hES細(xì)胞體外微環(huán)境的重要性。目前仍不知道MEF細(xì)胞對hES體外微環(huán)境具有何種作用。不過，已經(jīng)證實i3T3， 一種用于擴增角化細(xì)胞的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞系，分泌大量的IGF和ECM蛋白[32]以 及各種其他成分。因此，可以認(rèn)為MEF也分泌對hES細(xì)胞自我更新具有重要作用的類似蛋 白質(zhì)。已經(jīng)逐漸評價了大量這些ECM蛋白質(zhì)促進hES細(xì)胞的自我更新環(huán)境的作用。這些蛋 白質(zhì)包括純化的膠原蛋白[33]、層粘連蛋白[18，33]、纖連蛋白[20，33]和基質(zhì)膠"[33]。 不過，這些ECM培養(yǎng)技術(shù)僅在向培養(yǎng)基中加入其他生長促進成分時才能取得成功。就此而 言，Xu等(2001)發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白和基質(zhì)膠 僅在與MEF條件培養(yǎng)基相結(jié)合時才能成功增 殖hES細(xì)胞[18]。這提示對hES細(xì)胞的存活十分重要的生長促進成分可能是由MEF分泌至 CM中的。有鑒于此，本發(fā)明人假設(shè)MEF飼養(yǎng)細(xì)胞分泌對hES細(xì)胞的自我更新具有重要作用 的新蛋白質(zhì)，且這些蛋白質(zhì)可通過蛋白組學(xué)技術(shù)而被鑒定。近來，Prowse等(2005)和Wee Eng Lim和Bodnar (2002)分析了成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞及其相應(yīng)的CM的蛋白組學(xué)譜。這些 研究初步探討了成纖維細(xì)胞對hES細(xì)胞體外微環(huán)境的影響。不過，本研究通過不僅分析來自MEF的CM，而且還分析來自MEF與hES細(xì)胞的共培養(yǎng)物的CM，使得這方面有了進一步的進展。如本文所述，再次證明完全定義培養(yǎng)基，即VN:GF_hES，支持hES細(xì)胞的未分化生 長(圖1-3)。本研究證明，在VN:GF-hES中而非含KSR的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，有助于解析 CM中的蛋白質(zhì)(圖1)。此外，這一分析清楚地證明VN:GF-hES培養(yǎng)基具有極少的蛋白質(zhì)含 量。相反，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)KSR培養(yǎng)基中存在許多高豐度蛋白質(zhì)；其中一些可能已經(jīng)掩 蓋了細(xì)胞所分泌的重要因子(圖1泳道1)。不過，盡管VN:GF-hES培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)含量極 低，但后續(xù)的質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，在從VN:GF-hES培養(yǎng)基中無血清培養(yǎng)的細(xì)胞收集的CM中仍存 在一些牛血清蛋白，例如o-2-HS-糖蛋白和白蛋白。這并不完全出乎預(yù)料，因為在將細(xì)胞轉(zhuǎn) 移至VN:GF-hES培養(yǎng)基之前，這些細(xì)胞培養(yǎng)在含牛血清的培養(yǎng)基中。此外，高豐度的血清蛋 白質(zhì)，例如白蛋白，通常具有粘附性并結(jié)合細(xì)胞外表面和培養(yǎng)容器，因此使得它們難以通過 洗滌步驟而完全被去除。不僅如此，Prowse等(2005)和Lim和Bondar (2002)的蛋白組學(xué) 分析也發(fā)現(xiàn)一些牛血清蛋白，即使他們在將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)之前也采取了一系 列洗滌步驟也是如此。不過，他們的研究和本研究所采取的在將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無血清條件下 之前的一系列洗滌和血清饑餓步驟，顯著極低了這些血清來源的成分在CM中的存在。因 此，這些牛蛋白沒有顯著干擾蛋白組學(xué)譜的解析(圖3B和圖4B)。不過，應(yīng)該指出本方法 與其他蛋白組學(xué)分析相比的具有重要的不同；即本發(fā)明收集的CM采用了對細(xì)胞生長最佳 的培養(yǎng)基，即含有VN:GF-hES。相反，Prowse等(2005)和Lim和Bondar (2002)的蛋白組學(xué) 策略采用基礎(chǔ)的不含促有絲分裂補充物的無血清培養(yǎng)基，即先前研究中的CM收集自“饑餓 的”和/或“應(yīng)激的”細(xì)胞，且因此并非處于最佳的生長條件。分析在此所述的CM，也在CM中鑒定到大量通常與細(xì)胞分泌相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如來 自單獨MEF細(xì)胞和MEF:hES細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)類(ECM)。存在這些蛋白質(zhì)可 能是蛋白裂解事件所致。例如，在MEF:hES細(xì)胞CM中隱約鑒定到膠原酶3活性。此外，本 研究證實的一些ECM蛋白質(zhì)通常用于無血清培養(yǎng)系統(tǒng)并支持hES細(xì)胞粘附和增殖。這些 包括膠原蛋白I和IV、纖連蛋白1[20]、層粘連蛋白M、層粘連蛋白α 1、4和5[21，18，34] 和蛋白聚糖[18](表1和2)。此外，一些上述ECM蛋白類似于Prowse等(2005)和Lim和 Bondar (2002)在人和動物飼養(yǎng)細(xì)胞CM中鑒定的ECM蛋白，因此再次證實這些蛋白在CM中 的重要性。此外，在MEF CM中證實的凝血酶敏感蛋白1也被Prowse等(2005)在人飼養(yǎng)細(xì) 胞CM中鑒定到其在細(xì)胞粘附、遷移和增殖具有作用[35，36]。凝血酶敏感蛋白1基因已知 與血小板衍生的生長因子(PDGF) [37]、bFGF[37]和轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β) [38]協(xié)同作 用，這三種生長因子對hES細(xì)胞自我更新具有重要作用。其他感興趣的ECM蛋白包括膠原 蛋白V、VII、XI、XII和XV、腱糖蛋白X和多能聚糖核心蛋白(versican core protein)。盡 管沒有在hES細(xì)胞培養(yǎng)物中研究這些蛋白質(zhì)，但它們各自具有重要的功能，例如細(xì)胞粘附、 增殖和遷移，且因此也可構(gòu)成支持hES細(xì)胞自我更新的環(huán)境。如前所述，ECM蛋白僅在補充生長促進劑時才能成功支持hES細(xì)胞擴增。重要 的是，MEF細(xì)胞CM發(fā)現(xiàn)了一些與hES細(xì)胞自我更新相關(guān)的生長因子，例如IGF-I、IGF-II, TGF-β 2、PDGF、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15 (ΒΜΡ15)、表皮生長因子(EGF)和肝細(xì)胞生長因子(HGF) (表1)。迄今為止，加入到hES細(xì)胞培養(yǎng)物中的最為重要的生長成分是胰島素[39]。有趣 的是，已經(jīng)證實IGF-I能夠替代角化細(xì)胞培養(yǎng)過程中對胰島素的需求[26]。確實，IGF-I是VN:GF_hES無血清培養(yǎng)基的重要成分，且已經(jīng)證實其在hES細(xì)胞培養(yǎng)基中可替代對胰島 素的需求[31]。此外，先前的研究證實IGF-II和玻連蛋白(VN)之間的協(xié)同相互作用導(dǎo)致 細(xì)胞遷移增加[40，41]。初步的研究提示IGF-II也可促進hES細(xì)胞增殖和自我更新[31]。 還證實TGF-β和PDGF在維持hES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)中具有作用[16，23]。有趣的是， Hollier等(2005)和Schoppet等(2002)證實這兩種肝素結(jié)合生長因子能夠結(jié)合VN并與 VN相互作用[26，42]。通過本蛋白組學(xué)分析在CM中觀察到的其他生長因子包括EGF和HGF。 它們被報道可激活hES細(xì)胞的分化[43]。不過，bFGF，作為加入到hES細(xì)胞培養(yǎng)物中的常 見自我更新成分[44，45] ,Schuldiner等(2000)也報道其誘導(dǎo)hES細(xì)胞分化。這些數(shù)據(jù)提 示生長因子對分化可具有相反的作用，這取決于它們的濃度和/或表達水平。因此，EGF和 HGF這兩種顯示促進分化的生長因子，當(dāng)以合適的濃度使用時也可促進hES細(xì)胞的自我更 新環(huán)境。就CM中觀察到的BMP15而言，目前還沒有研究該生長因子和hES細(xì)胞之間的關(guān)系。 不過，BMP4已被證實促進hES細(xì)胞分化[46]。因此，如果BMP15與BMP4具有類似的作用， 則可以在培養(yǎng)基中加入拮抗劑例如noggin[47]、卵泡抑素[48]、激活素A[49]和bFGF[22]， 為hES細(xì)胞提供自我更新微環(huán)境。因此，通過本蛋白組學(xué)方法觀察到的許多蛋白質(zhì)顯然可 以成為可與VN:GF-hES培養(yǎng)基相結(jié)合的候選因素，用于消除hES細(xì)胞對與MEF細(xì)胞共培養(yǎng) 的需求。如果這些生長因子被證明可用于增殖hES細(xì)胞，它們相應(yīng)的受體必然也被表達。 本發(fā)明對CM的蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了一些生長因子受體，包括成纖維細(xì)胞生長因子受體 (FGFR)和胰島素受體(IR)，它們均與hES細(xì)胞生長相關(guān)[50，39]。不過，本研究還發(fā)現(xiàn)生長 因子受體-結(jié)合蛋白14(Grbl4)，已經(jīng)證明其抑制FGF[51，52]和胰島素[53-55]受體的活 性。因此，Grbl4在hES細(xì)胞中表達可調(diào)節(jié)由FGF和胰島素受體觸發(fā)的重要信號途徑的失 活并間接調(diào)節(jié)hES細(xì)胞的自我更新。在無飼養(yǎng)細(xì)胞的系統(tǒng)中鑒定到支持細(xì)胞生長的各個蛋白質(zhì)的同時，顯然許多這些 候選物參與了復(fù)雜的途徑和信號事件。例如，MEF CM中所見的Wnt2b和分泌型卷曲相關(guān)蛋 白2已知在Wnt/β-連環(huán)蛋白信號中發(fā)揮作用，該信號對于hES細(xì)胞自我更新具有重要作 用[56]。Wnt2b似乎可以通過穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白而引發(fā)這一功能，由此通過抑制限制Wnt信 號途徑的分泌型卷曲相關(guān)蛋白1而活化Tcf/LEF靶基因[57]和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2的 轉(zhuǎn)錄[58]。此外，在MEF:hES細(xì)胞CM中發(fā)現(xiàn)的酪蛋白激酶1(亞型α)已經(jīng)被證實可增強 β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化并增強誘導(dǎo)Wnt信號的靶基因[59]。酪蛋白激酶I (亞型α)也被報 道可結(jié)合并增強蓬亂蛋白(dishevelled)的磷酸化[60]，已知蓬亂蛋白是Wnt途徑的成分 并存在于MEF:hES細(xì)胞CM中。在MEF CM中鑒定到的轉(zhuǎn)錄因子TBX20也被證實正調(diào)節(jié)Wnt 途徑[61]。顯然，在這一途徑中存在復(fù)合物相互作用；不過將來的研究和分析可發(fā)現(xiàn)Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號活化過程中可能驅(qū)動hES細(xì)胞自我更新的成分。此外，腫瘤排斥抗原I(Tral)同系物和卵泡抑素相關(guān)蛋白1在CM(表1，2)中均被 鑒定到，它們在調(diào)節(jié)人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)中具有作用，因此與hES細(xì)胞的自我更新有 關(guān)[62]。Tral同系物和myc-結(jié)合蛋白2在MEF:hES細(xì)胞CM中被鑒定到，已經(jīng)報道它們可 通過調(diào)節(jié)c-myC而活化hTERT[63]。有趣的是，卵泡抑素相關(guān)蛋白1已經(jīng)被證明可滅活激 活素-A [64]和TGF-β，后兩種蛋白質(zhì)被證明可抑制hTERT [65]。反過來，激活素/TGF-β / 節(jié)分支(nodal branch)被證實可誘導(dǎo)hES細(xì)胞自我更新[16]。因此以上研究提示盡管TGF-β抑制hTERT，且因此誘導(dǎo)分化，但其也可與激活素一起作用促進hES細(xì)胞的全能性， 這表明調(diào)控途徑中存在的復(fù)雜性。對胚胎干(ES)細(xì)胞自我更新十分重要的另一途徑是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄3活化 (STAT3)途徑[66]。本研究已經(jīng)在CM中發(fā)現(xiàn)了已知參與調(diào)控STAT3的兩種蛋白質(zhì)即 E3SUM0(抑制)和EGF(活化)。E3 Sumo似乎可通過阻斷STAT3的DNA結(jié)合活性而抑制 STAT3途徑的調(diào)節(jié)[67]，而EGF似乎在小鼠肝細(xì)胞中誘導(dǎo)STAT3的酪氨酸磷酸化和核轉(zhuǎn)移 [68]。其他一些研究發(fā)現(xiàn)加入細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素(IL)-6可在小鼠ES細(xì)胞中活化 gpl30受體并誘導(dǎo)STAT3磷酸化[69]。不過，IL-6未能在hES細(xì)胞中引發(fā)相同的應(yīng)答[70]。 不過，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-8、IL-13被分泌到MEF和MEF: hES細(xì)胞 CM中。因此，有理由預(yù)期一或多種這些細(xì)胞因子可結(jié)合gpl30受體并觸發(fā)STAT3途徑，由此 支持hES細(xì)胞的自我更新。總之，本初步研究首次清楚地揭示了對hES細(xì)胞體外微環(huán)境的有趣的認(rèn)識。已經(jīng) 證明新的技術(shù)不僅可鑒定分離的MEF細(xì)胞可分泌什么，還可鑒定它們應(yīng)答于與hES細(xì)胞的 相互作用中出現(xiàn)的旁分泌相互作用而分泌什么。本研究揭示的一些候選蛋白質(zhì)對分化、增 殖和細(xì)胞生長具有作用。因此，將來的研究將致力于在hES細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中證實這些候選 蛋白質(zhì)的存在以及評價其體外生物學(xué)活性。本研究可能是邁向完全了解hES細(xì)胞體外微環(huán) 境的第一步，并有可能首次為hES細(xì)胞產(chǎn)生完全定義的、合成的培養(yǎng)系統(tǒng)。這一進展開啟了 通往移植用治療性活組織源的大道。實施例2 蛋白組學(xué)分析體外培養(yǎng)的角化細(xì)胞條件培養(yǎng)基本研究的目的在于對角化細(xì)胞體外微環(huán)境進行全面檢查。具體而言，采用蛋白組 學(xué)方法鑒定由飼養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的角化細(xì)胞生長所需的主要因子。此外，使用上述無血清培 養(yǎng)基，該培養(yǎng)基被完全定義并具有極低的蛋白含量。該無血清培養(yǎng)基的極低蛋白含量的 顯著優(yōu)勢在于其不會“掩蓋”飼養(yǎng)細(xì)胞所分泌的那些能夠支持角化細(xì)胞生長的主要因子。 此外，含血清培養(yǎng)基在進行蛋白組學(xué)分析之前通常需要前期處理步驟，例如“Multiple Affinity RemovalSystem “ (MARS) (Agilent Technologies)。該 MARS 免疫耗竭技術(shù)涉及 去除含血清培養(yǎng)基中的高豐度蛋白質(zhì)，這可能會導(dǎo)致丟失一些對原代角化細(xì)胞自我更新十 分重要的候選因子。類似地，不需要在無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長細(xì)胞(該方法被常規(guī)納入 “條件”培養(yǎng)基的集合中)，而是自培養(yǎng)細(xì)胞的“生長”培養(yǎng)基中收集待分析的培養(yǎng)基；因此 細(xì)胞是活躍生長的，而非處于營養(yǎng)饑餓和應(yīng)激狀態(tài)。總之，這些特征為鑒定由體外角化細(xì)胞 培養(yǎng)微環(huán)境所產(chǎn)生的重要因子提供了理想的獨特的平臺。方法分離原代角化細(xì)胞原代角化細(xì)胞分離自從巨乳縮小手術(shù)和腹壁成形術(shù)中獲得的中厚皮膚活檢物， 如Goberdhan等所述(1993)。簡言之，該方法涉及將皮膚活檢物切成0. 5cm2的片狀，隨 后是一系列抗生素洗滌步驟。將皮膚與0. 125%胰蛋白酶(Invitrogen，Mulgrave, VIC, Australia)在4°C溫育過夜。然后表皮與真皮層分離并分離到角化細(xì)胞。將角化細(xì)胞懸浮 于 DMEM(Invitrogen)，過濾(IOOym)和離心。VN: GF-Kc 培養(yǎng)物新鮮分離的角化細(xì)胞先培養(yǎng)于75cm2培養(yǎng)瓶中，密度為2xl06細(xì)胞，然后以每個75cm2培養(yǎng)瓶中2xl05個細(xì)胞的密度接種用于傳代。接種角化細(xì)胞之前，先預(yù)接種Y _照射 的(25Gy，兩劑)(Australian Red Cross BloodService, Brisbane, QLD, Australia)小鼠 i3T3細(xì)胞飼養(yǎng)層(2xl06細(xì)胞)4小時。接種后使飼養(yǎng)層血清饑餓3小時。角化細(xì)胞在VN:GF 培養(yǎng)基中增殖，該培養(yǎng)基含有無酚紅DMEM/HAMS培養(yǎng)基(Invitrogen) ；0. 4 μ g/mL氫化可 的松；0. InM霍亂毒素；1. 8χ10_4Μ腺嘌呤；2x 10_7M三碘-I-甲狀腺素；5 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白； 2xlO_3M 谷氨酰胺(Invitrogen) ； 1000IU/mL 青霉素/1000 μ g/mL 鏈霉素(Invitrogen)； 0. 6μ g/mL VN(Promega, Annandale, NSW, Australia) ；0. 6 μ g/mL IGFBP-3 (N109D 重組突 變體)(Auspep, Parkville, VIC, Australia) ；0. 2 μ g/mL IGF-I (GroPep, Adelaide, SA, Australia)；和 0. 2 μ g/mLEGF(Invitrogen) (VN:GF_Kc)。角化細(xì)胞培養(yǎng)物在 37°C，5%二氧 化碳溫育，隔日更換VN:GF-Kc培養(yǎng)基。利用形態(tài)學(xué)和標(biāo)記物表達來確保本實驗所使用的角 化細(xì)胞在表現(xiàn)上類似于在有血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞。簡言之，這涉及以針對角蛋白6(未分 化角化細(xì)胞表達的一種標(biāo)記物)的抗體檢測培養(yǎng)物。二維蛋白組學(xué)采用如實施例1所述的方法，通過二維液相層析分級條件培養(yǎng)基樣品，使用 BioLogic Duo-flow 高效液相層析(HPLC) (Bio-rad,Hercules,California,USA)進行第一 維分離，而使用Beckman Coulter's ProteomeLab PF 2D平臺的第二階段進行第二維分罔。樣品制備和使用LC/ESI/MS和LC-MALDI分析的LC/MS采用如實施例1所述的方法，采用兩種LC/MS方法，即LC/ESI/MS和LC-MALDI鑒 定飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞條件培養(yǎng)基樣品中存在的蛋白質(zhì)。樣品制備和MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜采用如實施例1所述的方法，將蛋白質(zhì)峰轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜板用于T0F-T0F分析。數(shù)據(jù)庫分析和解析使用自MS和MS/MS數(shù)據(jù)庫分析獲得的蛋白質(zhì)評分、蛋白質(zhì)評分可信限、總離子評 分(TIS)和總離子評分可信限，根據(jù)潛在匹配列表來分級蛋白質(zhì)。結(jié)果使用VN:GF-Kc培養(yǎng)基增殖的第二代角化細(xì)胞上出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)記物 表達進行蛋白組學(xué)分析。利用形態(tài)學(xué)和標(biāo)記物表達來確保待分析的條件培養(yǎng)基是收集自未分化原代角化 細(xì)胞。目前還沒有確定的分析法能夠確定培養(yǎng)的原代角化細(xì)胞是否保持未分化狀態(tài)。不 過，可使用角蛋白標(biāo)記物來提供與細(xì)胞增殖狀態(tài)以及細(xì)胞是否是基底角化細(xì)胞有關(guān)的有用 信息。因此使用識別角蛋白6(存在于高度增殖的角化細(xì)胞)、角蛋白14(存在于基底細(xì)胞) 和角蛋白1/10/11(存在于更加分化的細(xì)胞，見上文-基底細(xì)胞，數(shù)據(jù)未顯示)的抗體來評 價培養(yǎng)的細(xì)胞的分化狀態(tài)，用于蛋白組學(xué)研究。該分析發(fā)現(xiàn)，使用VN:GF-Kc培養(yǎng)基增殖的 細(xì)胞與使用血清生長的細(xì)胞相比維持正常的形態(tài)學(xué)(分別為圖6B和A)。此外，在VN:GF-Kc 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的角化細(xì)胞持續(xù)表達角蛋白6和14(分別為圖6C和D)，因此提示這些細(xì)胞保 持其未分化原代角化細(xì)胞形態(tài)學(xué)。收集自單獨的飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物和飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基的二維 分離
采用新形式的二維液相層析分離法分離來自單獨飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和來自 飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞共培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中存在的蛋白質(zhì)(分別為圖7A和B)。這包括在 第一維通過鹽梯度分離蛋白質(zhì)，隨后使用乙腈梯度進行第二維分離。因該平臺的第一維分 辨率低，因此標(biāo)準(zhǔn)的 BeckmanCoulter ProteomeLab 的第一維被 Bio-rad，s Duo-flow HPLC 替代。使用ProteoView軟件顯示蛋白質(zhì)。顯然，在飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中 表達的不同蛋白質(zhì)點的數(shù)目較多(圖7B)，高于單獨飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。此外，單獨飼 養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(圖7A)與來自飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基(數(shù)據(jù)未顯 示)在表達水平之間似乎存在可察覺的改變。隨后，分離、消化并使用MALDI T0F-T0F分析 了圖7A所示的187種蛋白質(zhì)和圖7B所示的238種蛋白質(zhì)。在飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞條件培養(yǎng)基中鑒定的蛋白質(zhì)首先，對蛋白質(zhì)點進行MALDI-T0F-T0F分析，但沒有發(fā)現(xiàn)單獨飼養(yǎng)細(xì)胞或飼養(yǎng)細(xì) 胞角化細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)具有顯著的離子評分。隨后，使用兩種液相層析方法分析CM 第一種使用QTRAP MS/MS系統(tǒng)(LC/ESI/MS)(在來自第一維分離的級份上進行)，而第二種 使用LC-MALDI (在濃縮CM樣品上進行)(表3和4)。然后使用Mascot數(shù)據(jù)庫分析條件培 養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。LC/ESI/MS和LC-MALDI結(jié)果被歸納為7個主要的組細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、 膜、核、分泌型、來自血清的和雜蛋白質(zhì)/因子。此外，采用登錄號、分子量、總評分和肽計數(shù) 來分離蛋白質(zhì)。通過離子評分確定，表3和4中所鑒定的所有蛋白質(zhì)是已鑒定的或表現(xiàn)出 廣泛的同源性。單獨飼養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果過揭示12種ECM蛋白質(zhì)、2種生長因子、17種雜蛋白 質(zhì)、14種膜蛋白質(zhì)、10種核蛋白、5種分泌型蛋白質(zhì)和3種來自血清的蛋白質(zhì)(表3)。飼養(yǎng) 細(xì)胞角化細(xì)胞結(jié)果過揭示3種細(xì)胞漿蛋白質(zhì)、22種ECM蛋白質(zhì)、30種雜蛋白質(zhì)、21種膜蛋 白質(zhì)、19種核蛋白、9種分泌型蛋白質(zhì)和4種來自血清的蛋白質(zhì)。通過分級歸納LCMS結(jié)果， 其與總離子評分相關(guān)(表4)。飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞hES/角化細(xì)胞條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)表達差異在獲自單獨飼養(yǎng)細(xì)胞或飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)的液體級份上使用 LC-ESI、LC-MALDI和MALDI-T0F-T0F分析鑒定的蛋白質(zhì)。使用Mascot數(shù)據(jù)庫分析這些處 理中存在的蛋白質(zhì)。然后將潛在的候選物和感興趣的蛋白質(zhì)按其相應(yīng)的類別分類，包括細(xì) 胞外基質(zhì)、生長因子和細(xì)胞因子、分泌型和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。兩種處理組的蛋白質(zhì)之間存在重 疊，包括膠原蛋白I、IV和VII ；纖連蛋白I ；層粘連蛋白V ;TGFa和β ；VEGF ；白細(xì)胞介素 1、10和15 ；端粒酶-結(jié)合蛋白ESTlA JfTral同系物。不過，在單獨飼養(yǎng)細(xì)胞處理組中也 發(fā)現(xiàn)了獨特的蛋白質(zhì)，包括Wnt-2b、Wnt-12、膠原蛋白V和VI ；骨形態(tài)發(fā)生蛋白1 (BMP 1)； bFGF ；人生長激素(HGH) ；FGF 3 ；胰島素；IGF-I和-II ；白細(xì)胞介素_8 ；白血病抑制因子和 巨核細(xì)胞-CSF.此外，在飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞處理組中也發(fā)現(xiàn)了獨特的蛋白質(zhì)，包括纖連 蛋白III ；層粘連蛋白I和III ；神經(jīng)生長因子(NGF)；肝細(xì)胞生長因子(hgf)、PC細(xì)胞-衍 生的生長因子；血小板-衍生的生長因子β (PDGF)；白細(xì)胞介素4和6 ;PDGF-誘導(dǎo)型JE糖 蛋白；卵泡抑素相關(guān)蛋白5 ；生長抑制因子；生長分化因子9和端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(表5)。討論治療產(chǎn)業(yè)正在研發(fā)許多涉及原代角化細(xì)胞的新技術(shù)以幫助皮膚再生和愈合皮膚 損傷[75，76]。不過，離體增殖這些細(xì)胞所采用的技術(shù)仍需要不確定的成分，例如血清和/ 或飼養(yǎng)細(xì)胞，且通常使用無法清楚定義的培養(yǎng)系統(tǒng)。盡管可支持分離、建立和連續(xù)增殖未分化角化細(xì)胞的完全定義的無血清技術(shù)(VN:GF-Kc)是一大進步，但該培養(yǎng)方法仍需要使用 經(jīng)照射的i3T3飼養(yǎng)層以便成功地連續(xù)增殖和體外擴增。已經(jīng)證實，照射的i3T3飼養(yǎng)細(xì)胞分泌大量IGF和ECM蛋白[77]，以及大量其他蛋 白質(zhì)。不僅如此，還證實角化細(xì)胞也表達的受體s for many許多生長因子和ECM蛋白的受 體[78-83]。確實，其他實驗室研究了使用這些蛋白質(zhì)來培養(yǎng)角化細(xì)胞。例如，Dawson等 (1996)證實角化細(xì)胞可應(yīng)答于VN包被的表面而粘附并增殖[84]。不過，最有效的角化細(xì) 胞培養(yǎng)系統(tǒng)仍需要使用飼養(yǎng)細(xì)胞層[85]。對飼養(yǎng)細(xì)胞層的需求說明飼養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中 的重要性。最近，其他小組證實，當(dāng)培養(yǎng)系統(tǒng)中補充了獲自MEF的條件培養(yǎng)基時，其他細(xì)胞 類型，例如人胚胎干細(xì)胞，可利用ECM蛋白進行無血清增殖，這提示飼養(yǎng)細(xì)胞所提供的重要 成分是飼養(yǎng)層分泌的可溶性因子[18]。因此，本發(fā)明人假設(shè)可采用蛋白組學(xué)技術(shù)來鑒定條件培養(yǎng)基中的新蛋白質(zhì)，且有 可能將這些蛋白質(zhì)與VN:GF-Kc培養(yǎng)基相結(jié)合，用于支持角化細(xì)胞的無血清且無飼養(yǎng)細(xì)胞 增殖。此外，鑒于VN:GF-Kc培養(yǎng)基不含血清或高豐度蛋白質(zhì)例如白蛋白，即它是一種低蛋 白含量的培養(yǎng)基，因此其提供了用于鑒定對角化細(xì)胞的存活具有重要作用的關(guān)鍵因子的獨 特平臺。而通常加入至含血清或高蛋白質(zhì)含量培養(yǎng)基中的高豐度蛋白質(zhì)常常會掩蓋這些因 子。目前，這一領(lǐng)域和相關(guān)領(lǐng)域中進行的絕大多數(shù)蛋白組學(xué)分析是在單獨的飼養(yǎng)細(xì)胞 層上進行的[24，25，86]，用于揭示成纖維細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌了什么。不過，本研究通過建 立如下系統(tǒng)而使得這一研究更進了一步，在該系統(tǒng)中可以分析由飼養(yǎng)細(xì)胞與角化細(xì)胞的旁 分泌相互作用而觸發(fā)的分泌。為了檢驗這一假設(shè)，檢查了單獨飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì) 胞培養(yǎng)物向培養(yǎng)基中分泌了什么。對這兩種處理組的研究有助于對不僅應(yīng)答于自分泌相互 作用，而且也應(yīng)答于旁分泌相互作用而分泌的因子獲得更加全面的了解，并更加了解角化 細(xì)胞的最佳體外微環(huán)境。盡管本發(fā)明所使用的系統(tǒng)采用的是無血清VN:GF-Kc培養(yǎng)基，但在單獨飼養(yǎng)細(xì)胞 和飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞處理組中鑒定到了一些血清來源的蛋白質(zhì)；即，牛血清白蛋白、胎球 蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員。這些蛋白質(zhì)均是通常添加至培養(yǎng)基中用于增殖飼養(yǎng)細(xì)胞和角化 細(xì)胞的血清和補充物中的常見組分。在本分析中出現(xiàn)這些蛋白質(zhì)提示，盡管本蛋白組學(xué)研 究使用的是VN:GF-Kc無血清培養(yǎng)基，但原始擴增成纖維細(xì)胞時盡管進行了充分洗滌和血 清饑餓步驟，但仍有一些產(chǎn)物被攜帶進來。此外，這些數(shù)據(jù)提示來源于血清的蛋白質(zhì)是由分 離角化細(xì)胞過程中由供者的皮膚攜帶進來的，因為角化細(xì)胞本身完全是在無血清條件下分 離和培養(yǎng)的。此外，在本研究的兩個處理組中均觀察到一些細(xì)胞內(nèi)蛋白。存在這些蛋白質(zhì) 很可能是細(xì)胞裂解將其細(xì)胞內(nèi)成分泄漏至培養(yǎng)系統(tǒng)而導(dǎo)致的。盡管這些細(xì)胞內(nèi)蛋白不是本 研究的首要焦點，但所鑒定的一些蛋白質(zhì)值得進一步研究，例如端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶結(jié) 合蛋白、c-myc和Tral。也要注意到，從表3和4省卻了一些蛋白質(zhì)，因為無法對它們加以 鑒定，即，假定的蛋白質(zhì)、未知蛋白質(zhì)和功能未知蛋白質(zhì)。分析單獨飼養(yǎng)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(圖7A和表3)和飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞培養(yǎng)條件培 養(yǎng)基(圖7B和表4)揭示了一些對原代角化細(xì)胞的存活具有重要作用的蛋白質(zhì)。鑒定了一 些ECM蛋白，包括；膠原蛋白I、V、VI和VII、纖連蛋白1和3、Lamb3、層粘連蛋白α 1、3、5 和腱糖蛋白X (表3和4)。重要的是，這些ECM蛋白在體內(nèi)存在于表皮和真皮的細(xì)胞外基質(zhì)[87]。此外，這些蛋白質(zhì)通常參與角化細(xì)胞的粘附、遷移和/或增殖，且也認(rèn)為它們對傷口 愈合具有作用[88-91]。參與建立hES細(xì)胞無血清和無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究小組最近開始嘗試在其 培養(yǎng)系統(tǒng)中使用ECM蛋白，例如前面提到的那些。例如，當(dāng)在存在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEF)條件培養(yǎng)基的情況下生長[18]或具有剔除血清替換(KSR) +激活素-A的條件下生長 [21]時，層粘連蛋白可替代對飼養(yǎng)細(xì)胞層的需求。不僅如此，Amit等(2006)發(fā)現(xiàn)了使用纖 連蛋白基質(zhì)與多種生長因子相結(jié)合而增殖這些細(xì)胞的方法，這些生長因子包括轉(zhuǎn)化生長因 子β 1 (TGF β 1)、白血病抑制因子(LIF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) [20]。由于原 代角化細(xì)胞培養(yǎng)類似于hES細(xì)胞培養(yǎng)，這些基于ECM蛋白的技術(shù)有可能會被轉(zhuǎn)變?yōu)榕囵B(yǎng)角 化細(xì)胞。有趣的是，目前為增殖角化細(xì)胞和hES細(xì)胞而建立的所有ECM技術(shù)也包括使用某 些形式的促細(xì)胞分裂原。在此所報告的結(jié)果證實條件培養(yǎng)基中存在一些生長因子和促細(xì)胞分裂原，包括 IGF-I, IGF-II、胰島素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) α和β、血小板-衍生的生長因子(PDGF)和 bFGF，所有這些均存在于這兩個處理組的條件培養(yǎng)基中(表3和4)。胰島素是許多哺乳動物 細(xì)胞培養(yǎng)基的重要成分，且也已經(jīng)添加至角化細(xì)胞培養(yǎng)物中。通常，胰島素以高濃度存在于 這些角化細(xì)胞培養(yǎng)基中，不過，我們近來證實低濃度的IGF-I可替代對胰島素的需求[26， 41]。確實，已經(jīng)報道，當(dāng)存在高濃度的胰島素時，其生長刺激作用實際上是由IGF-I受體 介導(dǎo)的[92]，因此能夠以IGF-I替代胰島素并不意外。類似地，我們小組的早期研究發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)IGF-I和IGF-II與VN結(jié)合使用時，導(dǎo)致在hES細(xì)胞中產(chǎn)生促細(xì)胞分裂效應(yīng)。不僅如此， bFGF,TGF-β和PDGF是肝素結(jié)合生長因子，已經(jīng)證實它們增強飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型hES細(xì)胞的 增殖和自我更新[16，23，44，45]。此外，已經(jīng)證實TGF蛋白可增強上皮和角化細(xì)胞的遷移 (Li等2006)和增殖[93，94]，因此認(rèn)為其可有效介導(dǎo)傷口愈合事件[95]。有趣的是，這些 肝素結(jié)合生長因子似乎能夠通過其肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合VN[26，42]。因此，本蛋白組學(xué)分析 中鑒定的生長因子均具有與角化細(xì)胞生長有關(guān)的作用，因此可與VN:GF-Kc培養(yǎng)基相結(jié)合， 以便為體外擴增用于臨床治療目的的可移植細(xì)胞提供無血清無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。此外，還鑒定了飼養(yǎng)細(xì)胞CM中存在的Wnt-12和人生長激素和飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞 CM中存在的生長分化因子_9 (⑶F-9)和PC-衍生的生長因子(PC-DGF)(表5)。目前還不 太清楚這些蛋白質(zhì)對hES細(xì)胞的生長和存活的影響。不過，Wnt途徑和某些Wnt蛋白證明 可以維持hES細(xì)胞處于自我更新狀態(tài)[56]。人生長激素也可通過活化JAK/STAT途徑而在 hES細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要作用[66，72]。此外，發(fā)現(xiàn)PC衍生的生長因子在胚胎發(fā)育過 程中廣泛表達，并證實其在細(xì)胞例如3T3成纖維細(xì)胞的增殖中發(fā)揮作用[71]。此外，GDF-9 被證實能夠活化SMAD-2/3信號[73]，后者對于維持hES細(xì)胞的未分化狀態(tài)具有重要作用 [74]。這些因子因此對那些培養(yǎng)方式類似于hES細(xì)胞的其他細(xì)胞，即原代角化細(xì)胞，可能具 有重要作用。除了以上討論的蛋白質(zhì)，端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)端粒酶-結(jié)合蛋白(ESTlA)JP 泡抑素樣5和腫瘤排斥抗原1 (Tral)同系物，也表達于這兩個處理組的條件培養(yǎng)基中(表 3和4)。端粒酶-結(jié)合蛋白通過人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶參與體外端粒復(fù)制。有趣的是，hTERT 或端粒酶表達的下調(diào)與胚胎干細(xì)胞分化有關(guān)[62]。因此，如果在角化細(xì)胞培養(yǎng)物中該蛋白 能被直接或間接誘導(dǎo)，可能會促進原代角化細(xì)胞的長期增殖。另一感興趣的核蛋白是Tral同系物，其在c-Myc轉(zhuǎn)錄活化中具有關(guān)鍵作用，也參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，c-Myc已經(jīng)證實對 hTERT的活化和調(diào)節(jié)具有重要作用[63]。分泌型蛋白質(zhì)卵泡抑素樣5也存在于所檢測的條 件培養(yǎng)基中。值得注意的是，該蛋白中存在的卵泡抑素樣結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為參與滅活激活素-A 和TGF-β [96，97]，這兩種蛋白質(zhì)被證實對人胚胎干細(xì)胞自我更新具有重要作用[16]。總 之，這些數(shù)據(jù)提示這些蛋白質(zhì)在維持其他原代細(xì)胞例如原代角化細(xì)胞的未分化狀態(tài)中也可 能具有重要作用?？傊镜鞍捉M學(xué)研究揭示了來自單獨飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞角化細(xì)胞培養(yǎng)處理 組的多種蛋白質(zhì)的表達。鑒于皮膚成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞之間存在旁分泌關(guān)系[98，99]，本 研究不僅鑒定了分離的飼養(yǎng)細(xì)胞在分泌什么，也鑒定了飼養(yǎng)細(xì)胞與角化細(xì)胞因它們之間的 旁分泌相互作用而分泌什么。理想地，如果同時檢查單獨角化細(xì)胞的條件培養(yǎng)基以確定當(dāng) 它們在無飼養(yǎng)細(xì)胞情況下培養(yǎng)時分泌什么或許會有極大的收獲。不過，本研究一個關(guān)鍵問 題在于，角化細(xì)胞在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞層時生長很差。前述數(shù)據(jù)已經(jīng)提供了關(guān)于原代角化細(xì)胞 體外微環(huán)境的有趣的初步認(rèn)識，并對有可能與無血清培養(yǎng)基相結(jié)合使用的那些候選蛋白質(zhì) 提供了有用的初始信息。實施例3 :hES細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞和血清條件下的生長在以下培養(yǎng)基配方中生長并測試hES細(xì)胞lug/mL IGF_I/1_64VN嵌合蛋白， 0. lug/mL bFGF，35ng/mL 激活素-A 和 40 μ g/mL 層粘連蛋白。使用針對0ct4、TRA1-60、SSEA-4、SSEA-I抗原的抗體進行免疫熒光(IF)。IF研 究(圖8)證實了 0ct4、TRA1-60和SSEA-4表達，但SSEA-I僅低表達。hES細(xì)胞也表現(xiàn)出 大核質(zhì)比，代表hES表型。Rexl異常，這一結(jié)果證實在我們的培養(yǎng)系統(tǒng)中大幅下調(diào)。不過，當(dāng)檢查0ct4和 Nanog時，在我們的培養(yǎng)系統(tǒng)中這些擴增子表現(xiàn)出表達幾乎升高了 2倍(圖9)。這些數(shù)據(jù)放在一起提示所述系統(tǒng)確實可維持這些細(xì)胞處于“未分化狀態(tài)”。整個說明書的目的在于描述本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，而無意于將本發(fā)明限制在 任一實施方式或具體的特征集合中。因此本領(lǐng)域人員可以理解，鑒于所公開的內(nèi)容，可以對 這些示例性的具體實施方式
做出各種修改和變化而不脫離本發(fā)明的范圍。通過引用將在此提及的所有計算機程序、算法、專利和科技文獻并入本申請。參考文獻1. Thomson, J. Α. , J. Itskovitz-Eldor, S. S. Shapiro, Μ. A. Wakni tz , J. J. Swiergiel, V. S. Marshall, and J.M.Jones· (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282 :1145—7.2. Reubinoff，B. E.，Μ. F. Pera, C. Y. Fong, A. Trounson, and A. Bongso. (2000). Embryonic stem cell lines from human blastocysts somatic differentiation in vitro. NatureBiotechnology 18 :399_404.3. Levy, Y. S. , M. Stroomza, E. Me lamed, and D. Offen. (2004). Embryonic and adult stemcells as a source for cell therapy in Parkinson ' s disease. JMol Neuroscience 24 :353_86.4. Tutter, A. V. , G. A. Baltus, and S. Kadam. (2006). Embryonic stem cells :a great hope fora new era of medicine. Current Opinion Drug Discovery Development
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養(yǎng)基中鑒定的蛋白質(zhì)
權(quán)利要求
細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含(i)合成嵌合蛋白，其包含胰島素樣生長因子(IGF)氨基酸序列和玻連蛋白(VN)氨基酸序列；(ii)選自以下一組中的一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子人生長激素(hGH)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP 15)、生長分化因子9(GDF 9)、巨核細(xì)胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關(guān)蛋白2、Wnt 2b、Wnt 12、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子 α(TGF α)、TGF β、神經(jīng)生長因子、血小板衍生的生長因子 β(PDGF β)、PC 衍生的生長因子(progranulin)、白細(xì)胞介素(IL) 1、IL 2、IL 4、IL 6、IL 8、IL 10、IL 13和激活素 A；和(iii)不含血清或含有明顯減少量的血清，所述明顯減少量的血清在缺乏IGF時不能支持細(xì)胞的生長。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子選自以下一 組hGH、BMP-15,⑶P-9、巨核細(xì)胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關(guān)蛋白2、Wnt_2b、Wnt_12、 生長抑制因子和激活素-A。
3.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述一或多種分離的飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子 是激活素-A。
4.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含選自以下一組的 一或多種額外的生物學(xué)活性蛋白堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、 IGF-I、IGF-II和層粘連蛋白。
5.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述一或多種額外的生物學(xué)活性蛋白選 自bFGF和層粘連蛋白。
6.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序 列或IGF-II氨基酸序列。
7.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。
8.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述VN氨基酸序列是成熟VN的1至64位氨基酸殘基。
9.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述合成嵌合蛋白還包含一或多個甘氨 酸殘基和一或多個絲氨酸殘基的接頭序列。
10.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述接頭序列為(Gly4Ser)4t5
11.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含分離的含IGF的復(fù)合物，其中IGF 選自 IGF-I 和 IGF-II。
12.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，當(dāng)IGF-II存在于所述分離的含IGF的復(fù)合 物中時，所述培養(yǎng)基還包含VN。
13.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，當(dāng)IGF-I存在于所述分離的含IGF的復(fù)合物 中時，所述培養(yǎng)基還包含IGFBP和VN。
14.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述IGFBP選自以下一組IGFBP-1、 IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 和 IGFBP-6。
15.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述IGFBP是IGFBP-3或IGFBP-5。
16.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃 度在 0. lng/ml 和 50 μ g/ml 之間。
17.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃 度在大約5ng/ml和1500ng/ml之間。
18.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃 度在 25ng/ml 和 1000ng/ml 之間。
19.前述權(quán)利要求中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述或每一飼養(yǎng)細(xì)胞替代因子的終濃 度在 150ng/ml 和 600ng/ml 之間。
20.胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，還包含大約250ng/ml和lOOOng/ml之間的包含IGF氨基酸序 列和VN氨基酸序列的合成嵌合蛋白，大約50ng/ml和lOOng/ml之間的bFGF，大約25ng/ml 和50ng/ml之間的激活素-A和大約10 μ g/ml和50 μ g/ml之間的層粘連蛋白。
21.權(quán)利要求20的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含大約lOOOng/ml的所述包含IGF氨基酸 序列和VN氨基酸序列的合成嵌合蛋白，大約lOOng/ml的bFGF，大約35ng/ml激活素-A和 大約40 μ g/ml的層粘連蛋白。
22.權(quán)利要求20或21中任一項的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述IGF氨基酸序列是 IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。
23.權(quán)利要求20至22中任一項的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述IGF氨基酸序列是 IGF-I氨基酸序列。
24.權(quán)利要求20至23中任一項的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述VN氨基酸序列是成熟 VN的1至64位氨基酸殘基。
25.細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包含培養(yǎng)容器和權(quán)利要求1至19中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基或權(quán)利要 求20至24中任一項的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。
26.細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包含在權(quán)利要求1至19中任一項的細(xì)胞培養(yǎng)基、權(quán)利要求20至 24中任一項的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基或權(quán)利要求25的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)一或多種細(xì)胞的步驟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述一或多種細(xì)胞是飼養(yǎng)細(xì)胞依賴型細(xì)胞類型。
28.權(quán)利要求26至27中任一項的方法，其中所述一或多種細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
29.權(quán)利要求26至27中任一項的方法，其中所述一或多種細(xì)胞是角化細(xì)胞。
30.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求26至29中任一項的方法產(chǎn)生的一或多種細(xì)胞， 以及藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
31.藥物組合物，其包含選自角化細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞和角化細(xì)胞前體細(xì)胞的一或多種 細(xì)胞。
32.權(quán)利要求30至31中任一項的藥物組合物，其中所述一或多種細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
33.權(quán)利要求30至32中任一項的藥物組合物，其中所述一或多種細(xì)胞是角化細(xì)胞。
34.輸送根據(jù)權(quán)利要求26至29中任一項的方法培養(yǎng)的一或多種細(xì)胞的方法，包括將權(quán) 利要求30至33中任一項的藥物組合物輸送至個體，以便促進所述個體中的一或多種細(xì)胞再生和/或增殖。
全文摘要
本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)基和系統(tǒng)，其消除或至少降低對飼養(yǎng)細(xì)胞的需求。所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含通常由飼養(yǎng)細(xì)胞分泌和/或產(chǎn)生的一或多種因子和包含IGF-I和一部分玻連蛋白的合成嵌合蛋白。所述細(xì)胞培養(yǎng)基特別適合用于增殖人胚胎干細(xì)胞和角化細(xì)胞。本發(fā)明還涉及利用培養(yǎng)于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞的組合物和方法。
文檔編號C12N5/0735GK101970642SQ200880114667
公開日2011年2月9日 申請日期2008年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月4日
發(fā)明者D·利弗斯利, D·哈金, L·B·科馬克, S·D·理查茲, Z·厄普頓 申請人:昆士蘭技術(shù)大學(xué)