一種適用于培養(yǎng)nk細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份I、NK細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II以及水組成。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細(xì)胞，能夠得到數(shù)量更多，純度更高且殺傷效果更好的NK細(xì)胞。本發(fā)明的適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）避免了由在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用的動(dòng)物血清中動(dòng)物成分對(duì)接受細(xì)胞治療患者帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)以及動(dòng)物血清中不確定的成分對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果造成的不確定影響；2）大大提高了NK細(xì)胞得率；3）增加了NK細(xì)胞培養(yǎng)的終密度，從而降低了細(xì)胞培養(yǎng)的成本。
【專利說(shuō)明】一種適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是機(jī)體天然免疫的主要細(xì)胞。無(wú)需抗原預(yù)先作用就可直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞，在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過(guò)程中起重要作用。NK細(xì)胞與腫瘤靶細(xì)胞密切接觸后，可通過(guò)釋放穿孔素顆粒酶，表達(dá)TRAIUFasL和分泌TNF-α產(chǎn)生細(xì)胞殺傷作用。目前，NK細(xì)胞已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床進(jìn)行腫瘤患者的治療。
[0003]目前臨床上獲得NK細(xì)胞的方法一般從外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)過(guò)程中一般需要加入動(dòng)物血清來(lái)提高細(xì)胞培養(yǎng)的效果，動(dòng)物血清能夠提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，還可以提供激素和各種生長(zhǎng)因子:胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素(氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板生長(zhǎng)因子等。動(dòng)物血清中這些物質(zhì)的存在為臨床上獲得安全有效的細(xì)胞產(chǎn)品提供了堅(jiān)強(qiáng)的保證。然而，由于動(dòng)物血清中含有動(dòng)物成分，若其用于臨床細(xì)胞治療體系中，可能會(huì)導(dǎo)致一些潛在的風(fēng)險(xiǎn)。主要由于動(dòng)物血清成分復(fù)雜，雖含許多對(duì)細(xì)胞有利成分，也含有對(duì)細(xì)胞有害的成分:1)動(dòng)物血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來(lái)自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)(如精胺、亞精胺)形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺，補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡；2)動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致；3)取材中可能帶入支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性；4)大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來(lái)源越來(lái)越困難，價(jià)格昂貴，是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)生產(chǎn)成本的主要部分之一。
[0004]除安全性因素外，NK細(xì)胞由于較難在體外大量的增殖，目前在臨床上應(yīng)用的NK細(xì)胞培養(yǎng)的方案主要有使用滋養(yǎng)細(xì)胞系方法(如使用Κ562細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞系)，該方法得到NK細(xì)胞純度較高，但是因?yàn)槠涫褂昧宿D(zhuǎn)基因的方法且Κ562細(xì)胞本身作為一個(gè)腫瘤細(xì)胞，在臨床安全性方面存在質(zhì)疑。而不使用滋養(yǎng)層細(xì)胞其細(xì)胞擴(kuò)增效果及細(xì)胞得率均不甚理想，在此背景下，急需一種安全，有效的NK細(xì)胞培養(yǎng)的方法來(lái)提高臨床NK細(xì)胞培養(yǎng)的安全性及有效性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，所含成分均為化學(xué)限定成分，不含任何動(dòng)物血清成分，從而避免了使用動(dòng)物血清可能導(dǎo)致的安全性的問(wèn)題，且成本較低。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份1、NK細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II以及水組成， 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份I是由以下濃度的組分組成的:
[0008]無(wú)水氯化1丐28 ~33.82mg/L, i_ 肌醇 13 ~19mg/L, L-酪氨酸 4 ~5.9mg/L,L-蛋氨酸3~5mg/L, L-纟顏氨酸6~13.7mg/L, L-苯丙氨酸4~7mg/L, D-葡萄糖1789~1802mg/L,鹽酸批卩多醇(維生素B6)0.055~0.066mg/L,次黃嘌呤3~5mg/L, L-絲氨酸7~15mg/L,氯化鈉 7200 ~7599mg/L,核黃素 0.022 ~0.048mg/L,亞油酸 0.077 ~0.094mg/L, L-蘇氨酸10~13.9mg/L,磷酸氫二鈉120~149mg/L,鹽酸硫胺0.22~0.34mg/L,硫辛酸0.12~0.29mg/L, L-天門冬酰胺7~18.01mg/L, L-精氨酸鹽酸鹽198~213mg/L，L-天門冬氨酸6~19.3mg/L，l，4 一丁二胺二鹽酸鹽0.11~0.19mg/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽22~39.12mg/L, L-谷氨酰胺113~149mg/L, L-谷氨酸2~17.7mg/L,丙酮酸鈉100~110mg/L,氯化膽堿12~13.99mg/L,甘氨酸6~8mg/L, L-亮氨酸11~13.4mg/L,維生素H0.004~(λ 008mg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽34~39.5mg/L, L-組氨酸鹽酸鹽9~25mg/L，L-脯氨酸25~34.5mg/L ;如表1所不。
[0009]所述NK細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II是由以下濃度的組分組成的:
[0010]表皮生長(zhǎng)因子I~100mg/L,神經(jīng)生長(zhǎng)因子I~10mg/L, IL-2120~100mg/L,成纖維素細(xì)胞生長(zhǎng)因子I~100mg/L，IL-1850~150mg/L，卵泡刺激因子50~500mg/L，IL-1250 ~500mg/L，CD16 單抗 20 ~100mg/L，CD3 單抗 50 ~500mg/L，CD125 單抗 50 ~500mg/L。本發(fā)明所用表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、IL-21、成纖維素細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-18、卵泡刺激因子、IL-12均采購(gòu)自R&D公司，CD16單抗以及CD3單抗采購(gòu)自德國(guó)美天妮公司，
0)125單抗米購(gòu)自Prepotech公司。
[0011]表1
【權(quán)利要求】
1.一種適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于:由基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份1、NK細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II以及水組成，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份I是由以下濃度的組分組成的: 無(wú)水氯化1丐28~33.82mg/L, i_肌醇13~19mg/L, L-酪氨酸4~5.9mg/L, L-蛋氨酸3~5mg/L, L-纟顏氨酸6~13.7mg/L, L-苯丙氨酸4~7mg/L, D-葡萄糖1789~1802mg/L,鹽酸批B多醇(維生素B6) 0.055~0.066mg/L,次黃嘌呤3~5mg/L,L_絲氨酸7~15mg/L,氯化鈉 7200 ~7599mg/L,核黃素 0.022 ~0.048mg/L,亞油酸 0.077 ~0.094mg/L, L-蘇氨酸10~13.9mg/L,磷酸氫二鈉120~149mg/L,鹽酸硫胺0.22~0.34mg/L,硫辛酸0.12~0.29mg/L,L-天門冬酰胺7~18.01mg/L,L_精氨酸鹽酸鹽198~213mg/L, L-天門冬氨酸6~19.3mg/L, 1,4 —丁二胺二鹽酸鹽0.11~0.19mg/L, L-半胱氨酸鹽酸鹽22~39.12mg/L, L-谷氨酰胺113~149mg/L,L-谷氨酸2~17.7mg/L,丙酮酸鈉100~110mg/L,氯化膽堿12 ~13.99mg/L,甘氛酸 6 ~8mg/L, L-亮氛酸 11 ~13.4mg/L,維生素 H0.004 ~0.008mg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽34~39.5mg/L, L-組氨酸鹽酸鹽9~25mg/L, L-脯氨酸25~34.5mg/L ； 所述NK細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II是由以下濃度的組分組成的: 表皮生長(zhǎng)因子I~100mg/L, 0)16單抗20~100mg/L,神經(jīng)生長(zhǎng)因子I~10mg/L,IL-2120~100mg/L，成纖維素細(xì)胞生長(zhǎng)因子I~100mg/L，IL-1850~150mg/L，卵泡刺激因子 50 ~500mg/L，IL-1250 ~500mg/L，CD3 單抗 50 ~500mg/L，CD125 單抗 50 ~500mg/L0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組份I是由以下濃度的組分組成的:無(wú)水氯化鈣29mg/L，1-肌醇15mg/L，L-酪氨酸4.5mg/L, L-蛋氨酸 4mg/L, L-纟顏氨酸 13.5mg/L, L-苯丙氨酸 6mg/L, D-葡萄糖 1800mg/L,鹽酸批卩多醇0.055mg/L,次·黃嘌呤5mg/L, L-絲氨酸8mg/L,氯化鈉7500mg/L,核黃素0.028mg/L,亞油酸0.079mg/L, L-蘇氨酸13mg/L,磷酸氫二鈉135mg/L,鹽酸硫胺0.25mg/L,硫辛酸0.19mg/L,L-天門冬酰胺14.4mg/L, L-精氨酸鹽酸鹽200mg/L, L-天門冬氨酸13.5mg/L, I,4 一丁二胺二鹽酸鹽0.18mg/L, L-半胱氨酸鹽酸鹽29mg/L，L-谷氨酰胺124mg/L，L-谷氨酸13.9mg/L,丙酮酸鈉105mg/L,氯化膽堿12.9mg/L,甘氨酸7mg/L, L-亮氨酸13.4mg/L,維生素H0.005mg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽37.5mg/L, L-組氨酸鹽酸鹽14mg/L, L-脯氨酸25.6mg/L ； 所述NK細(xì)胞特異性培養(yǎng)組份II是由以下濃度的組分組成的: 表皮生長(zhǎng)因子50mg/L，CD16單抗70mg/L，神經(jīng)生長(zhǎng)因子10mg/L，IL_2160mg/L，成纖維素細(xì)胞生長(zhǎng)因子50mg/L，IL-1850mg/L，卵泡刺激因子150mg/L，IL-12100mg/L, CD3單抗100mg/L, CD125 單抗 100mg/L。
3.權(quán)利要求1或2所述的適用于培養(yǎng)NK細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:步驟如下: (1)取組份I的各原料，混合混勻，在60°C真空下干燥15小時(shí)，備用；取組份II的各原料，在30°C真空下干燥18小時(shí)，混合混勻，備用； (2)將上述干燥后的組份I和組份II混合，針磨3個(gè)小時(shí)，過(guò)30目篩，得固態(tài)粉末，加水，混勻，0.2μπι濾膜過(guò)濾，即得適用于培養(yǎng)Y δΤ細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，針磨生產(chǎn)過(guò)程中，溫度控制在20~25°C，濕度 控制在15~20%，氮?dú)鈮毫刂圃?50~300psi。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK103849600SQ201410118900
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】葉永清 申請(qǐng)人:葉永清