專利名稱：一種無血清肝細胞培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝細胞培養(yǎng)基，具體涉及一種無血清的肝細胞培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
肝實質(zhì)細胞，即肝細胞，是肝臟功能的主要執(zhí)行者，其總重量占肝重80%左右。肝細胞吸收并處理血液中的營養(yǎng)物質(zhì)和其他物質(zhì)，如將膽紅素糖脂化最終形成膽汁分泌到腸道，同時肝細胞還合成白蛋白、補體蛋白、糖原(葡萄糖的儲存)和凝血蛋白，另外肝細胞還將血液中的氨轉(zhuǎn)化為尿素完成解毒作用。肝臟在糖類、脂質(zhì)和氨基酸調(diào)節(jié)中也起到重要作用，肝臟特異性功能由肝細胞合成的各種肝臟特異性酶完成，將由胃腸道吸收，經(jīng)門靜脈循環(huán)到達肝臟的營養(yǎng)物質(zhì)合成儲存，而將藥物代謝并解毒。隨著肝細胞分離、培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，體外培養(yǎng)的肝細胞能維持數(shù)小時的代謝活力， 執(zhí)行許多肝臟的代謝和解毒功能。由于肝移植供肝的嚴重短缺，利用體外培養(yǎng)的肝細胞進行細胞移植和構(gòu)建生物人工肝(bioartificial liver systems,BAL)來治療急性或慢性肝功能衰竭患者的方法正日益受到關(guān)注。目前在肝細胞體外培養(yǎng)中通常使用添加10% (ν/ν)胎牛血清(FBS)的 William’s-E培養(yǎng)基。然而，血清中的成分十分復(fù)雜，其中存在的未知物質(zhì)和可變因素往往影響研究結(jié)果和治療效果的準確性和重復(fù)性。另外，F(xiàn)BS等動物血清或血清蛋白等動物源成分進入人體后會引發(fā)多種不良反應(yīng)及疾病，為細胞移植和BAL治療的臨床應(yīng)用埋下了隱患。美國FDA即將停止受理用含血清細胞培養(yǎng)工藝的醫(yī)療技術(shù)以及制備的生物技術(shù)新藥的申報。無血清培養(yǎng)已經(jīng)成為生物技術(shù)制藥生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)工程臨床治療的總趨勢。目前，美國hvitrogen公司的H印atoZYME-SFM無血清培養(yǎng)基已經(jīng)上市，但 Masashi Kitazawa etal. (2007)Angiopoietin-related growth factor suppresses gluconeogenesis through the akt/forkhead box calss 0 1-dependent pathway in hepatocytes中報道，使用！fepatoZYME-SFM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代大鼠肝細胞時，仍需加入了 10%胎牛血清，不能真正實現(xiàn)無血清培養(yǎng)。Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental cell research 274 56-67,2002 ；Sustaining a bioatificial liver under hypothermic conditions. Tissue engineering 11 :427-437,2005. ；Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells. Cytotechnology 45 125-140,2004. ；Dexamethasone effects on rat hepatocyte spheroid formation and function. Tissue engineering 11 :415-426, 2005. ；Hypothermic maintence of Hepatocye spheroids. Cell transplantation 14 375-389,2005.等文獻中公開了三種無血清培養(yǎng)基，但是這三種無血清培養(yǎng)基含有動物來源成分，且不能用于肝細胞懸浮培養(yǎng)，難以滿足科研和臨床應(yīng)用的需求。其他商品化的肝細胞無血清培養(yǎng)基存在培養(yǎng)基的成分配方秘而不宣等問題，且價格昂貴，使得廣大肝細胞移植和BAL研究者和使用者望而卻步，亟需尋找一種新的肝細胞無血清培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的肝細胞無血清培養(yǎng)基。首先，本發(fā)明提供了一種肝細胞培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含有如下組分
Williams'-E 粉末9~10.時
碳酸氫鈉2~2.4g
胰島素200~600U
青霉素100000U
鏈霉素IOOmg
人血清白蛋白l~6g
亞油酸100~200ドg
人表皮生長因子5~50ドg
地塞米松0.01~l^imol
人胰高血糖素3.5~350昭
人轉(zhuǎn)鐵蛋白5~10mg
Gly-His-Lys10~50jxg
五水硫酸銅O.lpmol
亞硒酸鈉30~50nmol
七水硫酸鋅50pmol
L-肉毒堿0.2~2g
L-精氨酸0.1~0.4g
甘氨酸5~20mg
肝素鈉0~2000U余量為去離子水。優(yōu)選地，每升培養(yǎng)基含有如下組分
Williams'-E 粉末9.5~10.8g
碳酸氫鈉2.2g
胰島素200U
青霉素100000 U
鏈霉素IOOmg人血清白蛋白2~4g
亞油酸150ドg
人表皮生長因子5~50ドg
地塞米松0.01~l^imol
人胰高血糖素4~60陥
人轉(zhuǎn)鐵蛋白6mg
Lrlv-His-Lys20(ig
五水硫酸銅O.lpmol
亞硒酸鈉30 nmol
七水硫酸鋅50pmol
L-肉毒堿0.5~2g
L-精氨酸0.1~0.2g
甘氨酸8~10mg
肝素鈉10~1000U余量為去離子水。進ー步優(yōu)選地，每升培養(yǎng)基含有如下組分
Williams'-E 粉末10.8 g
碳酸氫鈉2.2g
胰島素200 U
青霉素100000U
鏈霉素IOOmg
人血清白蛋白3g
亞油酸150ドg
人表皮生長因子5昭
地塞米松O.lpmol
人胰高血糖素40ドg
人轉(zhuǎn)鐵蛋白6mg
Lrly-His-Lys20 mg
五水硫酸銅O.lpmol
亞硒酸鈉30nmol
七水硫酸鋅50pmol
L-肉毒堿Ig
L-精氨酸0.2g
甘氨酸IOmg
肝素鈉1000U
余量為去離子水。本發(fā)明還提供了制備前述培養(yǎng)基的方法，包括如下步驟(1)取前述組分，加入去離子水中，攪拌，使各組分充分溶解；(2)加入去離子水定容，除菌。本發(fā)明還提供了前述培養(yǎng)基在肝細胞培養(yǎng)中的用途。本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確且成本低廉，在本發(fā)明培養(yǎng)基中，肝細胞生長良好，細胞形態(tài)、密度與含血清培養(yǎng)基相當，細胞功能和活力優(yōu)于含血清培養(yǎng)基，克服了傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基的缺陷，且不含動物來源成分，能夠支持肝細胞高密度懸浮培養(yǎng)生長，明顯優(yōu)于現(xiàn)有文獻報道的無血清培養(yǎng)基。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中貼壁生長的!fepG2人肝癌細胞系細胞生長狀況(倒置顯微鏡下觀察)。圖2含血清培養(yǎng)基中貼壁生長的!fepG2人肝癌細胞系細胞生長狀況(倒置顯微鏡下觀察)。圖3本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中搖動懸浮生長的原代豬肝細胞球生長狀況(倒置顯微鏡下觀察)。圖4含血清培養(yǎng)基中搖動懸浮生長的原代豬肝細胞球生長狀況(倒置顯微鏡下觀察)。圖5本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中搖動懸浮生長的原代大鼠肝細胞球生長狀況(倒置顯微鏡下觀察)。圖6含血清培養(yǎng)基中搖動懸浮生長的原代大鼠肝細胞球生長狀況(倒置顯微鏡下觀察)。圖7本發(fā)明無血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基及另外3種無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng) (細胞濃度lX106cellS/ml)原代大鼠肝細胞成肝細胞球比例對比圖。圖8本發(fā)明無血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基及另外3種無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng) (細胞濃度lX106cellS/ml)原代大鼠肝細胞白蛋白分泌量對比圖。圖9本發(fā)明無血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基及另外3種無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng) (細胞濃度lX106cellS/ml)原代大鼠肝細胞尿素合成量對比圖。圖10本發(fā)明無血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基及另外3種無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮培養(yǎng)(細胞濃度5X106cellS/ml)原代大鼠肝細胞成肝細胞球比例對比圖。圖11本發(fā)明無血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基及另外3種無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮培養(yǎng)(細胞濃度5X106cellS/ml)原代大鼠肝細胞白蛋白分泌量對比圖。圖12本發(fā)明無血清培養(yǎng)基與含血清培養(yǎng)基及另外3種無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮培養(yǎng)(細胞濃度5X106cellS/ml)原代大鼠肝細胞尿素合成量對比圖<
具體實施例方式實驗材料:Williams’ _E粉末、碳酸氫鈉、胰島素、青霉素、鏈霉素、人血清白蛋白、 亞油酸、人表皮生長因子、地塞米松、人胰高血糖素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、Gly-His-Lys、五水硫酸銅、亞硒酸鈉、七水硫酸鋅、L-肉毒堿、L-精氨酸、甘氨酸、肝素鈉，均為市售品。實施例1本發(fā)明培養(yǎng)基的制備1、制備方法(1)取如下成分
Williams'-E 粉末
碳酸氫鈉
胰島素
青霉素
鏈霉素
人血清白蛋白
亞油酸
人表皮生長因子地塞米松人胰高血糖素人轉(zhuǎn)鐵蛋白 Gly-His-Lys 五水硫酸銅亞硒酸鈉七水硫酸鋅 L-肉毒堿 L-精氨酸甘氨酸
肝素鈉
10.8 g
2.2 g
200U
100000U
IOOmg
3g
150颶
5Pg
Ο. μπιο
40昭
6mg 20昭
Ο. μπιο
30μπιο1
50pmol
Ig 0.2 g 10 mg
1000U(2)將上述培養(yǎng)基成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解， 定容至1L，滅菌，即可。使用培養(yǎng)基時，用去離子水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鈉離子濃度至1. 3g/L(允許的誤差范圍為 1. 28g/L 1. 32g/L)，調(diào)節(jié)pH至7. 2，用0. 2微米濾膜過濾除菌，預(yù)熱至37°C。實施例2本發(fā)明培養(yǎng)基的制備1、制備方法(1)取如下成分
Williams'-E 粉末9.5 g碳酸氫鈉2.4 g胰島素200U青霉素100000U鏈霉素IOOmg人血清白蛋白4g亞油酸150颶人表皮生長因子50颶地塞米松Ιμπιο 人胰高血糖素60pg人轉(zhuǎn)鐵蛋白6 mgGly-His-Lys20颶五水硫酸銅0. Ιμπιο 亞硒酸鈉30μπιο1七水硫酸鋅50pmolL-肉毒堿2gL-精氨酸0.2 g甘氨酸10 mg肝素鈉1000U(2)將上述培養(yǎng)基成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解， 定容至1L，滅菌，即可。使用培養(yǎng)基時，用去離子水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鈉離子濃度至1. 3g/L(允許的誤差范圍為 1. 28g/L 1. 32g/L)，調(diào)節(jié)pH至7. 2，用0. 2微米濾膜過濾除菌，預(yù)熱至37°C。實施例3本發(fā)明培養(yǎng)基的制備1、制備方法(1)取如下成分Williams'-E 粉末9g碳酸氫鈉2.2 g胰島素200U青霉素100000U鏈霉素IOOmg人血清白蛋白2g亞油酸150颶人表皮生長因子5 Pg地塞米松Ιμπιο 人胰高血糖素4“g人轉(zhuǎn)鐵蛋白6 mgGly-His-Lys20颶五水硫酸銅0. Ιμπιο 亞硒酸鈉30μπιο1七水硫酸鋅50pmolL-肉毒堿0.5 gL-精氨酸0.1 g甘氨酸8mg肝素鈉IOU(2)將上述培養(yǎng)基成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解， 定容至1L，滅菌，即可。使用培養(yǎng)基時，用去離子水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鈉離子濃度至1. 3g/L(允許的誤差范圍為 1. 28g/L 1. 32g/L)，調(diào)節(jié)pH至7. 2，用0. 2微米濾膜過濾除菌，預(yù)熱至37°C。實施例4本發(fā)明培養(yǎng)基的制備1、制備方法(1)取如下成分
Williams'-E 粉末9.5 g
碳酸氫鈉2 g
胰島素200 U
青霉素100000 U
鏈霉素IOOmg
人血清白蛋白Ig
亞油酸100颶人表皮生長因子地塞米松人胰高血糖素人轉(zhuǎn)鐵蛋白 Gly-His-Lys
5 Pg
Ο.ΟΙμπιοΙ
5 mg
10昭
五水硫酸銅亞硒酸鈉七水硫酸鋅 L-肉毒堿
L-精氨酸
0.2 g 0.1 g 5 mg
Ο. μπιο
30μπιο1
50pmol
甘氨酸(2)將上述培養(yǎng)基成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解， 定容至1L，滅菌，即可。使用培養(yǎng)基時，用去離子水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鈉離子濃度至1. 3g/L(允許的誤差范圍為 1. 28g/L 1. 32g/L)，調(diào)節(jié)pH至7. 2，用0. 2微米濾膜過濾除菌，預(yù)熱至37°C。實施例5本發(fā)明培養(yǎng)基的制備1、制備方法(1)取如下成分
Williams'-E 粉末
10. Sg 2.4 g 600U
碳酸氫鈉胰島素青霉素鏈霉素
IOOmg 6g
100000U
人血清白蛋白亞油酸
人表皮生長因子地塞米松人胰高血糖素人轉(zhuǎn)鐵蛋白 Gly-His-Lys 五水硫酸銅亞硒酸鈉七水硫酸鋅 L-肉毒堿L-精氨酸0.4 g
甘氨酸20 mg
肝素鈉2000U(2)將上述培養(yǎng)基成分混合，溶于去離子水，室溫下攪拌10分鐘，使其充分溶解， 定容至1L，滅菌，即可。使用培養(yǎng)基吋，用去離子水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鈉離子濃度至1. 3g/L(允許的誤差范圍為 1. 28g/L 1. 32g/L)，調(diào)節(jié)pH至7. 2，用0. 2微米濾膜過濾除菌，預(yù)熱至37°C。實施例6用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細胞1、實驗方法(1)將凍存復(fù)蘇的H印G2人肝癌細胞系細胞，分別用本發(fā)明實施例1制備的無血清 培養(yǎng)基和含10% (ν/ν)胎牛血清(FBS)的William’S-E培養(yǎng)基分散細胞、調(diào)整細胞懸液濃 度為lX105cells/ml。按5ml/瓶接種75ml組織培養(yǎng)瓶，37°C，5% CO2靜置培養(yǎng)，用光學(xué)倒 置顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。每天更換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)2天后，觀察其生長狀況。(2)將新鮮分離的豬肝細胞，分別用上述本發(fā)明實施例1制備的無血清培養(yǎng)基 和含10% (ν/ν)胎牛血清(FBS)的William’ s_E培養(yǎng)基將細胞重懸，調(diào)整細胞濃度到 5X106cells/ml,然后加入20ml細胞懸液到40ml搖動培養(yǎng)玻璃皿中，置于搖動搖床上， 速度為10Cpm(CyCle per minute)，整個培養(yǎng)體系置于ニ氧化碳組織培養(yǎng)箱中(37°C，5% CO2)，懸浮培養(yǎng)M小吋，光學(xué)倒置顯微鏡下觀察其生長狀況。(3)將新鮮分離的大鼠肝細胞，分別用上述本發(fā)明實施例1制備的無血清培養(yǎng) 基和含10% (ν/ν)胎牛血清(FBS)的William’ s_E培養(yǎng)基將細胞重懸，調(diào)整細胞濃度到 5X106cells/ml,然后加入20ml細胞懸液到40ml搖動培養(yǎng)玻璃皿中，置于搖動搖床上， 速度為10Cpm(CyCle per minute)，整個培養(yǎng)體系置于ニ氧化碳組織培養(yǎng)箱中(37°C，5% CO2)，懸浮培養(yǎng)M小吋，光學(xué)倒置顯微鏡下觀察其生長狀況。2、實驗結(jié)果(1)如圖1 2所示，！fepG2人肝癌細胞系細胞在本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中和含10% FBS的William’ s_E培養(yǎng)基中均匯合成單細胞層，細胞形態(tài)呈多角形，肝細胞形態(tài)無差別。(2)如圖3 4所示，豬肝細胞在本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中和含10% FBS的 William' s-E培養(yǎng)基中均聚集形成形態(tài)良好的肝細胞球，肝細胞的形態(tài)無差別。(3)如圖5 6所示，大鼠肝細胞在本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中和含10% FBS的 William' s_E培養(yǎng)基中均聚集形成形態(tài)良好的肝細胞球，肝細胞的形態(tài)無差別。實驗說明本發(fā)明無血清培養(yǎng)基適用于體外培養(yǎng)大鼠、豬和人肝細胞。實施例7與其他無血清培養(yǎng)基的對比實驗1、實驗方法(1)將新鮮分離的大鼠肝細胞，分別用表1列出的4種無血清培養(yǎng)基和含10% (ν/ ν)胎牛血清(FBS)的William，s_E培養(yǎng)基將細胞重懸，調(diào)整細胞濃度到1 X 106cellS/ml， 然后加入20ml細胞懸液到40ml搖動培養(yǎng)玻璃皿中，置于搖動搖床上，速度為IOcpm(cycle per minute)，整個培養(yǎng)體系置于ニ氧化碳組織培養(yǎng)箱中(37°C ,5% CO2)，懸浮培養(yǎng)72小吋， 每M小時換液一次，并在培養(yǎng)M小時，48小時和72小時取樣，利用Multisizer 3 Beckman Coulter counter分析各時點各種培養(yǎng)條件下大鼠肝細胞成球(直徑大于60微米)比例，光學(xué)倒置顯微鏡下觀察其生長狀況，同時檢測培養(yǎng)基中白蛋白和尿素含量，分析大鼠肝細胞功能。(2)將新鮮分離的大鼠肝細胞，分別用表1列出的4種無血清培養(yǎng)基和含10% (ν/ ν)胎牛血清(FBS)的William，s_E培養(yǎng)基將細胞重懸，調(diào)整細胞濃度到5X 106cellS/ml， 然后加入20ml細胞懸液到40ml搖動培養(yǎng)玻璃皿中，置于搖動搖床上，速度為IOcpm(cycle per minute)，整個培養(yǎng)體系置于二氧化碳組織培養(yǎng)箱中(37°C ,5% CO2)，懸浮培養(yǎng)72小時， 每M小時換液一次，并在培養(yǎng)M小時，48小時和72小時取樣，利用Multisizer 3 Beckman Coulter counter分析各時點各種培養(yǎng)條件下大鼠肝細胞成球(直徑大于60微米)比例， 光學(xué)倒置顯微鏡下觀察其生長狀況，同時檢測培養(yǎng)基中白蛋白和尿素含量，分析大鼠肝細胞功能。4種無血清培養(yǎng)基的成分如表1所示表1 4種無血清培養(yǎng)基的成分
權(quán)利要求
1.-種肝細胞培養(yǎng)基，其特征在于每升培養(yǎng)基含有如下組分Williams'-E 粉末碳酸氫鈉胰島素青霉素鏈霉素人血清白蛋白亞油酸人表皮生長因子地塞米松人胰高血糖素人轉(zhuǎn)鐵蛋白 Gly-His-Lys 五水硫酸銅亞硒酸鈉七水硫酸鋅 L-肉毒堿 L-精氨酸甘氨酸肝素鈉9~10.8g 2~2.4g 200-600U 100000U IOOmg l~6g 100~20(^g0.01~1μπιο1 3.5~350pg 5~10mg 10~50pg Ο. μπιο 30~50nmol 50pmol 0.2~2g 0.1~0.4g 5~20mg 0-2000U余量為去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于每升培養(yǎng)基含有如下組分Williams'-E 粉末碳酸氫鈉胰島素青霉素鏈霉素人血清白蛋白亞油酸人表皮生長因子地塞米松人胰高血糖素9.5~10.8g 2.2g 200U 100000 U IOOmg 2~4g150颶 0.01~1μπιο1人轉(zhuǎn)鐵蛋白6mgLrly-His-LyszOpg五水硫酸銅Ο. μπιο 亞硒酸鈉30 nmol七水硫酸鋅50pmolL-肉毒堿0.5~2gL-精氨酸0.1~0.2g甘氨酸8~10mg肝素鈉10~1000U余量為去離子水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于每升培養(yǎng)基含有如下組分 Williams'-E 粉末10.8 g碳酸氫鈉2.2g胰島素200 U青霉素100000U鏈霉素IOOmg人血清白蛋白3g亞油酸150颶人表皮生長因子5昭地塞米松Ο. μπιο 人胰高血糖素40昭人轉(zhuǎn)鐵蛋白6mg Giy-His-Lys五水硫酸銅Ο. μπιο 亞硒酸鈉30nmol七水硫酸鋅50pmolL-肉毒堿IgL-精氨酸0.2g甘氨酸IOmg肝素鈉1000U余量為去離子水。
4.ー種制備權(quán)利要求1 3任意一項所述培養(yǎng)基的方法，其特征在于包括如下步驟(1)取權(quán)利要求1 3任意ー項所述的組分，加入去離子水中，攪拌，使各組分充分溶解；(2)加入去離子水定容，除菌。
5.權(quán)利要求1 3任意一項所述培養(yǎng)基在肝細胞培養(yǎng)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的無血清培養(yǎng)基，還提供了該培養(yǎng)基的制備方法和用途。本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基克服了傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基的缺陷，且明顯優(yōu)于現(xiàn)有文獻報道的無血清培養(yǎng)基，提高了細胞移植、組織工程肝臟和生物人工肝支持系統(tǒng)治療臨床應(yīng)用的可能性，具有較強的實用價值。
文檔編號C12N5/071GK102559581SQ20121001897
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者包驥, 步宏, 石毓君 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院