專利名稱：在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus, PCV)由 Tischer 于 1974 年在連續(xù)傳代的 PK15 細(xì)胞株(PK15 ATCC CCL31)中首次發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時被認(rèn)為是一種無致病性的細(xì)胞污染物，隨后即被證實是一種無囊膜、直徑為17nm的新病毒。這種圓環(huán)病毒廣泛存在于PK15細(xì)胞中且不引起豬的臨床癥狀，因而被稱為豬I型圓環(huán)病毒(PCVl)。斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (Postweaning multisystemic wastingsyndrome, PMWS)于 1991 年首先發(fā)現(xiàn)于加拿大西部，到1994年已廣泛流行于該國，現(xiàn)已在美洲和歐洲的許多國家和地區(qū)流行，亞洲地區(qū)的印度、日本、韓國、菲律賓、中國臺灣省等也有此病的報道。PMWS主要感染7 15周齡豬，患豬表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦，淋巴結(jié)腫大，皮膚蒼白或有黃疸等癥狀；豬群發(fā)病率為5 50%，死亡率接近100%，嚴(yán)重威脅世界各國的養(yǎng)豬業(yè)?，F(xiàn)已證實該病是由一種致病性豬圓環(huán)病毒引起的，并將該圓環(huán)病毒命名為豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)。我國朗洪武等于1999年在北京、 河北等地某些豬場中也檢測到豬圓環(huán)病毒的存在，此后國內(nèi)許多實驗室也相繼檢測到該病毒。兩型豬圓環(huán)病毒在分類上屬于圓環(huán)病毒科，被列入該科的既有動物病毒，也有植物病毒。PCVl基因組全長1759bp，PCV2基因組全長1768bp (或1767bp)。PCVl與PCV2型內(nèi)的同源性都在90 %以上，但兩型間同源性小于80 %。已有研究表明，兩型PCV的基因組均含有11個潛在的開放閱讀框架(Open readingframe, 0RF)。其中0RF1、2、3、6和7具有一定的同源性，而其余ORF無任何同源性。0RF1、2為兩個主要的0RF，對其功能研究較為清楚。ORFl編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白；0RF2編碼的蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白-核衣殼蛋白，具有較好的免疫原性，是構(gòu)建重組疫苗的首選基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法。在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法的步驟為I)豬圓環(huán)病毒2型SX04株全基因組序列的克?。?)含有豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-PCVCapHA的構(gòu)建；3)將pCI-PCVCapHA轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK15，轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入 MG132 ；4)繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，通過抑制蛋白酶體的活性，穩(wěn)定真核細(xì)胞中的豬圓環(huán)病毒 2型核衣殼蛋白，收集細(xì)胞，免疫印跡檢測表達(dá)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型SX04株全基因組序列的克隆步驟為收集 SXO株感染仔豬的淋巴結(jié)組織，抽提病毒基因組DNA，用長距離精確PCR擴(kuò)增基因組DNA全長，克隆于pGEM-T easy,獲得重組載體pGEM_T_PCV,并行序列測定,測定的序列在GenBank 登錄號為AY604430. I。所述的含有豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-PCVCapHA的構(gòu)建步驟為根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型SX04株基因組序列，GenBank登錄號AY604430. 1，設(shè)計核衣殼蛋白基因上下游引物pcvCapNhe CGACGCT AGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTAC, pcvCapMlu CTACGCGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGGGTTAAGTGGCGGGTCTTTAA ；并在蛋白C端引入HA序列，作為蛋白標(biāo)記，將獲得的核衣殼蛋白基因，通過NheI和MluI連接入 pCI-Neo真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-PCVCapHA，并進(jìn)行序列測定。所述的將pCI-PCVCapHA轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK15，轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MG132步驟為pCI-PCVCapHA質(zhì)粒在脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞 PK5，在轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，加入MG132，濃度為5nM。本發(fā)明相對于普通的真核表達(dá)方法，該方法可有效穩(wěn)定真核細(xì)胞中的PCV2核衣殼蛋白。轉(zhuǎn)染后72小時的蛋白免疫印跡檢測顯示，本專利使用的方法，可最高提高PCV2核衣殼蛋白的表達(dá)量在20倍左右。


圖I是本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒2型SX04株全基因組序列的克隆過程示意圖。圖2是本發(fā)明提供的含有豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖3是本發(fā)明提供的將上述質(zhì)粒(pCI-PCVCapHA)轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK15，轉(zhuǎn)染后24 小時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MG132示意圖。圖4是本發(fā)明提供的繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，收集細(xì)胞，免疫印跡檢測表達(dá)蛋白示意圖。圖5是本發(fā)明提供的，相對于普通的真核表達(dá)方法，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MG132， 可有效穩(wěn)定真核細(xì)胞中的PCV2核衣殼蛋白，并提高蛋白產(chǎn)量在20倍左右。圖6是本發(fā)明提供的pCI-PCVCapHA和pUBR7共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞的示意圖。圖7是本發(fā)明提供的泛素蛋白的表達(dá)，可抑制PCV2核衣殼蛋白在PK15細(xì)胞的表
達(dá)產(chǎn)量。
具體實施例方式在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法的步驟為I)豬圓環(huán)病毒2型SX04株全基因組序列的克??；2)含有豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-PCVCapHA的構(gòu)建；3)將pCI-PCVCapHA轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK15，轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入 MG132 ；4)繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，通過抑制蛋白酶體的活性，穩(wěn)定真核細(xì)胞中的豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白，收集細(xì)胞，免疫印跡檢測表達(dá)蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型SX04株全基因組序列的克隆步驟為收集 SXO株感染仔豬的淋巴結(jié)組織，抽提病毒基因組DNA，用長距離精確PCR擴(kuò)增基因組DNA全長，克隆于pGEM-T easy,獲得重組載體pGEM_T_PCV,并行序列測定,測定的序列在GenBank 登錄號為AY604430. I。所述的含有豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-PCVCapHA的構(gòu)建步驟為根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型SX04株基因組序列，GenBank登錄號AY604430. 1，設(shè)計核衣殼蛋白基因上下游引物pcvCapNhe CGACGCT AGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTAC, pcvCapMlu CTACGCGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGGGTTAAGTGGCGGGTCTTTAA ；并在蛋白C端引入HA序列，作為蛋白標(biāo)記，將獲得的核衣殼蛋白基因，通過NheI和MluI連接入 pCI-Neo真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-PCVCapHA，并進(jìn)行序列測定。所述的將pCI-PCVCapHA轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK15，轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MG132步驟為pCI-PCVCapHA質(zhì)粒在脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞 PK5，在轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，加入MG132，濃度為5nM。實施例I :本實施例描述了本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒2型(PCV 2)SX04株全基因組序列的克隆的整個實驗過程如圖I所示。稱取適量病料(腹股溝淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)和頸部淋巴結(jié)等)，加入適當(dāng)體積的組織裂解緩沖液進(jìn)行勻衆(zhòng)；將組織勻衆(zhòng)分裝到I. 5ml eppendorf管中，室溫，3000g離心 IOmin ;取上清加入蛋白酶K至終濃度為100 μ g/ml, 55°C裂解3h ;加入等體積的酹/氯仿， 上下顛倒混勻，4°C, 12000g離心IOmin ;取上清置一新的I. 5ml eppendorf管中；取上清置一新的I. 5ml eppendorf管中，加入2倍體積冰冷無水乙醇(其中含1/10體積的3M NaAc), 上下顛倒混勻，-20°C,40min,沉淀DNA ;4°C, 12000g離心IOmin,棄上清,沉淀用70%的乙醇洗滌一次；41，1200(^離心51^11，棄上清，沉淀于室溫干燥后，溶于3(^1的TE溶液中 (PH8. 0)。根據(jù)已發(fā)表的PCV2序列(GenBank序列號AF027217)設(shè)計引物(見表I)。以上引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，用前溶解于滅菌超純水中至終濃度15μπιΟ1/πι1，-20τ 保存?zhèn)溆?。表I豬圓環(huán)病毒基因組DNA擴(kuò)增用引物序列
引物序列結(jié)合位置產(chǎn)物長度Sense-PCV Anti-PCVTGGAGCTCCTAGATCTCAGGGAC TAGGAGCTCCACACTCCATCAGTAA371-394 357-3811767按照 Roche 公司 Expand High Fidelity PCR System 的操作指南進(jìn)行 PCR 反應(yīng)， 以抽提的病毒DNA為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性3min，94°C變性15sec，58°C退火 45sec，68°C延伸2min ;循環(huán)30次，72°C延伸lOmin。反應(yīng)完畢后取I 21%瓊脂糖凝膠電
5泳檢測，結(jié)果得到約1800bp的DNA條帶。割膠回收PCR產(chǎn)物直接連接到pGEM-T easy載體(Promega公司)上。具體按照說明書進(jìn)行，在O. 5ml離心管中，依次加入以下試劑2XBuffer 5 μ I, pGEM-T easy I μ I, 回收的PCR產(chǎn)物4μ 1，T4DNA liagase I μ 1，室溫連接lh，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HD5 α，涂布含氨芐青霉素的LB平板，挑取單菌落，以LB培養(yǎng)基過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR和酶切鑒定。為進(jìn)一步證實序列的正確性，選3個獨立的陽性克隆進(jìn)行測序。測序用引物步進(jìn)法，在ΑΒΙ3730測序儀上進(jìn)行。對測序正確的克隆分別命名為pGEM-T-PCV，GenBank登錄號為 AY604430. I。實施例2 本實施例描述了本發(fā)明提供的含有豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。如圖2所示跟據(jù)PCV2SX04株基因組序列，設(shè)計特異性引物(表2)，并在蛋白C端引入HA標(biāo)記，用于蛋白的檢測。表2豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白基因擴(kuò)增用引物序列
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法，其特征在于， 方法的步驟為1)豬圓環(huán)病毒2型SX04株全基因組序列的克隆；2)含有豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-PCVCapHA的構(gòu)建；3)將pCI-PCVCapHA轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK15，轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MG132；4)繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，通過抑制蛋白酶體的活性，穩(wěn)定真核細(xì)胞中的豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白，收集細(xì)胞，免疫印跡檢測表達(dá)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型SX04株全基因組序列的克隆步驟為收集 SXO株感染仔豬的淋巴結(jié)組織，抽提病毒基因組DNA，用長距離精確PCR擴(kuò)增基因組DNA全長，克隆于pGEM-T easy,獲得重組載體pGEM_T_PCV,并行序列測定,測定的序列在GenBank 登錄號為AY604430. I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法，其特征在于，所述的含有豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PCI-PCVCapHA的構(gòu)建步驟為根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型SX04株基因組序列， GenBank登錄號ΑΥ604430· I,設(shè)計核衣殼蛋白基因上下游引物pcvCapNhe CgacGCT AGCAtgacgtatccaaggaggcgttac，pcvCapMlu ctACGCGTttaAGCG TAATCTGGAACATCGTATGGGTA agggttaagtggCgggtctttaa ;并在蛋白C端引入HA序列，作為蛋白標(biāo)記,將獲得的核衣殼蛋白基因，通過NheI和MluI連接入pCI-Neo真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-PCVCapHA，并進(jìn)行序列測定。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法，其特征在于，所述的將PCI-PCVCapHA轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK15，轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MG132步驟為pCI-PCVCapHA質(zhì)粒在脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK5，在轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，加入MG132，濃度為5nM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的方法。該方法通過抑制豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的泛化作用(Ubiquitination)，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而提高病毒蛋白在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)水平。方法的步驟為1)豬圓環(huán)病毒2型SX04株全基因組序列的克??；2)含有豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)核衣殼蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；3)將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞PK15，轉(zhuǎn)染后24小時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MG132；4)繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，收集細(xì)胞，免疫印跡檢測表達(dá)蛋白。相對于普通的真核表達(dá)方法，該方法可有效穩(wěn)定真核細(xì)胞中的PCV2核衣殼蛋白。轉(zhuǎn)染后72小時的蛋白免疫印跡檢測顯示，本專利使用的方法，可最高提高PCV2核衣殼蛋白的表達(dá)量在20倍左右。
文檔編號C12N15/85GK102586326SQ20121001872
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者于漣, 方立, 李龍 申請人:杭州貝爾塔生物技術(shù)有限公司