含有豬圓環(huán)病毒2型抗原與副豬嗜血桿菌抗原的疫苗組合物及其制備方法與應(yīng)用
【專利說明】含有豬圓環(huán)病毒2型抗原與副豬嗜血桿菌抗原的疫苗組合 物及其制備方法與應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)為專利申請(qǐng)201210180842. 0的分案申請(qǐng)
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種豬用疫苗組合物，具體涉及一種同時(shí)抵抗豬圓環(huán)病毒2型（PCV2) 和副豬嗜血桿菌（HPS)感染的疫苗組合物及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 豬圓環(huán)病毒（PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒?，F(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清 型，即PCVl和PCV2。PCVl為非致病性的病毒。PCV2為致病性的病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng) 衰竭綜合征（PMffS)的主要病原。PMffS的臨床特征有消瘦、皮膚蒼白、呼吸困難、腹瀉、黃疽 等。病理變化可見全身淋巴結(jié)腫大，特別是腹股溝淋巴結(jié)腫大可達(dá)5~10倍；肺主要呈彌 散性、間質(zhì)性肺炎變化，質(zhì)地硬如橡皮，表面一般呈灰褐色的斑駁狀外觀；腎的變化較多，可 見皮質(zhì)和髓質(zhì)散在大小不一的白色壞死灶，由于水腫而導(dǎo)致其呈現(xiàn)蠟樣外觀；脾輕度腫大； 大多病豬的肝有不同程度的萎縮、纖維化。除PMffS外，豬皮炎與腎病綜合征（PDNS)、增生性 壞死性肺炎（PNP)、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與 PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)。PCV2相關(guān)的豬病，死亡率達(dá)10%~30%不等，較嚴(yán)重的豬場(chǎng)在暴發(fā) 時(shí)死淘率高達(dá)40%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 副豬嗜血桿菌病又稱多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，也稱Glasser氏病。該病 是由副豬嗜血桿菌引起。副豬嗜血桿菌只感染豬，可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主 要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5~8周齡的豬，發(fā)病率一般在10%~15%，嚴(yán)重 時(shí)死亡率可達(dá)50%臨床癥狀取決于炎癥部位，包括發(fā)熱、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮膚及 黏膜發(fā)紺、站立困難甚至癱瘓、僵豬或死亡。母豬發(fā)病可流產(chǎn)，公豬有跛行。哺乳母豬的跛 行可能導(dǎo)致母性的極端弱化。死亡時(shí)體表發(fā)紫，肚子大，有大量黃色腹水，腸系膜上有大量 纖維素滲出，尤其肝臟整個(gè)被包住，肺的間質(zhì)水腫。
[0005] 大量文獻(xiàn)報(bào)道，豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌混合感染非常普遍（魯杏華等， 中國獸醫(yī)雜志，2010,（03):46~48;賈松濤等，中國畜牧獸醫(yī)，2008,（08):99~100;等 等）。因此，需要能同時(shí)抵抗PCV2感染以及副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物。
[0006] 鮑春興等〃淺析疫苗免疫失敗的原因及對(duì)策〃（畜牧獸醫(yī)科技信息2010,（02)8~ 12)，報(bào)道兩種疫苗接種的間隔時(shí)間不夠，或有些養(yǎng)殖戶因防疫任務(wù)繁瑣，為了省事，把兩種 疫苗同時(shí)接種，疫苗進(jìn)入機(jī)體后，疫苗抗原之間可能產(chǎn)生競爭性抑制，造成免疫失敗。為了 避免免疫失敗，豬場(chǎng)一般采取PCV2疫苗和副豬嗜血桿菌疫苗的分別免疫的策略，二種疫苗 免疫的時(shí)間間隔15天以上，以避免兩種抗原之間的干擾，這就造成多次重復(fù)注射，加大了 動(dòng)物應(yīng)激并且提高了防疫成本，防疫效果也不確切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明通過大量的篩選研究，意外發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)和副豬嗜血桿菌 的抗原制備的疫苗組合物，二種抗原相互并不會(huì)相互干擾或影響；相反地，豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2)和副豬嗜血桿菌的抗原組合物和疫苗組合物不僅能夠產(chǎn)生更佳的保護(hù)性免疫應(yīng)答 的同時(shí)，還意外發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌增強(qiáng)了豬圓環(huán)病毒2型抗原（PCV2)的免疫效果，特別是 與副豬嗜血桿菌組合的情況下，即使PCV2抗原量減半仍能維持PCV2的免疫效果。因此本 發(fā)明的第一方面在于提供預(yù)防或治療豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)抗原和副豬嗜血桿菌抗原感 染的疫苗組合物。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明預(yù)防或治療豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)和副豬嗜血桿菌感 染的抗原組合物，其包含至少一種豬圓環(huán)病毒2型抗原和至少一種副豬嗜血桿菌抗原。
[0009] 本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型抗原是指含有至少一種PCV2抗原形式的任何組合物，所 述抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抵抗PCV2感染的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述PCV2抗原是 PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列（如0RF2蛋白）的嵌合病毒，任何其它至少含 PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位或其他成分。PCV2抗原還可以包含以下組合物 的任一種抗原：如梅里亞公司（Merial)的瑞公司（Pfizer)的Suvaxyn? PCV2;哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（LG株）；福州大北農(nóng)生物 技術(shù)有限公司的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（DBN-SX07株）和基因工程亞單位疫苗（如勃林 格殷格翰公司（Boehringer-Ingelheim)的 Ingelvac CircoFLEXli )
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明中豬圓環(huán)病毒2型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原，其中優(yōu)選使用 PCV2 SH株，保藏號(hào)為CGMCC No. 23890,公開于專利文獻(xiàn)CN101240264A。
[0011] 因 PCV2基因組大小為1767bp或1768bp，不同毒株之間核苷酸序列同源性較高，均 在90%以上，因此PCV2 SH株（GenBank登錄號(hào)為AY686763)、PCV2 LG株（GenBank登錄號(hào) 為HM038034)、PCV2 DBN-SX07-2(GenBank登錄號(hào)為HM641752)的抗原組合物或疫苗組合物 均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗中每劑量或每頭份（2ml)含PCV2全病毒抗原滅活前病毒含 量至少為Kf 5TCID5。更優(yōu)選4. 5X10 5'°TCID5QJ06· qTCID5q;再優(yōu)選每劑量或每頭份（2ml)含 PCV2 病毒 9X105.°TCID5。。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明中豬圓環(huán)病毒2型抗原為含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或 亞單位或其他成份，更優(yōu)選地，豬圓環(huán)病毒2型抗原為PCV2亞單位抗原，最優(yōu)選地，豬圓環(huán) 病毒2型抗原為PCV2 0RF2蛋白。其中，本發(fā)明PCV2 0RF2蛋白，優(yōu)選序列表SEQN01.DNA 序列編碼的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白或與其同源性在75%以上的、優(yōu)選 80 %以上的、更優(yōu)選90 %以上的氨基酸序列的蛋白，為能達(dá)到本發(fā)明目的的蛋白序列。本發(fā) 明對(duì)PCV2 0RF2蛋白沒有特別的限制，只要其具有保留對(duì)PCV2的免疫原性，任何PCV2 0RF2 蛋白都可用作本文所述PCV2 0RF2 DNA和/或多肽的來源。
[0014] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述PCV2 0RF2蛋白生物的含量為0. 5~20yg/ 頭份，更優(yōu)選5~10 μ g/頭份
[0015] 副豬嗜血桿菌抗原是指含有至少一種副豬嗜血桿菌抗原形式的任何組合物，所述 副豬嗜血桿菌抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抵抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應(yīng)答。副豬嗜 血桿菌為包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的1~15個(gè)血清 型。優(yōu)選地，所述副豬嗜血桿菌抗原是完整的副豬嗜血桿菌，優(yōu)選為滅活形式，更優(yōu)選，所述 副豬嗜血桿菌抗原是滅活的血清型為4型和5型的混合抗原；最優(yōu)選為滅活的副豬嗜血桿 菌血清4型JS株，和滅活的副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株。其中，副豬嗜血桿菌血清4型JS 株（Haemophilus parasuis Serotype 4, Strain JS)保藏號(hào)為：CCTCC NO:M 2011172;雖Ij 豬嗜血桿菌血清 5 型 ZJ 株（Haemophilus parasuis Serotype 5, Strain ZJ)的保藏號(hào)為： CCTCC N0:M 2011173;保藏日期均為2011年5月18日，保藏地址為：中國武漢，武漢大學(xué)， 中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位均為中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC)。
[0016] 本發(fā)明的副豬嗜血桿菌抗原還可以包含以下組合物的任一種抗原：如勃林格殷格 翰公司的Ingelvac HP-I ;海博萊公司（Hipra)的Hiprasuis-Glasser ;武漢科前動(dòng)物生物 制品有限責(zé)任公司的副豬嗜血桿菌滅活疫苗（4型MD0322株+5型SH0165株）。
[0017] 正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變 異，然而，當(dāng)變異不影響其蛋白質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)或者主要作用功能區(qū)時(shí)，該微生物之他種野外 分離株即使基因序列無法百分之百相同，其基本的生理功能并不會(huì)有所改變。因此，目前國 際上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)來進(jìn)行細(xì)菌型的分辨，因此在相似性的比較上 可以用16S rRNA來進(jìn)行比對(duì)而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本 發(fā)明所使用的副豬嗜血桿菌抗原并不限定于本發(fā)明所使用的野外分離株，
[0018] 16s rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染 色體基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長（包含約50 個(gè)功能域）
[0019] 因此，本發(fā)明包括與副豬嗜血桿菌兩株菌株（JS株、ZJ株）16S rRNA的同源性在 80%上以上的菌株，更優(yōu)選與JS株或ZJ株16S rRNA同源性在至少90%以上，優(yōu)選地至少 95%以上，更優(yōu)選地至少95%~99%以上的副豬嗜血桿菌菌株，即不改變副豬嗜血桿菌兩 株菌株（JS株、ZJ株）16S rRNA的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過簡單的篩選或誘變本 發(fā)明的副豬嗜血桿菌，獲得與本發(fā)明副豬嗜血桿菌16S rRNA高度同源的菌株，并獲得相應(yīng) 地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清4型副豬嗜血桿菌為JS株，保藏號(hào)為 CCTCC No. M2011172。
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清4型副豬嗜血桿菌JS株滅活前前含量 為IX IO9CFU/頭份~8X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌JS株滅活前含量為 2 X IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清4型副豬嗜血桿菌JS株滅活前含量I X IO9CFU/頭份。
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清5型副豬嗜血桿菌為ZJ株，保藏號(hào)為 CCTCC No. M2011173。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中所述血清5型副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量 為IX IO9CFU/頭份~8X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量為 I X IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清5型副豬嗜血桿菌ZJ株滅活前含量2 X IO9CFU/頭份。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)選方式涉及疫苗組合物的佐劑，優(yōu)選為氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、 Montanide? Gel、蜂膠、ISA206、ISA760VG、氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷、植物油、油酸乙酯、二 (辛酸/癸酸）丙二醇酯、三（辛酸/癸酸）甘油酯、二油酸丙二醇酯、異硬脂酸酯、山梨 聚糖、二縮甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸、羥基硬脂酸酯、聚氧丙 烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚 物、糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一種或幾種的一種或幾 種組合物。
[0025] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌病的疫苗 組合物，含有PCV2 l(f°TCID5。/頭份，血清4型副豬嗜血桿菌4X IO9CFU/頭份，含血清5型 副豬嗜血桿菌4X109CFU/頭份，疫苗佐劑為10% (V/V)Montanide? Gel佐劑。
[0026] 疫苗組合物還可以包含其它豬的病原體的附加抗原。附加抗原優(yōu)選豬繁殖與呼吸 綜合征病毒（PRRSV)的抗原、豬肺炎支原體抗原、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP)抗原、 豬偽狂犬病毒（PRV)抗原、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、豬流感病毒（SIV)抗 原及它們的組合。
[0027] 由上可見，本發(fā)明中預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒2型和副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合 物，不僅未產(chǎn)生兩種抗原成份的相互免疫干擾，而且還意外發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌增強(qiáng)了豬圓 環(huán)病毒2型抗原的免疫效果。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述 PCV2抗原為PCV2 0RF2蛋白。所述的副豬嗜血桿菌抗原為滅活的全菌抗原。
[0028] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述PCV2 0RF2蛋白生物的含量為0. 5~20yg/ 頭份，更優(yōu)選5~10 μ g/頭份。
[0029] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌滅活抗原為副豬嗜血桿菌JS