豬圓環(huán)病毒雙亞型orf2共表達載體構(gòu)建及疫苗制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒雙亞型0RF2共表達載體的構(gòu)建及亞單位疫苗的制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV)是最小的動物病毒之一，病毒粒子直徑 17-20nm，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無囊膜，單股、環(huán)狀、閉合的DNA病毒。根據(jù)致病性、 抗原性和核酸序列的差異，PCV可分為PCVl和PCV2。PCVl為豬腎細胞系的一種污染物，對 豬無致病性，而PCV2具有致病性，PCV2及其與其他病原體混合感染對養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng) 濟損失。在豬圓環(huán)病毒?。≒ostwearing multisystemic wasting syndrome associated disease, PCVAD)中，斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)和豬呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory disease comples，PRDC) 是最常見的臨床表現(xiàn)形式。PCV2感染使機體在感染期間發(fā)生免疫抑制，可造成豬的淋巴細 胞缺失，不能通過有效的免疫應(yīng)答清除病毒。在患病最后階段，PMWS病豬表現(xiàn)為嚴重的淋 巴組織損傷，同時影響外周血單核細胞和淋巴組織器官中細胞因子的表達。
[0003] PCV2分為PCV2a，PCV2b和PCV2c三個基因亞型。PCV2主要有兩個開放閱讀框ORFl 和0RF2。ORFl位于病毒基因組上，編碼兩種復(fù)制酶（Replicase，Rep和R印'）；0RF2位于 病毒基因組的鏈上，編碼病毒粒子的Cap蛋白。該蛋白是PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，也是PCV2 主要的免疫原性蛋白。PCV20RF2的大部分基因是抗原表位的所在區(qū)域。
[0004] 2003年前PCV2流行毒株以PCV2a亞型毒株為主，其后至今PCV2流行毒株則以 PCV2b亞型為主。臨床PMWS發(fā)生率與PCV2a向PCV2b基因型的改變有密切相關(guān)。如2004 年加拿大魁北克州的豬場鑒定出新的基因型PCV2b，豬群中PCVAD的死亡率有所增加。韓國 在2000~2008年期間鑒定出的PCV2毒株大部分為PCV2b。
[0005] 為防控PCV2對養(yǎng)豬業(yè)造成的影響，研發(fā)了多種PCV2商品化疫苗。疫苗的應(yīng)用有 效控制了 PCV2的流行。PCV2疫苗自從2006年商品化以來，該疫苗已成為防控PCVAD最重 要的手段。目前為止，全球已成功注冊的PCV2疫苗分為2類：全病毒滅活疫苗和單亞型亞 單位疫苗。其中進口注冊的商品化疫苗全部來源于PCV2a基因型毒株，國內(nèi)近幾年陸續(xù)有 PCV2b亞型的滅活疫苗與亞單位疫苗上市，如申請人的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（ZJ/C)株， 武漢中博生物股份有限公司的豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒載體滅活疫苗（CP08株）等。盡 管已有上述國內(nèi)外多個不同種類、不同亞型的疫苗上市，但圓環(huán)病毒的防控效果并不理想， 仍然是困擾養(yǎng)殖業(yè)的一個重大疫病。如前所述，PCV2a疫苗株、PCV2b疫苗株雖然能夠相互 提供一定的交叉保護，但由于PCV2a與PCV2b毒株之間的抗原性存在差異，保護力無法達到 100%，這可能是造成疫病防控效果不佳的主要原因之一。
[0006] 因此，本領(lǐng)域仍然需要能夠為PCV的防控提供更有效、更全面的防護，同時一針雙 防，在提供全面保護效果的同時，還可減少免疫次數(shù)，節(jié)約免疫成本的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，該免疫原性組合物含有PCV2a 0RF2編碼的Cap 蛋白和PCV2b 0RF2編碼的Cap蛋白。
[0008] 在一個具體實施例中，所述PCV2a 0RF2編碼的Cap蛋白如SEQ ID NO: 2所示。
[0009] 在一個具體實施例中，所述PCV2b 0RF2編碼的Cap蛋白如SEQ ID NO: 4所示。
[0010] 在一個具體實施例中，所述免疫原性組合物還含有佐劑。
[0011] 在一個具體實施例中，所述佐劑選自：NeB復(fù)合緩釋水性佐劑。
[0012] 在一個具體實施例中，所述佐劑含有MONTANIDE ISA 28VG水性佐劑和 Carbopol971P〇
[0013] 在一個具體實施例中，所述免疫原性組合物中每毫升免疫組合物含1 μ g-100 μ g， 優(yōu)選每毫升5 μ g_50 μ g，最優(yōu)選每毫升20 μ g的Carbopol971P。
[0014] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建豬圓環(huán)病毒雙亞型0RF2共表達載體，該表達載體使用 PFastBac-Dual載體作為骨架，在該載體的Pplt^動子下游插入PCV2a的0RF2,在該載體的 Pph啟動子下游插入PCV2b的0RF2。
[0015] 在一個具體實施例中，在該載體的Pplt^動子下游插入PCV2b的0RF2,在該載體的 Pph啟動子下游插入PCV2a的0RF2。
[0016] 在一個具體實施例中，所述PCV2a的0RF2如SEQ ID NO: 1所示。
[0017] 在一個具體實施例中，所述的PCV2b的0RF2如SEQ ID NO:3所示。
[0018] 在一個具體實施例中，所述共表達載體是重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
[0019] 本發(fā)明還提供一種重組穿梭質(zhì)粒，該重組穿梭質(zhì)粒以桿狀病毒骨架載體Bacmid 為骨架，并含有PCV2a 0RF2和PCV2b 0RF2。
[0020] 在一個具體實施例中，所述PCV2a的0RF2如SEQ ID NO: 1所示。
[0021] 在一個具體實施例中，所述的PCV2b的0RF2如SEQ ID N0:3所示。
[0022] 在一個具體實施例中，所述重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)由所述共表達載體與桿狀病毒骨架載 體Bacmid在宿主細胞中發(fā)生同源重組而制備得到。
[0023] 在一個具體實施例中，所述宿主為大腸桿菌。
[0024] 本發(fā)明還提供一種重組桿狀病毒，該重組桿狀病毒含有PCV2a 0RF2和PCV2b 0RF2〇
[0025] 在一個具體實施例中，所述PCV2a的0RF2如SEQ ID NO: 1所示。
[0026] 在一個具體實施例中，所述的PCV2b的0RF2如SEQ ID NO:3所示。
[0027] 在一個具體實施例中，通過用所述重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞而制備得到所述重 組桿狀病毒。
[0028] 本發(fā)明還提供一種免疫原性組合物的制備方法，該方法包括：
[0029] (1)提供豬圓環(huán)病毒雙亞型0RF2共表達載體；
[0030] (2)由（1)所述的豬圓環(huán)病毒雙亞型0RF2共表達載體制備重組穿梭質(zhì)粒；
[0031] (3)將步驟（2)所述重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，制備得到重組桿狀病毒；
[0032] (4)將步驟（3)所獲得的重組桿狀病毒接觸昆蟲細胞，獲得重組蛋白PCV2a Cap和 PCV2b Cap ；
[0033] (5)將步驟（4)所獲得的重組蛋白加到佐劑中，從而制備得到所述免疫原性組合 物。
[0034] 在一個具體實施例中，所述步驟（1)中的豬圓環(huán)病毒雙亞型0RF2共表達載體使用 PFastBac-Dual載體作為骨架，在該載體的Pplt^動子下游插入PCV2a的0RF2,在該載體的 Pph啟動子下游插入PCV2b的0RF2。
[0035] 在一個具體實施例中，所述步驟（1)中的豬圓環(huán)病毒雙亞型0RF2共表達載體使用 PFastBac-Dual載體作為骨架，在該載體的Pplt^動子下游插入PCV2b的0RF2,在該載體的 Pph啟動子下游插入PCV2a的0RF2。
[0036] 在一個具體實施例中，步驟（2)中的重組穿梭質(zhì)粒以桿狀病毒骨架載體Bacmid為 骨架，并含有 PCV2a 0RF2 和 PCV2b 0RF2。
[0037] 在一個具體實施例中，所述佐劑為NeB復(fù)合緩釋水性佐劑。
[0038] 本發(fā)明還提供所述免疫原性組合物在制備能減輕PCV2感染相關(guān)性臨床癥狀的嚴 重性的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述藥物用于預(yù)防PCV2感染，尤其是PCV2a和PCV2b單獨 或混合感染，更優(yōu)選用于小豬。
[0039] 本發(fā)明還包括所述免疫原性組合物在制備用于（i)預(yù)防PCV2再次感染或（ii)減 少或消除PCV2所致對象臨床癥狀的藥物中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0040] 圖1顯不pFastBac-Dual載體圖譜。
[0041] 圖2顯示PCV2-0FR2進化樹分析。
[0042] 圖3顯示重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b_Cap的PCR鑒定。其中，M為 DNA marker DL2000 ;1 為重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap 以 PCV2a-Cap 引 物進行PCR擴增的產(chǎn)物；2為重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap以PCV2b-Cap 引物進行PCR擴增的產(chǎn)物。
[0043] 圖4顯示重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac/PCV2a-PCV2b_Cap的酶切鑒定。其中，Ml為 DNA marker DL2000 ;M2 為 DNA marker DL15000 ;1 和 2 分別為重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 p