FastBac/ PCV2a-Cap-PCV2b-Cap 的 BamH I、Not I 雙酶切產(chǎn)物。
[0044] 圖5顯示重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，其中A為正常Sf9細(xì)胞（200X)，B為rBac/ PCV2a-PCV2b-Cap 轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞（200X)。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 本發(fā)明基于PCV2a_2b雙亞型的亞單位疫苗。
[0046] 本發(fā)明所用的"免疫原性或免疫原性組合物"指包含至少兩種抗原的組合物，所述 抗原能在宿主中引發(fā)針對感興趣的組合物或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通 常，"免疫應(yīng)答"包括但不限于以下一種或多種作用：產(chǎn)生或激活抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、 抑制T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或yd T細(xì)胞，其特異性針對感興趣組合物或疫苗中 包含的抗原。優(yōu)選地，宿主將顯示治療性或保護(hù)性免疫應(yīng)答，而提高對新發(fā)感染的抵抗力和 /或降低疾病的臨床嚴(yán)重程度。可通過感染宿主通常所顯示癥狀的減輕或缺失、恢復(fù)時(shí)間較 短和/或感染宿主中病毒效價(jià)降低來表明這種保護(hù)作用。
[0047] 本文中，"穿梭載體"或"穿梭質(zhì)粒"指一種DNA分子，其包含至少一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、異 源基因（在本文中是PCV20RF2)和允許將所述異源基因克隆入病毒載體的DNA序列。允許 將所述異源基因克隆入病毒載體的DNA序列優(yōu)選側(cè)接于該異源基因。更優(yōu)選的是，這些側(cè) 接序列至少與該病毒載體序列部分同源。這種序列同源性可允許病毒載體和穿梭載體的分 子之間發(fā)生重組，而產(chǎn)生含有該異源基因的重組病毒載體。所述穿梭載體優(yōu)選包含PCV2a 和 PCV2b 的 0RF2DNA。
[0048] 在更優(yōu)選的形式中，本發(fā)明將從分離PCV2a和PCV2b的0RF2DNA開始。通常，該 DNA可來自已知或未知毒株，因?yàn)?RF2DNA似乎在不同分離物中高度保守，序列相同性至少 約為95%。本領(lǐng)域已知的任何PCV2a和PCV2b的0RF2DNA均可用于本發(fā)明。SEQ ID N0:1 和3分別顯示了 PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA的實(shí)例。
[0049] 因此，本發(fā)明提供了構(gòu)建含有PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA的重組病毒載體 的方法。此方法包括以下步驟：i)將重組PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA克隆入穿梭載 體；和ii)將含有重組PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA的穿梭載體轉(zhuǎn)染到病毒載體中，產(chǎn) 生重組病毒載體。
[0050] 在步驟i)之前還可包括以下步驟：體外擴(kuò)增PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA ; 將體外擴(kuò)增獲得的PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA克隆到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中；和用該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞（例如大腸桿菌），使之與桿狀病毒骨架載體在該宿主細(xì)胞中發(fā)生同源重組， 從而制備得到所述穿梭載體。
[0051] 用于構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的載體例子包括pFastBac-Dual載體。通常，在pFastBac-Dual 載體的Ppltl啟動子下游插入PCV2a的0RF2, P pH啟動子下游插入PCV2b的0RF2,獲得重組轉(zhuǎn) 移質(zhì)粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap。或者，也可在P pic^動子下游插入PCV2b的0RF2， 而在Pph啟動子下游插入PCV2a的0RF2。此外，可將上述ORF進(jìn)行合適次數(shù)的重復(fù)插入。
[0052] 用于構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的骨架可以是桿狀病毒骨架載體Bacmid。
[0053] 前述步驟ii)通常在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行，例如在Sf9細(xì)胞中進(jìn)行。
[0054] 基于制備得到的重組蛋白，本發(fā)明提供了一種用于引發(fā)抗PCV2a和PCV2b的免疫 應(yīng)答的藥物組合物或免疫原性組合物，該組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。 本文所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、穩(wěn)定劑、稀釋 劑、防腐劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。
[0055] 稀釋劑可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。等滲劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露 醇、山梨糖醇和乳糖等。穩(wěn)定劑包括白蛋白、乙二胺四乙酸的堿金屬鹽、海藻糖、和蔗糖等。
[0056] 此外，本發(fā)明的藥物或免疫原性組合物（例如疫苗）可包含佐劑。本文所用"佐 劑"可包括氫氧化鋁和磷酸鋁，皂苷如Quil A、QS-21，油包水乳液，水包油乳液，水包油包 水乳液。具體說，乳液可基于輕質(zhì)石蠟油；類異戊二烯油如角鯊?fù)榛蚪酋徬?；鏈烯，具體是 異丁烯或癸烯硫代寡聚化產(chǎn)生的油；含有直鏈烷基的酸或醇的酯，更具體是植物油、油酸乙 酯、二（辛酸/癸酸）丙二醇酯、三（辛酸/癸酸）甘油酯或二油酸丙二醇酯；支鏈脂肪酸 或醇的酯，具體是異硬脂酸酯。將油與乳化劑聯(lián)用以形成乳液。乳化劑優(yōu)選非離子性表面活 性劑，具體是山梨聚糖、二縮甘露醇（如油酸脫水甘露醇酯）、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、 異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯（任選乙氧基化），以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共 聚物，具體是普朗尼克產(chǎn)品，尤其是L121。
[0057] 佐劑的另一個(gè)例子是選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者順丁烯二酸酐與烯 基衍生物共聚物的化合物。佐劑化合物宜為交聯(lián)的、尤其是與糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián) 的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。這些化合物稱為卡波姆。以名稱卡巴浦爾出售的產(chǎn)品 (BF Goodrich，Ohio,USA)尤其合適。它們與稀丙基鹿糖或與稀丙基戊赤蘚醇交聯(lián)。其中， 可提及的有卡巴浦爾974P、934P和971P。最優(yōu)選采用卡巴浦爾971P。在馬來酸酐和烯基 衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是馬來酸酐和乙烯的共聚物。這些聚合物在水 中的溶解產(chǎn)生的酸溶液應(yīng)予中和，優(yōu)選中和至生理pH，以產(chǎn)生其中可摻入免疫原性、免疫或 疫苗組合物本身的佐劑溶液。
[0058] 優(yōu)選每劑量加入約100 μ g-10mg量的佐劑。更優(yōu)選每劑量加入約500 μ g-5mg量 的佐劑。更優(yōu)選每劑量加入約750 μ g-2. 5mg量的佐劑。最優(yōu)選每劑量加入約Img量的佐 劑。
[0059] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，使用法國SEPPIC MONTANIDE ISA 28VG優(yōu)質(zhì)水性佐劑。 在更優(yōu)選的實(shí)施例中，使用法國SEPPIC公司M0NTANIDE ISA28VG水性佐劑與CAM高級聚合 物Carbopol971P的混合物（本文稱該混合物為"NeB復(fù)合緩釋水性佐劑"）。該NeB復(fù)合 緩釋水性佐劑具有復(fù)合緩釋雙重作用。所述MONTANIDE ISA 28VG能誘發(fā)高免疫力，且無副 反應(yīng)。Carb〇p〇1971P高聚物能使病毒顆粒均勻的分布在交聯(lián)的高聚合物中，同時(shí)在整體和 復(fù)微粒釋放系統(tǒng)中均具有高效控釋作用。優(yōu)選的，每毫升免疫組合物（例如疫苗成品）中， Carbopol971P添加的比例約為1 μ g-ΙΟΟ μ g，更優(yōu)選每毫升加入約5 μ g_50 μ g，最優(yōu)選每 毫升加入約20 μ g的Carbopol971P。
[0060] 本發(fā)明組合物中包含的PCV2a和PCV2b Cap蛋白的水平至少為0.2yg抗原/ ml最終免疫原性組合物（μ g/ml)，更優(yōu)選約0. 2-400 μ g/ml，更優(yōu)選約0. 3-200 μ g/ml， 更優(yōu)選約〇. 35-100 μ g/ml，更優(yōu)選約0. 4-50 μ g/ml，更優(yōu)選約0. 45-30 μ g/ml，更優(yōu)選約 0· 6-15 μ g/ml，更優(yōu)選約 0· 75-8 μ g/ml，更優(yōu)選約 L 0-6 μ g/ml，更優(yōu)選約 L 3-3. 0 μ g/ml， 更優(yōu)選約 I. 4-2. 5 μ g/ml，更優(yōu)選約 I. 5-2. 0 μ g/ml。
[0061] 本文所述組合物可制成已知的可注射、生理可接受的無菌溶液。對于制備用于胃 腸道外注射或輸注的即用型溶液而言，易于獲得等滲水溶液，如鹽水或相應(yīng)的血漿蛋白質(zhì) 溶液。
[0062] 本發(fā)明的該免疫原性組合物還可包含一種或多種其它免疫調(diào)節(jié)劑，如白介素、干 擾素或其它細(xì)胞因子。該免疫原性組合物也可含慶大霉素和硫柳汞。
[0063] 本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有本發(fā)明免疫原性組合物和說明手冊，用以指導(dǎo)技 術(shù)人員將所述免疫原性組合物給予所需的對象，如豬。
[0064] 本發(fā)明還包括將本文所述任何組合物用作藥物，優(yōu)選用作獸用藥物，更優(yōu)選用作 疫苗的應(yīng)用。而且，本發(fā)明也涉及本文所述任何組合物用于制備能減輕PCV2感染相關(guān)性 臨床癥狀的嚴(yán)重性的藥物的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述藥物用于預(yù)防PCV2感染，尤其是PCV2a和 PCV2b單獨(dú)或混合感染，更優(yōu)選用于小豬。
[0065] 本發(fā)明還包括用于（i)預(yù)防PCV2感染或再次感染或（ii)減少或消除PCV2所致 對象臨床癥狀的方法，所述方法包括將本文所述任何免疫原性組合物給予需要的對象。所 述對象優(yōu)選豬。優(yōu)選通過肌肉內(nèi)給予該免疫原性組合物。優(yōu)選給予一個(gè)劑量或兩個(gè)劑量的 該免疫原性組合物，其中一個(gè)劑量優(yōu)選含有至少約3 μ g PCV2a和PCV2b 0RF2蛋白，更優(yōu)選 約3-4 μ g，和至少約10-100 μ g卡巴浦爾，優(yōu)選約40 μ g卡巴浦爾。通常，一個(gè)劑量的體積 約為2ml。
[0066] 下文將以具體實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅僅是闡述性的，并 不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)條件、試劑，除非另有說明，否則為本領(lǐng)域 常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件和試劑。
[0067] 1、共表達(dá)載體的構(gòu)建