專利名稱：甘藍tt16基因家族及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別涉及甘藍型油菜(Brassica napus)及其親本物種白菜(Brassica rapa)和甘藍(Brassica oleracea) TT16 (TRANSPARENT TESTA 16,透明種皮 16 ;又稱 ABS，ARABIDOPSIS BSISTER ;或 AGL32，AGAM0US-LIKE 32)基因家族及其應用。
背景技術：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞植物品種，為人類提供營養(yǎng)價值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具有重要的經濟價值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍型油菜是由2個二倍體物種白菜和甘藍通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍型油菜是世界第二大油料作物，在全世界廣泛種植，栽培面積和產量僅次于大豆。白菜和甘藍也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍功能基因的比較基因組學研究將為揭示它們之間的遺傳進化關系提供理論基礎，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應用基礎。籽粒顏色是甘藍型油菜的重要性狀之一。甘藍型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅柏蛋白含量高等優(yōu)點，與黑籽品系相比，餅柏的經濟價值和油的品質都有所提高。雖然白菜和甘藍中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界中不存在天然的甘藍型油菜黃籽基因型。已有的甘藍型油菜黃籽材料主要通過遠緣雜交等方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負相關性狀難以克服等缺點，遠遠不能滿足生產要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘藍型油菜黃籽性狀成為甘藍型油菜育種的重要目標。長期以來，全世界眾多研究者對該性狀進行了廣泛研究，但到目前為止對于黃籽性狀形成的分子機理仍不清楚，更沒有通過轉基因分子育種創(chuàng)造黃籽性狀的任何報道。類黃酮物質是廣泛存在于植物界的次生代謝物質，是植物組織中紅色、藍色和紫色等花青素苷色素的呈色物質。擬南芥(Arabidopsis thaliana)等植物種皮色素的主要成分為原花青素(proanthocyanidin, PA)單體的聚合物,其是經公共苯丙燒途徑-類黃酮途徑-原花青素途徑合成的。目前的研究表明，類黃酮生物合成的調控是由轉錄因子的協(xié)同作用來完成的，而這些轉錄因子表達的時空特性受到精密調控。已知WD40、MYB、 bHLH、MADS-box、WRKY和bZIP轉錄因子都參與了類黃酮途徑的調控，其中MADS_box (TT16)、 WRKY(TTG2)和bZIP(TTl)轉錄因子在此途徑中的作用還沒有徹底明確。蕓薹屬和擬南芥同屬十字花科，具有較近的親緣關系。擬南芥TT16(AtTT16)基因編碼MADS_box轉錄因子，研究發(fā)現(xiàn)其對于BAN基因的表達和原花青素在內種皮中的積累是必需的。擬南芥ttl6突變體表現(xiàn)為透明種皮即黃籽性狀，且內種皮細胞變得不規(guī)則，推測該基因可能還參與調控內種皮細胞分化和發(fā)育，但具體作用和機制尚不清楚。因此，在蕓薹屬中對TT16基因進行同源克隆和功能鑒定，是篩選甘藍型油菜黃籽位點的重要途徑。蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬年前發(fā)生分離，蕓薹族植物發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，529Mbp)、甘藍(CC組，696Mbp) 和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當于甘藍和白菜兩個基因組之和，約相當于擬南芥基因組的6倍，也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍和白菜中可能分別有3個對應的拷貝，而在甘藍型油菜中可能有6個拷貝。目前對TT16基因的研究報道較少，而TT16基因在甘藍型油菜、白菜、甘藍等蕓薹屬物種中的成員數(shù)、蛋白特征、進化關系、表達的組織特異性及與黃籽性狀的關系等都未見報道。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT16
基因家族。為達到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴增(RACE)技術，分別克隆了甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT16基因家族成員的全長cDNA和對應的基因組序列，并進行了系統(tǒng)分析。結果顯示所述白菜TT16(BrTT16)基因家族包括以下3個成員BrTT16_l基因、BrTT16_2基因和&TT16-3基因；所述&TT16-1基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT16-2 基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 4所示，BrTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 6 所示；所述甘藍TT16(BoTT16)基因家族包括以下3個成員BoTT16_l基因、BoTT16_2基因和BoIT16-3基因；所述BoIT16-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示，BoTT16_2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BoTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ IDNo. 12 所示；所述甘藍型油菜TT16(BnTT16)基因家族包括以下6個成員BnTT16_l基因、 BnTT16-2 基因、BnTT16-3 基因、BnTT16-4 基因、BnTT16-5 基因和 BnIT16-6 基因；所述 BnTT16-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 14所示，BnTT16_2基因的全長cDNA序列如 SEQ IDNo. 16所示，BnTT16-3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 18所示，BnTT16-4基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 20所示，BnTT16_5基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 22 所示，BnTT16-6基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 24所示。進一步，所述BrTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. I所示，BrTT16_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示，BrTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示，BoTT16_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 9所示，BoTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 11所示；所述BnTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 13所示，BnTT16_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 15所示，BnTT16-3基因的基因組序列如SEQ ID No. 17所示，BnTT16_4 基因的基因組序列如SEQ ID No. 19所示，BnTT16-5基因的基因組序列如SEQ ID No. 21所示，BnTT16-6基因的基因組序列如SEQ ID No. 23所示。
上述3個物種的12條TT16基因與AtTT16基因具有較高的同源性，基因組序列一致性為67. I 70. 3%，編碼區(qū)序列一致性為82. 9 87. 0%，編碼蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分別為73. 0 78. 2%和78. 2 85. 7 %，核酸水平和氨基酸水平的序列比對、系統(tǒng)發(fā)生聚類等方面都表明，它們是AtTT16基因的垂直同源基因。這3個物種的12條 TT16基因之間也具有很高的同源性，基因組序列一致性為69. 4 100. 0%，編碼區(qū)序列一致性為85. 2 100. 0%，編碼蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分別為75. I 100%和 80. 4 100% ;其中，甘藍型油菜的BnTT16-l、BnTT16-4、BnTT16-6基因分別來源于白菜的 &TT16-1、BrTT16-2、BrTT16-3 基因，而甘藍型油菜的 BnIT16-2、BnTT16-3, BnTT16-5 基因分別來源于甘藍的 BoIT16-l、BoTT16-2、BoIT16-3 基因。BnIT16、BrTT16、BoIT16 基因家族保持了與AtTT16基因類似的器官特異性，主要在生殖器官中表達，以花和發(fā)育中的種子表達最高，并隨著種子的發(fā)育進程而逐漸下降。此外，TT16基因在甘藍型油菜和白菜的黑籽與黃籽材料中的表達存在著較明顯的差異，而在甘藍的黑籽與黃籽材料中無明顯差異，說明甘藍型油菜和白菜的黃籽性狀與TT16基因表達下調有關，而甘藍的黃籽性狀與TT16基因幾乎沒有關系?；谏鲜鼋Y果，利用本發(fā)明的BnTT16、BrTT16、B0TTI6基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構建TT16基因重組表達載體和轉化體，用于TT16基因的正義表達、反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT16基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應用。進一步，所述甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT16基因家族在甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明選取甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT16基因家族特異保守保守區(qū)段BTT16I(核苷酸序列如SEQ ID No. 14中第353 966位堿基所示)為 RNA干擾片段，以基于pFGC5941改造的植物RNA干擾基礎載體pFGC5941M為骨架，將BTT16I 分別以反義和正義方式同時插入PFGC5941M的CaMV35S啟動子和OCS終止子之間形成反向重復序列，構建了蕓薹屬TT16基因家族RNA干擾載體pFGC5941M-BTT16I，并通過農桿菌轉化法轉化了甘藍型油菜典型黑籽品種中雙10號，所得陽性轉基因植株的性狀調查發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾沉默BnTT16基因家族后，轉基因植株的背景性狀正常，轉基因種子明顯變小且種皮色素明顯減少，多數(shù)呈黃褐色和黃棕色，與非轉基因種子的典型黑籽形成鮮明對比。說明在甘藍型油菜等植物中，TT16基因同時調控種子大小發(fā)育、種皮色素積累等性狀的形成， 可以應用于蕓薹屬作物種子性狀的分子育種，尤其是甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種，利于創(chuàng)造出新型的甘藍型油菜黃籽材料，也可以超量表達后用于增加種子的大小，提高種子千粒重。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TT16基因在甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進化關系、表達的組織特異性等，并確認了 TT16基因家族同時參與種子大小的發(fā)育和種皮色素的積累， 由此本發(fā)明提供了 TT16基因在蕓薹屬作物種子性狀改良特別是甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種中的應用，應用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中圖I 為 BnTT16 (A)、BrTT16 (B)、B0TTI6 (C)基因家族 5，cDNA 末端的擴增。圖2 為 BnTT16 (A)、BrTT16 (B)、B0TTI6 (C)基因家族 3，cDNA 末端的擴增。圖3為BnTT16(A)、BrTT16(B)、BoTT16(C)基因家族成員全長cDNA的擴增，其中I采用引物組合FBT16-l+RBT16-2，2采用引物組合FBT16-3+RBT16-4，3采用引物組合 FBT16-5+RBT16-6。圖4為BnITie (A)、&TT16 (B)、BOIT16 (C)基因家族成員基因組DNA的擴增，其中I采用弓I物組合FBT16-1+RBT16-2，2采用弓I物組合FBT16-3+RBT16-4, 3采用弓I物組合 FBT16-5+RBT16-6。圖5為&TT16、BoTT16, BnTT16基因家族成員及AtIT16基因mRNA的序列比對。圖6為BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白及AtTT16蛋白的氨基酸序列比對。圖I為^■1'1'16、801'1'16、8111'1'16基因家族成員與4丨1'1'16基因1111 應的聚類分析。圖8為BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白與AtTT16蛋白的聚類分析。圖9為&TT16、BoTT16, BnTT16基因家族成員的Southern雜交鑒定，其中M為地高辛標記的分子量標準。圖10為BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族總體和成員的器官特異性表達檢測。圖11為白菜、甘藍、甘藍型油菜的黑籽、黃籽材料主要生殖器官中TT16基因家族總體和成員的表達。圖12為RNA干擾片段BTT161的PCR擴增。圖13為RNA干擾載體pFGC5941M_BTT16I的結構圖。圖14為RNA干擾載體pFGC5941M_BTT16I構建中的酶切和PCR鑒定，其中 A 為 Swa I+Aat II 雙酶切 pMD19-T_BIT16I，M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 PMD19-T-BTT16I ；B 為 Swa I+Aat 11 雙酶切 pFGC5941M, M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 PFGC5941M ；C 為 pFGC594IM-BIT16IA 的克隆子菌液 PCR 檢測；D 為 BamH I+Xba I 雙酶切 PMD19-T-BTT16I, M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 pMD19_T_BTT16I ;E 為 BamH I+Xba I 雙酶切 pFGC594IM-BIT16IA ；M 為 DNA marker, CK 代表酶切前的 pFGC594IM-BIT16IA ；F 為 PFGC5941M-BTT16I 的克隆子菌液 PCR 檢測，M 為 DNA marker。圖15為再生植株的Basta復檢鑒定，其中CK為非轉基因植株，1-3為再生植株。圖16為再生植株的PCR檢測結果，其中M為DNA marker, CK為陽性對照，I為陰性對照，2-15為再生植株。圖17為轉基因種子(左)和非轉基因種子(右)的比較。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實施例采用的植物材料白菜材料均來自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp.oleifera)，包括黑籽系09L597和黃籽系09L600 ;甘藍材料均來自于羽衣甘藍變種 (B. oleracea var. acephala)，包括黑桿系09L598和黃桿系09L599 ;甘藍型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黃籽系09L587)，均由重慶市油菜工程技術研究中心選育和大田常規(guī)種植，并經過了 10代以上的單花序套袋自交；甘藍型油菜黑籽品種中雙10號由中國農業(yè)科學院油菜作物所選育，種子由重慶市油菜工程技術研究中心提供。優(yōu)選實施例采用的試劑Easy-Taq DNA聚合酶[5U/iU，附10XPCR Buffer (含 Mg2+)]購自北京全式金生物技術有限公司；LA Taq DNA聚合酶[5U/yl，附10XLA PCR Buffer II (含Mg2+)]、X-HindIII DNA marker等購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內切酶Dral、EcoRI> EcoRV> Hindlll、尼龍膜、地高辛標記的DNA marker等購自立陶宛 MBI Fermentas公司；pMD19_T載體購自寶生物工程(大連)有限公司，MS (Murashige and Skoog medium)培養(yǎng)基購自荷蘭Duchefa公司，結冷膠購自浙江中肯生物科技有限公司，其它分子、生化和植物組織培養(yǎng)試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司和上海稼豐園藝用品有限公司；改進型植物RNA干擾基礎載體pFGC5941M是在pFGC5941的基礎上改進而成，改進之處是采用來自甘藍型油菜的BnPAP2基因第2內含子(BnPAP2I2)替換pFGC5941 上過長的PhChsA間隔區(qū)，并在間隔區(qū)與啟動子間增加一個AatII切點。優(yōu)選實施例采用的試劑盒小量植物組織RNA抽提試劑盒(W7021)購自上海華舜生物工程有限公司，小量膠回收試劑盒及質粒抽提試劑盒購自Omego公司，pMD19-T載體連接試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，GeneRacer Kit購自美國Invitrogen公司，PCR DIGProbe Synthesis Kit、DIG Easy Hyb>DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic AcidDetection Kit 均購自德國 Roche 公司，RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 購自寶生物工程 (大連)有限公司。一、甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT16基因家族的克隆I、甘藍型油菜、白菜和甘藍基因組總DNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍型油菜5B、白菜09L597和甘藍09L598的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質量和濃度。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，提取的3個物種的基因組總DNA完整性好，平均分子量均大于入-HindIII DNA Marker的23kb條帶，RNA消化比較完全，經分光光度法檢測純度較高，可以直接用于PCR擴增及Southern雜交。2、甘藍型油菜、白菜和甘藍各器官總RNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍型油菜5B、白菜09L597和甘藍09L598的蕾(Bu)、 花(Fl)以及4個發(fā)育階段的種子[甘藍型油菜和甘藍取開花后15天(iro)、30天(30D)、45 天(45D)和55天(55D)的種子;白菜取開花后10天(IOD)、25天(25D)、40天(40D)和45 天(45D)的種子];以及大田常規(guī)條件下栽培的甘藍型油菜09L587和09L588、白菜09L597 和 09L600、甘藍 09L598 和 09L599 的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St)、葉(Le)、蕾、 花、莢果皮(SP)以及4個發(fā)育階段的種子(甘藍型油菜和甘藍取iro、30D、4 和55D的種子；白菜取10D、2 、40D和4 的種子)共12個器官；采用小量植物總RNA抽提試劑盒提取各器官總RNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質量和濃度。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，獲得的總RNA特征條帶清晰，且無明顯RNA降解和DNA污染，經分光光度法檢測純度較高，能夠滿足RACE操作的基本要求。3、甘藍型油菜、白菜和甘藍RACE第一鏈cDNA的獲得分別取甘藍型油菜5B、白菜09L597和甘藍09L598的蕾、花和4個發(fā)育階段的種子的總RNA混合成總量為5 μ g的RNA樣品，采用GeneRacer Kit按其說明書進行一系列的 RACE操作，最終反轉錄獲得在3’端和5’端同時錨定有人工接頭序列的第一鏈cDNA，PCR 放大后進行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，三個物種的第一鏈cDNA呈現(xiàn)出大小在 200bp IOkb的拖帶,重心區(qū)域在500bp 4kb,最核心區(qū)在I. 5kb左右，說明反轉錄比較完全，得到了較高質量的總cDNA，可用于克隆甘藍型油菜、白菜和甘藍TT16基因家族完整的cDNA末端。4、甘藍型油菜、白菜和甘藍TT16基因家族5’ cDNA末端的克隆根據(jù)AtTT16基因序列多重比對的結果，設計了對應于兩個最保守點的反向引物R TT16-50(5’-ggatcgttttgaagattaggctgagcaag-3>)和 RBT16RT(5’-gctcgtgtggaggaatgga gg-3’)。分別以白菜、甘藍、甘藍型油菜第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer Kit提供的引物 5，P (5，-cgactggagcacgaggacactga-3，)與 RTT16-50 配對，進行 5，cDNA 末端的 RACE — 擴。50 μ I 標準 TaqPCR 擴增體系為10 X PCR Buffer 5. O μ 1，25mmol/L 的 MgCl2 3. 0μ I, IOmmoI/L 的 dNTPsl. 0μ l,10ymol/L 的正向引物 I. O μ l,10ymol/L 的反向引物 I. O μ 1， 5U/ μ I的Taq酶0. 5 μ I，模板O. 5 μ I，加雙蒸水至總體積為50 μ I。PCR擴增循環(huán)參數(shù)為 94°C預變性2分鐘；再94°C變性I分鐘，52°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共30個循環(huán)； 最后72°C延伸10分鐘。以一擴產物為模板，用GeneRacer Kit 提供的引物 5’NP (5’-ggacactgacatggactg aaggagta-3’ )與RBT16RT配對，進行5’ cDNA末端的RACE巢擴，PCR擴增體系與一擴相同但模板改為O. I μ 1，PCR擴增循環(huán)參數(shù)為94°C預變性2分鐘；再94°C變性I分鐘，58°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共25個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物進行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，采用小量膠回收試劑盒回收目標片段，與PMD19-T載體連接，再轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素(Amp)、IPTG和Χ-gal的LB平板培養(yǎng)至藍白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp的LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，取菌液進行PCR檢測，結果陽性克隆子表現(xiàn)出明顯的長度多態(tài)性，各挑選10個具有代表性的陽性克隆子委托上海英濰捷基生物技術有限公司進行測序。測序結果表明BrTT16基因家族的5’ cDNA末端介于429 681bp之間，B0TTI6基因家族的5’cDNA末端介于448 658bp之間，BnTT16 基因家族的5’ cDNA末端介于526 649bp之間。NCBI BLASTn表明，這些5’ cDNA末端與 AtTT16/ABS mRNA(AJ318098)具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬TT16基因家族的 5，cDNA 末端。5、甘藍型油菜、白菜和甘藍TT16基因家族3’ cDNA末端的克隆根據(jù)AtTT16基因序列多重比對的結果，設計了對應于兩個最保守點的正向引物 FTT16-30(5，-tgagctctct(g/a)ttctctg(c/t)gatgc-3，)和 FTT16-3N(5，-ctcacatcggtctc atcgtcttctc-3’)。分別以白菜、甘藍、甘藍型油菜第一鏈cDNA為模板,用GeneRacer Kit提供的引物 3，P (5，-gctgtcaacgatacgctacgtaacg-3，)與 FTT16-30 配對，進行 3，cDNA 末端的RACE —擴。PCR擴增體系和擴增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE —擴相同。以一擴產物為模板，用GeneRacer Kit提供的引物3’ N
8P (5，-cgctacgtaacggcatgacagtg-3’ )與 FTT16-3N 配對，進行 3’ cDNA 末端的 RACE 巢擴， PCR擴增體系和擴增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE巢擴相同。PCR產物如前法所述進行電泳檢測(圖2)、膠回收、PMD19-T載體克隆、轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞、陽性克隆子篩選、 菌液PCR鑒定和測序。測序結果表明BrTT16基因家族的3’ cDNA末端介于778 853bp 之間，B0TTI6基因家族的3’ cDNA末端介于733 936bp之間，BnTT16基因家族的3’ cDNA 末端介于687 820bp之間[均不包括poly (A)]。NCBI BLASTn表明，這些3’cDNA末端與 AtTT 16/ABS mRNA基因具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬TT16基因家族的3 ’ cDNA 末端。6、甘藍型油菜、白菜和甘藍TT16基因家族成員全長cDNA的克隆根據(jù)BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族5’和3’cDNA末端的測序結果，設計了 3條正向引物和3條反向引物(表I)，得到3對引物組合:FBT16-l+RBT16-2、FBT16-3+RBT16-4、 FBT16-5+RBT16_6 ;分別以白菜、甘藍、甘藍型油菜第一鏈cDNA為模板，采用上述引物組合和50 μ I標準Taq PCR擴增體系，擴增BnTT16、BrTT16、B0TTI6基因家族各成員的全長 cDNA，PCR擴增循環(huán)參數(shù)為94°C預變性2分鐘，再94°C變性I分鐘、54 57°C退火I分鐘、 72°C延伸2分鐘，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；再如前法所述進行電泳檢測(圖3)、 膠回收、PMD19-T載體克隆、轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測序。表I BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成員全長cDNA的擴增引物
引物名稱引物序列(5’—3’)核苷酸數(shù)(nt)解鏈溫度(°c)FBT16-1ggatccgagaaagtctgattaagcatattattccc3561.80/67.01FBT16-3ggatccaaaagcaacttatagatgtatatatgtaagg3759.35/64.68FBT16-5ggatccacacacgctatacacacggagtta3062.86/68.73RBT16-2cccggggalgatgaatgattattatgattaatataalc3856.96/64.69RBTI6-4cccggggatggctagtt aatcatataatcaagacc3561.80/69.36RBT16-6CCCgggagatgtaatgatgattgattatataattaaag3856.96/64.69結果以白菜第一鏈總cDNA為模板，引物組合分別為FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各擴增得到 I 條長度分別為 1060bp、1242bp、1123bp 的全長 cDNA，分別命名為 fcTT16-lmRNA、BrTT16-2mRNA 和 fcTT16_3mRNA。以甘藍第一鏈總cDNA為模板，引物組合分別為FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各擴增得到 I 條長度分別為 1087bp、1028bp、1134bp 的全長 cDNA，分別命名為 BoTT16-lmRNA、BoTT16-2mRNA 和 BoTT16_3mRNA。以甘藍型油菜第一鏈總cDNA為模板，引物組合為FBT16-1+RBT16-2，擴增得到2條長度分別為1060bp和1084bp的全長cDNA，分別命名為BnTT16_lmRNA和BnTT16_2mRNA ;引物組合為FBT16-3+RBT16-4，擴增得到2條長度分別為1214bp和1243bp的全長cDNA，分別命名為BnTT16-3mRNA和BnTT16_4mRNA ;引物組合為FBT16-5+RBT16-6，擴增得到2條長度分別為 1128bp 和 1123bp 的全長 cDNA，分別命名為 BnTT16_5mRNA 和 BnTT16_6mRNA。Vector NTI Advance 9.0多重比對表明，所得的&11'1'16、81'1716、801'1'16基因家族的全長cDNA均有相應的RACE末端克隆子序列與之對應，說明它們均是可轉錄表達的基因。多重比對還表明，3個物種中RACE末端所指示的各獨立基因均已獲得了對應的全長cDNA。7、甘藍型油菜、白菜和甘藍TT16基因家族成員基因組DNA的克隆根據(jù)BrTT16、B0TTI6、BnTT16基因家族成員全長cDNA的序列多重比對結果，設計檢測各成員的特異引物組合:FBT16-1S+RBT16-12S、FBT16-2S+RBT16-12S、 FBT16-34S + RBT16-3S、FBT I 6-34S + RBT I 6-4S、FBT I 6-56S + RBT I 6-5S、 FBT16-56S+RBT16-6S (表 2);根據(jù) &ΤΓ16、ΒοΤΤ16、ΒηΤΤ16 基因家族 RACE 末端和全長 cDNA 的克隆結果，分別以白菜09L597、甘藍09L598、甘藍型油菜5B的基因組總DNA為模板，采用上述全長cDNA的擴增引物組合和50 μ I標準Taq PCR擴增體系進行相同PCR，擴增ΒηΤΤ16、 BrTT16、BoTT16基因家族各成員的基因組DNA，再如前法所述進行電泳檢測(圖4)、膠回收、 PMD19-T載體克隆、轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和特異引物鑒定(用上述特異引物組合進行梯度PCR)，最后測序。表2檢測BrTT 16、BoTT 16、BnTT 16基因家族成員的特異引物
權利要求
1.甘藍TT16基因家族，其特征在于包括以下3個成員BoTT16-l基因、BOTT16-2基因和BoTT16-3基因；所述BoTT16-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示，BoTT16_2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BoTT16_3基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 12 所示。
2.根據(jù)權利要求I所述的甘藍TT16基因家族，其特征在于所述BoTT16-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示，BoTT16-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 9所示，BoTT16_3 基因的基因組序列如SEQ ID No. 11所不。
3.權利要求I或2所述的甘藍TT16基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應用，所述種子性狀為種子大小發(fā)育和種皮色素積累。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述蕓薹屬作物種子性狀的分子育種為甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘藍TT16基因家族，包括BoTT16-1基因(全長cDNA序列如SEQ IDNo.8所示)、BoTT16-2基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.10所示)和BoTT16-3基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.12所示)三個成員，該基因家族可應用于蕓薹屬作物種子大小發(fā)育和種皮色素積累等種子性狀的分子育種。
文檔編號C12N15/29GK102586274SQ20121001847
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權日2012年1月19日
發(fā)明者呂俊, 周清元, 李加納, 柴友榮, 諶利, 閆楠, 雷波, 馬麗娟, 馬赑 申請人:西南大學