專利名稱：利用油菜基因組間雜種優(yōu)勢的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于油菜雜種優(yōu)勢利用技術領域，具體涉及到一種利用油菜基因組雜種優(yōu)勢的方法。其國際專利分類號為A01H 1/02。
遺傳學研究已經證明，雙二倍體的甘藍型油菜(AACC)、芥菜型油菜(AABB)和埃塞俄比亞芥(BBCC)是由蕓苔屬的三個基本種，即白菜或白菜型油菜(AA)、黑芥(BB)和甘藍(CC)兩兩雜交后自然加倍產生的。這一歷程發(fā)生的年代久遠，長期的隔離、選擇和進化，使得相同的基因組在不同的種間產生了深刻的分化。如果將甘藍型油菜的染色體組認定為AACC，為了反映這種基因組分化，可將白菜型油菜的染色體組記為A’A’，埃塞俄比亞芥染色體組記為B’B’C’C’。
油菜種間雜種存在著極強的雜種優(yōu)勢。甘藍型油菜(AACC)與白菜型油菜(A’A’)的F1雜種(簡稱甘白雜種，A’AC)植株營養(yǎng)優(yōu)勢可超過高親值的152％(Qian等，10th International Workshop on Gene,Genome and Isoenzym,1999，北京)。甘藍型油菜與埃塞俄比亞芥(B’B’C’C’)、與芥菜型油菜(A’A’BB)的F1雜種也均表現(xiàn)出強大的雜種優(yōu)勢(劉后利，《油菜的遺傳與育種》，上?？萍汲霭嫔?，1985；Meng等，Euphytica,1998)。顯然，甘、白間的雜種優(yōu)勢來自于白菜型油菜A’基因組與甘藍型油菜中的A基因組或C基因組間的互作。而在甘埃雜交中，種間雜種優(yōu)勢源于甘藍型油菜的A、C基因組分別與埃芥的B’或C’基因組間的互作。由于油菜的這種種間雜種優(yōu)勢來源于整個基因組間的互作，稱之為基因組間雜種優(yōu)勢。
由于甘白雜種或甘埃雜種均為非整倍體，染色體配對不正常，雜種不育或育性極低，因此油菜的這種基因組間雜種優(yōu)勢只能表現(xiàn)在營養(yǎng)生長方面，但結實率極低，無法用于雜種種子生產。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術之不足，提供一種可以獲得結實率正常的油菜基因間雜種優(yōu)勢的方法，提高油菜雜種優(yōu)勢的強度。
本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)一種利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，該方法包括常規(guī)雜交育種方法和分子生物學育種方法，將傳統(tǒng)的育種方法革新為利用油菜基因組間雜種優(yōu)勢的方法，通過種間雜交和分子標記輔助選擇，將白菜型油菜的A’基因組與甘藍型油菜的C基因組，或白菜型油菜的A’基因組與埃塞俄比亞芥C’基因組結合在一起，培育出染色體組型為A’A’CC或A’A’C’C’的甘藍型油菜優(yōu)良品系，進而組配超強優(yōu)勢的甘藍型雜交組合。這些品系的價值并不在于其本身可能具有一定的雜種優(yōu)勢，而在于用它們與自然的甘藍型油菜配組，可產生染色體組型為A’ACC或A’AC’C的F1雜種。由于這些雜種中存在著A’/A、A’/C或C’/C間的基因組互作，將會產生超強的雜種優(yōu)勢。而在另一方面，這些雜種又是雙二倍體，育性正常，從而可以利用于油菜籽的生產。
本發(fā)明通過以下技術方案得到實現(xiàn)1．種間雜交甘白種間雜交以低芥酸、低硫苷(雙低)甘藍型油菜品種作母本，以白菜型油菜作父本，獲得染色體組型為AA’C的F1種間雜種種子。例如以甘藍型油菜品系7S159為母本，白菜型油菜品種浙江1號為父本，通過母本剝蕾去雄，有性雜交，獲得雜種一代。雜種一代表現(xiàn)為植株高大，生長勢強，盛花期干重超親優(yōu)勢達152.7％，中親優(yōu)勢達175％。
埃白種間雜交以埃塞俄比亞芥作母本，以白菜型油菜作父本，得到染色體組型為A’B’C’的F1種間雜種種子。但這一組合的雜交親和性低，結實率因組合不同而差異很大。對于結實率近于零的組合須采用胚挽救方法得到雜種苗。用0.1％秋水仙素處理埃塞俄比亞芥與白菜型油菜的F1雜種幼苗，獲得染色體組型為A’A’B’B’C’C’的異源六倍體。
2．對雜交后代的處理對甘白雜種后代的處理在甘白雜種(A’AC)減數分裂過程中，除產生大量非整倍配子外，也將產生整倍的A或A’配子，及整倍的AC或A’C配子，因此甘白雜種有一定的育性。將甘藍型油菜與白菜型油菜的雜種套袋并輔助授粉，生產自交種子，經種植產生F3代植株，淘汰生長畸形和育性不高的植株，獲得F2株系種子，對各F3株系的植株作農藝和品質性狀選擇后，再作染色體檢查，選出染色體數目為2n=38的優(yōu)良單株。
對埃白雜交后代的處理用雙低甘藍型油菜品種與埃塞俄比亞芥與白菜型油菜雜交的異源六倍體雜交，產生染色體組型為A’ABC’C的倍半五倍體。在減數分裂中，倍半五倍體中的B基因組因不能配對而將被消除，僅A’、A、C’、C基因組的染色體傳遞到F2代。種植F2代植株，檢查花粉母細胞減數分裂行為，選散粉正常，結實率高，農藝和品質性狀符合育種要求的染色體數為2n=38的單株。
3．對當選株系的基因組分析測試對處理雜交后代后所獲得的植株進行基因組指紋分析。所述的方法包括擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)，簡單序列重復(SSR)，限制片段長度多態(tài)性(RFLP)可靠性高等穩(wěn)定性好的DNA指紋分析方法。然后再根據當選植株的DNA指紋，結合其親本指紋在甘藍型油菜與白菜型油菜的雜交后代中選出染色體組型為A’A’CC的F4株系，在埃塞俄比亞芥與白菜型油菜雜交后代中選出染色體組型為A’A’C’C’的F3株系。
所述的DNA指紋分析方法具體步驟是AFLP的分析程序AFLP指紋分析主要采用Vos等(1995)的方法，并對其進行了以下修正(1)采用250ng基因組DNA,2.5U EcoRⅠ,2.5U MseⅠ,2.0μl雙酶切緩沖液Y+/TangoTM，加超純水到20μl 37℃酶切3小時；(2)酶切完成后，每個反應再加5μl連接混合液于37℃連接3小時，該混合液由以下成分構成EcoRⅠ接頭(5μM)0.5μl,MseⅠ接頭(50μM)0.5μl,T4 DNA連接酶0.5U,10x T4 DNA連接酶緩沖液0.5μl，用超純水把混合液體積調至5μl(3)預擴增采用以下體系進行，10×Taq DNA聚合酶緩沖液2.0μl,MgCl2(25mM)1.5μ1,dNTP(含dATP dTTP dCTPdGTP四種脫氧核苷酸各2.0mM)2μl，帶1-堿基3′-延伸末端的EcoRⅠ引物30ng,帶1-堿基3′延伸末端的MseⅠ引物30ng,Taq DNA聚合酶0.5U，稀釋了10倍的酶切/連接核苷酸產物1μl，加超純水至20μl。預擴增的PCR熱循環(huán)為①94℃ 2分鐘，②94℃ 30秒，③50℃ 30秒，④72℃ 1分鐘，⑤重復②到④步34次，⑥將PCR熱循環(huán)于4℃停止。(4)預擴增產物稀釋10倍后取1μl再進行選擇性擴增，并采用有3個堿基的3′-延伸末端的引物來控制擴增帶紋的密集程度。其PCR熱循環(huán)為①94℃ 2分鐘，②94℃ 30秒，③65℃ 30秒，④72℃ 1分鐘，⑤重復②到④步10次，并且使每個循環(huán)的復性溫度都在上個循環(huán)的基礎上降低一度，這樣使復性溫度一直降到56℃，然后保持56℃的復性溫度繼續(xù)進行25個循環(huán)。⑥最后將PCR熱循環(huán)于4℃停止。(6)按《分子克隆》(第二版)中的方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；(7)電泳結果采用試劑盒銀染顯示，方法見銀染試劑盒說明書。
SSR的分析程序SSRs(Simple Sequence Repeats簡單序列重復)是指根據真核生物基因組中具有豐富變異的簡單重復序列兩端的保守序列設計PCR引物擴增出來的多態(tài)性帶紋。我們所用的引物主要根據Szewc-McFadden等1996年的報道合成的。PCR混合液為DNA模板10ng，左右引物各15pmol,dATP dTTP dCTP dGTP四種脫氧核苷酸各3.75μmol,MgCl2(25mM)1.875μl,1.0U Taq酶，10×Taq DNA聚合酶緩沖液1.5μl,15μl反應體系。PCR熱循環(huán)采用以下體系進行94℃變性2分鐘，接著是20個循環(huán)的嚴緊性不斷降低的變溫PCR擴增94℃ 60秒變性，變溫30秒復性，72℃延伸45秒，復性溫度從68℃到58℃，每2個循環(huán)降低1℃，然后保持58℃的復性溫度再擴增25個循環(huán)，最后4℃儲藏。PCR擴增產物按《分子克隆》(第二版)中的方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和試劑盒銀染顯示多態(tài)性。
RFLP的分析程序RFLP指紋分析主要按《分子克隆》(第二版)的方法進行，并對其進行了少量修正(1)取15μg質量上好的基因組DNA進行酶切，0.4NNaOH轉膜；(2)1-4張10×20cm2膜取30ml預雜交液于65℃預雜交8-10小時；(30ml預雜交液包含硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)0.3g于17.7ml超純水65℃溶解，20×SETS6ml,50×Denharts 6ml,10％SDS 0.3ml，變性斷裂的鮭魚精DNA 3mg。)(3)5-10ml雜交液于65℃雜交12小時；(5ml雜交液包含硫酸葡聚糖0.5g于2.92ml超純水65℃溶解，20×SETS 1ml,50×Denharts 1ml,10％SDS 0.05ml，變性斷裂的鮭魚精DNA 0.1mg, [α-32P]dCTP標記的探針40μl；(4)探針標記采用以下體系常溫標記5小時探針DNA模板4μl(約400ng)，6堿基隨機引物3μl(150ng)，DNA分子量標記2μ1(20ng)，超純水19μl，以上混合均勻后沸水浴3分鐘，于冰水中冷卻后繼續(xù)加入二硫蘇糖醇(DTT)2ul(40mmol),dATP、dGTP和dTTP混合液2μl(各10mmol),10×Klenow聚合酶緩沖液4ul,DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow fragment)2ul，進口[α-32P]dCTP 2ul(20μCi)。(5)洗膜和壓片按《分子克隆》(第二版)中講述的方法進行。
采用以上各種分子標記，本發(fā)明在白菜型油菜或甘藍型油菜內部和它們之間都檢測到了豐富的多態(tài)性，其中更不乏白菜型油菜或甘藍型油菜所特有的標記，為輔助選擇提供了大量信息，現(xiàn)舉例說明。
白菜型油菜所特有的標記有PNl38H15、PN67H9、PA14H3.4、PN54B6.5……甘藍型油菜所特有的標記有PN25H2.2、PN25H3.3、PN31H3.3、PN159H10……4．配合力測驗以A’A’CC或A’A’C’C’與甘藍型油菜不育系測交，根據F1的表現(xiàn)選出超強優(yōu)勢的雜交組合。當所選株系中不含恢復基因時，采用轉基因方法導入TA29或其它雄性不育基因。
本發(fā)明的優(yōu)點是1．解決了油菜基因組間雜種不育的問題，使其雜種能用于油菜F1種子的生產。
2．獲得超強優(yōu)勢的油菜組合。
權利要求
1．一種利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，包括常規(guī)雜交育種和分子生物學育種方法，其特征在于將傳統(tǒng)的利用油菜是種間雜種優(yōu)勢利用方法革新為利用油菜基因組雜種優(yōu)勢的方法，通過種間雜交和分子標記輔助選擇，將白菜型油菜的A’基因組與甘藍型油菜的C基因組，或白菜型油菜A’基因組與埃塞俄比亞芥C’基因組結合在一起，培育出染色體組型為A’A’CC或A’A’C’C’的甘藍型油菜優(yōu)良品系，進而組配超強優(yōu)勢的甘藍型油菜雜交組合。
2．根據權利要求1所述的利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，其特征在于，以低芥酸、低硫苷(雙低)甘藍型油菜品種作母本，以白菜型油菜作父本，獲得染色體組型為AA’C的F1種間雜種種子。
3．根據權利要求1所述的利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，其特征在于，以埃塞俄比亞芥作母本，以白菜型油菜作父本，得到染色體組型為A’B’C’的F1種間雜種種子。
4．根據權利要求3所述的利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，其特征在于，用0.1％濃度的秋水仙素處理埃塞俄比亞芥與白菜型油菜的F1雜種的幼苗，獲得染色體組型為A’A’B’B’C’C’的異源六倍體。
5．根據權利要求1或2所述的利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，其特征在于，將甘藍型油菜與白菜型油菜的雜種套袋并輔助授粉，生產自交種子，經種植生產F2代植株，淘汰生長畸型和育性不高的植株，獲得F3株系植株作農藝和品質選擇后，再作染色體檢查，選出染色體數目為2n=38的優(yōu)良單株。
6．根據權利要求1或3所述的利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，其特征在于，用雙低甘藍型油菜品種與埃塞俄比亞芥與白菜型油菜雜交的異源六倍體雜交，生產染色體組型為A’ABC’C的倍半五倍體，種植F2代植株，檢查花粉母細胞減數分裂行為，選散粉正常，結實率高，農藝和品質符合育種要求的染色體數2n=38的單株。
7．根據權利要求1所述的利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，其特征在于對當選雜交后代處理后所獲得的植株進行DNA指紋分析，所述的方法包括運用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)，簡單系列重復(SSR)，限制片段長度多態(tài)性(RELP)方法，根據當選植株的DNA指紋，結合其親本指紋在甘藍型油菜與白菜型油菜的雜交后代中選出染色體組型為A’A’CC的F4株系，在埃塞俄比亞芥與白菜型油菜的雜交后代中選出染色體組型為A’A’C’C’的F3株系。
8．根據權利要求1或權利要求7所述的利用油菜雜種優(yōu)勢的方法，其特征在于，以A’A’CC或A’A’C’C’與甘藍型油菜不育系測交，根據F1的表現(xiàn)選出超強優(yōu)勢的雜交組合，當所選的株系中不含恢復基因時，采用轉基因方法導入TA29或其它雄性不育基因。
全文摘要
一種利用油菜基因組間雜種優(yōu)勢的方法,屬于油菜新品系選育技術領域。其特征是通過種間雜交和分子標記輔助選擇,將白菜型油菜的A’基因組與甘藍型油菜的C基因組,或白菜型油菜的A’基因組與埃塞俄比亞芥的C’基因組結合在一起,培育出染色體組型為A’A’CC或A’A’C’C’的新型甘藍型油菜優(yōu)良品系,并進而組配超強優(yōu)勢的甘藍型油菜雜交組合。
文檔編號A01H1/02GK1303588SQ9912012
公開日2001年7月18日 申請日期1999年12月15日 優(yōu)先權日1999年12月15日
發(fā)明者孟金陵, 錢偉, 劉仁虎, 趙建偉 申請人:華中農業(yè)大學