一種甘藍(lán)型油菜抗根腫病基因的分子標(biāo)記及其在抗根腫病育種中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及與甘藍(lán)型油菜抗根腫病基因PbBa8. 1位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記 A08-300的側(cè)翼基因組序列、根據(jù)該側(cè)翼序列設(shè)計(jì)的引物以該引物在篩選油菜抗根腫病植 株中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根腫?。–lubrootdisease)是由鞭毛菌亞門根腫菌屬蕓苔根腫菌 (Plasmodiophorabrassicae)侵染引起的一種傳染性非常強(qiáng)的土壤病害。根腫病菌專 性寄生于蕓薹屬、蘿卜屬以及擬南芥等十字花科植物的根部。當(dāng)根系受到病菌刺激，其薄 壁細(xì)胞大量分裂和增大而形成腫瘤。由于根的生理機(jī)能受阻抑，病株地上部則表現(xiàn)出葉 片失綠、無光澤、葉邊變黃、生長緩慢、植株矮小以及萎蔫等癥狀。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致作物 絕收。目前根腫病對全世界油菜產(chǎn)量造成10-15%的損失，通過遺傳轉(zhuǎn)育的方式提高油菜 抗病性是被認(rèn)為最有效的防治根腫病的措施（DixonG2009JofPlantGrowthRegul 28:194 - 202)。其中蕪菁（AA，2n= 20)中含有的抗病位點(diǎn)最多，在抗病育種中應(yīng)用也最 為廣泛（DiederichsenE2009JournalofPlantGrowthRegulation, 28)。日韓等國以 蕪菁為抗源培育出了多個(gè)抗根腫病的大白菜品種，而在歐洲也利用蕪菁（ECD04)與抗病性 甘藍(lán)（CC，2n= 18)雜交人工合成了甘藍(lán)型油菜，進(jìn)而培育出了抗病品種Mendel(RahmanH 2014CanadianJournalofPlantPathology, 36(suppl.1):122-134)〇
[0003] 2011年，我們獲得了 1份抗根腫病的純系蕪菁材料E⑶04,蕪菁E⑶04(AA)含有 多個(gè)抗病位點(diǎn)。樸鐘云課題組利用ECD04和白菜構(gòu)建的BC1F2群體定位到了 5個(gè)抗病位 點(diǎn)分別對2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)和10號(hào)生理小種具有一定抗性。其中PbBa8. 1是唯一對4號(hào)生 理小種具有抗性的位點(diǎn)（JingJ，2013Plos0ne，8(12):e85307-e85307)。經(jīng)過我們的研究 證明該位點(diǎn)同時(shí)對安徽黃山、湖北巴東地區(qū)的生理小種具有良好的抗性，其中與PbBa8. 1 位點(diǎn)遺傳距離最近的2個(gè)側(cè)翼標(biāo)記為cnu_m090a、sau_um353a見（JingJ, 2013Plos One, 8(12) :e85307-e85307)。但這兩個(gè)標(biāo)記與大白菜抗根腫病基因PbBa8. 1的遺傳距離較 遠(yuǎn)。本發(fā)明以ECD04抗源材料為供體，結(jié)合回交育種及分子標(biāo)記輔助選擇，將ECD04中抗4 號(hào)生理小種的抗病位點(diǎn)PbBa8. 1定向地向優(yōu)良甘藍(lán)型油菜常規(guī)品種華雙5號(hào)轉(zhuǎn)移。在此基 礎(chǔ)上，通過對兩親本進(jìn)行全基因組重測序，對cun_m090a和sau_um353a兩對標(biāo)記之間的序 列進(jìn)行比較分析后，開發(fā)了與甘藍(lán)型油菜抗根腫病基因PbBa8. 1緊密連鎖的標(biāo)記A08-300， 并精細(xì)定位該基因，從而簡化甘藍(lán)型油菜抗根腫病品種的轉(zhuǎn)育過程。
[0004] 在常規(guī)油菜抗根腫病品種轉(zhuǎn)育過程中，每代都需要采用田間接種根腫病菌的方法 來鑒定中間材料的基因型，并且溫度、濕度以及病原菌的田間分布等因素會(huì)影響到接種發(fā) 病率，進(jìn)而影響抗病材料的正確選擇及轉(zhuǎn)育進(jìn)程。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及其選育方法可 以在育種過程中的任何時(shí)期根據(jù)基因型對單株進(jìn)行有效選擇，提高了選擇效率、縮短育種 年限。本發(fā)明將為甘藍(lán)型油菜抗根腫病育種提供重要支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了與蕪菁E⑶04抗根腫病基因位點(diǎn)PbBa8. 1緊密連鎖的分 子標(biāo)記A08-300的側(cè)翼序列，其序列為SEQIDNO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了根據(jù)蕪菁E⑶04分子標(biāo)記A08-300的側(cè)翼序列設(shè) 計(jì)的特異性引物，該引物可特異鑒別SEQIDNO. 1所示序列。
[0007] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于A08-300分子標(biāo)記的側(cè)翼序列及其引物在油菜抗根 腫病育種中的應(yīng)用。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0009] 申請人通過以憲菁ECD04(JingjingChen等IdentificationofnovelQTLsfor isolate-specificpartialresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinBrassica rapa. [J] ?PlosOne, 2013, 8 (12) :e85307-e85307)為父本，易感常規(guī)甘藍(lán)型油菜華雙5號(hào) 為母本雜交，構(gòu)建分離群體，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與蕪菁抗根腫病PbBa8. 1基因位點(diǎn)緊密連鎖的分 子標(biāo)記A08-300 :
[0010] (1)ECD04中A08-300的側(cè)翼序列如下：
[0011] 5?-AATTTTGATATTTTAAAAACAAATTTTATTAATATAATAAATATGCTTGAATAATTGAGTGAGGAT AAATATCAAGTGAAATTTGCCGAACCATGAAAGTAAAGCATTTAAATCTTATCCAGATTAAAAAAAAATCAAGTAAA TGTTTTTGGCCAACCACCGAGCGACACGTGGTAGTGCGGGCCACAAAATTTTTTTTCAGGTGTTGAAATTTTCCAAC GATGCCATGTAGACAAACACATTTTTACAACATCCTCACTGCAAAGATTTAAACTGTTGAAAGTGAATTTCAACACT CCATTGTGAGTGGTCTAACAGAATAAATGTCTTGTGCCAATCCAAGTTTGTTCTATGCAGTTCTCAAAATACATATA TGTGTATGTATATATTAAGATTAGTATTTGATTGTAAATATCTCAAAATTACGAAAACTTTAACCCAACATATCTTA AATAAGGATATTTTGGACTGAATTTCA-3 '
[0012] (2)華雙5號(hào)中A08-300的側(cè)翼序列序列如下：
[0013] 5?-AATTTTGATATTTTAAAAACAAATTTTATTAATATAATAAATGTGTTTGAATAATTGAGTGAGGAT AAATATCAAGTGAAATCTGCCGAACCAATGAAAATAAAGCATTTAAGTCTTATCCAGATTTAAAAAAAATCAAGTAA ATGTTTTTGGCCAACCACAGAGCGACACGTGGTAGTGCGGGCCACAAAATTTTTTTTCAGCTGTTGAAATTTTTCAA CGCCTGTTGCTACCATGTAGACAAACATATTTTTACAACATCCTCACTACAAAGATTTAAACTGTTGAAAGTGAATT TCAACACTCCATTGTGAGTGGTCTAACAGAATAAATGTCTTGTGCCAATCCAGGTTTGTTCTATGCAGTTCTCAAAA TACATATATGTGTATGTATATATTAAGATTAGTATTTGATTGTAAATATCTTGAAATTACGAAAAATTTAACCCAAC ATACCCTAAATAAGGATATTTTGGACTGAATTTCA-3'
[0014] 根據(jù)蕪菁ECD04分子標(biāo)記A08-300的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)的特異性引物，所述的引物優(yōu) 選：FA08-300:5'-GTAGTGCGGGCCACAAAAT-3'；RA08-300:5'-CACAATGGAGTGTTGAAATTCA CT-3,
[0015] A08-300分子標(biāo)記引物在油菜抗根腫病育種中的應(yīng)用，包括利用上述引物對待測 植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能特異性的擴(kuò)增出ECD04中，優(yōu)選的，利用引物FA08-300:5 '-GTA GTGCGGGCCACAAAAT-3'；RA08-300:5' -CACAATGGAGTGITGAAAITCACT-3' 對待測植株DNA進(jìn) 行PCR〇
[0016] 擴(kuò)增結(jié)果中帶有132bp條帶的單株是含有抗根腫病位點(diǎn)PbBa8. 1的材料。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 本發(fā)明公開的分子標(biāo)記A08-300與蕓薹屬抗根腫病位點(diǎn)PbBa8. 1緊密連鎖，可廣 泛應(yīng)用于蕓薹屬抗根腫病位點(diǎn)PbBa8. 1的分子標(biāo)記輔助選擇育種。本發(fā)明通過引物PCR擴(kuò) 增可對待測植株進(jìn)行苗期鑒定，大大提高育種效率，縮短育種進(jìn)程。
【附圖說明】
[0019] 圖1為E⑶04相對華雙5號(hào)不同的堿基數(shù)差異所對應(yīng)的Indel位點(diǎn)數(shù)量。
[0020] 圖2為A08-300引物在親本及BC3F2部分抗病、感病個(gè)體上的擴(kuò)增結(jié)果示意圖。
[0021] 其中▼為華5號(hào)、▲為E⑶04,圖2中A是BC3F2部分抗病個(gè)體擴(kuò)增結(jié)果示意圖；圖 2中B是BC3F2部分感病個(gè)體擴(kuò)增結(jié)果示意圖。
[0022] 圖3為ZHE-226自交后代在湖北恩施巴東田間病圃的抗病性表現(xiàn)。
[0023] 箭頭標(biāo)識(shí)的是對照組，未標(biāo)識(shí)的是抗病新株系。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 與甘藍(lán)型油菜抗根腫病基因PbBa8. 1緊密連鎖標(biāo)記的獲得與鑒定
[0026] 1、分離群體的構(gòu)建
[0027] 以含有抗4號(hào)生理小種PbBa8. 1位點(diǎn)的蕪菁ECD04(JingjingChen 等IdentificationofnovelQTLsforiso1ate-specificpartial resistancetoPlasmodiophorabrassicaeinBrassicarapa. [J].Plos One, 2013, 8 (12) :e85307-e85307)為父本，易感常規(guī)甘藍(lán)型油菜華雙5號(hào)為母本雜交獲得 F1。以安徽黃山生理小種對F1進(jìn)行抗病性鑒定，F(xiàn)1全部表現(xiàn)為抗病。接下來，我們將F1繼 續(xù)和華雙5號(hào)回交3代，分別獲得BC1、BC2、BC3代回交群體，同時(shí)利用與PbBa8. 1位點(diǎn)兩側(cè) 與之連鎖的SSR標(biāo)記cum_m090a和sau_um353a開始對BC1群體進(jìn)行基因型分析，從中篩選 出可能含有PbBa8. 1位點(diǎn)的單株用于后續(xù)的回交工作，直至獲得BC2、BC3以及BC3F2群體。
[0028] 2014年秋天，我們將2個(gè)BC3F2群體在安徽黃山田間病圃進(jìn)行了抗病性鑒定，結(jié)果 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對照組華雙5號(hào)100%發(fā)病，其中一個(gè)包含117個(gè)單株編號(hào)為ZHE-226BC3F2測 試群體中發(fā)現(xiàn)抗病株系91株、感病株系27株，卡方測驗(yàn)結(jié)果表明該群體的抗感分離比符合 3:
[0029] 1分離（x2=〇.34〈x 2〇.〇5(1) =3.84)(圖2)，以上結(jié)果說明該抗性由顯性單基 因控制。
[0030] 2、與PbBaS. 1緊密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)
[0031] 為了快速開發(fā)出與抗病位點(diǎn)PbBaS. 1更加緊密連鎖的分子標(biāo)記，我們通過對兩親 本進(jìn)行全基因組重測序。對E⑶04和華雙5號(hào)分別進(jìn)行40X、30X