肝內(nèi)膽管細胞癌相關(guān)的基因突變靶點及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及肝內(nèi)膽管細胞癌相關(guān)的基因突變 靶點，及其這些基因突變靶點在診斷或治療肝內(nèi)膽管細胞癌、評估肝內(nèi)膽管細胞癌預(yù)后的 試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝癌（肝癌）是危害人類健康的主要疾病之一，目前全世界每10萬人的發(fā) 病率約為0.85,且在過去30年內(nèi)的增長率為165%。包括中國在內(nèi)的亞洲人的肝癌發(fā)病率 是全世界最高的，約56%肝癌發(fā)生在中國，其10萬人的發(fā)病率和增長率都遠高于世界平均 水平。
[0003] 原發(fā)性肝癌主要包括肝細胞癌與肝內(nèi)膽管細胞癌，肝內(nèi)膽管細胞癌是原發(fā)性肝癌 的一種，其發(fā)病率占原發(fā)性肝癌的5~10%，盡管發(fā)病率低，但其發(fā)病率仍在不斷增加。與 肝細胞癌相比，肝內(nèi)膽管細胞癌發(fā)生的背景不同，惡性程度更高，早期診斷非常困難，發(fā)展 快，治療效果差，預(yù)后差，特別是沒有有效的藥物治療，5年生存率極低。
[0004] 有關(guān)肝癌的預(yù)防、診斷和治療一直是醫(yī)療科學(xué)和技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)大家普遍關(guān)注的問題 和研究目標(biāo)。目前肝癌治療方法主要有外科關(guān)聯(lián)的治療有手術(shù)切除、肝臟移植，非外科治療 方法有放射介入，超聲介入、放療以及藥物治療等。對肝癌病人的治療方法主要根據(jù)每個病 人的具體情況，選擇手術(shù)或非手術(shù)治療，或多種方法聯(lián)合治療，如有的采用外科手術(shù)切除腫 瘤組織的方法加抗癌藥物治療，有的采用抗癌藥物治療的方法。
[0005] 然而，對于肝內(nèi)膽管細胞癌，其治療方法雖然基本上類似于肝細胞癌，但由于肝內(nèi) 膽管細胞癌本身生物學(xué)行為，其治療方法的選擇與治療效果與肝細胞癌有著很大的不同， 其治療效果差，死亡率高，生存時間短。到目前為止，沒有任何一個藥物被批準(zhǔn)用于肝內(nèi)膽 管細胞癌的治療。
[0006] 這是目前存在的主要問題，為什么存在這樣的問題，重要原因之一就是對肝內(nèi)膽 管細胞癌的生物學(xué)行為，特別是基因突變的特征沒有搞清楚?？梢灶A(yù)料，如果對于所有肝內(nèi) 膽管細胞癌的病人都使用完全相同的治療方案，如相同的藥物，相同的劑量，以及完全相同 的治療時間，其結(jié)果一定不完全相同。因此，最有效的方法是，首先搞清楚每一個肝內(nèi)膽管 癌病人的基因突變情況，完全了解其個體化差異，然后根據(jù)這些具體基因突變，制定個性化 的治療方案，選擇針對每一個病人，某個突變基因靶點的合適藥物的種類，劑量，時間等，只 有這樣，才能獲得最佳的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于尋找到肝內(nèi)膽管細胞癌相關(guān)的基因突變靶點。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供這些基因突變靶點在診斷和/或治療肝內(nèi)膽管細胞 癌、評估肝內(nèi)膽管細胞癌預(yù)后的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明對102例肝內(nèi)膽管細胞癌患者癌組織及其對照組織的全基因組外顯子進 行測序，這是目前國內(nèi)外對肝內(nèi)膽管細胞癌最大樣本的測序研究，測序數(shù)據(jù)高達200G，可見 根據(jù)本研究中發(fā)現(xiàn)的突變基因靶點制定肝內(nèi)膽管細胞癌治療方案，必將更加有針對性，更 加合理，可以獲得有效的治療效果。
[0010] 本發(fā)明擬提供一種完全根據(jù)肝內(nèi)膽管細胞癌病人的基因測序結(jié)果而進行臨床治 療的方案和方法，即所謂的個性化治療方案。
[0011] 本發(fā)明提供的個性化治療方案，主要是根據(jù)兩個方面的因素，一是每個病人的肝 內(nèi)膽管細胞癌組織的全基因組外顯子測序結(jié)果，二是每個病人的身體狀況等，根據(jù)我們的 研究成果，對于每一個肝內(nèi)膽管細胞癌的病人來說，其基因都存在變異。在所研究的102 例肝內(nèi)膽管細胞癌患者中，發(fā)現(xiàn)有25個基因存在顯著突變，其中8個基因，即TP53(p= 0? 0001)，KRAS(p= 0? 004)，IDH1(p= 0? 00019)，PTEN(p= 0? 0078)，ARIDlA(p= 0? 00449)， EPPKl(p= 0.00486)，ECE2(p= 0.0357)和FYN(p= 0.00258)可能為驅(qū)動基因；發(fā)現(xiàn)的 CTG>CAG和CAG>CTG突變目前僅見于肝內(nèi)膽管細胞癌，且與肝內(nèi)肝臟炎癥、肝纖維化或肝 硬化具有很強的關(guān)聯(lián)性；同時還發(fā)現(xiàn)P53基因突變主要發(fā)生于血清HBsAg陽性的肝內(nèi)膽 管細胞癌（61. 54% )，KRAS基因突變基本唯一發(fā)生在血清HBsAg陰性的肝內(nèi)膽管細胞癌 (29. 6 % )，此外，有三條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Ras/phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinasesignalling,p53/cellcyclesignalling和transforminggrowthfactor-b/Smadsignaling)極有可能與肝內(nèi)膽管細胞癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，約75%的病人存在p53/cell cyclesignaling和Ras/PI3Ksignaling信號通路上的變異。這些突變基因極有可能成為 未來肝內(nèi)膽管細胞癌藥物治療的靶點。
[0012] 本發(fā)明的第一方面，提供了肝內(nèi)膽管細胞癌相關(guān)的基因突變靶點，所述的基因突 變靶點是TP53(ID7157)、KRAS(ID3845)、IDH1(ID3417)、PTEN(ID5728)、ARID1A(ID 8289)、EPPK1(ID83481)、ECE2(ID9718)，或FYN(ID2534)。
[0013] 進一步地，本發(fā)明還提供了CTG>CAG和CAG>CTG突變目前僅見于肝內(nèi)膽管細胞癌， 且與肝內(nèi)肝臟炎癥、肝纖維化或肝硬化具有很強的關(guān)聯(lián)性；
[0014] 進一步地，本發(fā)明還提供了血清HBsAg陽性的肝內(nèi)膽管細胞癌相關(guān)的基因突變靶 點是P53 ;血清HBsAg陰性的肝內(nèi)膽管細胞癌相關(guān)的基因突變靶點是KRAS。
[0015] 本發(fā)明的第二方面，提供了上述的基因突變靶點TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN在制備診斷和/或治療肝內(nèi)膽管細胞癌的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0016] 進一步地，P53在制備診斷和/或治療血清HBsAg陽性的肝內(nèi)膽管細胞癌的試劑 或試劑盒中的應(yīng)用；KRAS在制備診斷和/或治療血清HBsAg陰性的肝內(nèi)膽管細胞癌的試劑 或試劑盒中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的第三方面，提供了上述的基因突變靶點TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN在制備肝內(nèi)膽管細胞癌預(yù)后評估的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0018] 進一步地，P53在制備血清HBsAg陽性的肝內(nèi)膽管細胞癌預(yù)后評估的試劑或試劑 盒中的應(yīng)用；KRAS在制備HBsAg陰性的肝內(nèi)膽管細胞癌預(yù)后評估的試劑或試劑盒中的應(yīng) 用。
[0019] 本發(fā)明的第四方面，還提供了一種檢測試劑盒，其包含：（i)檢測有效量的檢測 TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子突變率的一種或多種試劑；（ii) 選自下組的一種或多種物質(zhì)：容器、使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、助劑或 溶劑，例如用于混懸或固定細胞的溶液，可檢測的標(biāo)簽或標(biāo)記，使核酸易于雜交的溶液，用 于裂解細胞的溶液，或用于核酸純化的溶液。
[0020] 本發(fā)明的檢測試劑盒中還可附有試劑盒的使用說明書，其中記載了如何采用試劑 盒進行檢測，和如何利用檢測結(jié)果對肝內(nèi)膽管細胞癌發(fā)展進行判斷、對治療方案進行選擇 和/或?qū)︻A(yù)后進行評估。
[0021] 采用本發(fā)明的試劑盒，可通過選自下組的各種方法（包括但不限于）檢測TP53、 KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子：實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR、生物芯片檢測 法、DNA印跡法、或RNA印跡法或原位雜交法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)實際條件和需要 對檢測方式進行調(diào)整和改變。
[0022] 生物芯片檢測法、DNA印跡法、RNA印跡法和原位雜交法可參考《分子印跡技術(shù)》劉 朝奇等主編，化學(xué)工業(yè)出版社出版。
[0023] 當(dāng)然，所述試劑盒還包含臨床上用于對象中腫瘤發(fā)展的判斷、治療方案的選擇和 /或預(yù)后評估的其它試劑，以輔助或驗證通過檢測TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、 ECE2，或FYN分子所得到的結(jié)果。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)具體需要進行常規(guī)選擇。
[0024] 通常，可利用本發(fā)明的檢測試劑盒，采用如下方法進行腫瘤發(fā)展判斷、抗腫瘤藥物 制備和/或預(yù)后評估：(a)從對象獲得待測樣品；(b)使待測樣品與本發(fā)明檢測試劑盒中的 檢測試劑接觸；（c)檢測該待測樣品中TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2，SFYN 分子的水平，并將該水平與對照水平相比較；（d)根據(jù)檢測結(jié)果進行腫瘤發(fā)展判斷、抗腫瘤 藥物制備和/或預(yù)后評估：如檢測結(jié)果顯示對象組織中的TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN分子的水平低于對照水平，則提示所述對象已患有腫瘤適于采用提高 TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2，或FYN分子的量的治療方法來治療腫瘤、或腫 瘤預(yù)后不良。
[0025] 如本文所用，術(shù)語"對照水平"是指用作參照的TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN分子的水平，其包括但不限于：由同一對象的非腫瘤正常生物樣品 (例如獲自該對象非腫瘤癌旁組織或正常組織的樣品）中測得的TP53、KRAS、IDH1、PTEN、 ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子水平、通過統(tǒng)計學(xué)確定的群體標(biāo)準(zhǔn)水平、或經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的水 平。
[0026] 可用于提示所述對象已患有腫瘤適于采用提高TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、 EPPK1、ECE2,或FYN分子的治療方法來治療腫瘤、或腫瘤預(yù)后不良的水平差異可為：待測 樣品中的TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子水平比對照水平低 10-50 %，優(yōu)選 20-40 %，更優(yōu)選 30-35 %。
[0027] 如本文所用，術(shù)語"預(yù)后"是指預(yù)測疾病的可能病程和結(jié)局，其包括判斷疾病的特 定后果（如康復(fù)，某種癥狀、體征和并發(fā)癥等其它異常的出現(xiàn)或消失及死亡）。本發(fā)明中 所述的預(yù)后不良包括但不限于：生存期縮短、易發(fā)肝硬化、腫瘤數(shù)量增加快、腫瘤變大加快、 門靜脈癌栓出現(xiàn)比例增加、?M分級上升等。在預(yù)測了患者預(yù)后情況后，可結(jié)合提高TP53、 KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2,或FYN分子的量的治療方法改善患者的預(yù)后。
[0028] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0029] 本發(fā)明基于肝內(nèi)膽管細胞癌病人的全基因組外顯子測序結(jié)果，即根據(jù)此類病人的 外顯子突變情況所采取的對應(yīng)臨床治療方案，有助于評估病情，更有助于治療方法的選擇 與評估。正是由于本發(fā)明給出的臨床醫(yī)療方案和方法是基于病人的全基因組外顯子檢測大 數(shù)據(jù)分析結(jié)果所制定的，其所采用的臨床治療方案更加個體化，它比其它方法更加具有針 對性與靶向性，也將會有更好的治療效果。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了與肝內(nèi)膽管細胞癌相關(guān)的基因突 變靶點TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARID1A、EPPK1、ECE2，或FYN，這些基因突變靶點可有效用于 肝內(nèi)膽管細胞癌發(fā)展判斷、治療方案選擇和/或預(yù)后評估，從而為本領(lǐng)域提供了一種新穎 的肝內(nèi)膽管細胞癌診斷劑和/或治療劑，具有一定的臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030] 圖1中A:P53突變氨基酸位點改變；B:肝內(nèi)膽管細胞癌P53突變及其與患者生存 關(guān)系：有P53基因突變肝內(nèi)膽管細胞癌患者預(yù)后明顯低于沒有P53基因突變患者；圖中英 文注釋相對應(yīng)的中文譯文：P53轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（p53_TAD) ;P53DNA結(jié)合區(qū)（p53DNA-binding domain) ;P53四聚體（p53_tetramer);框架插入與缺失（InframeInDel);移碼插入與缺失 (FrameshiftInDel);錯義突變（Missense);無義突變（Nonsense);剪接位點（Splicing sites);生存率（Percentsurvival);生存時間（月）（surviv