專利名稱：油菜多目標(biāo)性狀重組的設(shè)計(jì)及重組產(chǎn)物的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種方法領(lǐng)域，具體涉及植物多特異性狀的重組設(shè)計(jì)及重組產(chǎn)物的鑒定方法，以及該鑒定方法在鑒別正品油菜多性狀重組體中雙9號(hào)及其衍生品種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物生產(chǎn)的增產(chǎn)、增收有賴于優(yōu)良品種的選育與推廣應(yīng)用，而新品種的選育與適當(dāng)?shù)倪x育方法及攜帶有優(yōu)良性狀基因的特異資源的發(fā)掘、利用等密切相關(guān)。傳統(tǒng)的育種技術(shù)依賴于雜交后代的自交重組，這需要有很大的分離群體、可靠的環(huán)境條件、準(zhǔn)確的篩選技術(shù)及較長的試驗(yàn)周期?，F(xiàn)代轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以對(duì)特定的植物群體進(jìn)行改良，但改良的目標(biāo)性狀數(shù)量有限。
長期以來，物種的進(jìn)化及人為操縱等使得植物形成了各自特定基因群結(jié)構(gòu)。利用多個(gè)植物材料進(jìn)行多目標(biāo)性狀重組可以滿足人類生產(chǎn)及特定時(shí)期生活需求。當(dāng)前，國內(nèi)外油菜育種一直依賴來源于歐洲的雙低資源。這種單一資源的利用方式使得育成品種的遺傳基礎(chǔ)變窄，從而限制了新品種(包括雜交組合)增產(chǎn)、增收潛力。此外，國內(nèi)外油菜資源(包括育成品種)中抗(耐)倒伏及菌核病、病毒病等能力十分有限，而菌核病、倒伏等是影響油菜高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要不利因素。具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗病性、廣適應(yīng)性油菜品種一直為農(nóng)民看好。
知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)及農(nóng)作物種苗市場(chǎng)等常常需要進(jìn)行品種的鑒別。通?？捎糜谧魑锲贩N的鑒定方法主要有利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記法、生化標(biāo)記法和分子標(biāo)記鑒定法等。形態(tài)學(xué)標(biāo)記數(shù)量很少，易受環(huán)境影響，生化標(biāo)記數(shù)量亦十分有限，且具有組織特異性，在品種數(shù)量日益增多及人們對(duì)作物產(chǎn)品品質(zhì)要求日益嚴(yán)格的情況下，這兩種標(biāo)記的應(yīng)用范圍及能力日顯不足。分子標(biāo)記是基于物種DNA指紋特征的標(biāo)記技術(shù)，它不易受環(huán)境影響，理論上數(shù)量可以是無限的。由于不同品種材料具有不同特征的指紋，因此它不僅可以用于品種的鑒別，而且可以用于品種(組合)的純度鑒定。目前，RFLP、AFLP、SSR、RAPD、SCAR等標(biāo)記技術(shù)已用于水稻、玉米、大豆等作物DNA指紋分析及品種(雜種)鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種超高產(chǎn)、高抗病、高抗倒伏、高含油量、高蛋白質(zhì)含量、低芥酸、低硫甙含量等多項(xiàng)性狀優(yōu)異的油菜新品種的重組方法及重組產(chǎn)物的鑒定方法。
本發(fā)明提供了一種油菜的重組設(shè)計(jì)(育種)方法，包括步驟(1)以中油821作母本，中間材料84004作父本雜交，得到雜種F1；(2)以雜種F1作母本，常規(guī)品種中雙4號(hào)的變異株系作父本進(jìn)行復(fù)合雜交，獲得綜合目標(biāo)性狀的基因群；(3)對(duì)綜合目標(biāo)性狀基因群的分離世代進(jìn)行品質(zhì)、抗性和農(nóng)藝性狀的綜合鑒定和篩選，獲得目標(biāo)性狀優(yōu)異的材料；(4)對(duì)早期世代表現(xiàn)優(yōu)異的初選材料進(jìn)行小孢子培養(yǎng)、染色體加倍和夏繁加代，使優(yōu)良基因型純合、穩(wěn)定，獲得油菜新品種。
本發(fā)明所述方法育成油菜品種中雙9號(hào)。
本發(fā)明還提供了中雙9號(hào)的鑒定方法，包括步驟(1)選取待測(cè)品種植物幼嫩組織，-70℃保存；總DNA的提取采用SDS法進(jìn)行；DNA純化采用苯酚-氯仿-異戊醇法；純化后的DNA-20℃保存以用于分子鑒定。
(2)以待測(cè)品種DNA為模版，進(jìn)行SSR鑒定，其中10對(duì)SSR引物如下上游引物5’TGG GAC GTA GTC AGT CAA CAA 3’
下游引物5’CCA AGT GCG AGA AGA GGA AG 3’；上游引物5’ACC GTT GAG ATC AAT CCC TAT 3’下游引物5’CAT CTT CCT TAA TCG AAA CCC 3’；上游引物5’TCC ATT AGC TCT CGT CCT C 3’下游引物5’TTT TTA GAA CAG TGC CTT GAC 3’；上游引物5’ATC TCA GGC TGG CGA ATA CA 3’下游引物5’CGA CAA GTC AAT CCG AAT CAA 3’；上游引物5’AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3’下游引物5’ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3’；上游引物5’CAC CGT CGG AGT CTG AAT 3’下游引物5’GAG CCG TTAAAC C(AGCT)T AGT GTG 3’；上游引物5’ATT GGG TTC TGA CCT TTT CTC 3’下游引物5’TTT TCC TTC ATC GCT ACC AC 3’；上游引物5’TCG GGG TTT GTT GTG AGG 3’下游引物5’GAG GAG GAT GCT AAG AGT GAG C 3’；上游引物5’ACC AAA ATG TGT GAA GCC AC 3’下游引物5’CTT GTG GCC AGA TTC ATC AC 3’；上游引物5’ATT CAA ATC AAG GGT CTG GTC 3’下游引物5’GCT GCG TGC CAT CTT C3’。
PCR反應(yīng)體系如下1×擴(kuò)增緩沖液，2mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5U Taq酶，上下游引物各2.5mmol/L，50ng模板DNA，加入ddH2O(雙蒸水)至終體積10μL；PCR熱循環(huán)程序?yàn)?5℃ 2min；1個(gè)循環(huán)；
94℃ 1min；60℃ 30s，每循環(huán)降0.5℃；72℃ 45s；10個(gè)循環(huán)；94℃ 1min；55℃ 30s；72℃ 45s；30個(gè)循環(huán)；所得擴(kuò)增產(chǎn)物冷藏保存?zhèn)溆谩?br> (3)擴(kuò)增產(chǎn)物加等體積的變性上樣緩沖液，95℃變性3min后冷卻，進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；優(yōu)選地，擴(kuò)增產(chǎn)物加等體積的變性上樣緩沖液，95℃變性3min后立即冷卻，然后在6％的變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，38×32.5cm)上電泳45～60min，電壓1800V。
(4)電泳后的凝膠用冰醋酸溶液固定，ddH2O漂洗，再用硝酸銀溶液染色，ddH2O漂洗，用無水碳酸鈉溶液顯色，用冰醋酸溶液終止顯影，顯影后的凝膠漂洗、風(fēng)干備用；優(yōu)選地，電泳完成后，凝膠用10％冰醋酸溶液固定30min，取出用ddH2O漂洗2次(每次5～10min)，再用0.1％硝酸銀溶液染色30min，取出用ddH2O漂洗10～15s，然后用3％無水碳酸鈉溶液顯色，最后用10％冰醋酸溶液終止顯影。顯影好的凝膠經(jīng)漂洗、風(fēng)干，用于中雙9號(hào)與其它品種的鑒別。
(5)選取中雙9號(hào)植物組植，提取DNA，以中雙9號(hào)DNA為模版，進(jìn)行上述步驟(2)-(4)，獲得中雙9號(hào)的SSR擴(kuò)增帶型。
(6)將步驟(4)所得的待測(cè)品種的SSR擴(kuò)增帶型與步驟(5)所得的中雙9號(hào)的SSR帶型進(jìn)行比較鑒定。
若10對(duì)SSR引物擴(kuò)增的帶型與對(duì)照(中雙9號(hào))完全相同，表明該品種為中雙9號(hào)，若存在差異，則為異品種。
NCBI GENBANK中與植物芥酸合成有關(guān)的基因資源包括5個(gè)FAE基因(GeneID分別為1795811、1797097、79071、2178、170439)和160個(gè)FAE核苷酸片斷序列(登錄號(hào)為AJ716156、AJ716158、NM 004333、NM 024090、AY888044、AY888043等)。基因庫檢索和序列對(duì)比分析結(jié)果表明，中雙9號(hào)品種控制芥酸合成的關(guān)鍵基因FAE1(GENBANK登錄號(hào)為AY888037)與其它已公布的FAE基因或核苷酸片段序列的不同之處在于存在由4個(gè)堿基的缺失導(dǎo)致的移碼突變，由此造成編碼蛋白質(zhì)合成提前終止，其編碼蛋白質(zhì)的第282位氨基酸為絲氨酸(與一般的高芥酸品種相同)，而迄今為止發(fā)現(xiàn)的低芥酸油菜的FAE基因都是在編碼蛋白質(zhì)的第282位氨基酸為苯丙氨酸。也即中雙9號(hào)的芥酸合成基因FAE1序列位于5’-TTAAAGCCCCTAAAGC-3’(互補(bǔ)鏈為5’-GCTTTAGGGGCTTTAA-3’)中的GCC與CCT間缺失TGAC(互補(bǔ)鏈AGG與GGC間缺失GTCA)四個(gè)堿基。
有鑒于此，本發(fā)明還提供了另一種中雙9號(hào)的鑒定方法，其特征在于，利用中雙9號(hào)特有的芥酸基因(位于缺失的TGAC兩端)設(shè)計(jì)引物，以鑒定、區(qū)別中雙9號(hào)及其衍生品種與其他油菜品種，包括步驟(1)選取待測(cè)品種植物組織；優(yōu)選地，選取待測(cè)試品種植株的幼嫩葉片，-70℃保存；總DNA的提取采用SDS法進(jìn)行；DNA純化采用苯酚-氯仿-異戊醇法；純化后的DNA-20℃保存以用于鑒定。
(2)以待測(cè)品種DNA為模版，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中引物如下上游引物5’TTG ACA TTG TTT AGA GCC ACC CA 3’下游引物5’GAG AAG GAA CCT AGC CCT AGC ACC 3’；上游引物5’AGA GCC GTG ATT GAT GTG CTA GAG A 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；上游引物5’AGC CGT GAT TGA TGT GCT AGA GAA G 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；PCR反應(yīng)體系含有的組分為1×擴(kuò)增緩沖液，0.2mmol/L dNTPs，1U Pyrobest DNA多聚酶，上下游引物各2mmol/L，100ng模板DNA，加ddH2O至終體積50μL；PCR熱循環(huán)程序?yàn)?
94℃ 4min；1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s；復(fù)性30s，復(fù)性溫度根據(jù)所用引物的TM值確定；72℃ 45s；35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；1個(gè)循環(huán)；所得擴(kuò)增產(chǎn)物冷藏保存?zhèn)溆茫?3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段測(cè)序分析，若序列中缺失TGAC(互補(bǔ)鏈缺失GTCA)四個(gè)堿基，則為中雙9號(hào)或其衍生品種，否則為偽品種。
本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有的有益效果是建立了一種快速有效的油菜重組技術(shù)體系，并以此培育出攜帶有不同于歐洲雙低基因、抗倒伏性和抗(耐)菌核病性明顯改善的新種質(zhì)材料(中雙9號(hào))；建立了客觀、科學(xué)、準(zhǔn)確的油菜品種鑒定技術(shù)體系，為保護(hù)油菜育種產(chǎn)權(quán)、登錄新品種、鑒別和檢測(cè)油菜品種的真實(shí)性、規(guī)范油菜經(jīng)營市場(chǎng)等提供了技術(shù)保障。


圖1油菜的重組設(shè)計(jì)(育種)方法流程圖。
圖210對(duì)SSR引物的中雙9號(hào)SSR指紋圖譜。
圖3引物上游引物5’ATT CAA ATC AAG GGT CTG GTC 3’下游引物5’GCT GCG TGC CAT CTT C 3’檢測(cè)結(jié)果，其中箭頭所指為中雙9號(hào)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1利用高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗菌核病及廣適應(yīng)性的高芥酸、高硫甙含量油菜品種中油821作母本，低芥酸、低硫甙、高產(chǎn)、抗倒、高含油量的中間材料84004作父本雜交，得到雜種F1。次年春，以上述雜種F1作母本，用低芥酸、低硫甙、高蛋白質(zhì)含量、抗病毒病的常規(guī)品種中雙4號(hào)的變異株系作父本進(jìn)行復(fù)合雜交，獲得復(fù)合雜交F1，即獲得綜合目標(biāo)性狀的基因群。對(duì)所構(gòu)建的綜合目標(biāo)性狀基因群的分離世代進(jìn)行品質(zhì)、抗性和農(nóng)藝性狀的綜合鑒定和篩選，獲得了一批目標(biāo)性狀優(yōu)異的材料。同時(shí)，對(duì)早期世代表現(xiàn)優(yōu)異的初選材料進(jìn)行小孢子培養(yǎng)和染色體加倍并結(jié)合夏繁加代加速優(yōu)良基因型的純合與穩(wěn)定。
對(duì)多個(gè)基因DH系進(jìn)行綜合鑒定，編號(hào)為93256的品系表現(xiàn)十分突出，進(jìn)行多點(diǎn)鑒定，結(jié)果產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等突出。兩年平均畝產(chǎn)165.48kg，比對(duì)照中油821增產(chǎn)15.33％，達(dá)極顯著水平；種子含油量41.97％，蛋白質(zhì)含量32.83％，居同輪區(qū)試首位，比對(duì)照高1.55％；種子芥酸含量0.22％，商品籽硫甙含量16.65μmol/g(餅)；抗倒性、抗菌核病能力、抗病毒病能力均居參試品種第一位。定名為中雙9號(hào)。
實(shí)施例2選取待測(cè)試品種植株的幼嫩葉片，提取DNA；總DNA的提取采用SDS法進(jìn)行；DNA純化采用苯酚-氯仿-異戊醇法；純化后的DNA-20℃保存以用于分子鑒定。
以待測(cè)品種DNA為模版，進(jìn)行SSR鑒定的PCR反應(yīng)，其中10對(duì)SSR引物如下上游引物5’TGG GAC GTA GTC AGT CAA CAA 3’下游引物5’CCA AGT GCG AGA AGA GGA AG 3’；上游引物5’ACC GTT GAG ATC AAT CCC TAT 3’下游引物5’CAT CTT CCT TAA TCG AAA CCC 3’；上游引物5’TCC ATT AGC TCT CGT CCT C 3’下游引物5’TTT TTA GAA CAG TGC CTT GAC 3’；上游引物5’ATC TCA GGC TGG CGA ATA CA 3’下游引物5’CGA CAA GTC AAT CCG AAT CAA 3’；上游引物5’AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3’
下游引物5’ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3’；上游引物5’CAC CGT CGG AGT CTG AAT 3’下游引物5’GAG CCG TTA AAC C(AGCT)T AGT GTG 3’；上游引物5’ATT GGG TTC TGA CCT TTT CTC 3’下游引物5’TTT TCC TTC ATC GCT ACC AC 3’；上游引物5’TCG GGG TTT GTT GTG AGG 3’下游引物5’GAG GAG GAT GCT AAG AGT GAG C 3’；上游引物5’ACC AAA ATG TGT GAA GCC AC 3’下游引物5’CTT GTG GCC AGA TTC ATC AC 3’；上游引物5’ATT CAA ATC AAG GGT CTG GTC 3’下游引物5’GCT GCG TGC CAT CTT C3’。
PCR反應(yīng)體系各組分為1×擴(kuò)增緩沖液，2mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5U Taq酶，上下游引物各2.5mmol/L，50ng模板DNA，加入ddH2O至終體積10μL；PCR熱循環(huán)程序?yàn)?5℃ 2min；1個(gè)循環(huán)；94℃ 1min；60℃ 30s，每循環(huán)降0.5℃；72℃ 45s；10個(gè)循環(huán)；94℃ 1min；55℃ 30s；72℃ 45s；30個(gè)循環(huán)；將擴(kuò)增產(chǎn)物加等體積的變性上樣緩沖液，95℃變性3min后立即冷卻，然后在6％的變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，38×32.5cm)上電泳45～60min，電壓1800V。
電泳完成后，凝膠用10％冰醋酸溶液固定30min，取出用ddH2O漂洗2次(每次5～10min)，再用0.1％硝酸銀溶液染色30min，取出用ddH2O漂洗10～15s，然后用3％無水碳酸鈉溶液顯色，最后用10％冰醋酸溶液終止顯影。顯影好的凝膠經(jīng)漂洗、風(fēng)干，備用。
選取中雙9號(hào)植株的幼嫩葉片，提取DNA，以中雙9號(hào)DNA為模版DNA，進(jìn)行上述步驟，獲得中雙9號(hào)的SSR擴(kuò)增帶型。
將待測(cè)品種的SSR擴(kuò)增帶型與中雙9號(hào)的帶型進(jìn)行比較鑒定。若10對(duì)SSR引物擴(kuò)增的帶型與對(duì)照(中雙9號(hào))完全相同，表明該品種為中雙9號(hào)，若存在差異，則為異品種。
實(shí)施例3選取待測(cè)試品種植株的幼嫩葉片，提取DNA；總DNA的提取采用SDS法進(jìn)行；DNA純化采用苯酚-氯仿-異戊醇法；純化后的DNA-20℃保存以用于分子鑒定。
以待測(cè)品種DNA為模版，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中引物如下上游引物5’TTG ACA TTG TTT AGA GCC ACC CA 3’下游引物5’GAG AAG GAA CCT AGC CCT AGC ACC 3’；上游引物5’AGA GCC GTG ATT GAT GTG CTA GAG A 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；上游引物5’AGC CGT GAT TGA TGT GCT AGA GAA G 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；PCR反應(yīng)體系為1×擴(kuò)增緩沖液，0.2mmol/L dNTPs，1U Pyrobest DNA多聚酶，上下游引物各2mmol/L，100ng模板DNA，加ddH2O至終體積50μL；PCR熱循環(huán)程序?yàn)?4℃ 4min；1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s；復(fù)性30s，復(fù)性溫度根據(jù)所用引物的TM值確定；72℃ 45s；35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；1個(gè)循環(huán)；
將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段測(cè)序分析，以進(jìn)行品種鑒定。
若序列中位于GCC與CCT間處缺失TGAC(互補(bǔ)鏈AGG與GGC間缺失GTCA)四個(gè)堿基的為中雙9號(hào)及其衍生品種。
權(quán)利要求
1.一個(gè)油菜多目標(biāo)性狀重組及篩選方法，包括步驟(1)以中油821作母本，中間材料84004作父本雜交，得到雜種F1；(2)以雜種F1作母本，常規(guī)品種中雙4號(hào)的變異株系作父本進(jìn)行復(fù)合雜交，獲得綜合目標(biāo)性狀的基因群；(3)對(duì)綜合目標(biāo)性狀基因群的分離世代進(jìn)行品質(zhì)、抗性和農(nóng)藝性狀的綜合鑒定和篩選，獲得目標(biāo)性狀優(yōu)異的材料；(4)對(duì)早期世代表現(xiàn)優(yōu)異的初選材料進(jìn)行小孢子培養(yǎng)、染色體加倍和夏繁加代，使優(yōu)良基因型純合、穩(wěn)定，獲得油菜品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其重組篩選的產(chǎn)物為油菜品種中雙9號(hào)。
3.一種權(quán)利要求1或2所述油菜品種中雙9號(hào)的鑒定方法，包括步驟(1)選取待測(cè)品種植物幼嫩組織，提取DNA；(2)以待測(cè)品種DNA為模版，進(jìn)行SSR鑒定的PCR反應(yīng)，其中10對(duì)SSR引物如下上游引物5’TGG GAC GTA GTC AGT CAA CAA 3’下游引物5’CCA AGT GCG AGA AGA GGA AG 3’；上游引物5’ACC GTT GAG ATC AAT CCC TAT 3’下游引物5’CAT CTT CCT TAA TCG AAA CCC 3’；上游引物5’TCC ATT AGC TCT CGT CCT C 3’下游引物5’TTT TTA GAA CAG TGC CTT GAC 3’；上游引物5’ATC TCA GGC TGG CGA ATA CA 3’下游引物5’CGA CAA GTC AAT CCG AAT CAA 3’；上游引物5’AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3’下游引物5’ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3’；上游引物5’CAC CGT CGG AGT CTG AAT 3’下游引物5’GAG CCG TTA AAC C(AGCT)T AGT GTG 3’；上游引物5’ATT GGG TTC TGA CCT TTT CTC 3’下游引物5’TTT TCC TTC ATC GCT ACC AC 3’；上游引物5’TCG GGG TTT GTT GTG AGG 3’下游引物5’GAG GAG GAT GCT AAG AGT GAG C 3’；上游引物5’ACC AAA ATG TGT GAA GCC AC 3’下游引物5’CTT GTG GCC AGA TTC ATC AC 3’；上游引物5’ATT CAA ATC AAG GGT CTG GTC 3’下游引物5’GCT GCG TGC CAT CTT C3’。PCR反應(yīng)體系含有1×擴(kuò)增緩沖液，2mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.5U Taq酶，上下游引物各2.5mmol/L，50ng模板DNA，加入ddH2O(雙蒸水)至終體積10μL；PCR熱循環(huán)程序?yàn)?5℃ 2min；1個(gè)循環(huán)；94℃ 1min；60℃ 30s，每循環(huán)降0.5℃；72℃ 45s；10個(gè)循環(huán)；94℃ 1min；55℃ 30s；72℃ 45s；30個(gè)循環(huán)；所得擴(kuò)增產(chǎn)物冷藏保存?zhèn)溆茫?3)擴(kuò)增產(chǎn)物加等體積的變性上樣緩沖液，95℃變性3min后立即冷卻，進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；(4)電泳后的凝膠用冰醋酸溶液固定，ddH2O漂洗，再用硝酸銀溶液染色，ddH2O漂洗，用無水碳酸鈉溶液顯色，用冰醋酸溶液終止顯影，顯影后的凝膠漂洗、風(fēng)干備用；(5)選取中雙9號(hào)植物幼嫩組織，提取DNA，以此為模版，進(jìn)行上述步驟(2)-(4)，獲得中雙9號(hào)的SSR擴(kuò)增帶型；(6)將步驟(4)所得的待測(cè)品種的SSR擴(kuò)增的帶型與步驟(5)所得的中雙9號(hào)的擴(kuò)增帶型進(jìn)行比較鑒定。
4.一種權(quán)利要求1或2所述油菜品種中雙9號(hào)的鑒定方法，其特征在于，利用中雙9號(hào)含有特異的芥酸合成基因設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的序列分析，以鑒定、區(qū)別中雙9號(hào)及其衍生品種與其他油菜品種，包括步驟(1)選取待測(cè)品種植物幼嫩組織，提取DNA；(2)以待測(cè)品種DNA為模版，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中引物如下上游引物5’TTG ACA TTG TTT AGA GCC ACC CA 3’下游引物5’GAG AAG GAA CCT AGC CCT AGC ACC 3’；上游引物5’AGA GCC GTG ATT GAT GTG CTA GAG A 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACT T 3’；上游引物5’AGC CGT GAT TGA TGT GCT AGA GAA G 3’下游引物5’CCA CCC AAA CTG CAC TGT TAC ACTT 3’；PCR反應(yīng)體系各組分為1×擴(kuò)增緩沖液，0.2mmol/L dNTPs，1U Pyrobest DNA多聚酶，上下游引物各2mmol/L，100ng模板DNA，加ddH2O至終體積50μL；PCR熱循環(huán)程序?yàn)?4℃ 4min；1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s；復(fù)性30s，復(fù)性溫度根據(jù)所用引物的TM值確定；72℃ 45s；35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；1個(gè)循環(huán)；所得擴(kuò)增產(chǎn)物冷藏保存?zhèn)溆茫?3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段測(cè)序分析，以進(jìn)行品種鑒定。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種超高產(chǎn)、高抗病、高抗倒伏、高含油量、高蛋白質(zhì)含量、低芥酸、低硫甙含量等多項(xiàng)性狀優(yōu)異的油菜新品種的重組方法及重組產(chǎn)物的鑒定方法。它選用中油821和中間材料84004為親本材料，得到的雜種F
文檔編號(hào)A01H1/02GK1887060SQ200510012028
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2005年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月28日
發(fā)明者王漢中, 劉貴華, 鄭元本, 王新發(fā), 沈金雄, 盧長明, 楊向東, 金河成, 陳吾新, 楊慶 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所