專利名稱：：豬圓環(huán)病毒的生產方法及監(jiān)控生產的測定法的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及在批量孵育生產過程中使用熒光抗體細胞分選分析在線(in-process)監(jiān)控病毒產量的方法。本發(fā)明進一步涉及在可能缺乏血清組分的培養(yǎng)基中在線監(jiān)控并收獲被圓環(huán)病毒感染的細胞培養(yǎng)物的方法。
背景技術：
：斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome)(PMWS)是最近被識別的仔豬疾病。在加拿大、美國和法國檢測到的PMWS綜合征的臨床特征為體重逐漸減輕，以及體征例如呼吸急促、呼吸困難和黃疽。從病理學觀點來看，其表現為淋巴細胞或肉芽腫浸潤，淋巴結病以及較罕見的肝炎和淋巴細胞或肉芽腫性腎炎。(ClarkE.G.(1997)Proc.Am.Assoc.SwinePrac.499—501;LaSemaineVeterinaireNo.26，supplementtoLaSemaineVeterinaire1996(834);LaSemaineVeterinaire1997(857):54;Nayar等人(1997)Can.Vet.J.38:385-387)。目前還沒有治療和預防這種疾病的方法。然而，多項證據指出豬圓環(huán)病毒是PMWS的病原體(Ellis等人(1998)Can.Vet.J.39:44-51)。圓環(huán)病毒已從患有PMWS的豬回收，并且針對豬圓環(huán)病毒的抗體已在患有該疾病的豬體內證實。命名為圓環(huán)病毒科的病毒科在一系列植物和動物種類中發(fā)現并且通常被稱為圓環(huán)病毒，其特征為包含環(huán)狀單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)的圓形無包膜的病毒粒子，平均直徑為17-23.5nm。圓環(huán)病毒的ssDNA基因組代表已知的最小的病毒DM復制子。如WO99/45956中公開的，依據國際病毒分類委員會笫6次報告，至少6種病毒已鑒定為該科成員(Lukert等人，1995，TheCircoviridae，第166-168頁。InMurphy等人，(eds.)VirusTaxonomy,SixthReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,Arch.Virol.10Suppl.)。該科中包括的動物病毒是雞貧血病毒(CAV);味羽病病毒(BFDV);豬圓環(huán)病毒(PCV);和鴿圓環(huán)病毒。PCV最初從豬腎細胞培養(yǎng)物中分離。PCV在細胞核中復制并產生大的核內包含體。參見Murphy等人(1999，Circoviridae第357-361頁，VeterinaryVirology,第3版，AcademicPress,SanDiego)。目前識另'J了2種類型的PCV-PCV1型(PCV1)和PCV2型(PCV2)。作為連續(xù)豬腎細胞系PK-15(ATCCCCL31)的持續(xù)污染物被分離出的PCV1,在細胞培養(yǎng)物中不會引起可檢測細胞病變效應，并且在實驗性感染后在豬中未能產生臨床疾病(參見AllanG.(1995)Vet.Microbiol44:49-64;Tischer等人(1982)Nature295:64-66;和Tischer等人(1986)Arch.Virol91:271-276)。只在最近，一些作者認為PCV毒林能夠致病且與PMWS綜合征有關(Nayar等人(1997)Can.Vet.J.38:385-387和ClarkE.G.(1997)Proc.Am.Assoc.SwinePrac.499-501)。Nayar等人用PCR技術在患有PMWS綜合征的豬中已檢測到PCVDM。和PCV1相反，PCV2與斷奶豬中的斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)緊密相關(參見Allan等人(1998)Eur.J.Vet.Diagn.Investig.10:3-10;Ellis等人(1998)Can.Vet.J.39:44-51和Morozov等人(1998)'J.Clin.Microbiol.36:2535-2541)。關于PCV1的核苷酸序列在Mankertz等人(1997)J.Virol.71:2562-2566)和Meehan等人(1997)J.Gen.Virol.78:221-227)中公開，并且關于PCV2的核苷酸序列在Hamel等人(1998)J.Virol.72:5262-5267;Mankertz等人(2000)VirusRes.66:65-77和Meehan等人(1998)J.Gen.Virol.79:2171-2179中公開。PCV2毒抹在W000/01409中公開且已保藏在英國PortonDown,Salisbury,WiltshireSP4OJG應用微生物學研究中心(CentreforAppliedMicrobiology&Research)的歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心，并且包括登記號V97100219;登記號V9700218;登記號V97100217;登記號V98011608;和登記號V98011609。WO00/77216同樣7^開了PCV2。在PCV2基因組中已鑒定了多達13個可讀框(M尸)。Meehan等人，(1998))也稱為M尸《包含核苷酸398-1342(GenBank登記號AF055392)并且可能編碼預測分子量為37.7kD的蛋白質。^F2(Meehan等人，(1998));也稱為朋尸7J,包含與1-314相連的核苷酸1381-1768(GenBank登記號AF055392),且可以編碼預測分子量為27.8kD的蛋白質。PCV2ORFs1-13的進一步描述可以在美國專利號6,368,601、6,391,314、6，660272、6,217,883、6,517,843、6，497,883以及AU764379、EP1019510、MX221562、MX216996、RU2237492和NZ505008中找到，所述專利全文引入本文作為參考。PCV2的與PCV1分離林的高度相似(86%同一性)(Meehan等人，(1998))。PCV1的0RF1蛋白質已部分表征(Meehan等人，1997;Mankertz等人，(1998)Virusgenes16:267-276)并且已顯示是病毒復制所必需的，很可能涉及病毒DNA復制。其0RF2s之間的蛋白質序列同一性(66%同一性)低于0RF1之間的同一性，但是每個0RF2具有高度保守的堿性N-末端區(qū)，類似于在禽類圓環(huán)病毒雞貧血病毒(CAV)(Meehan等人，1998)的主要結構蛋白質的N-末端區(qū)所觀察到的那種。最近，Mankertz等人，在(1998)J.Gen.Virol.79:381—384中已提出PCV1分離林的,2(Mankertz等人命名為ORFl,1998)編碼衣殼蛋白。PCV2基因組的轉錄分析仍未公開。使用PCV1分離林獲得的近期數據表明M尸2轉錄物是被剪接的(Mankertz等人，1998)。的培養(yǎng)病毒。Tischer等人((1987)ArchVirol.96:39-57)報導豬腎細胞通過D-葡糖胺處理被刺激進入細胞周期中的S期。然而，該處理必須謹慎進行因為D-葡糖胺對細胞培養(yǎng)物有毒性(參見，Allan等人(2000)J.Vet.Diagn.Investigation.12:3-14)。仍需要用于培養(yǎng)圓環(huán)病毒包括例如PCV1、PCV2以及其他圓環(huán)病毒的方法，從而使得高產量的圓環(huán)病毒是可能的。此類方法特別對于制備PCV2抗原作為針對PMWS的疫苗將是有利的。本發(fā)明致力于此需要。本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)和定量感染或抗原量，以及測定針對圓環(huán)病毒特別是豬圓環(huán)病毒(PCV)的抗體的方法，其允許在線監(jiān)控批量培養(yǎng)中的病毒生產過程。雖然豬圓環(huán)病毒在豬組織培養(yǎng)物中可以作為污染物4皮檢測，但該病毒的成功的大規(guī)模批量培養(yǎng)需要快速測定法以允許連續(xù)監(jiān)控病毒生產過程以獲得最佳產量。因此，本發(fā)明的目的是開發(fā)用于監(jiān)控圓環(huán)病毒如豬圓環(huán)病毒體外培養(yǎng)過程的方法，以便能夠檢查ORFs的動態(tài)表達。本發(fā)明也希望增加細胞培養(yǎng)物的病毒產量用于生產疫苗，所述疫苗可能需要滅活的PCV或者無毒性PCV毒林(例如，在適應各種細胞培養(yǎng)和/或使用誘變劑處理受感染的細胞培養(yǎng)物后，或者PCV遺傳修飾后，通過選擇無毒性PCV毒株)作為活疫苗。另外，從培養(yǎng)的豬圓環(huán)病毒獲得的抗原材料也可用于診斷用途。因此需要在提供適合于疫苗或其他用途的病毒顆粒的條件下能夠定期且快速監(jiān)控圓環(huán)病毒的批量細胞培養(yǎng)過程。需要可以快速給出結果的監(jiān)控方法，而不是目前為此目的使用的勞動密集且耗時的方法。本申請中任何文件的引用或認同并非承認此類文件可用作本發(fā)明的現有技術。發(fā)明概述本發(fā)明提供了基于FACS的程序，用于在線監(jiān)控和快速測定被圓環(huán)病毒感染的細胞培養(yǎng)物的有效收獲點，從而使得可以獲得該病毒的最佳產量。該方法包括提供被圓環(huán)病毒感染的宿主細胞的種子培養(yǎng)物并由其接種批量培養(yǎng)物，孵育種子培養(yǎng)物，取出培養(yǎng)細胞的等分試樣，分離懸浮細胞和貼壁細胞，使貼壁細胞脫離其基質，測定宿主細胞存活力，并通過FACS測定0RF1-和0RF2-陽性細月包的百分比，由此確定培養(yǎng)物的收獲點。本發(fā)明的一個方面提供了基于FACS的方法，用于檢測宿主細胞培養(yǎng)物的圓環(huán)病毒抗原的生產，其中該方法可以包括下列步驟從被圓環(huán)病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物中獲得包含非貼壁宿主細胞群和附著至基質的宿主細胞群的樣品，從該樣品中分離出其非貼壁宿主細胞，從該樣品中分離出其貼壁宿主細胞和基質并使貼壁宿主細胞脫離基質，通過使所述細胞與0RF1特異性抗體接觸來測定非貼壁和脫離的貼壁宿主細胞中的0RF1量，通過使所述細胞與0RF2特異性抗體接觸來測定非貼壁和脫離的貼壁宿主細胞中的受感染細胞百分比，和將樣品中的0RF1-和0RF2-陽性細胞百分比和該樣品中的圓環(huán)病毒量相關聯。在該方法的各個實施方案中，圓環(huán)病毒可以是PCV2。在各個實施方案中，宿主細胞林可以是PK-15或者其他合適的細胞系。然而，預期本發(fā)明的方法可以有效地應用于檢測和在線監(jiān)控在分離的宿主細胞上培養(yǎng)的任何圓環(huán)病毒生產，并且對于該圓環(huán)病毒存在可用的病毒抗原特異性抗體。本發(fā)明的另一方面提供了基于FACS的方法，用于在線監(jiān)控來自培養(yǎng)的宿主細胞的圓環(huán)病毒生產，該方法包括下列步驟從被圓環(huán)病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物中獲得時間依賴性的多個樣品，該系列中的每個樣品包含非貼壁宿主細胞群和附著至基質的宿主細胞群，從細胞培養(yǎng)物的每個樣品中分離出其非貼壁宿主細胞，從細胞培養(yǎng)物的每個樣品中分離出其貼壁宿主細胞和基質并使貼壁宿主細胞脫離基質，通過使用流式細胞法測量碘化丙錠攝取來測定樣品中宿主細胞的存活力，通過使所述細胞與0RF1特異性抗體接觸測定非貼壁和脫離的貼壁細胞中的0RF1量來測定非貼壁和脫離的貼壁細胞中存在的ORFl陽性細胞百分比，通過FACS測定與細胞結合的抗體量并將結合抗體的量與細胞中存在的ORFl量相關聯，通過使所述細胞與0RF2特異性抗體接觸測定非貼壁和脫離的貼壁宿主細胞中的0RF2量來測定非貼壁和脫離的貼壁細胞中存在的0RF2陽性細胞百分比，通過FACS測定與細胞結合的抗體量并將結合抗體的量與細胞中存在的0RF2量關聯，和對存活力、0RF1和0RF2水平中的變化作圖，從而確定在宿主細胞培養(yǎng)物中的圓環(huán)病毒生產的時間過程。在本發(fā)明的這種方法的一個實施方案中，細胞存活力可以使用碘化丙錠和流式細胞法來測定。在本發(fā)明的這種方法的各個實施方案中，圓環(huán)病毒可以是PCV2并且宿主細胞林可以是PK-15，雖然該方法不應解釋為只能應用于這種圓環(huán)病毒毒林/宿主細胞組合。本發(fā)明的再一方面是以可能對例如疫苗制備有用的產量生產圓環(huán)病毒的方法，包括下列步驟通過在線監(jiān)控0RF1的表達制備圓環(huán)病毒種子培養(yǎng)物并且用圓環(huán)病毒種子培養(yǎng)物接種宿主細胞培養(yǎng)物，在不存在胎牛血清的情況下孵育宿主細胞培養(yǎng)物，監(jiān)控(i)宿主細胞存活力，和(ii)由宿主細胞表達的ORFl和0RF2，并當宿主細胞培養(yǎng)物的非貼壁細胞和貼壁細胞中0RF2的表達幾乎相同時，從宿主細胞培養(yǎng)物中收獲圓環(huán)病毒。本發(fā)明的這個方面的各個實施方案中，種子培養(yǎng)物中的圓環(huán)病毒產量可以通過使用基于熒光抗體細胞分選(FACS)的方法監(jiān)控懸浮宿主細胞中的圓環(huán)病毒ORFl和0RF2抗原表達來測定，并且其中當0RF2由非貼壁細胞表達時收獲種子培養(yǎng)物。在本發(fā)明的這個方面的各個實施方案中，細胞存活力可以通過使用流式細胞法測量碘化丙錠攝取來測定。在本發(fā)明的這種方法的各個實施方案中，圓環(huán)病毒可以是PCV2并且宿主細胞林可以是PK-15,雖然該方法不應解釋為只能應用于這種圓環(huán)病毒毒抹/宿主細胞組合。然而，預期本發(fā)明的方法可以有效地應用于檢測和在線監(jiān)控在分離的宿主細胞上培養(yǎng)的任何圓環(huán)病毒生產，并且對于圓環(huán)病毒存在可用的病毒抗原特異性抗體。應當注意在本公開內容中以及特別在權利要求和/或段落中，術語例如"包含"可以具有在美國專利法中對其認定的含義；例如它們可以意指"包括"；并且此類術語如"基本上由……組成"具有在美國專利法中歸于其的含義，例如它們涵蓋未明確敘述的元件，但排除在現有技術中發(fā)現或影響本發(fā)明的基本或新穎特征的元件。這些以及其他實施方案在下文詳細描述中/〉開，或由于下文詳細描述而變得顯而易見并由下文詳細描述所涵蓋。附圖簡述作為例子給出，但不希望將本發(fā)明單獨限制于描述的具體實施方案的下列詳細描述，與引入本文參考的附圖結合可以被最好地理解，其中圖1舉例說明從細胞培養(yǎng)物中分離懸浮和貼壁PK-15細胞以及測定其中的病毒抗原0RF1和0RF2的方案；圖2舉例說明細胞懸浮液中PK-15總細胞的流式細胞法計數，包:括活細力包和死細月包；圖3舉例說明通過碘化丙錠攝取中的變化和FACS檢測被PCV2感染的PK-15細胞群中死細胞的比例；圖4舉例說明在整個孵育期間在胎牛血清存在下被PCV2感染的PK-15細胞的工作種子培養(yǎng)物存活力的時間過程；圖5舉例說明0RF1的免疫檢測和經由FACS的測量；圖6舉例說明在工作種子培養(yǎng)物醉育期間PCV2病毒0RF1和0RF2抗原的生產；和圖7舉例說明在3天后從培養(yǎng)基中除去FCS后被PCV2感染的PK-15細胞中的病毒抗原0RF1和0RF2的生產。發(fā)明詳述在下文中引用了各種文件，并且在下文引用的文件中參考或引用了各種文件。這并不是承認任何此類文件實際上是關于本發(fā)明的現有件在此引入本文作為參考。''^'如本文使用的，術語"流式細胞儀"指用第一個波長的光照射懸浮在流體介質中的顆粒，并且能夠檢測相同或不同波長處的光的任何裝置，其中檢測到的光表明了細胞或在細胞上的指示劑的存在。"流式細胞儀"可以與細胞分選儀偶聯，所述細胞分選儀能夠使顆?；蚣毎c不發(fā)射第二種光的其他顆粒和細胞分離。細胞表面上的指示劑可以是與熒光團偶聯的抗體，例如但不限于FITC(如果是熒光抗體細胞分選(FACS))。如本文使用的，術語"宿主細胞"指用于病毒優(yōu)選圓環(huán)病毒感染和復制的宿主的分離細胞。如本文使用的，術語"貼壁細胞"指在體外生長且附著至基質的動物細胞?；|可以是培養(yǎng)容器的表面，或者，如在批量細胞培養(yǎng)中可以是顆粒狀固體支持物如CYTODEX(AmershamBiosciences,Inc)珠等。通過需要酶消化亞細胞基質的方法，包括在受控條件下使用蛋白酶例如，但不限于，胰蛋白酶消化，可以使此類細胞與下面的固體支持物分離。相反，術語"非貼壁細胞"指在培養(yǎng)的過程中已與基質分離的那些培養(yǎng)細胞。如本文中使用的，基因、基因位點或其轉錄物用斜體指示；并且由其表達的蛋白質或多肽用非斜體指示。如本文中使用的，術語"0RF1"和"0RF2"分別指由可讀框^/7和朋尸2表達的圓環(huán)病毒抗原(如Meehan等人，(1998)J.Gen.Virol.78:221-227指定的)。0RF1被認為是早期復制酶并且0RF2被認為是促成病毒衣殼的多肽。在PCV2基因組中已鑒定出13個可讀框(M尸s)。PCV20RFs的進一步描述可以在全文引入本文作為參考的美國專利號6，368，601、6，391，314、6，660272、6，217，883、6，517，843、6，497，883以及AU764379、EP1019510、MX221562、MX216996、RU2237492和NZ505008中找到。PCV2中每個ORF蜂皮指定的各種名稱之間的相互關系顯示于下文實施例1中。如本文使用的，0RF1和0RF2分別與0RF4和0RF13相對應(如上文參考的專利中指定的)。術語"在線"指在整個培養(yǎng)期間監(jiān)控細胞和病毒培養(yǎng)物，包括被病毒感染的細胞培養(yǎng)物，所特有的參數。監(jiān)控可以是連續(xù)的，例如監(jiān)控培養(yǎng)基的pH或氧含量，或者可以是定期監(jiān)控，其中樣品在所選時間點取自培養(yǎng)物，檢測并測量參數例如存活力或病毒抗原含量并且將參數對培養(yǎng)時間作圖。如本文使用的，術語"種子培養(yǎng)物"指被所選病毒例如圓環(huán)病毒感染且隨后孵育一定時間以允許病毒滴度增加的宿主細胞培養(yǎng)物。通常，但不是必需的，種子培養(yǎng)物的體積少于接受種子培養(yǎng)物的后續(xù)主要培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基的體積。根據長期的法律約定，如本文包括權利要求使用的，術語"a"和"an"應理解為"一個(種)"或"多個(種)"?？s寫:0RF，可讀框；朋尸，編碼ORF的核苷酸序列；PK,豬腎；PCV,豬圓環(huán)病毒；PK-15,豬腎細胞；FACS，熒光抗體細胞分選；ELISA，酶聯免疫吸附測定法；Mab,單克隆抗體；FITC，異硫氰酸熒光素；IgG，免疫球蛋白G;PBS/BSA，磷酸鹽緩沖鹽水/牛血清白蛋白。本發(fā)明提供了用于測定被圓環(huán)病毒特別是豬圓環(huán)病毒感染的宿主動物細胞培養(yǎng)物中的病毒產量的方法。然而，本發(fā)明的方法一般可應用于特別是批量培養(yǎng)程序中，在細胞培養(yǎng)物上生長的任何其他圓環(huán)病毒毒林或類型。本發(fā)明的方法對監(jiān)控豬圓環(huán)病毒毒林PCV2的批量培養(yǎng)的病毒產量特別有用。本發(fā)明中基于FACS的方法包括測定細胞培養(yǎng)基中懸浮的宿主細胞和保持附著至固體支持物的那些細胞的存活力，所述固體支持物例々口，但不卩艮于，CYTODEX(AmershamBiosciences,Inc)。培養(yǎng)的宿主細胞的病毒載量通過下列方法測量測定非貼壁和脫離的貼壁細胞中存在的ORFl-陽性細胞百分比，測定非貼壁和脫離的貼壁細胞中存在的0RF2-陽性細胞百分比，將樣品中的0RF1-和0RF2-陽性細胞百分比與樣品中的圓環(huán)病毒量相關聯。病毒產量通過檢測和測量懸浮細胞中的兩種抗原來確定，例如從宿主細胞轉移至無血清培養(yǎng)基時起5-7天。因此本發(fā)明的一個實施方案是適合于滴定PCV2的新型測定法，其基于通過流式細胞法使用對0RF1或0RF2特異的單克隆抗體來免疫檢測PK-15宿主細胞中的病毒蛋白質。此外，PK-15細胞的生長動力學也可以通過流式細胞法來監(jiān)控。本發(fā)明方法的快速性允許測定最佳收獲點來達到高病毒產量?？梢赃x擇提供對例如疫苗生產有用的病毒產量的收獲點，同時最小化細胞孵育期，隨之降低成本。本發(fā)明的方法快速地產生定量數據。這允許在整個孵育期過程中反復監(jiān)控病毒生產并易于選擇最合適收獲點。測量病毒滴度的常規(guī)方法慢得多且涉及擴充培養(yǎng)測試樣品以形成可計數斑。在PK-15細胞上生長的病毒的常規(guī)板測定法基于使用以0RF2單克隆抗體為基礎的ELISA的免疫熒光檢測，耗時且勞動密集，需要幾天才能得到有用的結果。本發(fā)明的一個方面是用于在批量培養(yǎng)期間快速測定培養(yǎng)的宿主細胞的存活力特性的方法。雖然該方法對監(jiān)控用于病毒生產的任何細胞培養(yǎng)都是有用和合適的，但是該方法對在線監(jiān)控PK-15細胞的細胞培養(yǎng)物是特別有用的，所述PK-15細胞用于批量生產PCV2圓環(huán)病毒，用于疫苗生產。依據本發(fā)明方法的這個方面中，以及如圖l舉例說明的，批量細胞培養(yǎng)物的樣品分成懸浮(非貼壁)細胞群和附著至固體基質的細胞群。用于在PK-15宿主細胞培養(yǎng)中使用的基質是，例如，CYT0DEX(AmershamBiosciences,Inc)珠，盡管也可以選擇組織培養(yǎng)領域技術人員已知的任何其他合適材料。密度大的基質珠允許通過重力來沉降，并且含有非貼壁細胞的懸浮培養(yǎng)基可通過各種方法中的任何一種去除，如抽吸、傾析、離心等。附著至基質的細胞隨后可以通過例如胰蛋白酶消化脫離基質，在顯微鏡下監(jiān)控消化脫離的程度以確定細胞脫離基質的最大點，而對細胞自身的損傷最小。收獲脫離的細胞以產生兩種所需細胞群中的第二種。本文描述了用于生產能夠特異地識別圓環(huán)病毒例如但不限于PCV2的0RF1或0RF2蛋白質中一種或多種表位的抗體的方法。此類抗體可以包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab"2片段、由FAb表達文庫產生的片段、抗獨特型(抗-Id)抗體，以及上述任何一種的表位結合片段。有利地，用于在本發(fā)明中使用的抗體是對由圓環(huán)病毒M/7和M尸2基因表達的0RF1或0RF2蛋白質特異的單克隆抗體。最有利地，0RF1或0RF2蛋白質由圓環(huán)病毒PCV2表達。對于抗體生產，各種宿主動物可以通過注射分離的0RF1或0RF2多肽或其免疫原性肽進行免疫。此類宿主動物可以包括，但不限于，例如兔、小鼠、和大鼠等。取決于宿主種類，可以使用各種佐劑增加免疫應答，包括，但不限于，弗氏(完全和不完全)，礦物膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、多聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍蛋白、二硝基苯酚，以及可能有用的人佐劑例如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Cor，6a"e"'咖；ar層)。免疫步驟完成后，可以收集與0RF1或0RF2蛋白質反應的抗血清并且需要時，可以分離多克隆抗"0RF1(或抗"0RF2)蛋白質抗體。多克隆抗體是來源于用抗原免疫的動物血清的抗體分子異質群體，所述抗原例如是靶基因產物，或其抗原功能性衍生物。為了產生多克隆抗體，宿主動物例如上文所述的那些可以通過注射補充了如上所述的佐劑的0RF1或0RF2蛋白質進行免疫。單克隆抗體是針對特定抗原的抗體同質群體，可以通過提供經由培養(yǎng)的連續(xù)細胞系來生產抗體分子的任何技術獲得。這些包括，但不限于Kohler和Milstein的雜交瘤才支術(1975)Nature256:495-497;和美國專利號4，376，IIO)，人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等人(1983)ImmunologyToday4:72;Cole等人(1983)Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030)，以及EBV-雜交瘤技術(Cole等人(1985)MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapyAlanR.Liss，Inc.笫77-96頁)。簡言之，從被免疫的小鼠收獲脾細胞且與永生化細胞(即，骨髓瘤細胞)融合以產生抗體生產性雜交瘤。雜交瘤可以用免疫化學法歸選，以確定生產與0RF1或0RF2蛋白質特異反應的單克隆抗體的雜交瘤。用于獲得定制的多克隆抗血清和單克隆抗體的商業(yè)來源也是可利用的。，H口，HTIBio—Products，Inc.(Ramona，Calif.)生產定制的抗體、抗血清、腹水和雜交瘤系。用于生產、分離和純化常規(guī)和單克隆抗體的方案可以類似于下列中描述的那些Cassone等人(1988)J.Med.Microbiol.27:233-238;Hancock和EvanProductionandCharacterizationofAntibodiesagainstSyntheticPeptides第23-33頁，ImmunochemicalProtocolsed.M.M.Manson，(1992)(HumanaPress,Totowa,N.J.);Goding,J.W.,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第二版，(1986)(AcademicPressLtd.,London)以及Lam和Mutharia,"Antigen-AntibodyReactions,"第104-132頁，MethodsforGeneralandMolecularBacteriology,ed.P.Gerhardt:(1994)(ASMPress,Washington,D.C.)，其內容整體引入本文作為參考。此類抗體可以是任何免疫球蛋白類包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，及其任何亞類。本發(fā)明中生產MAbs的雜交瘤可以在體外或體內培養(yǎng)。高滴度MAbs的體內生產使得這成為目前優(yōu)選的生產方法?？商娲兀糜趩捂溈贵w生產的技術例如，但不僅是，美國專利號4，946，778;Bird(1988)Science242:423-426;Huston等人(1988)Pro"Natl.Acad.Sci.85:5879-5883;和Ward等人(1989)Nature334:544-546,可以適合于生產0RF1或0RF2蛋白質特異性抗體。單鏈抗體經由氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段產生單鏈多肽而形成。識別特異性表位的抗體片段可以通過已知技術產生。例如，此類片段包括，但不限于可以通過胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab')2片段和可以通過還原F(ab')2片段的二硫橋產生的Fab片段?？商娲兀梢詷嫿‵ab表達文庫(Huse等人(1989)Science246:1275-1281)以允許快速且容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段。依據本發(fā)明制備的抗體可以用于檢測細胞、細胞提取物之中或之上、或者其他包含0RF1或0RF2蛋白質的生物制劑中的0RF1(或0RF2)蛋白質。此外，此類抗體可以用檢測分子標記以允許檢測抗原/抗體復合物。合適的標記包括各種酶、熒光分子、放射性標記、化學發(fā)光分子等。例如，用于標記抗體的酶包括辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。熒光標記包括，但不限于，熒光素、若丹明、丹磺酰氯或藻紅蛋白。如下文實施例2中所述，兩種細胞群的存活力通過將分離的細胞群的等分試樣與碘化丙錠混合來測定，所述碘化丙錠只能被非存活細胞的細胞核吸收。染色的細胞通過流式細胞法分析以獲得總細胞計數，例如如圖2中所示，以及樣品群中活細4包和死細胞的比例，如圖3中所示。除了宿主細胞的存活力測量外，本發(fā)明的方法進一步包括使分離的細胞群與對病毒抗原0RF1和0RF2特異的抗體接觸的步驟，同樣如下文實施例2中所述。細胞隨后進行洗滌并可以與用焚光團例如，但不限于，FITC標記的抗-IgG抗血清接觸，之后通過流式細胞儀測量細胞結合的熒光，同樣如下文實施例2中所述。圖2、3和4顯示了在培養(yǎng)基中使用胎牛血清的l升批量培養(yǎng)物中生長的PK-15細胞上的PCV2病毒生長的示例性存活力結果。例如，在孵育5天后的一個實驗中，大約50%培養(yǎng)總細胞群位于培養(yǎng)基的上清液中并且主要是死亡的。這與附著至CYT0DEX(AmershamBiosciences,Inc)基質且存活的剩下50%細月包形成對比。包含胎牛血清的批量培養(yǎng)物中的病毒生產測量顯示，0RF1在第1和2天時且只在基質附著細胞中暫時表達。例如如圖6中所示，0RF1只在第3-5天在懸浮(或非貼壁)細胞中檢測到。例如如圖6中所示，病毒衣殼抗原0RF2只能在懸浮、非貼壁細胞中檢測到，在第1天孵育后隨著孵育期過去而持續(xù)增加。本發(fā)明的方法允許通過檢測直到收獲點時懸浮(且因此主要是死亡的)細胞中表達的0RF1和0RF2來檢測和監(jiān)控圓環(huán)病毒和受感染細胞。這些數據獲得的快速性允許經常定期監(jiān)控細胞培養(yǎng)物的感染進展。隨后培養(yǎng)物可以在產生適合于接種大批量宿主細胞培養(yǎng)物的病毒高產量點收獲，用于病毒的最終生產，其質和量足以用于在例如疫苗開發(fā)和生產中使用。由于使用本發(fā)明方法開發(fā)的種子培養(yǎng)物可以用于接種100-1000升體積級別的大體積的細胞培養(yǎng)物。在此過程中，在第5天或如通過上文測定的0RF2表達特別指出的其他時間點上收獲的種子培養(yǎng)物，接種到包含含有胎牛血清的細胞培養(yǎng)基的大規(guī)模細胞培養(yǎng)體系內。宿主細胞如PK-15細胞的存活力隨后依據下文實施例2中所述的方法監(jiān)控。例如如圖7中所示，可以是但不限于大約3天的初始孵育期后，細胞培養(yǎng)基可以換成不包括胎牛血清的培養(yǎng)基，并繼續(xù)孵育，再次使用定期在線取樣和測定。因此，本發(fā)明的另一方面是通過使用FACS監(jiān)控0RF1和0RF2的生產來在線監(jiān)控大規(guī)模宿主細胞培養(yǎng)物中的圓環(huán)病毒生產。當與基于常規(guī)培養(yǎng)的程序比較時，使用如實施例2中所述的本發(fā)明方法，可以快速且更頻繁地監(jiān)控細胞培養(yǎng)物，從而使得一旦達到所需病毒產量就可以收獲培養(yǎng)物。例如如圖7中所示，可以監(jiān)控培養(yǎng)物的病毒特異性抗原0RF1和0RF2表達。通常，如圖7中所示，總0RF1和0RF2抗原的生產模擬如圖7中舉例說明的宿主細胞生長模式。如下文實施例5中所示，在PK-15細胞上生長的PCV2標記0RF1和0RF2從第4天到第7天線性增長，并顯示與附著至基質的貼壁細胞以及培養(yǎng)基上清液中的非貼壁細胞相似的增長模式。從培養(yǎng)基中去除血清減少并延遲病毒抗原表達的開始，特別是如果培養(yǎng)物在第5天時收獲。然而，超過第5天的連續(xù)培養(yǎng)(從培養(yǎng)物接種時開始計算)可以明顯增加0RF2抗原即成熟病毒顆粒的產量(參見圖7)。因此，本發(fā)明提供了FACS操作，用于在線監(jiān)控和快速測定被圓環(huán)病毒感染的細胞培養(yǎng)物的有效收獲點，從而使得可以獲得病毒的最佳產量。該方法包括提供被圓環(huán)病毒感染的宿主細胞的種子培養(yǎng)物和用其接種批量培養(yǎng)物，孵育種子培養(yǎng)物，取出培養(yǎng)細胞的等分試樣，分離懸浮細胞和貼壁細胞，使貼壁細胞脫離基質，測定宿主細胞的存活力，通過FACS測定細胞樣品中的0RF1和0RF2百分比，并確定培養(yǎng)物的收獲點。本發(fā)明的一個方面提供了基于熒光抗體細胞分選(FACS)的方法，用于檢測被病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物的圓環(huán)病毒抗原的生產，其中圓環(huán)病毒抗原的生產與可讀框1(0RF1)和可讀框2(0RF2)陽性細胞百分比相關，包括從來自被圓環(huán)病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物的包含非貼壁宿主細胞群和附著至基質的宿主細胞群的樣品中分離(i)非貼壁宿主細胞和(ii)脫離基質的貼壁宿主細胞，并測定在分離的非貼壁宿主細胞和脫離基質的貼壁宿主細胞中存在的(i)可讀框l(ORFl)陽性細胞百分比和(ii)可讀框2(0RF2)陽性細胞百分比。在該方法的這個方面的各個實施方案中，圓環(huán)病毒可以是PCV2。在各個實施方案中，宿主細胞抹可以是PK-15。然而，預期本發(fā)明的方法可以有效地應用于檢測和在線監(jiān)控在分離的哺乳動物宿主細胞上培養(yǎng)的任何圓環(huán)病毒生產，并且對于該圓環(huán)病毒存在可用的病毒抗原特異性抗體。本發(fā)明另一方面提供了基于熒光抗體細胞分選(FACS)的方法，用于在線監(jiān)控來自培養(yǎng)的宿主細胞的圓環(huán)病毒生產，其中對存活力、0RF1和0RF2水平中的變化作圖確定宿主細胞培養(yǎng)物中的圓環(huán)病毒生產的時間過程，其包括從來自被圓環(huán)病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物的、包含非貼壁宿主細胞群和附著至基質的宿主細胞群的樣品中分離(i)非貼壁宿主細胞和Ui)脫離基質的貼壁宿主細胞，測定非貼壁宿主細月包和貼壁宿主細月包的存活力，并測定在分離的非貼壁宿主細l包和脫離基質的貼壁宿主細胞中存在的(i)可讀框l(0RF1)陽性細胞百分比和(ii)可讀框2(0RF2)陽性細胞百分比。在本發(fā)明的這種方法的一個實施方案中，細胞存活力通過使用流式細胞法測量碘化丙錠攝取來測定。在本發(fā)明的這種方法的各個實施方案中，圓環(huán)病毒可以是PCV2并且宿主細胞株可以是PK-15,雖然該方法不應解釋為只能應用于這種圓環(huán)病毒毒林/宿主細胞組合。例如本發(fā)明的方法一般可以應用于雞貧血病毒或味習習病病毒(beakandfeatherdiseasevirus)和宿主細胞如合適的禽類宿主細胞等。本發(fā)明再一方面是在無血清條件下生產圓環(huán)病毒的方法，并且因此可用于制備疫苗，其包括下列步驟通過在線監(jiān)控ORFl的表達制備圓環(huán)病毒種子培養(yǎng)物并且用圓環(huán)病毒種子培養(yǎng)物接種宿主細胞培養(yǎng)物，在不存在胎牛血清的情況下孵育宿主細胞培養(yǎng)物，監(jiān)控(i)宿主細胞存活力，和(ii)由宿主細胞表達的ORFl和0RF2，并當宿主細胞培養(yǎng)物的非貼壁細胞和貼壁細胞中0RF2表達幾乎相同時，從宿主細胞培養(yǎng)物中收獲圓環(huán)病毒。本發(fā)明的這個方面的各個實施方案中，種子培養(yǎng)物中的圓環(huán)病毒產量可以通過使用基于熒光抗體細胞分選(FACS)的方法監(jiān)控懸浮宿主細^^中的圓環(huán)病毒0RF1和0RF2抗原表達來測定，并且其中當0RF2由非貼壁細胞表達時收獲種子培養(yǎng)物。在本發(fā)明的這個方面的各個實施方案中，細胞存活力可以通過使用流式細胞法測量碘化丙錠攝取來測定。在本發(fā)明的這種方法的各個實施方案中，被病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物中的ORFl和0RF2抗原表達可以使用基于熒光抗體細胞分選(FACS)的方法來監(jiān)控，其中圓環(huán)病毒抗原的生產與可讀框1(ORFl)和可讀框2(0RF2)陽性細胞百分比相關。在本發(fā)明的這種方法的各個實施方案中，圓環(huán)病毒可以是PCV2并且宿主細胞林可以是PK-15,雖然該方法不應解釋為只能應用于這種圓環(huán)病毒毒株/宿主細胞組合。然而，預期本發(fā)明的方法可以有效地應用于檢測和在線監(jiān)控在分離的哺乳動物宿主細胞上培養(yǎng)的任何圓環(huán)病毒生產，并且對于該圓環(huán)病毒存在可用的病毒抗原特異性抗體。應當理解本發(fā)明并不限于本文描述的具體組合物、設備或方法，圍內。用于測定細胞培養(yǎng)物中受感染細胞的百分比的方法步驟僅是示例性的，以便使得本領域普通技術人員能夠根據所述過程及其等價過程制備并使用組合物。還應當理解盡管本文顯示和描述的本發(fā)明形式構成本發(fā)明的有利的實施方案，但它并不意味著舉例說明了本發(fā)明的所有可能形式。措辭是說明性而不是限制性的措辭?？梢詫Ρ景l(fā)明進行各種變化和改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍。本發(fā)明通過下列非限制性實施例進一步描述。實施例實施例1:圓環(huán)病毒PCV2的ORFs名稱之間的相互關系下表1顯示了整體引入本文作為參考的圓環(huán)病毒PCV2的ORF、其等價名稱、及其分別的來源。如Meehan等人(1997;1998)所述，0RF1和0RF2已分別可替代地命名為ORF4和13。表i;<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例2:存活力、檢測被PCV2感染的PK-15細胞中的0RF1和0RF2的測定法"J浙定細應^炎和勿^存話力使用碘化丙錠來評估質膜的完整性。碘化丙錠是染色核酸的熒光活體染料。死細胞摻入硪化丙錠，這通過流式細胞法使用Galaxy細胞計數器(可以使用其他類似功能型號的流式細胞儀)檢測為紅色染色。這種細胞計數器能夠區(qū)別、檢測并計數未染色(活的)或碘化丙錠染色(死的)細胞。根據關于所用細胞計數器的具體型號的制造商說明書測定200m1體積中的細胞數目。在Galaxy細胞計數器專用的試管中在PBS中制備1ml細胞懸浮液。細胞懸浮液的稀釋度調整至大約2xl(T-約1x106細胞/ml(對應細胞計數器計數的線性值)。向細胞懸浮液中加5pi碘化丙錠(50Hg/ml)。懸浮液隨后漩渦混合數秒并立即在細胞計數器上分析。細胞計數器的一般設置為FSC-譜系范圍上的閾值；FL3對數范圍上檢測到的細胞熒光(對應碘化丙錠通道)。如圖2和3中所示，細胞計數器軟件自動產生作為散點圖的計數結果。廣69遞過^/量Mi^和/威M尸2^^/定憂惑染細^的^"為^化。單次測定需要大約3xl(T細胞，等分為lxl()6用于陰性對照、1x106用于0RF1檢測和1x106用于0RF2檢測。對于不同的細胞量，相應地調整反應物體積。(""使用BDCytofixCytoperm(BDBiosciences,ref.554714)。依據固定劑制造商的建議進行固定。簡言之，3x106細胞在15ml或50ml的圓錐管中在400g下離心6分鐘。棄去上清液，用750^1的Cytofix重懸浮細胞并在水上孵育20分鐘。細胞用lml含1。/。BSA的PBS洗滌2次并重懸浮于lml的PBS/1%BSA中。染色之前樣品儲存于5'C至多15天。f//>^f和g;固定細胞在400g下離心6分鐘，棄去上清液并加入300jalIXBDPerm/Wash溶液。100jul固定細胞分配到96微孔板的3個孔中并在400g下離心6分鐘。棄去上清液并加入IOOpiIXBDPerm/Wash溶液。向每個孔中加入5抗體(1mg/ml)。通常，5jug單克隆抗體-純化的Mab抗-PCV2(0RF1)編號1991D3GA，初始濃度-lmg/ml或者純化的Mab抗-PCV2(0RF2)編號1903A8BC，初始濃度-lmg/ml足夠用于每次染色。純化的Mab抗-梭菌N。101B9B或等價物，初始濃度-lmg/ml，用作陰性對照?？自谒戏跤?0分鐘。細胞用IXBDPermWash溶液(200^1/次洗滌/孔)洗滌2次。隨后每孔加入10(^1含VI抗小鼠FITC(與FITC綴合的抗小鼠IgG(例如，Beckman，參考號115-095-146)或其等價物)的IXBDPermWash溶液并將孔在冰上再孵育30分鐘。細胞用IXBDPermWash溶液(200jnl/次洗滌/孔)洗滌2次并重懸浮于20(^1PBS/1。/。BSA/孔中。遞3關于細胞計數器的參數設定，如GalaxyCytometer(Partec)，一般為FSC-鐠系范圍上的閾值；FL1對數范圍上檢測到的細胞熒光(對應FITC通道)。圖3中顯示的代表性柱狀圖顯示了與陰性對照細胞群比較，由于受感染PK-15宿主細胞群中的0RF1檢測的熒光活性。為了計算受感染細胞的百分比，從ORF細胞的百分比中減去陰性細胞的百分比。在左側的柱狀圖中，受感染細胞為0%，而在圖3右側的例子中，88%的細胞纟皮感染。圖2中顯示了通過粒度測量測定的活細胞和死細胞的一般分布，并且圖4中顯示了由于受感染的宿主細胞群死亡的碘化丙錠熒光信號中的變化。在這種情況中，80%的宿主細胞是死細胞。實施例3:在批量種子培養(yǎng)物接種PCV2后PK-15計數和存活力如圖3中所示，在PK-15細胞上生長的PCV2病毒的批量種子培養(yǎng)孵育期的第5天時，50%的宿主細胞位于上清液中且大多數是死的(73%)。相反，50%的宿主細胞位于CYTODEXTM(AmershamBiosciences,Inc)基質支持物上且?guī)缀跞渴腔罴毎?96%)。被PCV2感染的PK-15細胞在第5天培養(yǎng)結束時檢測到，但只在懸浮細胞中(使用流式細胞法檢測ORFl和ORF2)。例如如圖6中所示，病毒特異性抗原形成的動力學取決于0RF:0RF1在早期產生且水平低，而ORF在孵育周期中較晚產生且水平漸增。實施例4:0RF1和0RF2總染色如圖6中所示，對于0RF1，在培養(yǎng)物孵育期的晚期在細胞膜上沒有信號。下表2顯示在附著至CYT0DEXTM(AmershamBiosciences,Inc)的細胞上檢測不到膜信號。主要ORF-特異性信號存在于來自培養(yǎng)物上清液中的細胞上并且從第2天到第5天漸增。活細胞或死細胞的結果相似，在第4天為最大值60%。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例5:3天后去除血清的大規(guī)模批量培養(yǎng)物中PK-15細胞上的PCV2圓環(huán)病毒培養(yǎng)依據本文引用的文件，用預先與PCV2病毒一起孵育5天的PK-15細胞培養(yǎng)物接種300升發(fā)酵罐。培養(yǎng)3天后，培養(yǎng)基換成缺乏胎牛血清的生長培養(yǎng)基。如上文實施例中所述測試每天獲取樣品中的PK-15存活力以及0RF1和0RF2的表達。圖7中舉例說明了病毒抗原ORF1和ORF2表達的時間過程。**鑒于此處詳細描述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，應當理解由所附權背離其精神或范圍即可進行其許多顯而易見的變化。權利要求1.一種基于熒光抗體細胞分選(FACS)的用于檢測被病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物的圓環(huán)病毒抗原生產的方法，其中所述圓環(huán)病毒抗原的生產與可讀框1(ORF1)和可讀框2(ORF2)陽性細胞百分比相關，其包括從來自被圓環(huán)病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物的、包含非貼壁宿主細胞群和附著至基質的宿主細胞群的樣品中分離(i)非貼壁宿主細胞和(ii)脫離基質的貼壁宿主細胞，和測定在所述分離的非貼壁宿主細胞和所述脫離基質的貼壁宿主細胞中存在的(i)可讀框1(ORF1)陽性細胞的百分比和(ii)可讀框2(ORF2)陽性細胞的百分比。2.—種基于熒光抗體細胞分選(FACS)的用于在線監(jiān)控來自培養(yǎng)的宿主細胞的圓環(huán)病毒生產的方法，其中對存活力、0RF1和0RF2水平中的變化作圖確定了宿主細胞培養(yǎng)物中的圓環(huán)病毒生產的時間過程，其包括..從來自被圓環(huán)病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物的、包含非貼壁宿主細胞群和附著至基質的宿主細胞群的樣品中分離(i)非貼壁宿主細胞和(ii)脫離基質的貼壁宿主細胞；測定所述非貼壁宿主細胞和貼壁宿主細胞的存活力；和測定在所述分離的非貼壁宿主細胞和所述脫離基質的貼壁宿主細胞中存在的(i)可讀框l(ORFl)陽性細胞百分比和(ii)可讀框2(ORF2)陽性細胞百分比。3.根據權利要求2的方法，其中所述細胞存活力通過使用流式細胞法測量碘化丙錠攝取來測定。4.一種用于生產圓環(huán)病毒的方法，其包括使用圓環(huán)病毒種子培養(yǎng)物接種宿主細胞培養(yǎng)物；在不存在胎牛血清的情況下孵育所述宿主細胞培養(yǎng)物；監(jiān)控(i)所述宿主細胞存活力，和(ii)所述宿主細胞的0RF1和0RF2表達；和當所述宿主細胞培養(yǎng)物的非貼壁細胞和貼壁細胞中0RF2的表達幾乎相同時，從所述宿主細胞培養(yǎng)物中收獲所述圓環(huán)病毒。5.根據權利要求4的方法，其中所述種子培養(yǎng)物中的圓環(huán)病毒產量通過使用基于熒光抗體細胞分選(FACS)的方法監(jiān)控懸浮宿主細胞中的圓環(huán)病毒0RF1和0RF2抗原表達來測定，并且其中當0RF2由非貼壁細胞表達時收獲所述種子培養(yǎng)物。6.根據權利要求4的方法，其中所述細胞存活力通過使用流式細胞法測量碘化丙錠攝取來測定。7.根據權利要求4的方法，其中被病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)物中的0RF1和0RF2抗原表達使用基于焚光抗體細胞分選(FACS)的方法來監(jiān)控，并且其中所述圓環(huán)病毒抗原的生產與可讀框1(0RF1)和可讀框2(0RF2)陽性細胞的百分比相關。8.根據權利要求4的方法，其中所述圓環(huán)病毒為PCV2。9.根據權利要求4的方法，其中所述宿主細胞為PK-15。全文摘要本發(fā)明提供了用于測定被圓環(huán)病毒感染的宿主動物宿主細胞培養(yǎng)物的病毒滴度的方法。本發(fā)明的基于FACS的方法可以包括測定細胞培養(yǎng)基上清液中的宿主細胞和保持附著至固體支持物的那些細胞的存活力。檢測和測量表達病毒抗原ORF1和ORF2的細胞百分比可以確定培養(yǎng)的宿主細胞的病毒載量。病毒產量可以通過檢測和測量懸浮細胞中的兩種抗原來確定，例如從宿主細胞轉移至無血清培養(yǎng)基起5-7天。本發(fā)明的方法可以快速地產生定量數據。這允許在整個孵育過程中反復監(jiān)控病毒生產并為選擇最合適收獲點作準備。文檔編號G01N33/569GK101194165SQ200680020513公開日2008年6月4日申請日期2006年4月13日優(yōu)先權日2005年4月13日發(fā)明者J·雷耶斯,L·P·丘皮爾拉德,P·埃利伯特申請人:梅瑞爾有限公司