一種雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，通過加入化學(xué)成分明確的多種氨基酸、維生素、微量元素及生物堿、脂肪酸和激素等補(bǔ)充因子，使該培養(yǎng)基能使雜交瘤細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)條件下無需適應(yīng)即可快速生長(zhǎng)，細(xì)胞密度和細(xì)胞活性都可以與有血清培養(yǎng)基相當(dāng)，既能滿足雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)需求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素，降低生產(chǎn)成本，可完全取代有血清培養(yǎng)基進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的高密度大規(guī)模培養(yǎng)。
【專利說明】一種雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基中的血清給生產(chǎn)與科研帶來多種不利因素。血清的主要作用 在于給細(xì)胞提供生長(zhǎng)增值所需的激素、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移蛋白和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但其存在很多 缺點(diǎn)：具有批間差異、需要大量驗(yàn)證工作、使用不方便、成分不明確、有抑制生長(zhǎng)的成分、尤 其不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)物的分離純化、容易被病毒和支原體感染；血清昂貴 可能發(fā)生供應(yīng)緊張，血清的來源不穩(wěn)定等問題。
[0003] 雜交瘤細(xì)胞是在制備單克隆抗體過程中，用骨髓瘤細(xì)胞和B細(xì)胞融合而成的細(xì) 胞。雜交瘤細(xì)胞是一種能分泌單一獨(dú)特抗體的無限傳代細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞技術(shù)首先由英國(guó) 的Kohler和Mistein在1975年通過小鼠骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞融合建立的。雜交瘤細(xì) 胞分泌的單克隆抗體在診斷、免疫、純化、疫苗生產(chǎn)、治療和基礎(chǔ)研究等方面有著廣泛的應(yīng) 用，已成為生物工程發(fā)面的重要產(chǎn)品。單克隆抗體用于體內(nèi)診斷和治療之后，對(duì)單克隆抗體 產(chǎn)品的純度提出了更高的要求，而雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用的血清中的各種蛋白是單克隆抗 體純化的主要障礙。目前，國(guó)外已有雜交瘤細(xì)胞商業(yè)無血清培養(yǎng)基上市，如Gibco公司的 CD Hybridoma 培養(yǎng)基、Hybridoma-SAM 培養(yǎng)基、PFHM-Protein-Free 培養(yǎng)基，Hyclone 公司 的HyQCCMI等等。上述雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基都有各自的優(yōu)點(diǎn)，但因?yàn)閮r(jià)格昂貴不適合 大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)有些培養(yǎng)基沒有針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化，所支持的細(xì)胞密度較低，導(dǎo)致生產(chǎn)過 程產(chǎn)量不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，通過加入化學(xué)成分明確的多 種氨基酸、維生素、微量元素及表皮生長(zhǎng)因子、血清胺等補(bǔ)充因子替代血清蛋白成分，使該 培養(yǎng)基能使雜交瘤細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)條件下無需適應(yīng)即可快速生長(zhǎng)，細(xì)胞密度和細(xì)胞活性都 可以與有血清培養(yǎng)基相當(dāng)，既能滿足雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)需求，又能有效避免因使用血清帶來 的諸多不利因素，降低生產(chǎn)成本，可完全取代有血清培養(yǎng)基進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的高密度大規(guī) 模培養(yǎng)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0006] -種雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其中，包括下列重量份的組分：
[0007] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 13000-16000 ;
[0008] 微量元素組合物10073-10100 ;
[0009] 氨基酸組合物523-1275 ;
[0010] 無菌水 900-1100;
[0011] 其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由DMEF和F12培養(yǎng)基按照0. 8-1. 2 : 0. 8-1. 2的重量比混 合而成。
[0012] 優(yōu)選的是，所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述氨基酸組合物包括以下重量 份的組分中的一種或幾種：
[0013] 谷氨酰胺 125. 24-250. 59、組氨酸 30. 48-105. 98、異亮氨酸 53. 41-131. 25、亮氨酸 58. 94-167. 23、賴氨酸 91. 25-193. 26、甲硫氨酸 15. 26-61. 42、苯丙氨酸 34. 12-83. 56、脯氨 酸 17. 34-35. 41、絲氨酸 27. 31-95. 15、蘇氨酸 54. 16-97. 24 和色氨酸 8. 27-52. 41。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述微量元素組合物包括以下 重量份的組分中的一種或幾種：氯化鎳0. 00003-0. 00031、氯化錫0. 00002-0. 00023、 亞硒酸鈉0. 00005-0. 0005、碳酸氫鈉2440-2451、氯化鈉6995. 50-7031. 20、氯化鉀 312. 81-313. 90、氯化鎂 29. 65-30. 42、硫酸鎂 48. 85-49. 21、一水磷酸二氫鈉 62. 51-62. 53、 磷酸氫二鈉71. 03-72. 15、硫酸鋅0. 431-0. 445、氯化鈣116. 60-117. 32、五水硫酸銅 0. 0014-0. 0016 和七水硫酸鐵 0. 062-0. 071。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中還包括11-14重 量份的維生素組合物，所述維生素組合物包括以下重量份的組分中的一種或幾種：維生 素 B6 0.01-0. 2、維生素 B12 0.02-0. 42、維生素 C9-10、維生素 E0. 30-0. 31、D-泛酸鈣 0· 004-0. 005、葉酸 0· 062-0. 081、肌醇 0· 83-1. 43 和生物素 0· 4-1. 21。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中還包括230-560重 量份的補(bǔ)充因子組合物，所述補(bǔ)充因子組合物包括以下重量份的組分中的一種或幾種：表 皮生長(zhǎng)因子 〇· 025-0. 05、血清胺 0· 06-0. 03、硫代甘油 0· 00001-0. 0001、乙醇胺 3. 50-4. 50、 羥丙基-B-環(huán)狀糊精235. 34-543. 12、谷胱甘肽0. 45-1. 26和卵磷脂1. 25-2. 86。
[0017] 優(yōu)選的是，所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中還包括1100-2500 重量份的糖類物質(zhì)組合物，所述糖類物質(zhì)組合物包括以下重量份的組分中的一種或幾種： 果糖1000-2000和海藻糖100-500。
[0018] 本發(fā)明具有以下有益效果：通過加入化學(xué)成分明確的多種氨基酸、維生素、微量 元素及表皮生長(zhǎng)因子、血清胺等補(bǔ)充因子替代血清蛋白成分，使該培養(yǎng)基能使雜交瘤細(xì)胞 在懸浮培養(yǎng)條件下無需適應(yīng)即可快速生長(zhǎng)，細(xì)胞密度和細(xì)胞活性都可以與有血清培養(yǎng)基相 當(dāng)，既能滿足雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)需求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素，降低生 產(chǎn)成本，可完全取代有血清培養(yǎng)基進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的高密度大規(guī)模培養(yǎng)。通過對(duì)比試驗(yàn)檢 驗(yàn)，雜交瘤細(xì)胞在本發(fā)明所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度和細(xì)胞活性都可以 與有血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果相當(dāng)，并優(yōu)于國(guó)外商品化的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為雜交瘤細(xì)胞在本發(fā)明所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和Hyclone公司的 HyQPF-Mab培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參閱本說明書后能 夠據(jù)以實(shí)施。
[0021] 一種雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其中，包括下列重量份的組分：
[0022] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 13000-16000 ;
[0023] 微量元素組合物10073-10100 ;
[0024] 氨基酸組合物523-1275 ;
[0025] 無菌水 900-1100;
[0026] 其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由DMEF和F12培養(yǎng)基按照0. 8-1. 2 : 0. 8-1. 2的重量比混 合而成。
[0027] 所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述氨基酸組合物包括以下重量份的組分中 的一種或幾種：
[0028] 谷氨酰胺 125. 24-250. 59、組氨酸 30. 48-105. 98、異亮氨酸 53. 41-131. 25、亮氨酸 58. 94-167. 23、賴氨酸 91. 25-193. 26、甲硫氨酸 15. 26-61. 42、苯丙氨酸 34. 12-83. 56、脯氨 酸 17. 34-35. 41、絲氨酸 27. 31-95. 15、蘇氨酸 54. 16-97. 24 和色氨酸 8. 27-52. 41。
[0029] 所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述微量元素組合物包括以下重量份的 組分中的一種或幾種：氯化鎳〇. 00003-0. 00031、氯化錫0. 00002-0. 00023、亞硒酸鈉 0· 00005-0. 0005、碳酸氫鈉 2440-2451、氯化鈉 6995. 50-703L 20、氯化鉀 312. 81-313. 90、 氯化鎂29. 65-30. 42、硫酸鎂48. 85-49. 21、一水磷酸二氫鈉62. 51-62. 53、磷酸氫二鈉 71. 03-72. 15、硫酸鋅 0· 431-0. 445、氯化鈣 116. 60-117. 32、五水硫酸銅 0· 0014-0. 0016 和 七水硫酸鐵0.062-0. 071。
[0030] 所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中還包括11-14重量份的維生素 組合物，所述維生素組合物包括以下重量份的組分中的一種或幾種：維生素 B6 0. 01-0. 2、 維生素 B12 0· 02-0. 42、維生素 C9-10、維生素 E0. 30-0. 31、D-泛酸鈣 0· 004-0. 005、葉酸 0· 062-0. 081、肌醇 0· 83-1. 43 和生物素 0· 4-1. 21。
[0031] 所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中還包括230-560重量份的補(bǔ) 充因子組合物，所述補(bǔ)充因子組合物包括以下重量份的組分中的一種或幾種：表皮生長(zhǎng) 因子 0. 025-0. 05、血清胺 0. 06-0. 03、硫代甘油 0. 00001-0. 0001、乙醇胺 3. 50-4. 50、羥丙 基-B-環(huán)狀糊精235. 34-543. 12、谷胱甘肽0. 45-1. 26和卵磷脂1. 25-2. 86。
[0032] 所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中還包括1100-2500重量份 的糖類物質(zhì)組合物，所述糖類物質(zhì)組合物包括以下重量份的組分中的一種或幾種：果糖 1000-2000 和海藻糖 100-500。
[0033] 所述雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基是在參考現(xiàn)有的文獻(xiàn)基礎(chǔ)上經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 而設(shè)計(jì)出的培養(yǎng)基配方，通過選擇適當(dāng)?shù)奈⒘吭睾桶被岽嫜宓鞍壮煞?，?yīng)用 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)培養(yǎng)基添加成分進(jìn)行了評(píng)價(jià)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化各個(gè)組 分的最佳使用劑量得到所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
[0034] 具體實(shí)施中，本發(fā)明所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基以重量比為1 : 1的DMEF和 F12的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加以下組分：
[0035] (1)表皮生長(zhǎng)因子：促進(jìn)多種類型細(xì)胞有絲分裂；
[0036] (2)血清胺：廣泛存在于哺乳細(xì)胞組織中的血管收縮劑，具有促進(jìn)體外細(xì)胞黏附 和生長(zhǎng)的作用；
[0037] (3)微量元素：&146、56、2〇和1%等微量元素，主要為酶的輔基參與代謝的調(diào)節(jié) ；
[0038] (4)金精三羧基：金屬螯合劑，具有結(jié)合并運(yùn)輸Fe2+，部分替代轉(zhuǎn)鐵蛋白的功能，同 時(shí)也能通過結(jié)合和運(yùn)輸Ca 2+及Mg2+促進(jìn)細(xì)胞的黏合和伸展；
[0039] (5)氨基酸：蛋白合成的前體和合成其他生物大分子的中間體，是細(xì)胞提供的必 要營(yíng)養(yǎng)成分；
[0040] (6)生物素：參與羧化、糖原異生和蛋白質(zhì)合成等生化反應(yīng)，對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生 長(zhǎng)和黏附具有一定的促進(jìn)作用；
[0041] (7)乙醇胺：磷脂和細(xì)胞膜合成的前體物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用；
[0042] (8)單糖和雙糖：可作為細(xì)胞代謝的能源物質(zhì)，并對(duì)細(xì)胞具有非特異性保護(hù)作用；
[0043] (9)羥丙基-B-環(huán)狀糊精：儲(chǔ)存和運(yùn)送生物大分子，提高生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和 生物利用度；
[0044] (10)維生素：細(xì)胞組成成分；
[0045] (11)谷胱甘肽：具有保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基損傷的作用；
[0046] (12)卵磷脂：做為細(xì)胞膜的重要組成部分。
[0047] 本發(fā)明所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的制備方法十分簡(jiǎn)單，稱取配方量的各組 分，加入1000ml無熱源超純水溶解并混勻，室溫下攪拌20-30min，使其溶解。用0. 32um微 孔濾膜過濾除菌，無菌保存。
[0048] 本發(fā)明可用于雜交瘤細(xì)胞傳代培養(yǎng)或雜交瘤細(xì)胞高密度連續(xù)灌注懸浮培養(yǎng)，具有 以下優(yōu)點(diǎn)：
[0049] (1)無任何蛋白質(zhì)添加物，化學(xué)成分確定；
[0050] (2)無需適應(yīng)而雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、維持活力時(shí)間長(zhǎng)，在產(chǎn)物表達(dá)方面與血清培 養(yǎng)基接近或相當(dāng)；
[0051] (3)支持細(xì)胞長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)；
[0052] (4)所有化學(xué)結(jié)構(gòu)已知，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品的品質(zhì)；
[0053] (5)成分均為小分子物質(zhì)、成本低、易于分離純化，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0054] 實(shí)施例1
[0055] 按照下列配方稱取個(gè)組分，本發(fā)明所有原料均采購Sigma細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)的原料，并 按照相關(guān)要求儲(chǔ)存。
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 一種雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，包括下列重量份的組分： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基13000-16000 ; 微量元素組合物10073-10100 ; 氨基酸組合物523-1275 ; 無菌水900-1100 ; 其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由DMEF和F12培養(yǎng)基按照0. 8-1. 2 : 0. 8-1. 2的重量比混合而 成。
2. 如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸組合物包 括以下重量份的組分中的一種或幾種： 谷氨酰胺125. 24-250. 59、組氨酸30. 48-105. 98、異亮氨酸53. 41-131. 25、亮氨酸 58. 94-167. 23、賴氨酸 91. 25-193. 26、甲硫氨酸 15. 26-61. 42、苯丙氨酸 34. 12-83. 56、脯氨 酸 17. 34-35. 41、絲氨酸 27. 31-95. 15、蘇氨酸 54. 16-97. 24 和色氨酸 8. 27-52. 41。
3. 如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述微量元 素組合物包括以下重量份的組分中的一種或幾種：氯化鎳0. 00003-0. 00031、氯 化錫 0· 00002-0. 00023、亞硒酸鈉 0· 00005-0. 0005、碳酸氫鈉 2440-2451、氯化鈉 6995. 50-703L 20、氯化鉀 312. 81-313. 90、氯化鎂 29. 65-30. 42、硫酸鎂 48. 85-49. 21、 一水磷酸二氫鈉62. 51-62. 53、磷酸氫二鈉71. 03-72. 15、硫酸鋅0. 431-0. 445、氯化鈣 116. 60-117. 32、五水硫酸銅(λ 0014-0. 0016 和七水硫酸鐵(λ 062-0. 071。
4. 如權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中還包括 11-14重量份的維生素組合物，所述維生素組合物包括以下重量份的組分中的一種或幾種： 維生素 Β6 0. 01-0. 2、維生素 Β12 0. 02-0. 42、維生素 C9-10、維生素 Ε0. 30-0. 31、D-泛酸鈣 0· 004-0. 005、葉酸 0· 062-0. 081、肌醇 0· 83-L 43 和生物素 0· 4-L 21。
5. 如權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中還包 括230-560重量份的補(bǔ)充因子組合物，所述補(bǔ)充因子組合物包括以下重量份的組分中的 一種或幾種：表皮生長(zhǎng)因子0. 025-0. 05、血清胺0. 06-0. 03、硫代甘油0. 00001-0. 0001、 乙醇胺3. 50-4. 50、羥丙基-B-環(huán)狀糊精235. 34-543. 12、谷胱甘肽0. 45-1. 26和卵磷脂 1. 25-2. 86〇
6. 如權(quán)利要求5所述的雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中還包括 1100-2500重量份的糖類物質(zhì)組合物，所述糖類物質(zhì)組合物包括以下重量份的組分中的一 種或幾種：果糖1000-2000和海藻糖100-500。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK104087558SQ201410322954
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】張春穎 申請(qǐng)人:西藏天虹科技股份有限責(zé)任公司