一株來源于反芻動物瘤胃的棉酚降解菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物領域，尤其是一株來源于反芻動物瘤胃的棉酚降解菌株及其應用，該菌株于2013年8月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No.8069。本發(fā)明以棉酚為唯一碳源，從反芻動物瘤胃中分離，篩選，純化和培育出對棉酚具有較高降解活性的新菌株，經形態(tài)學及分子生物學鑒定，確定菌株RBS為枯草桿菌屬(Bacillus subtilis)，與Bacillus tequilensis strain KM34同源性98％。該菌株來源于活體反芻動物瘤胃，避開了土壤或其他自然環(huán)境來源微生物毒理的不確定性，小鼠毒理試驗表明該菌不具有毒性。液態(tài)發(fā)酵降解棉酚率達94.74％，使用該菌種發(fā)酵棉粕，液相色譜(HPLC)測定其發(fā)酵后棉粕中游離棉酚降解率達到近80％。
CGMCC NO.8069
2013.08.23
【專利說明】一株來源于反芻動物瘤胃的棉酚降解菌株及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領域，尤其是一株來源于反芻動物瘤胃的棉酚降解菌株及其應用。

【背景技術】
[0002]隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，我國蛋白飼料的缺口日趨嚴峻。為此，需通過開發(fā)非常規(guī)性蛋白質飼料解決。棉柏因其蛋白含量達到44%而成為關注對象，其蛋白含量僅次于豆柏，我國每年棉柏產量約800萬噸，占國內蛋白飼料產量11%左右，但由于棉柏中抗營養(yǎng)因子的存在，特別是游離棉酚影響了其在單胃動物飼養(yǎng)中的廣泛使用。
[0003]棉酚(Gossypol)，俗稱棉毒素，是錦葵科棉屬植物色素腺體產生的多酚二萘衍生物，主要存在于棉花的根、莖、和籽實中。棉酚在棉柏中以結合和游離兩種形式存在，結合棉酚是指棉酚與氨基酸或其他物質的結合物，在動物體內不易被消化道吸收，可忽略其毒性。游離棉酚是指具有活性羥基和活性醛基棉酚這些含有活性基團的棉酚進入動物體內后形成鐵-棉酚和蛋白-棉酚化合物，是機體細胞，血管，神經性的毒物，最終危害動物的生產和生長,嚴重甚至會導致動物中毒死亡。
[0004]目前市場上脫毒工藝多樣，采用生物、物理、化學、水洗等方法的棉籽脫毒工藝相對于傳統(tǒng)工藝，脫毒效果不佳，而且成本太大，無法在飼料工業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)中普遍應用，未脫毒棉籽餅柏依然是主要的棉籽餅柏來源，存在安全風險。
[0005]為此，解決棉柏中游離棉酚問題是利用棉柏作為蛋白質飼料的根本所在。動物營養(yǎng)與飼料科學家正尋求能降低棉柏棉酚的毒性，以提高棉柏在單胃動物中的使用，使用生物方法降解棉酚是目前很熱門的研究方向之一。
[0006]自然環(huán)境中，如土壤中存在可以降解棉酚的微生物，但來源于土壤的微生物大部分不能確定其毒性，一般不能直接作為動物飼料添加劑使用。
[0007]棉籽餅柏在反芻動物飼料中應用最為廣泛，主要是由于反芻動物瘤胃內微生物的存在，微生物將棉柏中的游離棉酚轉化為無毒的代謝物。但是雖然反芻動物瘤胃具有解毒作用，使得游離棉酚對反芻動物的毒性較單胃動物小很多，反芻動物飼喂棉籽餅柏依然存在安全風險，生產實踐中也時常發(fā)生反芻動物棉酚中毒的例子。湖北省某奶牛場1991年春購回大批未脫殼、未去毒處理的棉籽餅，將乳牛混合飼料內的棉籽餅的比例由15%增加到20 %，飼喂40天使出生2?5天的犢牛發(fā)生棉籽餅中毒8例，死亡5例；黃克和等對上海及安徽省的全椒、和縣、來安和江蘇省的南通、海安、如東、海門、泅洪等地調查發(fā)現(xiàn)，這些地區(qū)均有因飼喂棉籽餅而引起尿石癥的病例。飼喂棉餅引起尿石癥的機理可能是因腎臟受棉酚的毒害發(fā)生炎癥，引起代謝障礙，從而為磷酸鹽的沉積提供了條件。一般認為，棉酚對反芻動物有毒性，雖然在瘤胃內的游離棉酚能與可溶性蛋白結合，減少進入腸道的游離棉酚，但仍有63%的棉酚通過瘤胃，結合的棉酚在十二指腸又被釋放，這就有可能使反芻動物攝入的棉酚像單胃動物一樣被吸收。
[0008]歐盟對反芻動物日糧中游離棉酚允許量，其成年牛、山羊、綿羊彡500mg/kg，犢牛(100mg/kg，其他不含棉籽餅柏飼料和配合飼料120mg/kg。美國針對反芻動物游離棉酚限量有著更詳細的規(guī)定:日糧中游離棉酚含量O?3周齡時為100mg/kg，3?24周齡時為200mg/kg,大于24周齡時母畜為600mg/kg,育種公畜為200mg/kg。
[0009]所以本試驗通過在反芻動物瘤胃中篩選菌種、選育，以期得到棉酚降解率更高的無毒菌株，為棉籽餅柏的廣泛安全使用提供基礎，為單胃動物及反芻動物的蛋白質飼料開辟新的來源。


【發(fā)明內容】

[0010]為克服現(xiàn)有技術的不足之處，本發(fā)明提供一株安全無毒、能夠充分降解棉酚的棉酹降解菌株(枯草桿菌屬，Bacillus subtilis),本發(fā)明另一目的是提供該棉酹降解菌株的應用。
[0011]本發(fā)明所采用的技術方案是:本發(fā)明所述的棉酚降解菌RBS，該菌株于2013年8月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCN0.8069。
[0012]所述棉酚降解菌RBS系從反芻動物瘤胃中分離，篩選，純化和培育出來，經形態(tài)學及分子生物學鑒定，確定該菌株為枯草桿菌屬，與Bacillus te-quilensis strain KM34同源性98%。
[0013]所述棉酚降解菌RBS主要形態(tài)學特性為:菌落粗糙，污白色，中心起褶皺，不易挑起；形狀不規(guī)則，有花瓣形，有近圓形；菌落正反面，中間邊緣顏色質地不一致。
[0014]有益效果:本發(fā)明以棉酚為唯一碳源，從反芻動物瘤胃中中分離篩選對棉酚具有降解作用的菌株，避開了土壤微生物來源的毒理不確定性，得到具有較高降解活性的菌株RBS，所述棉酚降解菌RBS在實驗室三角瓶培養(yǎng)條件下，對棉柏進行固態(tài)發(fā)酵，液相色譜(HPLC)測定發(fā)酵后棉柏中的游離棉酚降解率達到近85.25 %，該菌液態(tài)發(fā)酵，確定其對棉酚降解率達到94.74%。雖然該菌株來源于活體反芻動物瘤胃，避開了土壤或其他自然環(huán)境來源微生物毒理的不確定性，但為確保RBS菌株能在生產中應用，本試驗同時對該菌進行小鼠毒理試驗，結果表明該菌不具有毒性(如圖8、9所示)，屬于安全菌株。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]下面參照附圖結合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。
[0016]圖1A為棉酚降解細菌RBS菌落形態(tài)特征；
[0017]圖1B為棉酚降解細菌RBS顯微鏡形態(tài)特征；
[0018]圖1C為棉酚降解細菌RBS電子顯微鏡形態(tài)特征；
[0019]圖2棉酚降解菌RBS的PCR產物電泳圖譜；
[0020]圖3為棉酚降解菌RBS16S序列；
[0021 ]圖4為棉酚降解菌RBS的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0022]圖5為棉酚含量標準曲線；
[0023]圖6為液態(tài)發(fā)酵中棉酚降解菌RBS的生物量與棉酚降解率；
[0024]圖7A為棉柏發(fā)酵前游離棉酚含量色譜圖；
[0025]圖7B為棉柏發(fā)酵后游離棉酚含量色譜圖；
[0026]圖7C為棉柏發(fā)酵前后棉柏中游離棉酚含量；
[0027]圖8為棉酚降解菌RBS的毒理實驗報告第一頁；
[0028]圖9為棉酚降解菌RBS的毒理實驗報告第二頁。

【具體實施方式】
:
[0029]1.材料與方法
[0030]1.1 材料
[0031]瘤胃液取自于牛的胃液。LB培養(yǎng)基，無碳基礎培養(yǎng)基，無氮基礎培養(yǎng)基，棉酚基礎培養(yǎng)基在無碳培養(yǎng)基滅菌后，無菌條件下加入適量醋酸棉酚。
[0032]1.2 方法
[0033]1.2.1菌種篩選
[0034]從動物瘤胃中取樣，將Ig左右樣品在dd H20中稀釋，涂布在含有醋酸棉酚基礎培養(yǎng)基平板上，39°C恒溫培養(yǎng)24h。挑取單菌落，液體培養(yǎng)基中進一步分離，并在含有0.2%醋酸棉酚的無碳基礎培養(yǎng)基平板上反復篩選，直至菌落形態(tài)均一保種備用。
[0035]1.2.2形態(tài)學鑒定
[0036]采用稀釋平板法，培養(yǎng)適當時間獲得單菌落，觀察其菌落特征。再用平板劃線法培養(yǎng)6h后,通過革蘭氏染色，16 X 100倍顯微鏡下觀察。
[0037]1.2.3分子生物學鑒定
[0038]1.2.3.1細菌基因組DNA的提取
[0039]采用SDS蛋白酶K法，具體步驟如下:
[0040]I)取 1.5mL 菌液，1000g 離心 Imin,棄上清。
[0041]2)加40 μ L溶菌酶，80 μ L無菌水，渦旋振蕩混勻，37°C水浴30min。
[0042]3)加 150 μ LlO% ^ SDS 溶液，70 μ LlOmg.mL_l 蛋白酶 K，37°C水浴 30min。
[0043]4)轉入75°C水浴5min，加入5mol *L-1醋酸鉀溶液0.3mL,混勻，冰上放置30min，并不時混勻。
[0044]5) 1000g離心lOmin，將上清轉入一干凈無菌離心管，棄沉淀，重復操作。
[0045]6)將上清轉入另一干凈無菌離心管，加入兩倍體積的無水乙醇，1000g離心1min,加40 μ L TE緩沖液溶解。
[0046]1.2.3.2 16S rDNA 的擴增
[0047]PCR擴增，產物割膠回收，與pMD19-T Vecter連接及轉化參考。
[0048]1.2.3.3菌落PCR鑒定參照
[0049]1.2.3.4 16S rDNA序列測定與分析
[0050]菌落PCR陽性菌落轉接到LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12_15h后，送上海生工進行測序，將測序結果用b1edit去除載體序列后，登陸NCBI，應用Blast-N軟件進行同源搜索，并利用MEGA5.1建立同源對比進化樹。
[0051]1.2.4棉酚含量標準曲線繪制-間苯三酚法
[0052](I)棉酚標準容液的制備精密稱取0.0050g棉酚純品，用70%丙酮溶液溶解，并定容到50mL，此溶液相當于每毫升含棉酚0.1mg0
[0053](2)顯色劑配制:用10mL量筒量取16.6mL濃鹽酸(12.0mol.L-1)，加95%乙醇至10mL刻度，倒入10mL三角瓶中，搖勻，再加入Ig間苯三酚，溶解后混合置于棕色瓶中放入冰箱備用。
[0054](3)標準曲線的繪制:精密吸取 0mL、0.1mL,0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL棉酚標準液并依次編號為1_10號放入1mL試管中，再依次分別加入lmL、0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL、0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL 的 70%丙酮溶液，各試管中再加入2mL的顯色劑，搖勻，在55°C恒溫水浴箱中加熱5min，用70 %丙酮溶液調零，在550nm波長處測定吸光度值。
[0055]1.2.5生物量及降解率測定
[0056]將一環(huán)菌接于10mL的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h后作為種子液(冰箱保存)。取ImL種子液接入盛有40mL無碳基礎培養(yǎng)基(以0.2%醋酸棉酚為碳源)的容量為150mL三角瓶中，39 °C，150r.min-1振蕩培養(yǎng)，再12h后將另一組相同處理，兩組都每隔2h從中取出100 μ L樣品，涂于LB平板，再無菌水稀釋10倍，涂于LB平板，各連續(xù)測定12h，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察菌落數(shù)，將兩組數(shù)據(jù)連起來繪制生長曲線。
[0057]同時在每次取樣時取出300 μ L樣品，取樣時，確保搖勻，并用槍頭尖已剪掉的槍頭，使取樣盡量均勻。平行取3組樣品，各加入700 μ L丙酮，各加入2mL的顯色劑，搖勻，在55°C恒溫水浴箱中加熱5min，用70 %丙酮溶液調零，在550nm波長處測定吸光度值。記錄并根據(jù)棉酚標準曲線計算降解率，繪制降解率變化圖。
[0058]2.結果
[0059]2.1形態(tài)學鑒定
[0060]如圖1A所示，菌落粗糙，污白色，中心起褶皺，不易挑起。形狀不規(guī)則，有花瓣形，有近圓形。菌落正反面，中間邊緣顏色質地不一致。如圖1B所示，培養(yǎng)6h，革蘭氏染色程紫色，為革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀。圖1C為棉酚降解細菌RBS電子顯微鏡形態(tài)特征。根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》第九版，鑒定與枯草芽孢桿菌屬菌株形態(tài)相似。
[0061]2.2分子生物學鑒定
[0062]2.2.1基因組提取及PCR擴增結果
[0063]棉酚降解菌BS-1采用SDS蛋白酶K法提取效果較好，片段在23kb左右，質量較好，可以滿足PCR擴增要求。PCR擴增產物電泳結果如圖2所示，有一條大小約為1500bp的條帶，與預期擴增大小一致。
[0064]2.2.2序列分析
[0065]如圖3所示，所獲得的棉酚降解菌16S rDNA序列經測序后，與NCBI中相關數(shù)據(jù)庫進行相似性分析。其系統(tǒng)發(fā)育樹參見圖4,結果顯示,RBS與Bacillus tequilensis strainKM34同源性98%，推定BS-1屬于枯草芽孢桿菌。分子生物學鑒定結果與形態(tài)學觀察結果一致。
[0066]2.2.3棉酚標準曲線
[0067]根據(jù)棉酚含量與吸光度值進行回歸計算，得y = 17.520x+0.0068，并繪制標準曲線，如圖5所示。R2 = 0.9988，比較可信。
[0068]2.3.4生物量與降解率
[0069]如圖6所示，在棉酚液體培養(yǎng)基中，隨著菌體生物量的增加，降解率也不斷升高。在對數(shù)生長期菌體生物量增長最快，降解率也增加最快；而隨著生物量的減少，降解率增加速度變慢。生物量與降解率關系密切，最初40mL棉酚培養(yǎng)基中加入的80mg棉酚，培養(yǎng)24h后棉酚含量為11.8mg,即該菌株24h的棉酚最大降解率達94.7%。
[0070]如圖7A、圖7B和圖7C所示，液相色譜(HPLC)測定所述菌株發(fā)酵后棉柏中游離棉酚降解率達到近80%。
[0071]盡管已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。
【權利要求】
1.棉酚降解菌RBS，該菌株于2013年8月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.8069。
2.根據(jù)權利要求1所述的棉酚降解菌RBS在生物降解游離棉酚中的應用。
3.根據(jù)權利要求1所述的棉酚降解菌RBS在降低棉籽柏的游離棉酚含量中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK104328063SQ201410322736
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權日:2014年6月27日
【發(fā)明者】陳麗娟, 張云華, 陳迅, 程茂基, 孟秀麗, 蔡海瑩 申請人:安徽農業(yè)大學