本發(fā)明涉及神經細胞轉分化
技術領域：
，具體地，本發(fā)明主要涉及向細胞的基礎培養(yǎng)基中添加少量代血清添加劑、酪氨酸激酶類生長因子以及小分子化合物，獲得一種新型無血清培養(yǎng)基，以及使用該新型無血清培養(yǎng)基直接轉分化獲得神經細胞的方法。
背景技術：
：近幾十年以來，得益于小分子藥物的大力發(fā)展和廣泛應用，過去一些嚴重危害人類健康的疾病能夠得到很好的治療，人均壽命和身體素質都有了很大的飛躍。目前，危害人類健康的疾病的結構已經產生了變化：伴隨著衰老而來的一些慢性退行性疾病如帕金森綜合癥、阿爾茨海默病，糖尿病等逐漸成為危害現(xiàn)代人健康的疑難病癥。由于神經細胞的再生能力很差，神經退行性疾病(NeurodegenerativeDiseases)如帕金森病、阿爾茨海默病，以及神經系統(tǒng)損傷性疾病如脊髓損傷、腦損傷等已經成為危害人類健康的重要疾病類型之一。以阿爾茲海默病(Alzheimer’sDisease,AD,)為例：在歐美國家，每年因阿爾茲海默病死亡的人數約10萬，列于冠心病、癌癥和中風后，是第四大致死原因。在中國，對阿爾茲海默病的流行病學調查尚不完善，一般認為65歲以上人群中患病率約為4％，發(fā)病率為0.6～1.2％。隨著老齡化社會進程的加劇，預計到2050年我國阿爾茲海默病的患者將超過3000萬，預期醫(yī)療費用超過1萬億。針對阿爾茲海默病的發(fā)病機制研究者提出過多種理論，并研制出包括AChE抑制劑、膽堿前體等在內的多種藥物。不幸的是，雖然這些藥物可以改善患者膽堿能神經的功能障礙，但是并不能根治疾病。其他神經退行性疾病的治療中也有類似的困境。因此，在繼續(xù)研究這些神經退行性疾病的發(fā)病機理并開發(fā)新型小分子藥物的同時，也需要從其他新的角度(如以干細胞為基礎的再生醫(yī)學)為神經退行性疾病的治療開辟新的治療途徑。由于神經退行性疾病一般伴隨著大腦特定區(qū)域的遲發(fā)性神經細胞退行性病變、細胞丟失等特征，因此可以通過移植神經細胞來緩解癥狀或者治療疾病。但是，由于神經細胞的細胞結構相對復雜且亞型眾多，難以直接從體內分離神經細胞。即使成功分離出神經細胞，也一般不具備擴增能力，因此很難獲得足夠數量的神經細胞來開展移植實驗和治療。由于神經干細胞具有一定的自我增殖能力，并能夠分化為神經系統(tǒng)中主要類型的細胞，因此在神經退行性疾病的治療中可以發(fā)揮更有效的作用。目前，體內來源的神經干細胞在帕金森 病，脊髓損傷等疾病模型的治療中都取得了不錯的效果。美國的StemCells公司在瑞典獲得批準使用胎腦來源的神經干細胞進行脊髓損傷的I/II期臨床使用。NeuroGeneration公司獲得美國FDA批準利用病人自身的神經干細胞在體外進行培養(yǎng)后進行I/II期臨床實驗。然而，目前國際上用于臨床前研究的神經干細胞多是從流產胎兒的腦或脊髓中分離，涉及來源不足、倫理爭議及免疫排斥等問題，很難大面積推廣。因此，依耐體內獲得神經細胞的移植治療在很大程度上受限于細胞來源問題。干細胞領域的發(fā)展為人類治療疾病提供了一條新的途徑：從人體內分離出特定的細胞，在體外的一定條件下進行擴增和轉換為目的細胞，并在移植回體內后修復或者替換受損的組織和器官，從而達到疾病治療的目的(Li等，Howfarareinducedpluripotentstemcellsfromtheclinic？Ageingresearchreviews(2010)9(3):257-64；Grabel,Prospectsforpluripotentstemcelltherapies:intotheclinicandbacktothebench.JCellBiochem(2012)113(2):381-7)。研究者曾經計劃使用胚胎干細胞(ESCs)體外分化獲得神經干細胞或者神經細胞，但是由于胚胎干細胞來源不足、面臨倫理爭議、免疫排斥以及成瘤風險，這一計劃離實際應用有一段很大的距離。2006年誘導多能干細胞技術(iPS技術)的建立，使來源不足、倫理爭議以及免疫排斥等問題都在很大程度上都得到了解決(Takahashi等，Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell(2006)126(4):663-76)。而2010年神經轉分化技術的建立則可以有效規(guī)避成瘤性風險(Vierbuchen等，Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.Nature(2010)463(7284):1035-41)。這樣，以干細胞為基礎的再生醫(yī)學有望成為治療部分疾病尤其是神經退行性疾病的重要手段。綜上所述，體外獲得神經細胞或者神經干細胞有兩種途徑：1)利用iPS技術將體細胞變?yōu)槎嗄芨杉毎?，再通過定向分化獲得神經細胞或者神經干細胞；2)直接利用轉分化技術從體細胞出發(fā)獲得神經細胞或者神經干細胞。早在1973年，Eguchi和Okada就提出了轉分化(transdifferentiation)的概念，其是指一種分化完全的細胞丟失其原有表型而轉變?yōu)槠渌愋图毎默F(xiàn)象。此后，不同的細胞類型轉換被科學家發(fā)現(xiàn)或者實現(xiàn)：胚胎成纖維細胞轉換成具有收縮特性的肌細胞，在成年蠑螈四肢再生過程中，皮膚、肌肉和軟骨細胞先轉換為祖細胞，B淋巴細胞轉換為巨噬細胞，耳蝸細胞轉換成功能性的聽覺細胞(Izumikawa等AuditoryhaircellreplacementandhearingimprovementbyAtoh1genetherapyindeafmammals.Journal(2005)11(Issue):271-6.)。2008年，Zhou等以Ngn3，Pdx1和Mafa三個因子為主的誘導體系可將20％的胰島外分泌細胞轉化為類似于β-胰島細胞的細胞。在神經轉 分化方面，國內外也已經取得了一定的研究進展：2010年，美國科學家成功將小鼠成纖維細胞誘導成為神經細胞(Vierbuchen等，Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.Nature(2010)463(7284):1035-41)。隨后，將不同體細胞誘導成為神經細胞以及神經干細胞的技術也逐漸建立了起來(Sheng等，DirectreprogrammingofSertolicellsintomultipotentneuralstemcellsbydefinedfactors.CellRes(2011)22(1):208-18；Wang等，Generationofintegration-freeneuralprogenitorcellsfromcellsinhumanurine.Natmethods(2012)10(1):84-89)。雖然通過轉分化獲得神經元/神經干細胞的方法相比于采用ES/iPS細胞體外分化來說能夠一定程度上規(guī)避成瘤風險，且在獲得目標細胞的周期上會更短，但是，目前大部分的轉分化方法也同樣需要借助于在細胞內過表達某幾個轉錄因子而實現(xiàn)，這需要借助于病毒載體等來實現(xiàn)，因此引入了安全性問題，離實際臨床應用仍然有一定的距離。如果能通過化學小分子或其他無需向細胞內導入基因的方法來實現(xiàn)轉分化，則以上問題能夠得到解決。2012年，我國科學家利用附加體(episomal)在人尿液細胞中導入多個因子，獲得了無基因組整合的神經前體細胞。2014年，我國科學家利用小分子化合物以及低氧環(huán)境直接將小鼠和人類的體細胞轉分化成為神經干細胞(Cheng等,Generationofneuralprogenitorcellsbychemicalcocktailsandhypoxia.CellRes(2014)24(6):665-79)，在這方面取得了重要突破。然而，通過以上兩種方法轉分化獲得的神經干細胞都面臨著兩大問題：其一，效率較低或獲得的神經干細胞難以純化，例如采用小分子加低氧環(huán)境誘導而來的神經干細胞需要在體外多次傳代才能得以純化和穩(wěn)定。其二，所需的周期還是較長。另外，從安全性上考慮，通過神經干細胞的移植來治療神經系統(tǒng)疾病是否具有致瘤性還并沒有被完全確定。針對利用轉分化技術獲得神經細胞中出現(xiàn)的種種問題，在本發(fā)明中，向基礎的細胞培養(yǎng)基中添加加少量酪氨酸激酶類生長因子以及小分子化合物，我們實現(xiàn)不同種屬的不同類型細胞向神經元的轉分化，得到的神經元可以表達神經特異性標記蛋白β-tublinⅢ，GABA，Glutamate等。該方法不需要借助外源轉錄因子的高表達，有效地避免了轉分化過程對于基因組產生的影響，并且我們的方法是目前所有報道中實驗周期最短的之一。本方法能夠直接獲得沒有增殖能力的神經元，因此沒有致瘤性的安全考慮。該方法能夠在體外更加安全快速的獲得神經元，為今后神經系統(tǒng)疾病的臨床治療提供技術支撐。技術實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的之一是提供一種用于將不同來源的體細胞或者成體干細胞直接轉分化成 為神經細胞的無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明的目的之二是提供一種利用該無血清培養(yǎng)基直接轉分化獲得神經細胞的方法。本發(fā)明采用的技術方案為：一種用于將不同來源的體細胞或者成體干細胞直接轉分化成為神經細胞的無血清培養(yǎng)基，該無血清培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基、代血清添加劑、酪氨酸激酶類生長因子以及小分子化合物；所述代血清添加劑包括N2和/或B27，所述酪氨酸激酶類生長因子包括bFGF和/或EGF，所述小分子化合物包括維生素C。其中所述基礎培養(yǎng)基為Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM),MinimalEssentialMedium(MEM),BasalMediumEagle(BME),F-10,F-12,RPMI1640,Glasgow’sMinimalEssentialMedium(GMEM),αMinimalEssentialMedium(αMEM),Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium中的一種或兩種以上的混合物。優(yōu)選地，所述基礎培養(yǎng)基為DMEM和F12的混合物，更優(yōu)選地，所述基礎培養(yǎng)基為DMEM和F12體積比為1:1的混合物。所述代血清添加劑為N2、B27、或者是N2和B27的混合物；優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中N2的濃度在0％-1％之間，B27的濃度在0％-2％之間，但N2、B27不同時為零；更優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中N2的濃度為1％,不包含B27。％均指體積濃度。(其中，N2為Gibco公司生產的17502-048(貨號)或者同等產品；B27為Gibco公司生產的17504-044(貨號)或者同等產品。)所述酪氨酸激酶類生長因子為bFGF，EGF，或者是bFGF和EGF的混合物；優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中bFGF的濃度在0-40ng/ml之間，EGF的濃度在0-40ng/ml之間，但bFGF、EGF不同時為零；更優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中bFGF的濃度為20ng/ml，不包含EGF。所述小分子化合物為維生素C；優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中，維生素C的濃度在10-200μg/ml之間；更優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中維生素C的濃度為50μg/ml。所述培養(yǎng)基還包含適于細胞生長的其它組分，其中其它組分選自L-谷氨酰胺、NEAA，丙酮酸鈉和2-巰基乙醇中的一種或兩種以上的組合。如NEAA(100X)，GlutaMax(100X)，2-巰基乙醇(終濃度0.1mM)。本發(fā)明還提供了上述無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：將上述配置培養(yǎng)基所需的代血清添加劑、酪氨酸激酶類生長因子、小分子化合物以及適于細胞生長的其它組分分別加入基礎培養(yǎng)基中，顛倒混合均勻，同時避免產生大量泡沫(對于不同組分的加入順序等沒有要求，只是簡單的混合)，配置好的培養(yǎng)基于4℃保存， 可穩(wěn)定保存2周。其中N2、B27在配置培養(yǎng)基之前應保存在-20℃，具體保存方式參見產品說明書。其中小分子化合物為維生素C易發(fā)生氧化，應先將粉末配置成高濃度的儲存液(例如100mg/mL)，并分裝保存于-20℃。其中酪氨酸激酶類生長因子也應配置為高濃度儲存液分裝保存于-20℃，并避免反復凍融。本發(fā)明還提供了將不同來源的體細胞或者成體干細胞直接轉分化成為神經細胞的方法，包括如下步驟：(a)準備不同來源的體細胞或者成體干細胞；(b)用上述的無血清培養(yǎng)基，在適合于細胞生長的條件下，培養(yǎng)步驟(a)中的細胞，以獲得神經細胞；(c)檢測并且分析經誘導獲得的神經細胞；(d)于神經細胞生長的條件下繼續(xù)培養(yǎng)步驟(c)中的神經細胞。上述方法中，所述體細胞或者成體干細胞來源于人、大鼠或小鼠。上述方法中，所述體細胞為成纖維細胞、神經膠質細胞。上述方法中，所述成體干細胞為間充質干細胞。上述方法中，所述步驟(c)中檢測并且分析經誘導獲得的神經細胞包括，免疫熒光或者流式細胞分選確定在獲得細胞中一個或者多個神經細胞標志物(TuJ，MAP2，NeuN等)的表達。本發(fā)明所具有的有益效果：利用本發(fā)明制得的無血清培養(yǎng)基可以在不借助外源性轉錄因子高表達的條件下，將不同來源的體細胞或者成體干細胞直接轉分化為神經細胞。附圖說明圖1：在利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞16天后，利用免疫熒光染色確定這些細胞表達神經細胞標志物(TuJ，GABA，Glutamate)的情況，DAPI用于標記細胞核，從而確定轉分化的成功。圖2：在利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠神經膠質細胞16天后，利用免疫熒光染色確定這些細胞表達神經細胞標志物(TuJ，Map2)的情況，DAPI用于標記細胞核，從而確定轉分化的成功。圖3：在利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人類骨髓來源的間充質干細胞16天后，利用免疫熒光染色確定這些細胞表達神經細胞標志物(TuJ)的情況，DAPI用于標記細胞核， 從而確定轉分化的成功。圖4：在利用最優(yōu)化的和多種非最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞16天后，利用流式細胞分選確定這些細胞表達神經細胞標志物(TuJ)的細胞的比例。定義和技術1.除非另外指明，本發(fā)明的實踐將使用分子生物學、微生物學、細胞生物學、免疫學和重組DNA的傳統(tǒng)技術，其屬于本領域技術范圍。參見例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實驗指南，第3版(2002)；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人編著(1987))；叢書METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress，Inc.)：PCR2：APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編著，(1995))，Harlow和Lane編著，(1988)ANTIBODIES，ALABORATORYMANUALandANIMALCELLCULTURE(R.I.Freshney編著，(1987))；W.FrenchAnderson等人，HANDBOOKOFSTEMCELLS，卷2。2.除非另外說明，本文中所用的術語均具有本領域技術人員常規(guī)理解的含義，為了便于理解本發(fā)明，將本文中使用的一些術語進行了下述定義。3.所有的數字標識，例如pH、溫度、時間和濃度，包括范圍，都是近似值。要了解，雖然不總是明確的敘述所有的數字標識之前都加上術語“約”。也要了解，雖然不總是明確的敘述，本文中描述的試劑僅僅是示例，其等價物是本領域已知的。4.本發(fā)明所用的術語“基礎培養(yǎng)基”是指任何能夠支持細胞生長的培養(yǎng)基。基礎培養(yǎng)基提供了標準的無機鹽例如鋅、鐵、鎂、鈣和鉀，以及維生素、葡萄糖、緩沖系統(tǒng)以及關鍵的氨基酸?？梢杂糜诒景l(fā)明的基礎培養(yǎng)基包括但不限于Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM)、MinimalEssentialMedium(MEM)、BasalMediumEagle(BME)、RPMI1640、F-10、F-12、αMinimalEssentialMedium(αMEM)、Glasgow’sMinimalEssentialMedium(G-MEM)、以及Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium。本領域的技術人員已知如何選擇適用于所培養(yǎng)的細胞的基礎培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實施方案中，基礎培養(yǎng)基是DMEM與F12的混合物。在更優(yōu)選的實施方案中，基礎培養(yǎng)基是DMEM與F12體積比1:1的混合物。5.本發(fā)明所用的術語“代血清添加劑”是指在細胞培養(yǎng)中，用于加入到基礎培養(yǎng)基中，以部分或全部替代血清在支持細胞生存生長作用方面作用的添加劑，一般包括胰島素、轉金屬蛋白、微量元素、維生素等因子，這些因子一般并不包含于基礎培養(yǎng)基中，而是由通常培養(yǎng)細胞使用的血清所提供。代血清添加劑包含支持細胞生長的至少一種或多種以下組 分：一個或多個胰島素及胰島素替代物、一個或多個轉金屬蛋白及轉金屬蛋白替代物、一個或多個微量元素、一個或多個維生素、一個或多個氨基酸、一個或多個激素及類激素化合物、血清白蛋白或血清白蛋白替代物、以及一個或多個脂類等。已知多種商業(yè)化的代血清添加劑，例如KonckOutSerumReplacement(KOSR)，N2，B27，Insulin-Transferrin-SeleniumSupplement(ITS)，G5等，這是本領域技術人員容易獲得的。優(yōu)選地，本文中所用的代血清添加劑由N2和/或B27按一定比例混合得到的混合添加劑，更優(yōu)選地，最終培養(yǎng)基中N2的濃度從0％到1％，B27的濃度在0％-2％之間；最優(yōu)選的方案是在最終培養(yǎng)基中N2的濃度為1％。6.本發(fā)明所用的酪氨酸激酶類生長因子包括所有的已經鑒定出的以及將來即將鑒定出的具有受體酪氨酸激酶性質的酪氨酸激酶類生長因子。優(yōu)選地，本文中所用的酪氨酸激酶類生長因子由bFGF和/或EGF按一定比例混合得到的混合添加劑，更優(yōu)選地，最終培養(yǎng)基中bFGF的濃度在0-40ng/ml之間，EGF的濃度在0-40ng/ml之間；最優(yōu)選的方案是在最終培養(yǎng)基中bFGF的濃度為20ng/ml。7.本文所用的小分子化合物是指維生素C。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，優(yōu)選培養(yǎng)基中添加的維生素C的濃度可以在10-200μg/ml之間，更優(yōu)選在大約50μg/ml。8.根據本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基是通過本領域技術人員已知的常規(guī)技術制備的，如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實驗指南，第3版(2002)中所述的混合配制血清的技術和條件。9.本文中所用的術語“體細胞”是相對于“生殖細胞”以及“胚胎干細胞”而言的概念，其是由“胚胎干細胞”分化或內細胞團繼續(xù)發(fā)育產生的不再具備多能性，一般具有具體功能的細胞，其一般從發(fā)育階段位于囊胚期(在小鼠中具體為受精后3.5天)之后的胎鼠或成鼠取材，取材時一般避免取到可能具有多能性的生殖細胞及其來源(如精原干細胞、生殖嵴干細胞等)。本文中所用的體細胞優(yōu)選來源于人、大鼠或小鼠，更優(yōu)選地，來源于小鼠。本文中的體細胞可以是機體內任何類型的體細胞，優(yōu)選為成纖維細胞、神經膠質細胞。10.本文中所用的術語“成體干細胞”是相對于“體細胞”以及“胚胎干細胞”而言的概念，其是由“胚胎干細胞”分化或內細胞團繼續(xù)發(fā)育產生的具備一定的分化潛能的細胞。其相對于“胚胎干細胞”來說多能性和分化潛能比較低，相對于“體細胞”而言則具有其所沒有的分化能力?！俺审w干細胞”一般從成年個體取材。本文中所用的成體干細胞優(yōu)選來源于人、大鼠或小鼠，更優(yōu)選地來源于人。本文中的成體干細胞可以是機體內任何類型的成體干細胞，優(yōu)選為間充質干細胞。11.本文所述的術語“轉分化”(有時也稱為“重編程”)是指一種分化完全的細胞丟失其原有表型而轉變?yōu)槠渌愋图毎默F(xiàn)象，且這一轉變不經過多能干細胞的中間過程。在本發(fā)明中，“轉分化”指將不同來源的體細胞或者成體干細胞轉變?yōu)樯窠浖毎倪^程。優(yōu)選為將成纖維細胞、神經膠質細胞以及間充質干細胞轉變?yōu)樯窠浖毎?。更?yōu)選為小鼠胚胎成纖維細胞、大鼠神經膠質細胞以及人類骨髓來源間充質干細胞轉變?yōu)樯窠浖毎?。最?yōu)選為小鼠胚胎成纖維細胞。12.本文所述的“適宜細胞生長的條件”是本領域的常規(guī)干細胞培養(yǎng)條件，并且包括一些適宜各個具體細胞系，但是不影響細胞基本性質的修飾，培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)條件參見W.FrenchAnderson等人，HANDBOOKOFSTEMCELLS，卷2。13.本文所述的檢測神經細胞的方法是本領域技術人員熟知的，參見例如Vierbuchen等，Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.Nature(2010)463(7284):1035-41)等。所述方法包括免疫熒光染色、流式細胞分選和電生理測試等。14.除了特別說明,本文中提及的各種試劑均來自英杰生命科學公司(Invitrogen)或者西格瑪公司(Sigma)。具體實施方式下列實施例舉例了發(fā)明人的標準實驗室實踐，用于示例本發(fā)明的模式，而不應將本發(fā)明理解為限定于這些實施例的范圍。這些實施例根據本文公開和本領域技術人員的普遍水平，技術人員將理解下列僅用于示例，可以在不超過本發(fā)明的范圍內進行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術，除非特別說明，均是本領域技術人員熟知的分子生物學、細胞生物學、生物化學等各個領域的常規(guī)技術。本發(fā)明中所用技術概述：1.小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的分離與培養(yǎng)取孕齡13-14天的小鼠，頸椎脫臼處死，浸泡在0.5％新潔爾滅中30s，取出后，將其固定在無菌的鋪有吸水紙的解剖盤上，腹面向上。用75％的乙醇清潔孕鼠腹部，防止腹毛黏附在子宮及其他腹腔臟器上，造成污染。用無菌手術器械剖開孕鼠腹部皮膚層，肌肉層，暴露小鼠腹腔。用新的無菌手術器械去除黏連到子宮上的脂肪和結締組織，迅速將小鼠子宮取出。將其放入預裝有含雙抗的PBS的10cm培養(yǎng)皿中。在超凈工作臺內，用含雙抗的PBS洗滌小鼠子宮3次。用無菌眼科剪剪開包膜，將小鼠胚胎與胚外組織分離，將胚胎放置于新的預裝有含雙抗PBS的10cm培養(yǎng)皿中。用彎頭眼科剪將小鼠胚胎剪至1-3mm3大小。向培養(yǎng)皿中加入適量0.25％和0.05％混合的胰蛋白酶，37℃條件下，消化10min，至溶液變 渾濁，加入等體積MEF細胞培養(yǎng)基，終止消化。輕輕吹打混勻5-10次，靜置。將細胞懸液轉移至50ml離心管中，200g，離心5min。棄上清，向沉淀中加入MEF細胞培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸，將細胞分種到15cm培養(yǎng)皿中，補充適量培養(yǎng)基，混勻，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。于第二天，觀察細胞狀態(tài)，更換新鮮培養(yǎng)基，標記細胞代數為P0。MEF細胞培養(yǎng)基(500ml)包含：高糖DMEM培養(yǎng)基430ml，F(xiàn)BS60ml，GlutaMax和NEAA各5ml。2.MEF細胞凍存吸棄培養(yǎng)基，用DPBS洗滌細胞一次，加入適量0.25％胰蛋白酶，37℃條件下消化1-2min，加入等量MEF細胞培養(yǎng)基，終止消化。用巴氏吸管吹散細胞，將細胞懸液轉移至15ml離心管中，200g離心5min。棄上清，用MEF細胞培養(yǎng)基重懸細胞，吸取少量細胞進行計數，其余細胞重新離心。配置凍存液，凍存液成分為，10％DMSO+90％FBS。用凍存液重懸細胞，調整細胞濃度至3×106個/ml，每只凍存管加入0.5ml細胞懸液，標記凍存細胞名稱，代數及凍存時間。將凍存管放入程序降溫盒中，放于-80℃冰箱中進行過夜凍存。于第二天將凍存管取出，放入液氮中進行長期低溫保存。3.MEF細胞轉分化從液氮管中取出凍存管，于37℃水浴快速振蕩解凍，解凍后，用吸水紙擦去水滴。用75％酒精對凍存管外壁進行消毒后放入生物安全柜，于生物安全柜內吸取細胞懸液加入到15ml離心管中。逐滴加入MEF細胞培養(yǎng)液6ml，邊加邊振蕩，200g，離心5min。棄上清，加入MEF培養(yǎng)基重懸，并將細胞轉移到培養(yǎng)皿中，搖動鋪勻后，與37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，待細胞長滿10cm培養(yǎng)皿80％時傳代培養(yǎng)。將于BD公司購買的Matrigel于冰上放置，低溫解凍。待解凍后，分裝Matrigel至無菌EP管中，280ul/支，于-80℃條件下保存。使用時，將EP管于-80℃中取出，于冰上解凍，解凍時間約為30-50min。待Matrigel解凍后，取45ml4℃預冷的F12培養(yǎng)基，從中取少量加入到EP管中，反復吹打，吹打次數約為50次，將280ulMatrigel充分溶于45mlF12培養(yǎng)基中，放于4℃保存，待用。使用時，在細胞培養(yǎng)板中加入Matrigel，覆蓋培養(yǎng)板底部，置于37℃條件下30min以上。吸棄培養(yǎng)基，用DPBS洗滌細胞一次，加入1ml0.25％胰蛋白酶，37℃條件下消化3min，加入2mlMEF細胞培養(yǎng)基，終止消化。用巴氏吸管吹散細胞，將細胞懸液轉移至15ml離心管中，200g離心5min。棄上清，用MEF細胞培養(yǎng)基重懸細胞，細胞計數，并調整細胞 濃度。對于24孔板，每孔種MEF細胞1×104個，6孔板每孔種細胞5×104至8×104個，待細胞貼壁完全后(12-24小時)，更換本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基，此時標記天數為D0。利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞16天，每天觀察細胞狀態(tài)，拍攝明場照片，記錄細胞形變情況。每48小時更換一次新鮮的無血清培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基前需提前將培養(yǎng)基置于室溫進行預熱。記錄培養(yǎng)天數，培養(yǎng)天數為D0至D16。4.免疫熒光染色鑒定神經細胞將處理過的蓋玻片取出，于超凈工作臺內，用酒精燈點燃蓋玻片上的殘余無水乙醇，進行輕度灼燒滅菌。將蓋玻片方置于在24孔板中。將Matrigel鋪于蓋玻片上，并將MEF細胞接種于蓋玻片上。按照上述方法進行接種和培養(yǎng)，于D24取出24孔板。用PBS洗滌細胞一次，吸棄PBS，加入4％多聚甲醛進行固定，室溫固定30min。固定結束后，用PBS洗滌3次，每次5min。利用0.3％Triton-X100(PBS配置)進行通透，室溫通透20min。通透結束后，加入3％BSA(PBS配置)溶液室溫封閉2h，PBS洗滌3次，每次5min。封閉結束后。向蓋玻片中滴加一抗(稀釋比例按照抗體說明書所提供，PBS+1％BSA稀釋)200ul，4℃孵育過夜。用PBS洗滌3次，每次5min，洗去殘余一抗。加入二抗(Invitrogen1：400稀釋，PBS稀釋)200ul，避光，室溫孵育1h。用PBS洗滌三次，每次5min，洗去殘余二抗。加入DAPI(終濃度為1μg/ml，PBS稀釋)染液，對細胞核進行染色，避光，室溫5min，PBS洗滌三次，每次5min。洗去殘余DAPI后，用封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。大鼠神經膠質細胞、人類骨髓來源的間充質干細胞的分離與培養(yǎng)、細胞凍存，轉分化為本領域已知的常規(guī)技術，在此不再具體說明。實施例1：利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基實現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細胞向神經細胞的轉分化。如前所述，一種無血清培養(yǎng)基(最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基)，以DMEM和F12混合培養(yǎng)基(體積比1：1)為基礎，添加：N2(終濃度1％(體積))，bFGF(終濃度20ng/ml)，維生素C(終濃度50μg/ml)以及細胞培養(yǎng)輔助成分：NEAA(100X)，GlutaMax(100X)，2-巰基乙醇(終濃度0.1mM)制得。在利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞16天之后，利用免疫熒光的方法可以發(fā)現(xiàn)獲得表達神經細胞標志物的神經細胞。如圖1所示，利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞后所獲得細胞可以表達包括TuJ，GABA以及Glutamate在內的神經細胞標志物。實施例2：利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基可以實現(xiàn)大鼠神經膠質細胞向神經細胞的轉分化。如前所述，最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基以DMEM和F12混合培養(yǎng)基(體積比1：1)為基礎，添加：N2(終濃度1％(體積))，bFGF(終濃度20ng/ml)，維生素C(終濃度50μg/ml)以及細胞培養(yǎng)輔助成分：NEAA(100X)，GlutaMax(100X)，2-巰基乙醇(終濃度0.1mM)。在利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠神經膠質細胞16天之后，利用免疫熒光的方法可以發(fā)現(xiàn)獲得表達神經細胞標志物的神經細胞。如圖2所示，利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠神經膠質細胞后所獲得細胞可以表達包括TuJ和MAP2在內的神經細胞標志物。實施例3：利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基可以實現(xiàn)人類骨髓來源的間充質干細胞向神經細胞的轉分化。如前所述，最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基以DMEM和F12和混合培養(yǎng)基(體積比1：1)為基礎，添加：N2(終濃度1％(體積))，bFGF(終濃度20ng/ml)，維生素C(終濃度50μg/ml)以及細胞培養(yǎng)輔助成分：NEAA(100X)，GlutaMax(100X)，2-巰基乙醇(終濃度0.1mM)。在利用最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人類骨髓來源的間充質干細胞16天之后，利用免疫熒光的方法可以發(fā)現(xiàn)獲得表達神經細胞標志物的神經細胞。如圖3所示，利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人類骨髓來源的間充質干細胞后所獲得細胞可以表達包括TuJ在內的神經細胞標志物。實施例4：利用非最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基實現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細胞向神經細胞的轉分化。如前所述，非最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基以DMEM和F12和混合培養(yǎng)基(1：1)為基礎，添加不同濃度的N2、B27、bFGF、EGF、維生素C。在利用非最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞16天之后，利用流式細胞分選的方法確定細胞中表達神經細胞標志物(TuJ)的比例。其中，非最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基組成如下表：N2B27bFGFEGF維生素C最優(yōu)化1％0％20ng/ml0ng/ml50μg/ml10％2％20ng/ml0ng/ml50μg/ml21％1％20ng/ml0ng/ml50μg/ml31％0％0ng/ml20ng/ml50μg/ml41％0％10ng/ml20ng/ml50μg/ml51％0％20ng/ml0ng/ml10μg/ml61％0％20ng/ml0ng/ml20μg/ml71％0％20ng/ml0ng/ml100μg/ml81％0％20ng/ml0ng/ml200μg/ml如圖4所示，最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基獲得表達神經細胞標志物(TuJ)的細胞的比例最高，但是非最優(yōu)化的無血清培養(yǎng)基也可以獲得表達神經細胞標志物(TuJ)的細胞。當前第1頁1 2 3