本發(fā)明屬于細胞生物學和醫(yī)藥領域領域，具體而言，本發(fā)明涉及澳洲茄胺衍生物的新用途。本發(fā)明還涉及相應的藥物組合物及其應用方法。
背景技術：
腫瘤是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，導致其克隆性異常增生而形成的異常病變。我國的腫瘤病例數相當龐大，有資料顯示占全世界病例數的55％。
良性腫瘤對機體的影響較小，主要表現為局部壓迫和阻塞癥狀。惡性腫瘤由于分化不成熟、生長較快，浸潤破壞器官的結構和功能，并可發(fā)生轉移，因而對機體影響嚴重。惡性腫瘤除可引起與上述良性腫瘤相似的局部壓迫和阻塞癥狀外，還可有發(fā)熱、頑固性疼痛，晚期可出現嚴重消瘦、乏力、貧血和全身衰竭的狀態(tài)。
中醫(yī)認為，癌癥的起因首先是人體內陰陽平衡，組織細胞在不同的致癌因素長期作用下，細胞突變而引起的。其實癌組織也是人體的一部分，只有在人本陰陽平衡失調，五行生克乘侮發(fā)生變化的前提下，人體的免疫監(jiān)控系統才會對其失去監(jiān)控，任其發(fā)展。中草藥能夠以調理氣血、調整陰陽平衡、維持正常生命體征而保命；以培補正氣、產生抗體，清理"毒源"而治本。因而，中草藥提取物成為治療腫瘤一個重要方向。
澳洲茄胺衍生物是天然產物，生物利用度高、性質比較穩(wěn)定,具有臨床使用價值。隨著人們對其的化學和生物學研究的深入,其分子作用機制將逐步明確,這將進一步推動此類化合物的化學結構修飾和構效關系研究,并有助于提高相關中草藥的藥用價值。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是提供式Ⅰ結構的澳洲茄胺衍生物的新的藥物用途。
本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤藥物增敏劑。
一方面，本發(fā)明提供了澳洲茄胺衍生物在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應用。其中，澳洲茄胺衍生物結構如式1所示。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、結腸癌或胰腺癌。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
澳洲茄胺衍生物可以作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑。
另一方面，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤藥物組合物，所述的抗腫瘤藥物組合物的有效成分是抗腫瘤藥物和澳洲茄胺衍生物。
所述的抗腫瘤藥物是細胞周期特異性藥物或者細胞周期非特異性藥物。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
本發(fā)明還提供了一種抑制體外腫瘤細胞生長增殖的方法，即在腫瘤細胞的培養(yǎng)基中加入澳洲茄胺衍生物和抗腫瘤藥物。
其中，加入澳洲茄胺衍生物的終濃度為1-20μmol/L。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌或者胰腺癌。
實施上述方法時，先加入澳洲茄胺衍生物，然后加入抗腫瘤藥物。也可以同時加入澳洲茄胺衍生物和抗腫瘤藥物。
本發(fā)明提供了澳洲茄胺衍生物的新用途，即其在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應用。澳洲茄胺衍生物是天然產物，具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的作用，可以作為腫瘤多藥耐藥的逆轉劑；澳洲茄胺衍生物還具有增加腫瘤多藥耐藥細胞對抗腫瘤藥物敏感性的作用，可以作為化療增敏劑使用。本發(fā)明中的小分子化合物澳洲茄胺衍生物作為新的抗腫瘤藥物或者其輔助成分進行開發(fā)，抑瘤效果明顯，綠 色環(huán)保，將為治療和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
具體實施方式
本發(fā)明提供了澳洲茄胺衍生物在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應用。其中，澳洲茄胺衍生物結構如式1所示。
本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工化學合成的方法。也可以從市售獲得。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、結腸癌或胰腺癌。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
澳洲茄胺衍生物可以作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑。
澳洲茄胺衍生物和抗腫瘤藥物可以構成抗腫瘤藥物組合物。
所述的抗腫瘤藥物是細胞周期特異性藥物或者細胞周期非特異性藥物。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與澳洲茄胺衍生物發(fā)生相互作用的物質，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)：肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。
以本發(fā)明的澳洲茄胺衍生物為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的澳洲茄胺衍生物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的澳洲茄胺衍生物還可與其他治療劑一起使用。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、 病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
本發(fā)明還提供了一種抑制體外腫瘤細胞生長增殖的方法，即在腫瘤細胞的培養(yǎng)基中加入澳洲茄胺衍生物和抗腫瘤藥物。
其中，加入澳洲茄胺衍生物的終濃度為1-20μmol/L。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌或者胰腺癌。
實施上述方法時，先加入澳洲茄胺衍生物，然后加入抗腫瘤藥物。也可以同時加入澳洲茄胺衍生物和抗腫瘤藥物。
實驗方法：
1.細胞復蘇
1)從液氮罐中取出凍存管，直接投入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
2)從37℃水浴中取出凍存管，用吸管吸出細胞懸液，注入離心管并加入10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，棄上清，再重復用培養(yǎng)液洗一次。
3)用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至一定濃度時進行傳代。PANC-1細胞培養(yǎng)在含10％Gibico胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中；K562、HGC、QGY、MCF-7、PC-3等細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，SK-hep1、HeLa、HepG2、等細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。
2.細胞傳代培養(yǎng)
每天觀察細胞生長的情況，當細胞在培養(yǎng)瓶中長至約90％匯合時傳代，約每隔2-4天傳代一次。一瓶傳代成三瓶，或一個25cm2傳代于一個75cm2的培養(yǎng)瓶中。方法：
1)用1×磷酸緩沖液洗滌細胞一次。
2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培養(yǎng)箱中數分鐘。用手拍打細胞培養(yǎng)瓶，使細胞分離。
3)用含10-15％的Gibico胎牛血清的合適培養(yǎng)基終止胰酶消化。將細胞分裝于新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。
懸浮細胞傳代時，直接收集于離心管中離心，棄舊培養(yǎng)基。一般一瓶傳代成三瓶的比例分裝于新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
3.細胞凍存
1)取培養(yǎng)至對數生長期的細胞胰蛋白酶消化，收集于離心管中并計數，離心。
2)棄除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配置好的凍存培養(yǎng)液(含10％DMSO，40％DMEM和50％Gibico胎牛血清)，凍存液中細胞的最終濃度為0.5-1×107/ml。用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后分裝入無菌凍存管中，每管加1-1.5ml。
3)將凍存管放入凍存盒置-80℃速凍，5小時后移入液氮罐中保存。
4.實驗材料
藥物準備：
澳洲茄胺衍生物溶于DMSO(二甲基亞砜),配制成100mM或50mM的母液備用。
澳洲茄胺衍生物可從上海遠慕生物科技有限公司購買，其結構如式1所示。
維拉帕米(VPL)、長春新堿(VCR)和阿霉素(ADR)購自羅氏化學公司，純度都大于99％。
細胞來源:
人口腔癌細胞株KB及其耐藥細胞株KB/VCR由中科院藥物所提供，人乳腺癌細胞株MCF-7及其耐藥細胞株MCF-7/ADR，人結腸癌HCT-8及其耐藥細胞株HCT-8/VCR均購自南京凱基生物公司。
試劑盒:
CCK-8試劑盒購自同仁公司。
CCK-8實驗
KB和KB/VCR細胞以及MCF-7和MCF-7/ADR細胞都按照3500/孔的密度接種到96孔板中，24h后不同濃度的ADR，VCR，澳洲茄胺衍生物以及VCR和澳洲茄胺衍生物一起用含10％胎牛血清的α-MEM配好后被加到各個孔中。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入90μL不含血清的培養(yǎng)基和10μL CCK-8試劑。37℃反應2h后，酶標儀讀取450nm波長的吸光值(OD450)。通過計算得到用藥組相對于對照組的細胞增殖比率?？瞻捉M為不加細胞只加培養(yǎng)基，對照組為加入與藥物同體積的DMSO，細胞存活率＝(實驗組OD450-空白組OD450)/(對照組OD450-空白組OD450)。通過IC50值再計算耐藥倍數(Resistance Fold，RF)。
RF＝耐藥細胞株的IC50值/親本細胞株的IC50值。每個濃度設3個重復孔，實驗重復3次。
所有耐藥細胞系在生長抑制實驗之前在無藥物培養(yǎng)基中生長3天。每個數值是3個獨立實驗結果，IC50以“均值±標準差”形式表示。VCR，長春新堿；ADR，柔紅霉素；RF，耐藥倍數。
實施例1
實驗結果：
KB/VCR和MCF-7/ADR是兩種常用的多藥耐藥細胞株，在本實施例中，這兩種細胞也表現出多藥耐藥的特性。如表1所示，KB/VCR細胞相對于KB細胞對VCR和ADR的耐藥倍數分別為81.9倍和94.4倍，而MCF-7/ADR細胞跟MCF-7細胞相比對VCR和ADR的耐藥倍數分別是38.1倍和20.9倍，顯示實驗所用耐藥細胞具有多藥耐藥性，且MDR活性類似于文獻報道的結果。
澳洲茄胺衍生物對親本細胞株KB和MCF-7耐藥細胞株、KB/VCR和MCF-7/ADR的半數抑制濃度IC50均大于100μΜ，兩者之間無顯著性差別，多藥耐藥細胞株KB/VCR和MCF-7/ADR沒有表現出對化合物澳洲茄胺衍生物的交叉耐藥，說明澳洲茄胺衍生物可以逃脫耐藥細胞的多藥耐藥性。澳洲茄胺衍生物在20μΜ以下的濃度下，對細胞生長無明顯的抑制，高于100μΜ的濃度下會抑制細胞的增殖。
結論：澳洲茄胺衍生物能夠克服耐藥細胞株的耐藥性，耐藥細胞株對澳洲茄胺衍生物的敏感性基本相同。
實施例2：CCK-8方法檢測澳洲茄胺衍生物對腫瘤細胞多藥耐藥活性的逆轉作用
KB/VCR,MCF-7/ADR和HCT-8/VCR細胞按照3500/孔的密度接種到96孔板中，24h后不同濃度的VCR，以及不同濃度的VCR和澳洲茄胺衍生物一起用含10％胎牛血清的α-MEM配好后被加到各個孔中。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，同實施實例1中方法，用CCK-8試劑盒測耐藥細胞株及其親本細胞對VCR和VCR+澳洲茄胺衍生物的活性，繪成曲線。每個濃度設3個重復孔，實驗重復3次。
實驗結果：
KB/VCR細胞對VCR的耐藥倍數為81.9倍，MCF-7/ADR對ADR的耐藥倍數為20.9倍。當加入20μM的澳洲茄胺衍生物后，使KB/VCR細胞對VCR的敏感性增加了1.34倍，而ADR對耐藥細胞MCF-7/ADR的敏感性增加了1.29倍。澳洲茄胺衍生物能夠逆轉腫瘤多藥耐藥細胞對化療藥物的耐藥性。而這種效應在親本細胞中表現并不明顯。
結論：
澳洲茄胺衍生物可以逆轉腫瘤多藥耐藥細胞KB/VCR和MCF-7/ADR的耐藥性，可以作為抗腫瘤藥物的增敏劑，或者與抗腫瘤藥物制成藥物組合物。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請 所附權利要求書所限定的范圍。