專利名稱：一株適用于油藏環(huán)境的假單胞菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株適用于油藏環(huán)境的假單胞菌菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物提高原油米收率技術(shù)(Microbial Enhanced Oil Recovery, MEOR)是指利用各種微生物(主要是細(xì)菌)及其代謝產(chǎn)物與油藏巖石、流體等發(fā)生生物化學(xué)作用，以提高原油采收率的技術(shù)。MEOR是繼聚合物驅(qū)、熱力驅(qū)、化學(xué)驅(qū)等方法之后新興的提高原油采收率的方法，該技術(shù)具有成本低、對油藏適應(yīng)性強(qiáng)、不傷害地層和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是二十一世紀(jì)最有發(fā)展前景的提高采油收率技術(shù)。至今，在世界上已有三十多個(gè)國家開展了相關(guān)的研究，在一些現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)，也取得了顯著的效果。微生物提高原油采收率的機(jī)理十分復(fù)雜，微生物來源的表面活性劑以及基于微生物生物量的微生物調(diào)剖是最主要的作用機(jī)理。鼠李糖脂是其中最常用的表面活性劑之一，它是一類陰離子型的糖脂。因其良好的生物相容性和高效的乳化、增溶以及降低表面張力等能力而被廣泛應(yīng)用于石油工業(yè)等領(lǐng)域。微生物生物量可以選擇性或非選擇性的封堵一些油層，改變巖石表面潤濕性，降低原油粘度，因此，對于原油采收率的提高也非常重要。生物被膜(biofilm)，也稱生物膜，是一種或多種微生物為適應(yīng)自然環(huán)境而形成的膜性聚合體。它由胞外基質(zhì)包裹微生物細(xì)胞形成，能夠增強(qiáng)其中微生物對環(huán)境的抗逆性，使其更好的在各種環(huán)境中定殖。因此，油藏環(huán)境中生物被膜的形成也將有助于菌體生物量的積累，從而增強(qiáng)其生物調(diào)剖效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株適用于油藏環(huán)境的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的銅綠假單胞菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)MP68，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.7267。本發(fā)明所提供的銅綠假單胞菌MP68CGMCC N0.7267的應(yīng)用為如下任一所述:(I)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在制備具有耐多環(huán)芳烴性能的微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用；(2)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制備能在含有多環(huán)芳烴的環(huán)境中生長的微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用；(3)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在油藏環(huán)境中提高原油采收率中的應(yīng)用；(4)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在修復(fù)多環(huán)芳烴污染中的應(yīng)用；(5)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制備表面活性劑和/或乳化劑中的應(yīng)用；
(6)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制備抑制細(xì)菌增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用；其中，所述細(xì)菌為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或結(jié)核分支桿菌中的任意一種或其組合。上述任一所述應(yīng)用中，所述含有多環(huán)芳烴的環(huán)境為含有多環(huán)芳烴的銅綠假單胞菌培養(yǎng)基或含有多環(huán)芳烴的油藏。上述任一所述應(yīng)用中，所述多環(huán)芳烴具體為熒蒽、苯并菲或芘。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 發(fā)酵后得到的發(fā)酵產(chǎn)物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法可為:將銅綠假單胞菌IMP68接種于低磷酸培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，攪拌，發(fā)酵2天，離心去除菌體后即得發(fā)酵產(chǎn)物；所述低磷酸培養(yǎng)基具體為PPGAS培養(yǎng)基。PPGAS培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基中的濃度如下:氯化銨0.02M，氯化鉀
0.02M, Tris-HCl0.12M，硫酸鎂0.0016M，蛋白胨I % (質(zhì)量百分含量)，甘油lg/100ml，余量為水。 上述發(fā)酵產(chǎn)物的如下任一應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:(I)上述發(fā)酵產(chǎn)物在作為表面活性劑和/或乳化劑中的應(yīng)用；(2)上述發(fā)酵產(chǎn)物在制備抑制細(xì)菌增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用；其中，所述細(xì)菌為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或結(jié)核分支桿菌中的任意一種或其組
口 ο上述發(fā)酵產(chǎn)物中的提取物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述提取物的制備方法為:將上述任一所述發(fā)酵產(chǎn)物去除菌體，保留發(fā)酵液上清，調(diào)節(jié)發(fā)酵液上清的PH值至2，然后4°C放置過夜，離心，取沉淀，再用氯仿甲醇混合液抽提，取有機(jī)相，即得；所述氯仿甲醇的體積比為2: I。所述提取物含有鼠李糖脂。上述提取物的如下任一應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:(I)上述任一所述提取物在作為表面活性劑和/或乳化劑中的應(yīng)用；(2)上述任一所述提取物在制備抑制細(xì)菌增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用；其中，所述細(xì)菌為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或結(jié)核分支桿菌中的任意一種或其組合。本發(fā)明的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 可以在含有多環(huán)芳烴的培養(yǎng)基中生長，并且合成大量的鼠李糖脂，合成的鼠李糖脂具有很強(qiáng)的表面活性劑性能和乳化能力，并且可以抑制其他細(xì)菌的生長；同時(shí)，該菌也可以在含有多環(huán)芳烴的培養(yǎng)基中生長形成生物被膜。因此，該菌具有應(yīng)用于多環(huán)芳烴污染環(huán)境的修復(fù)和油藏環(huán)境中提高原油采收率的潛能。


圖1 為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 提取物中鼠李糖脂的薄層層析圖，其中遷移率(Rf)為0.6的是雙鼠李糖脂，遷移率為0.9的是單鼠李糖脂。圖2 為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在含有熒蒽培養(yǎng)基中的生長、表面活性劑的產(chǎn)生以及生物被膜的形成能力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，其中A為菌株在三種培養(yǎng)基中的生長曲線；B為菌株在三種培養(yǎng)基中鼠李糖脂的產(chǎn)量；C為菌株在三種培養(yǎng)基中生物被膜的形成情況。圖3 為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在含有苯并菲培養(yǎng)基中的生長、表面活性劑的產(chǎn)生以及生物被膜的形成能力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，其中A為菌株在三種培養(yǎng)基中的生長曲線；B為菌株在三種培養(yǎng)基中鼠李糖脂的產(chǎn)量;C為菌株在三種培養(yǎng)基中生物被膜的形成情況。圖4 為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在含有芘培養(yǎng)基中的生長、表面活性劑的產(chǎn)生以及生物被膜的形成能力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，其中A為菌株在三種培養(yǎng)基中的生長曲線；B為菌株在三種培養(yǎng)基中鼠李糖脂的產(chǎn)量；C為菌株在三種培養(yǎng)基中生物被膜的形成情況。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 菌株的分離和鑒定

取新疆克拉瑪依油田8區(qū)8805井附近的原油污染土壤樣品，使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)得到菌株IMP68。檢測菌株MP68的16s rDNA的序列，測得序列為SEQ ID N0.1所示。將該序列在Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,結(jié)果該序列與銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株IXD12的相似性為99%。結(jié)果鑒定IMP68為Pseudomonas aeruginosa銅綠假單胞菌，本發(fā)明中稱其為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68。該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7267，保藏日期為2013年3月I日，分類命名為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa。保藏中心的地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編100101。實(shí)施例2、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 菌株的功能驗(yàn)證一、菌株發(fā)酵物中提取物的制備發(fā)酵:將菌株接種于PPGAS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵周期為2天，離心去除菌體后得到發(fā)酵液上清。PPGAS培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基中的濃度如下:氯化銨0.02M，氯化鉀0.02M, Tris-HCl0.12M，硫酸鎂0.0016M，蛋白胨1%(質(zhì)量百分含量)，甘油lg/100ml，余量為水。提取物的制備:用鹽酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液上清pH值至2，然后4°C放置過夜，離心，取沉淀，然后再用氯仿甲醇(體積比為2: I)抽提，取有機(jī)相，即為抽提產(chǎn)物(即提取物)，該提取物為較高純度的鼠李糖脂。提取物的含量檢測:將抽提產(chǎn)物進(jìn)行干燥，得到固體提取物，直接稱量干重。結(jié)果IMP68菌株發(fā)酵液上清中提取物的含量為4.2±0.01克/升。同樣條件下，對照菌株銅綠假單胞菌PAOl發(fā)酵液上清中提取物的含量為2.8±0.1克/升。提取物中鼠李糖脂的鑒定:用薄層層析法鑒定，結(jié)果如圖1，遷移率(Rf)為0.6的是雙鼠李糖脂，遷移率為0.9的是單鼠李糖脂。二、提取物的表面活性劑性能及乳化劑性能:MP68菌株提取物具有高效的表面活性和乳化能力。MP68產(chǎn)生的提取物在水中的表面張力值為31.27mN/mm,臨界膠束濃度為80毫克/升，汽油乳化指標(biāo)值為60，柴油的乳化指標(biāo)值為65。PAOl產(chǎn)生的提取物在水中的表面張力值為31.23mN/m,臨界膠束濃度為60毫克/升，汽油乳化指標(biāo)值為65，柴油的乳化指標(biāo)值為70。在高溫、高鹽以及不同pH等環(huán)境下，MP68菌株產(chǎn)生的提取物都能保持較高的表面活性和乳化能力。三、菌株發(fā)酵物中提取物的抑菌 功能驗(yàn)證。(一 )最低半數(shù)抑菌濃度的檢測將生長12小時(shí)的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的細(xì)菌數(shù)調(diào)整為IO5個(gè)/毫升，然后加入實(shí)驗(yàn)一制得的MP68的提取物溶液進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，過夜生長，細(xì)菌濃度與對照組相比，0D_減少一半的提取物的濃度即為該提取物的最低半數(shù)抑菌濃度。對照組:未添加提取物。結(jié)果:MP68來源的提取物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最低半數(shù)抑菌濃度值分別為6 μ g/ml, 16 μ g/ml, 16 μ g/ml,6 μ g/ml,說明實(shí)驗(yàn)一制得的提取物能夠較好的抑制枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生長。PAOl來源的提取物對上述四種菌的最低半數(shù)抑菌濃度值分別為10 μ g/ml, 30 μ g/ml, 25 μ g/ml, 20 μ g/ml,說明實(shí)驗(yàn)一制得的提取物能夠較好的抑制枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生長。( 二)管碟法測抑菌能力將實(shí)驗(yàn)一制得的來源于MP68的固體提取物重新溶解后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過管碟法，加入濃度為lmg/ml實(shí)驗(yàn)一制得的來源于IMP68的提取物，然后檢測對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及結(jié)核分支桿菌的抑菌圈，結(jié)果頂P68來源的提取物對上述五種菌的抑菌圈分別為27.5土 1.5mm, 16土 1.5mm, 25土 1.0mm, 16.5±0.5mm和17.5±lmm。說明MP68來源的提取物具有很好的抑菌活性，而且可以抑制慢性感染病原菌結(jié)核分支桿菌的生長。PAOl來源的提取物對上述五種菌的抑菌圈分別為22±3mm，14mm± 1.5mm, 24mm± lmm, 20mm± Imm和20.5± 1mm。說明IMP68來源的提取物具有很好的抑菌活性，而且可以抑制慢性感染病原菌結(jié)核分支桿菌的生長。四、菌株在含有多環(huán)芳烴培養(yǎng)基中的生長、表面活性劑的產(chǎn)生以及生物被膜的形成能力。(一)菌株在含有熒蒽培養(yǎng)基中的生長、表面活性劑的產(chǎn)生以及生物被膜的形成能力將菌株分別接種到PPGAS培養(yǎng)基、由等量熒蒽替代甘油的PPGAS培養(yǎng)基和同時(shí)含有熒蒽和甘油的PPGAS培養(yǎng)基中(熒蒽和甘油的質(zhì)量比為1: 1)，然后，在371:，200轉(zhuǎn)/分鐘條件下連續(xù)培養(yǎng)10天，每天取樣，檢測菌液OD值，制備菌株在上述三種培養(yǎng)基中的生長曲線；在第5天和第10天，檢測菌株在三種培養(yǎng)基中合成的表面活性劑產(chǎn)量；取第I天，第5天和第10天的菌液，以每孔200微升的量接種到96孔板中，37°C過夜培養(yǎng)后，棄去液體，然后用1%的結(jié)晶紫染結(jié)合在96孔板板管壁上的生物被膜，然后用95%的乙醇溶解結(jié)合在生物被膜上的結(jié)晶紫，檢測0D560讀數(shù)。檢測結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管熒蒽代替甘油作為碳源，菌株基本無法生長，但是，在同時(shí)含有熒蒽和甘油的PPGAS培養(yǎng)基中，菌體可以生長繁殖形成較高的生物量(圖2A)，同時(shí)，保持較高的合成鼠李糖脂的能力(圖2B)，而且，形成生物被膜的能力更強(qiáng)(圖2C)。(二)菌株在含有苯并菲培養(yǎng)基中的生長、表面活性劑的產(chǎn)生以及生物被膜的形成能力將菌株分別接種到PPGAS培養(yǎng)基、由等量苯并菲替代甘油的PPGAS培養(yǎng)基和同時(shí)含有苯并菲和甘油的PPGAS培養(yǎng)基中(苯并菲和甘油的質(zhì)量比為1: 1)，其它方法與實(shí)驗(yàn)(一)相同。檢測結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在用苯并菲代替甘油作為碳源的培養(yǎng)基中，菌體在后期有略微生長，說明菌體可以直接代謝少量的苯并菲；而且，在同時(shí)含有苯并菲和甘油的培養(yǎng)基中，菌體生長(圖3A)、表明活性劑的產(chǎn)量(圖3B)和生物被膜(圖3C)的形成基本無影響，說明菌株可以適應(yīng)含有苯并菲的環(huán)境。(三)菌株在含芘培養(yǎng)基中的生長、表面活性劑的產(chǎn)生以及生物被膜的形成能力將菌株分別接種到PPGAS培養(yǎng)基、由等量芘替代甘油的PPGAS培養(yǎng)基和同時(shí)含有芘和甘油的PPGAS培養(yǎng)基中(芘和甘油的質(zhì)量比為1:1)，其它方法與實(shí)驗(yàn)(一)相同。檢測結(jié)果見圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在用芘代替甘油作為碳源的培養(yǎng)基中，菌體4天后，就有比較明顯的生長(圖4A)，說明菌體可以直接代謝芘。在同時(shí)含有芘和甘油的培養(yǎng)基中，前7天，菌體生長基本無影響，7天后不再增殖，但仍保持較高生物量，且表面活性劑的產(chǎn)量(圖4B)和生物被膜(圖4C)的形成 能力一直略強(qiáng)于只有甘油的培養(yǎng)基。說明該菌很好地生活在含有芘的環(huán)境中，而且，同時(shí)能合成鼠李糖脂。
權(quán)利要求
1.一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267。
2.權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌MP68CGMCCN0.7267的如下任一應(yīng)用: (1)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在制備具有耐多環(huán)芳烴性能的微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用； (2)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制備能在含有多環(huán)芳烴的環(huán)境中生長的微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用； (3)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在油藏環(huán)境中提高原油采收率中的應(yīng)用； (4)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在修復(fù)多環(huán)芳經(jīng)污染中的應(yīng)用； (5)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267 在制備表面活性劑和/或乳化劑中的應(yīng)用； (6)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267在制備抑制細(xì)菌增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用；其中，所述細(xì)菌為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或結(jié)核分支桿菌中的任意一種或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述含有多環(huán)芳烴的環(huán)境為含有多環(huán)芳烴的銅綠假單胞菌培養(yǎng)基或含有多環(huán)芳烴的油藏。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述多環(huán)芳烴為熒蒽、苯并菲或芘。
5.權(quán)利要求1 所 述的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) IMP68CGMCC N0.7267發(fā)酵后得到的發(fā)酵產(chǎn)物。
6.權(quán)利要求5所述發(fā)酵產(chǎn)物的如下任一應(yīng)用: (1)權(quán)利要求5所述發(fā)酵產(chǎn)物在作為表面活性劑和/或乳化劑中的應(yīng)用； (2)權(quán)利要求5所述發(fā)酵產(chǎn)物在制備抑制細(xì)菌增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用；其中，所述細(xì)菌為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或結(jié)核分支桿菌中的任意一種或其組合。
7.權(quán)利要求5所述發(fā)酵產(chǎn)物中的提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的提取物，其特征在于:所述提取物的制備方法為:將權(quán)利要求3所述的發(fā)酵產(chǎn)物去除菌體，保留發(fā)酵液上清，調(diào)節(jié)發(fā)酵液上清的pH值至2，然后4°C放置過夜，離心，取沉淀，再用氯仿甲醇混合液抽提，取有機(jī)相，即得；所述氯仿甲醇的體積比為2: 10
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8任一所述的提取物，其特征在于:所述提取物含有鼠李糖脂。
10.權(quán)利要求7-9任一所述提取物的如下任一應(yīng)用: (1)權(quán)利要求7-9任一所述提取物在作為表面活性劑和/或乳化劑中的應(yīng)用； (2)權(quán)利要求7-9任一所述提取物在制備抑制細(xì)菌增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用；其中，所述細(xì)菌為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或結(jié)核分支桿菌中的任意一種或其組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可以在含有多環(huán)芳烴的培養(yǎng)基中生長，合成鼠李糖脂，并且可以形成生物被膜的菌株及其應(yīng)用。該菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其保藏編號(hào)為CGMCC NO.7267。本發(fā)明的菌株具有很強(qiáng)的產(chǎn)高效抑菌鼠李糖脂的功能。所產(chǎn)鼠李糖脂能夠用于多環(huán)芳烴污染環(huán)境的修復(fù)，原油的開采等，在醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)以及能源開采等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K31/7024GK103215207SQ20131013509
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者馬旅雁, 王世偉, 王迪, 楊新平 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所