專利名稱：假單胞菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) SC221-M及其用途。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)以來，隨著人口的急劇增加和社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們對水產(chǎn)品的需求量大大增加，傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式已不能滿足人們對水產(chǎn)品的需求。近二十年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，集約化高密度養(yǎng)殖逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的主流，目的是發(fā)揮各類有限的水體資源，從而得到更好的經(jīng)濟效益和產(chǎn)量。人工養(yǎng)殖對水產(chǎn)品生產(chǎn)的貢獻(xiàn)日益增大，2006年全國水產(chǎn)品總量約5290萬噸，其中養(yǎng)殖產(chǎn)量為3597萬噸，占我國漁業(yè)總產(chǎn)量的68%，占世界水產(chǎn)品養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%。我國是目前唯一養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國家，是全球最大的漁業(yè)養(yǎng)殖?！笆濉逼陂g我國水產(chǎn)品產(chǎn)量提高了 821萬噸，增長全部來自養(yǎng)殖業(yè)。但是集約化生產(chǎn)在提高經(jīng)濟效益的同時也帶來新的問題。在集約化高密度養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖水體自身污染非常嚴(yán)重，許多學(xué)者研究表明，在養(yǎng)殖過程中餌料利用率較低，養(yǎng)殖過程中大量的殘餌、生物代謝物、動植物尸體等有機物積累于養(yǎng)殖池底，這些有機物在嫌氣細(xì)菌的作用下會腐敗分解產(chǎn)生大量對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物有毒的物質(zhì)，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體的理化環(huán)境和生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重惡化。另一方面，人類生活污水、各種工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)廢水等的超量排放，污染了養(yǎng)殖用水水源，造成養(yǎng)殖水質(zhì)下降，養(yǎng)殖環(huán)境惡化。病原微生物種類增多和傳播速度加快，養(yǎng)殖生物病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國每年發(fā)生中等程度以上的養(yǎng)殖病害面積占養(yǎng)殖總面積的20%以上，年損失產(chǎn)量超過146多萬噸。目前，國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化的方法一般采用物理法、化學(xué)法或者生物法。物理和化學(xué)法雖然在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化過程中起到了重要的作用，但是這些方法存在很多弊端，例如珠江三角洲沿岸曾經(jīng)大量使用硫酸銅來治理蝦病，造成現(xiàn)在該地區(qū)水環(huán)境中存在相當(dāng)嚴(yán)重的銅離子污染；采用換水的方法換去的水中的污染物也會給其生態(tài)環(huán)境帶來污染，并且換去的水中若含有養(yǎng)殖動物的致病菌,就大大地加速了致病菌的傳播；使用各種消毒劑、殺蟲劑在殺死水體中有害的生物時，也必然會影響?zhàn)B殖池塘中養(yǎng)殖動物及其它生物的正常生長。同時，漁藥市場管理混亂，養(yǎng)殖過程中濫用藥和誤用藥的現(xiàn)象普遍，養(yǎng)殖用藥量迅速增力口，養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題日益突出。養(yǎng)殖者在用藥劑量、給藥方法、用藥部位和用藥動物的種類等方面不遵守用藥規(guī)定或者使用水產(chǎn)品中未經(jīng)批準(zhǔn)的藥物，甚至不管有病無病皆用藥，不僅使病原菌的抗藥性不斷增加，而且增加了養(yǎng)殖對象對藥物的依賴性，致使產(chǎn)品質(zhì)量安全無法保證，限制了水產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，探求高效、安全的水質(zhì)改良措施是減少病害的發(fā)生，減少抗生素等藥物的使用，實現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。近年來，國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)普遍采用生物法來凈化養(yǎng)殖水質(zhì)，其中以利用有益菌制備的微生態(tài)制劑來處理水體為主，取得了顯著的成績。在歐美、日本以及印度尼西亞、泰國等國家的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，微生態(tài)制劑得到較為廣泛的應(yīng)用。但是，目前所用微生態(tài)制劑存在有益菌株種類偏少、有效活菌數(shù)目低、不耐高溫、耐鹽范圍較窄等缺陷，不能完全滿足生產(chǎn)實踐中的需要，制約了微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)SC221-M及其用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種假單胞菌，其保藏名稱為Pseudomonasstutzeri SC221-M,保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址中國武漢武漢大學(xué)；保藏日期2012年7月11日，保藏號CCTCC No: M 2012281。本發(fā)明還同時提供了上述假單胞菌的用途用于凈化養(yǎng)殖廢水。本發(fā)明的菌株P(guān)seudomonas stutzeri SC221-M在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落直徑為 2.5-3. Omm,圓形，米黃色，表面光滑不透明，有光澤，中間略突起，邊緣整齊，無暈環(huán)，質(zhì)地較軟。在LB液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁，菌株數(shù)量可高達(dá)I X 108cfu/g以上。本發(fā)明的菌株P(guān)seudomonas stutzeri SC221-M在厭氧條件下，在4d內(nèi)可去除100mg/L亞硝酸鹽氮,在IOd內(nèi)可去除120mg/L亞硝酸鹽氮；在4d內(nèi)可去除氨氮15mg/L。本發(fā)明的菌株P(guān)seudomonas stutzeri SC221-M具有如下優(yōu)點I)、培養(yǎng)方便，生長速度快；2)、培養(yǎng)發(fā)酵后的活菌菌株數(shù)目高；3 )、該菌可有效去除養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮和亞硝酸鹽氮，顯著改善水質(zhì)。本發(fā)明的Pseudomonas stutzeri SC221-M實際使用時,可采取向水中投放的方法,一般控制 Pseudomonas stutzeri SC221-M 在水體中的濃度為 0. 5 5 X IO8 cfu/m3 ;本發(fā)明的Pseudomonas stutzeri SC221-M也可先制成干菌粉,再進行如上操作。
具體實施例方式實施例I、假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) SC221-M的獲得，依次進行以下步驟I )、菌的篩選取杭州郊區(qū)草魚養(yǎng)殖池底泥10克，加IOOml浙江大學(xué)紫金港啟真湖水，5mg飼料(為常規(guī)的草魚飼料)和35mg檸檬酸鈉，充分混勻后，添加亞硝酸鹽氮(濃度為5mg/L)。每隔24h分別取樣點樣，定性檢測亞硝酸鹽氮的降解情況。當(dāng)亞硝酸鹽氮完全降解，取微量進行保存，剩余的大部分再進行后續(xù)的增加亞硝酸鹽氮；即，再向降解完全的混合液中繼續(xù)增加亞硝酸鹽氮(濃度從5mg/L開始)，直到確定菌能降解的亞硝酸鹽氮的最大濃度。亞硝酸鹽氮的定性檢測培養(yǎng)液用亞硝酸鹽顯色劑點樣，若出現(xiàn)紅色則說明培養(yǎng)液中存在亞硝酸鹽氮，且顏色越深濃度越大。2)、菌的分離純化選取步驟I)中所得對應(yīng)亞硝酸鹽氮降解效果最好的混合液，用接種針挑取混合液，在LB固體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,酵母浸出物5g/L，瓊脂16g/L，其余為水；利用濃度為lOmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH7. 0,121°C滅菌20分鐘)表面連續(xù)劃線培養(yǎng)，選擇那些形態(tài)不一樣的菌落，重復(fù)幾次后便可形成單獨孤立的菌落，因而獲得純培養(yǎng)菌株。
3)、菌的再篩選選取分離純化后所得菌，按1% (體積比)的接種量接種到馴化培養(yǎng)基(100ml浙江大學(xué)紫金港啟真湖水，5mg飼料(為常規(guī)的草魚飼料)和35mg檸檬酸鈉)，充分混勻后，添加亞硝酸鹽氮(濃度為5mg/L)，檢測亞硝酸鹽氮的降解情況，待完全降解，梯度(5mg/L)增加亞硝酸鹽氮的濃度，直到確定各菌能降解的最大濃度。4)、菌的核輻射選取亞硝酸鹽氮降解效果最好(50mg/L)的菌株，命名為SC221，進行核輻射處理。12Gy/min福射強度條件下福照60min,總福射量為720Gy。5)、突變株的亞硝酸鹽降解效果試驗將步驟4)所得的突變株(命名為SC221-M)接種到馴化培養(yǎng)基(100ml浙江大學(xué)紫金港啟真湖水，5mg飼料(為常規(guī)的草魚飼料)和35mg檸檬酸鈉)檢測亞硝酸鹽降解效果。添加亞硝酸鹽氮(濃度為50mg/L)，檢測亞硝酸鹽氮的降解情況，每隔24h點樣檢測亞硝酸鹽氮的降解情況，待完全降解，逐漸增加亞硝酸鹽氮(25mg/L)，直到確定突變株能降解的最大濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厭氧條件下，SC221-M在4d內(nèi)可去除100mg/L亞硝酸鹽氮，在IOd內(nèi)可去除125mg/L亞硝酸鹽氮。對亞硝酸鹽氮的去除能力比輻射前有所提升。6)、采用甘油保藏法在滅菌的菌種管中，加入I. O ml細(xì)菌培養(yǎng)液(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,酵母浸出物5g/L，其余為水；利用濃度為lOmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH7. 0，121°C滅菌20分鐘)和0. 5ml 50% (體積濃度)的甘油，混勻后于_80°C冰箱保存。7)、菌種鑒定(I)形態(tài)特征在液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁并伴有微量沉淀，輕輕搖動沉淀即散開。在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落SC221-M直徑為2. 5-3. 0mm，圓形，米黃色，表面光滑不透明，有光澤，中間略突起，邊緣整齊，無暈環(huán)。(2) 16S rDNA 序列分析對分離篩選到的突變株SC221-M進行進一步的16S rDNA序列分析與比對。引物序列如下上游引物(Pl):5，一 AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT — 3’ 下游引物(P6):5’ 一TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC 一 3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成。以篩選得到的菌株的總DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系(50L)為10XBuffer 5. OyL，上下游引物各 I. 0μ L，dNTP4. 0μ L，Taq 酶 O. 5μ L，模板 I. 0μ L，ddH20 37. 5 μ L ;反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94V,變性50s，52°C退火60S，72°C延伸lmin30s，共30個循環(huán)。目的片斷按照常規(guī)方法(Sambrook, et al. , 2001)進行克隆和序列測定,測定結(jié)果與GenBank中所登錄的16S rDNA序列(登錄號NC_017532. 1、NC_015740. I和NC_009434. I等)進行比對分析，基因同源性達(dá)到 99% 以上。根據(jù)《Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology))(Holt, J. G. , Gibbons, N. E. , 1994)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英等，2001)，通過性態(tài)特征和16S rDNA序列分析，確定菌株SC221-M為假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)。將其進行保藏，保藏名稱為Pseudomonas stutzeri SC221-M,保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學(xué)；保藏日期2012年7月11日，保藏號CCTCC No: M 2012281。實施例2、假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) SC221-M菌粉的制備方法,依次進行以下步驟將假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) SC221-M接種于LB液體培養(yǎng)基(蛋白腺10g/L，NaCl 10g/L,酵母浸出物5g/L，其余為水；利用濃度為lOmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH7. 0,121°C滅菌20分鐘)中，于30°C培養(yǎng)20小時后，離心取菌泥，60度恒溫干燥至恒重、與玉米淀粉按4:1混合(B卩，玉米淀粉與干燥后的菌泥的重量比為4:1)而制成干菌粉，每克干菌粉活菌數(shù)為108cfu。實施例3、假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) SC221-M對模擬廢水的凈化作用在6個1000L錐形瓶中分別裝入500ml模擬廢·水，其中C/N為4，氨氮0. 86mg/L,亞硝酸鹽氮117. 72mg/L,硝酸鹽氮16. 74mg/L。向模擬廢水中按照IX IO8 cfu/m3的終濃度添加假單胞菌SC221-M菌粉(實施例2所得)作為實驗組，以不添加菌粉為對照組，每組三個重復(fù)。用納氏試劑光度法測定氨氮(nh4+-n)、n_ (I-萘基)-乙二胺光度法測定亞硝酸鹽氮(NO2--N)、紫外分光光度法測定硝酸鹽氮(NO3--N)15 24h后檢測到實驗組氨氮(NH4+-N)的濃度為1. 09mg/L，亞硝酸鹽氮(Ν02__Ν)的濃度為0. 06mg/L，硝酸鹽氮(NOf-N)的濃度為1. 99mg/L。對照組氨氮(NH4+-N)的濃度為1. 27mg/L,亞硝酸鹽氮(Ν02__Ν)的濃度為123. 63mg/L,硝酸鹽氮(Ν03_-Ν)的濃度為11. 73mg/L。因此，假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) SC221-M有明顯降低水中亞硝酸鹽氮含量的效果，改善了水質(zhì)，適合于作為水質(zhì)凈化劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上應(yīng)用。實施例4、假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) SC221-M對養(yǎng)殖水體的調(diào)控將6個容量為2000L的PE桶，隨機分成2組(對照組和試驗組)，每組三個重復(fù)。每桶注入1400L的浙江省紹興縣孫端鎮(zhèn)大畈河(經(jīng)緯度30° 03' 38" N, 120° 40' 52" E)河水，經(jīng)檢測氨氮含量為0. 35mg/L,亞硝酸鹽氮含量為0. 075mg/L,化學(xué)需氧量COD為27. 03mg/L，可溶性總磷含量為0. 148mg/L。草魚用2. 5% (質(zhì)量濃度)的食鹽水進行浸泡消毒，飼養(yǎng)10 d后，選取平均體重約4 g的草魚共9Kg，隨機分為兩組，每組設(shè)3個平行重復(fù)，每個平行草魚I. 5Kg :對照組在水中不添加任何菌，處理組向水中按照I X IO8 cfu/m3的終濃度添加假單胞菌SC221-M菌粉(實施例2所得)，二組均飼喂基礎(chǔ)日糧(每組每天投放兩次，每次投放20g)。添加假單胞菌SC221-M菌粉3天后分別檢測試驗組和對照組的水質(zhì)指標(biāo)變化，具體如下表I :表I SC221-M對草魚養(yǎng)殖水質(zhì)的影響
pSlpMl
氨氮含量(mg/L)0. 391 + 0. 0350. 395 + 0. 043
亞硝酸鹽氮含量(mg/L) 0. 005 + 0. 0010. 036 + 0. 00權(quán)利要求
1.一種假單胞菌，其特征是保藏名稱為Pseudomonas stutzeri SC221-M,保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學(xué)；保藏日期2012年7月11日，保藏號CCTCC No: M 2012281。
2.如權(quán)利要求I所述的假單胞菌的用途，其特征是用于凈化養(yǎng)殖廢水?！?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種假單胞菌，其保藏名稱為 Pseudomonas stutzeri SC221-M，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國 武漢 武漢大學(xué)；保藏日期2012年7月11日，保藏號CCTCC No: M 2012281。本發(fā)明還同時公開了上述假單胞菌的用途，用于凈化養(yǎng)殖廢水。
文檔編號C02F3/34GK102876617SQ20121039835
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者李衛(wèi)芬, 張小平, 鄭佳佳, 鄧斌, 傅羅琴, 梁權(quán), 余東游 申請人:浙江大學(xué)