基于流感血凝素蛋白的新穎疫苗的制作方法
【專利摘要】提供了引發(fā)廣泛中和性抗流感抗體的新穎疫苗。一些疫苗包含在其表面上展示來(lái)自流感病毒的血凝素三聚體的納米顆粒。納米顆粒包含融合蛋白，該融合蛋白包含至少與流感血凝素蛋白的一部分連接的鐵蛋白的單體亞基。一些部分包含胞外結(jié)構(gòu)域，而一些部分限于莖區(qū)。融合蛋白自身裝配以形成血凝素展示性納米顆粒。一些疫苗僅包含與三聚化域連接的流感血凝素蛋白的莖區(qū)。此類疫苗可以用于針對(duì)感染對(duì)個(gè)體接種疫苗，所述感染由異源流感病毒和與獲得納米顆粒血凝素蛋白的病毒在抗原性上趨異的流感病毒引起。還提供了融合蛋白和編碼此類蛋白質(zhì)的核酸分子。
【專利說(shuō)明】基于流感血凝素蛋白的新穎疫苗
[0001]發(fā)明概述
[0002]本發(fā)明提供了基于血凝素蛋白的新穎流感疫苗，其是容易制造的，有力的，且引發(fā)廣泛中和性流感抗體。具體地，本發(fā)明提供了可用于誘導(dǎo)中和性抗體生成的流感血凝素蛋白及其部分。它還提供了新穎的HA-鐵蛋白納米顆粒(np)疫苗。此類納米顆粒包含融合蛋白，每種所述融合蛋白包含與流感血凝素蛋白的免疫原性部分連接的鐵蛋白的單體亞基。由于此類納米顆粒在其表面上展示流感血凝素蛋白，它們可以用于針對(duì)流感病毒對(duì)個(gè)體接種疫苗。
[0003]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是包含融合蛋白的納米顆粒，并且在此實(shí)施方案中，融合蛋白包含與第一流感血凝素(HA)蛋白連接的至少25個(gè)來(lái)自單體鐵蛋白亞基蛋白的連續(xù)氨基酸，使得所述納米顆粒在其表面上包含流感病毒HA蛋白三聚體。納米顆?？梢孕纬砂嗣骟w，所述八面體可以由24個(gè)具有432對(duì)稱的亞基組成。此外，單體鐵蛋白亞基蛋白可以選自細(xì)菌鐵蛋白、植物鐵蛋 白、藻鐵蛋白、昆蟲鐵蛋白、真菌鐵蛋白和哺乳動(dòng)物鐵蛋白，并且在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)鐵蛋白蛋白質(zhì)。
[0004]在此實(shí)施方案中，單體鐵蛋白亞基蛋白可以包含選自下組的氨基酸序列的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸:SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:5或者可以包含與那些序列至少約80%相同，至少約85 %相同，至少約90 %相同，至少約95 %相同，至少約97 %相同，至少約99 %相同的氨基酸或者可以包含那些序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單體亞基包含與SEQ ID N0:2的氨基酸5-167對(duì)應(yīng)的區(qū)域。
[0005]在此實(shí)施方案中，所述血凝素蛋白可以包含來(lái)自選自下組的流感病毒的血凝素蛋白的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸:甲型/新喀里多尼亞/20/1999(1999NC，Hl)、甲型 / 加利福尼 /04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亞 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛羅里達(dá) /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯/16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班 /59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班/60/2008 (2008Bris，B)。此外，血凝素蛋白可以包含氨基酸序列，該氨基酸序列選自SEQ IDNO:8，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23，SEQ IDNO: 26，SEQ ID NO: 29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO: 35和 SEQ ID NO: 38 的氨基酸序列或與其至少80%相同，至少約85%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，至少約97%相同，至少約99%相同的氨基酸序列。或者，血凝素蛋白可以包含氨基酸序列，該氨基酸序列選自SEQID NO:71，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQID NO: 89，SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO: 95 和 SEQ ID NO: 98 的氨基酸序列或與其至少 80%相同，至少約85%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，至少約97%相同，至少約99%相同的氨基酸序列。
[0006]在此實(shí)施方案中，血凝素蛋白能夠引發(fā)對(duì)包含選自下組的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO:20, SEQID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:38，或者它可以包含選自下組的區(qū)域:能夠容許血凝素三聚體形成的區(qū)域、莖區(qū)、胞外結(jié)構(gòu)域、和包含從剛好在第二螺旋卷曲螺旋的最后一個(gè)氨基酸的遠(yuǎn)端的氨基酸殘基至跨膜域的第一個(gè)氨基酸的近端的氨基酸殘基的氨基酸序列的區(qū)域。
[0007]血凝素蛋白還可以包含血凝素刺突域、與SEQ ID N0:8的氨基酸1-519對(duì)應(yīng)的區(qū)域或者選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:8的氨基酸1-519和SEQ ID NOill0
[0008]在此實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含接頭序列。
[0009]在此實(shí)施方案中，納米顆?？梢砸l(fā)針對(duì)下列各項(xiàng)的免疫應(yīng)答:流感血凝素的莖區(qū)、流感血凝素的刺突、與獲得血凝素蛋白的流感病毒株異源的流感病毒株或與獲得血凝素蛋白的流感病毒在抗原性上趨異的流感病毒。
[0010]在此實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含與選自下組的序列至少80 %相同，至少約85 %相同，至少約90 %相同，至少約95 %相同，至少約97 %相同，至少約99 %相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQID NO:56, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:62, SEQ ID N0:65 和 SEQ ID NO:68，其中納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答或者可以包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ IDNO:44，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:62, SEQ ID N0:65和SEQ ID N0:68。融合蛋白還可以包含與選自下組的序列至少80%相同，至少約85%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，至少約97%相同，至少約99%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO: 110SEQ IDN0:113SEQ ID N0:116SEQ ID N0:119SEQ ID N0:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128，其中納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。 [0011 ] 在此實(shí)施方案中，所述納米顆?？梢园诙诤系鞍?，該第二融合蛋白包含第二流感血凝素蛋白，其中所述第一和第二流感血凝素蛋白來(lái)自不同類型、不同亞型或不同毒株的流感病毒。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含任何上述納米顆粒的疫苗組合物。疫苗組合物可以進(jìn)一步包含至少一種別的納米顆粒，所述別的納米顆粒包含至少一種血凝素蛋白，該血凝素蛋白與所述第一血凝素蛋白和所述第二血凝素蛋白來(lái)自不同流感毒株。
[0013]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是生成針對(duì)流感病毒的疫苗的方法。該方法包括在一定的條件下表達(dá)融合蛋白，使得所述融合蛋白形成在其表面上展示血凝素三聚體的納米顆粒，所述融合蛋白包含與流感血凝素蛋白連接的單體鐵蛋白蛋白質(zhì)，并回收所述納米顆粒。
[0014]本發(fā)明還包括針對(duì)流感對(duì)個(gè)體接種疫苗的方法，該方法包括對(duì)個(gè)體施用納米顆粒，使得所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。在此實(shí)施方案中，所述納米顆粒包含與流感血凝素蛋白連接的鐵蛋白單體亞基，且所述納米顆粒在其表面上展示流感血凝素三聚體。在此實(shí)施方案中，所述納米顆?？梢砸l(fā)針對(duì)流感病毒株的免疫應(yīng)答，所述流感病毒株對(duì)于獲得所述血凝素蛋白的流感病毒的亞型或毒株而言是異源的或者與獲得所述血凝素蛋白的流感病毒在抗原性上是趨異的。
[0015]此方法可以進(jìn)一步包括對(duì)個(gè)體施用第一疫苗組合物，然后在后來(lái)的時(shí)間，施用包含納米顆粒的第二疫苗組合物，所述納米顆粒包含HA-SS-鐵蛋白融合蛋白。HA SS-鐵蛋白融合蛋白可以包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO:74, SEQ IDNO:77，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ IDN0:95和SEQ ID N0:98或者與其至少80%相同，至少85%相同，至少90%相同，至少95%相同，至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列，其中HA SS-鐵蛋白融合蛋白引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。HA SS-鐵蛋白融合蛋白可以包含選自下組的氨基酸序列:SEQ IDNO:101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO:110SEQ ID NO:113SEQ ID NO:116SEQ IDNO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO: 125 和 SEQ ID NO: 128，或與其至少 80%相同，至少 85%相同，至少90%相同，至少95%相同，至少97%相同或至少99%相同的氨基酸序列，其中所述HA SS-鐵蛋白融合蛋白弓丨發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。
[0016]在此方法中，第一疫苗組合物可以包含納米顆粒，其包含來(lái)自選自下組的流感病毒的血凝素蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域:甲型/新喀里多尼亞/20/1999 (1999NC, Hl)、甲型 / 加利福尼 /04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亞 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛羅里達(dá) /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯/16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班 /59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班/60/2008 (2008Bris，B)?；蛘撸谝灰呙缃M合物蛋白質(zhì)的血凝素可以包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO:20, SEQ IDNO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:38 或者與其至少80%相同，至少85%相同，至少90%相同，至少95%相同，至少97%相同或至少99 %相同的氨基酸序列。此外，第一疫苗組合物可以包含HA-鐵蛋白融合蛋白，其包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ IDNO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68 或者與其至少80%相同，至少85%相同，至少90%相同，至少95%相同，至少97%相同或至少99 %相同的氨基酸序列，其中納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。
[0017]加強(qiáng)性組合物 的施用一般為施用引發(fā)性組合物后幾周或幾個(gè)月。
[0018]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是融合蛋白，其包含與流感血凝素蛋白連接的單體鐵蛋白亞基蛋白。單體鐵蛋白亞基蛋白可以選自細(xì)菌鐵蛋白、植物鐵蛋白、藻鐵蛋白、昆蟲鐵蛋白、真菌鐵蛋白和哺乳動(dòng)物鐵蛋白或者可以是幽門螺桿菌鐵蛋白蛋白質(zhì)的單體亞基。單體鐵蛋白亞基蛋白可以包含容許融合蛋白自身裝配成納米顆粒的域。在此實(shí)施方案中，單體鐵蛋白亞基蛋白可以包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 5或包含至少25個(gè)來(lái)自選自SEQ IDNO:2和SEQ I NO:5的序列的連續(xù)氨基酸或者與選自SEQ ID NO:2和SEQ I NO:5的序列至少約80%相同，至少約85%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，至少約97%相同，至少約99%，并且融合蛋白能夠自身裝配成納米顆粒。另外，單體亞基可以包含與SEQ IDNO:2的氨基酸5-167對(duì)應(yīng)的區(qū)域。
[0019]在此實(shí)施方案中，血凝素蛋白可以包含至少25個(gè)來(lái)自選自下組的流感病毒的氨基酸:甲型/新喀里多尼亞/20/1999 (1999NC, Hl)、甲型/加利福尼/04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)，甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亞 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛羅里達(dá) /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, HI)、和乙型 / 布里斯班 /60/2008 (2008Bris, B)?；蛘?，血凝素蛋白能夠引發(fā)針對(duì)包含選自下組的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答:SEQ ID NO:8, SEQ IDNO:11，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ IDNO:29, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO: 38 或與其至少約 80%相同，至少約 85%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，至少約97%相同或至少約99%相同的氨基酸序列。
[0020]在此實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID N0:41, SEQID NO:44，SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:59, SEQID NO:62, SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:68或與其至少約80%相同，至少約85%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，至少約97%相同或至少約99%相同的氨基酸序列。
[0021]此外，在此實(shí)施方案中，血凝素蛋白可以包含選自下組的區(qū)域:能夠容許所述血凝素蛋白三聚化的區(qū)域、莖區(qū)、胞外結(jié)構(gòu)域、和包含從剛好在第二螺旋卷曲螺旋的最后一個(gè)氨基酸的遠(yuǎn)端的氨基酸殘基至跨膜域的第一個(gè)氨基酸的近端的氨基酸殘基的氨基酸序列的區(qū)域?；蛘撸氐鞍卓梢园cSEQ ID N0:8的氨基酸1-519對(duì)應(yīng)的區(qū)域，選自下組的氨基酸序列:SEQ ID N0:8的氨基酸1-519和SEQ ID N0:11,或血凝素刺突域。此外，血凝素蛋白可以包含來(lái)自選自下組的流感病毒的莖區(qū):甲型 / 新喀里多尼亞 /20/1999 (1999NC, Hl)、甲型 / 加利福尼 /04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris，H3)、甲型 / 印度尼西亞 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛羅里達(dá) /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, Hl)、或乙型/布里斯班/60/2008 (2008Bris, B)。血凝素蛋白還可以包含與 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:83, SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98 至少約 80%相同，至少約85%相同，至少約90%相同，至少約95%相同，至少約97%相同或至少約99%相同的氨基酸序列。
[0022]在此實(shí)施方案中，融合蛋白可以包含一個(gè)或多個(gè)接頭序列或選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:101，SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO:110SEQ ID N0:113SEQ IDN0:116SEQ ID N0:119SEQ ID N0:122SEQ ID NO: 125 和 SEQ ID NO: 128 或與其至少約 80%相同，至少約85 %相同，至少約90 %相同，至少約95 %相同，至少約97 %相同或至少約99 %相同的序列。
[0023]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是編碼上文描述的任何融合蛋白的核酸分子。在此實(shí)施方案中，核酸分子可以與啟動(dòng)子在功能上連接。本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括重組細(xì)胞和病毒，其包含此類核酸分子。
[0024]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含與選自下組的氨基酸至少80%相同，至少約85 %相同，至少約90 %相同，至少約95 %相同，至少約97 %相同或至少約99 %相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì):SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ IDNO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98，其中蛋白質(zhì)與一個(gè)或多個(gè)三聚化域連接。在此實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以至少與流感血凝素蛋白的頭區(qū)的一部分連接，包含一個(gè)或多個(gè)接頭區(qū)或者引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。又一個(gè)實(shí)施方案是編碼此類蛋白質(zhì)的核酸分子。
[0025]發(fā)明背景[0026]通過(guò)針對(duì)流感病毒的疫苗接種誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答主要針對(duì)病毒血凝素(HA)蛋白，其是病毒表面上負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞受體相互作用的糖蛋白。病毒表面上的HA蛋白是血凝素蛋白單體的三聚體，其被酶促切割以生成氨基端HAl和羧基端HA2多肽。球狀頭部?jī)H由HAl多肽的主要部分組成，而將血凝素蛋錨定于病毒脂質(zhì)包膜中的莖由HA2和HAl的一部分構(gòu)成。血凝素蛋白的球狀頭部包含兩個(gè)域:受體結(jié)合域(RBD)(—個(gè)包含唾液酸結(jié)合位點(diǎn)的約148個(gè)氨基酸殘基的域)和退化(vestigial)酯酶域(一種剛好在RBD下的約75個(gè)氨基酸殘基的較小區(qū)域)。RBD中與2，6-唾液酸識(shí)別位點(diǎn)相鄰的頂部包含每個(gè)三聚體超過(guò)6000 A2的較大區(qū)域(氨基酸131-143，170-182，205-215和257-262，1918編號(hào))(本文中稱為RBD-A區(qū))，其在甲型/南卡羅來(lái)納/1/1918 (1918SC)和甲型/加利福尼/04/2009 (2009CA)流行病毒株之間是95%保守的。球狀頭部包含幾個(gè)抗原性位點(diǎn)，其包括免疫優(yōu)勢(shì)表位。例子包括Sa，Sb，Ca1, Ca2和Cb抗原性位點(diǎn)(參見例如Caton AJ等，1982，Cell31, 417-427)。RBD-A區(qū)包括Sa抗原性位點(diǎn)和Sb抗原性位點(diǎn)的一部分。
[0027]針對(duì)流感的抗體經(jīng)常靶向HA球狀頭部中的可變抗原性位點(diǎn)，其圍繞保守的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)，并且因此僅中和抗原上緊密相關(guān)的病毒。HA頭部的可變性是由于流感病毒的恒定抗原性漂移所致，并且造成流感的季節(jié)性地方病。比較而言，病毒基因組的基因區(qū)段可以在宿主物種中經(jīng)歷再分類(抗原性轉(zhuǎn)變)，產(chǎn)生能夠變得流行性的具有改變的抗原性的新病毒[Salomon, R.等Celll36，402-410 (2009)]。迄今，每年，將流感疫苗更新以反映對(duì)即將到來(lái)傳播病毒預(yù)測(cè)的HA和神經(jīng)氨酸酶(NA)。
[0028]目前用于流感的疫苗策略使用化學(xué)滅活的或活的減毒的流感病毒。這兩種疫苗一般在胚胎蛋中生成，這由于費(fèi)時(shí)的過(guò)程和有限的生產(chǎn)能力而呈現(xiàn)主要的制造局限。目前疫苗的另一項(xiàng)更為重要的局限是其高度毒株特異性功效。這些挑戰(zhàn)在2009H1N1大流行的出現(xiàn)期間變得尤其明顯，因此確認(rèn)能夠克服這些局限的新疫苗平臺(tái)的必要性。病毒樣顆粒代表一種此類備選的方法，并且目前在臨床試驗(yàn)中評(píng)估[Roldao, A.等Expert RevVaccines9, 1149-1176(2010) ；Sheridan, C.Nat Biotechnol27, 489-491 (2009)]。代替胚胎蛋，經(jīng)常包含HA、NA和基質(zhì)蛋白I(Ml)的VLP可以在哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中大規(guī)模生產(chǎn)[Haynes, J.R.Expert Rev Vaccines8, 435-445 (2009)]。此辦法的優(yōu)點(diǎn)是其顆粒的、多價(jià)的性質(zhì)和如實(shí)模擬感染性病毒體的正確折疊的三聚體HA刺突的真實(shí)展示。比較而言，通過(guò)其裝配的性質(zhì)，有包膜的VLP含有較小的但有限的宿主細(xì)胞組分，其可以在重復(fù)使用此平臺(tái)后呈現(xiàn)潛在安全性、免疫原性考驗(yàn)[Wu，C.Y.等PLoS 0ne5，e9784(2010)]。此外，由VLP誘導(dǎo)的免疫與目前的疫苗誘導(dǎo)的免疫基本上相同，因此不可能改善疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫的效力和寬度兩者。在VLP外，重組HA蛋白也已經(jīng)在人體中進(jìn)行過(guò)評(píng)估[Treanor，J.J.等 Vaccinel9, 1732-1737 (2001) ；Treanor, J.J.JAMA297, 1577-1582 (2007)]，盡管誘導(dǎo)保護(hù)性中和性抗體效價(jià)的能力是有限的。那些試驗(yàn)中使用的重組HA蛋白在昆蟲細(xì)胞中生成，并且不能優(yōu)先形成天然三聚體[Stevens, J.Science303, 1866-1870 (2004)]。
[0029]最近，完全新類別的針對(duì)流感病毒的廣泛中和性抗體得到分離。一類抗體識(shí)別高度保守的 HA 莖[Corti，D.等 J Clin Investl20, 1663-1673(2010)；Ekiert,D.C.等 Science324,246-251(2009) ；Kashyap,A.K.等 Proc Natl Acad SciUSA105, 5986-5991 (2008) ；0kuno, Y.等 J Virol67, 2552-2558 (1993) ；Sui, J.等 NatStruct Mol Bioll6 ,265-273 (2009) ；Ekiert, D.C.等 Science333,843-850 (2011);Corti1D.等.Science333，850-856 (2011)]，且另一類抗體精確識(shí)別可變HA頭部上的RBD的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)[Whittle, J.R.等 Proc Natl Acad Sci USA108, 14216-14221 (2011)；Krause, J.C.等J Virol85, 10905-10908 (2011) ] ?與毒株特異性抗體不一樣，那些抗體能夠中和多種抗原上獨(dú)特的病毒，并且因此誘導(dǎo)此類抗體已經(jīng)成為下一代通用疫苗的焦點(diǎn)[Nabel,G.J.等Nat Medl6，1389-1391 (2010)]。然而，通過(guò)疫苗接種強(qiáng)力引發(fā)具有此類異源中和性概況的這些抗體是困難的[Steel, J.等MBiol，e0018(2010) ；ffang, Τ.Τ.等PLoSPathog6, e1000796(2010) ；ffei, C.J.等 Science329, 1060-1064(2010)]。
[0030]盡管常規(guī)流感疫苗有幾種備選，過(guò)去幾十年的生物技術(shù)進(jìn)展已經(jīng)容許工程化改造生物學(xué)材料以用于新一代疫苗平臺(tái)。鐵蛋白(一種存在于幾乎所有活生物體中的鐵貯存蛋白)是一個(gè)例子，其已經(jīng)廣泛研究和工程化改造，用于許多潛在的生物化學(xué) / 生物醫(yī)學(xué)目的[Iwahori, K.美國(guó)專利 2009/0233377 (2009) ；Meldrum, F.C.等Science257, 522-523(1992) ；Naitou, Μ.等美國(guó)專利 2011/0038025 (2011) ；Yamashita, 1.Biochim Biophys Actal800, 846-857 (2010)]，包括用于展示外源表位肽的潛在疫苗平臺(tái)[Carter, D.C.等美國(guó)專利 2006/0251679(2006) ；Li, C.Q.等 IndustrialBiotechnol2, 143-147 (2006)]。其作為疫苗平臺(tái)的用途由于其自身裝配和比單價(jià)形式誘導(dǎo)更強(qiáng)的B細(xì)胞應(yīng)答及誘導(dǎo)不依賴于T細(xì)胞的抗體應(yīng)答的抗原多價(jià)呈現(xiàn)而是特別令人感興趣的[Bachmann, M.F.等 Annu Rev Immunol15，235-270(1997) ；Dintzis, H.Μ.等 Proc NatlAcad Sci USA73，3671-3675 (1976)]。此外，鐵蛋白(其由24個(gè)裝配成具有432對(duì)稱的八面體籠的亞基組成)的分子構(gòu)造具有在其表面上展示單體抗原的潛力。[0031]仍然需要有效的流感疫苗，其提供針對(duì)流感病毒的強(qiáng)力保護(hù)。特別地，仍然需要保護(hù)個(gè)體免于異源流感病毒毒株(包括進(jìn)化中的季節(jié)性和流行性的未來(lái)流感病毒株)的流感疫苗。本發(fā)明通過(guò)提供新穎HA-鐵蛋白納米顆粒(HA-鐵蛋白np)流感疫苗來(lái)滿足此需要，所述新穎HA-鐵蛋白納米顆粒(HA-鐵蛋白np)流感疫苗是容易制造的，有力的，并且引發(fā)廣泛中和性流感抗體。
[0032]附圖簡(jiǎn)述
[0033]圖1:展示流感病毒血凝素的鐵蛋白顆粒的分子設(shè)計(jì)和構(gòu)建。(a)幽門螺桿菌非血紅素鐵蛋白(PDB:3bve)亞基的帶狀圖(左側(cè))。氣基端和竣基端分別標(biāo)記為N和C。在八面體三次軸周圍的三個(gè)鐵蛋白亞基以帶狀圖顯示(中間)。標(biāo)示殘基Asp5。鐵蛋白顆粒(沿著八面體三次軸以8A分辨率觀察)和甲型/所羅門群島(Solomon Islands)/3/2006 (HlNl)
HA三聚體(PDB:3sm5)(從膜近端側(cè)向下觀察)(右側(cè))的八面體裝配體。在八面體三次軸周圍的每個(gè)鐵蛋白亞基中的Asp5殘基之間測(cè)量的平均距離以三角形顯示。對(duì)HA三聚體也
畫出相同的等邊三角形(a = b = c =28 A )(右側(cè))。(b)用于蛋白質(zhì)生成的HA-鐵蛋白
表達(dá)載體的圖示。(c)鐵蛋白納米顆粒(np)和HA-np的大小排阻層析的層析譜(左側(cè))。在曲線上方用垂直線標(biāo)示校正標(biāo)準(zhǔn)品的分子量(kDa)。對(duì)鐵蛋白納米顆粒和HA-np計(jì)算的分子量分別是419和2，165kDa，并且在預(yù)測(cè)的分子量(分別為408和2，040kDa)的10%內(nèi)。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定純化的鐵蛋白納米顆粒和HA-np的顆粒大小分布(半徑)(中間)。標(biāo)示測(cè)量的均值直徑(d)。純化的鐵蛋白np和HA-np的多分散性指數(shù)分別是0.035和0.011。通過(guò)SDS-PAGE分析純化的HA三聚體(凝血酶未切割)>HA-np和鐵蛋白納米顆粒(右側(cè))。(d)鐵蛋白納米顆粒(左側(cè))和HA-np(右側(cè))的負(fù)染色透射電子顯微術(shù)圖像。最初，以67，OOOx放大率記錄圖像。(e)顯示了代表HA-鐵蛋白np (頂部小圖)和實(shí)際TEM圖像(底部小圖)的八面體四次、三次和兩次對(duì)稱的模型。在圖像中對(duì)可見的HA刺突計(jì)數(shù)。
[0034]圖2:鐵蛋白的遺傳和結(jié)構(gòu)比較。(a)存在于RSCB PDB中的鐵蛋白的系統(tǒng)樹分析。22種序列含有16鐵蛋白，包括Vc(霍亂弧菌(Vibrio cholerae))、Ec (大腸桿菌(E.coli))、Hp(幽門螺桿菌)、Af (閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus))、Pf (激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))、Tm(海棲熱袍菌(Thermatoga maritime) )、Pm(多列擬菱形藻(Pseudo-nitzschia multiseries))、Tn (L)(粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)輕鏈)、大豆(葉綠體)、馬(L)(輕鏈)、人(L)、⑶和(M)(分別為輕鏈、重鏈和線粒體)、小鼠(L)(輕鏈)、和蛙(M)和(L)(分別為中等和低級(jí)亞基)，和6種細(xì)菌鐵蛋白(B)，包括Mt (B)(結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) )、Pa (B)(銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) )、Rs (B)(球形紅細(xì)菌(Rhodabacter sphaeroides))、Bm(B)(馬爾他布魯氏菌(Brucella melitensis))、Av (B)(維捏蘭德固氮菌(Azobacter vinelandii))和 Ec (B)。使用 Clustal W2 (www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)用 Gonnet 矩陣比對(duì)蛋白質(zhì)序列，并使用鄰接法(neighbor-joining method)用 Phylodendron 程序(http://iubi0.bi0.1ndiana.edu/treeapp/treeprint_form.html)產(chǎn)生系統(tǒng)樹。(b)幽門螺桿菌與小鼠(輕鏈)(左側(cè))或人(輕鏈)(中間)，與小鼠和人(輕鏈)(右側(cè))之間的表面暴露殘基的比較。使用由Clustal W2產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列比對(duì)，表滿暴露殘基的保守由UCSF嵌合物給予。兩種鐵蛋白間的保守的和變化的殘基分別以明売和黑暗殘基顯不。PDB文件3bve (幽門螺桿菌)(左側(cè)和中間)和lh96(小鼠輕鏈)(右側(cè))用于表面渲染(surface rendering)。
[0035]圖3:HA-鐵蛋白np的抗原性表征。(a)通過(guò)ELISA測(cè)量針對(duì)HA球狀頭部和莖的單抗的結(jié)合。將等量(每孔20 0ng HA)HA三聚體(▲ )、TIV( 實(shí)心 )、HA-鐵蛋白(籲)或Ferr (與HA-Ferr等摩爾 量)(〇)在板上包被,并將孔用抗頭部單抗(3u_u)和抗莖單抗CR6261探查。對(duì)每種抗體計(jì)算半最大有效結(jié)合濃度(EC5tl),并且以ng ml-1顯示。(b)通過(guò)使用HA三聚體、HA-Ferr或Ferr作為競(jìng)爭(zhēng)物抑制抗體介導(dǎo)的1999NC假型病毒中和。將中和抑制以相對(duì)于無(wú)競(jìng)爭(zhēng)物對(duì)照的百分比抑制繪圖?？骨o中和性單抗FlO (左側(cè))和CR6261(右側(cè))分別以3.125和25 μ g ml-1使用。將競(jìng)爭(zhēng)物蛋白質(zhì)以終濃度20 μ g ml-1添加至反應(yīng)。
[0036]圖4:經(jīng)HA-np免疫的小鼠中的免疫應(yīng)答。(a)在具有或沒(méi)有Ribi佐劑和3周時(shí)間間隔的情況中用0.17118011撤的量)1'1￥或撤-即的兩次免疫后針對(duì)1999% HA的HAI (左側(cè))，IC9tl中和(中間)、和抗HA抗體終點(diǎn)效價(jià)(右側(cè))。在第二次免疫后2周收集免疫血清。數(shù)據(jù)以具有均值線(η = 5)的盒須圖(從下至上四分位數(shù)為框，從最小值至最大值為須)呈現(xiàn)。(b)由HA-三聚體、TIV、或HA-np引發(fā)的免疫血清的中和寬度。使用Ribi佐劑和4周時(shí)間間隔用20 μ g三聚體HA蛋白將額外的一組小鼠(η = 4)免疫兩次。在第二次免疫后2周收集免疫血清。測(cè)定針對(duì)一組HlNl假型病毒的IC5tl中和效價(jià)。(c)針對(duì)幽門螺桿菌(頂部)和小鼠(底部)鐵蛋白細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。使用Ribi佐劑和3周時(shí)間間隔用1.67^如撤的量)1^或撤-即，或0.57yg鐵蛋白納米顆粒(與HA-np等摩爾)將小鼠免疫兩次。在第二次免疫后11天收獲脾細(xì)胞和免疫血清。通過(guò)ICS(左側(cè))測(cè)量細(xì)胞因子生成性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞，并且通過(guò)ELISA (右側(cè))檢測(cè)抗體應(yīng)答。所有表達(dá)IFN- Y、TNFa、或IL-2的細(xì)胞鑒定為細(xì)胞因子+細(xì)胞。將響應(yīng)用覆蓋整個(gè)幽門螺桿菌或小鼠鐵蛋白(組合的重鏈和輕鏈)的特定肽刺激而活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞中細(xì)胞因子+細(xì)胞的百分比繪圖。使用重組幽門螺桿菌和純化的小鼠(肝)鐵蛋白檢測(cè)抗鐵蛋白抗體應(yīng)答。數(shù)據(jù)以具有均值線(η = 5)的盒須圖呈現(xiàn)。
[0037]圖5:小鼠中HA-納米顆粒的連續(xù)免疫。將小鼠用1.67 μ g(HA的量)2009珀斯(H3) HA-納米顆?；?.57 μ g (與HA-納米顆粒等摩爾)空鐵蛋白納米顆粒在第O周時(shí)預(yù)免疫，然后用1.67 μ g (HA的量)1999NC (HI) HA-納米顆粒在第3周時(shí)免疫。使用Ribi作為佐劑。在沒(méi)有用空鐵蛋白納米顆?；騂3HA-納米顆粒預(yù)免疫的情況中用1999NC(H1)HA-納米顆粒免疫另一組小鼠。(a)對(duì)幽門螺桿菌鐵蛋白(左側(cè))和2009珀斯H3HA (右側(cè))的抗體應(yīng)答。通過(guò)ELISA分析用H3HA-納米顆粒或空鐵蛋白納米顆粒免疫后2周收集的免疫血清。(b)在1999NC(H1)HA-納米顆粒免疫后對(duì)1999NC(H1)的免疫應(yīng)答。在第3周時(shí)用HlHA-納米顆粒免疫未免疫的小鼠或?qū)﹁F蛋白或H3HA具有預(yù)先免疫的小鼠，并在免疫后2周測(cè)量HAI (左側(cè))、IC9tl中和(中間)和ELISA(右側(cè))抗體效價(jià)。數(shù)據(jù)以具有均值線(η=5)的盒須圖呈現(xiàn)。
[0038]圖6:三價(jià) HA-np 的形成。(a)將由來(lái)自 2009CA(H1) ,2009 珀斯(H3)或 2006FL (乙型)的HA組成的HA-np純化，并通過(guò)TEM顯現(xiàn)。(b)經(jīng)免疫小鼠中針對(duì)2009CA (HlNl)和2009珀斯(H3N2)病毒的HAI效價(jià)。使用Ribi佐劑及3周時(shí)間間隔用1.67 μ g(HA的量)單價(jià)H1、單價(jià)H3、單價(jià)乙型、或5.0μ g(HA的總量)三價(jià)HA-np或TIV(2011-2012季)將小鼠免疫兩次。在第二次免疫后2周收集免疫血清。數(shù)據(jù)以具有均值線(η = 5)的盒須圖呈現(xiàn)。
[0039]圖7:用HA-np免疫的白鼬中誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫。使用Ribi佐劑和4周時(shí)間間隔用 PBS(對(duì)照)、7.5ug(2.5ug H1HA)TIV 或 2.5ug(HA 的量)1999NC HA-np 將白鼬免疫兩次。對(duì)照動(dòng)物接受PBS。(a)測(cè)定針對(duì)同源1999NC HA的經(jīng)免疫白鼬中的HAl (左側(cè))、IC90中和(中間)、和抗HA抗體終點(diǎn)效價(jià)(右側(cè))。分別在第一次(R.Salomon, R.G.Webster, Theinfluenza virus enigma.Cel1136，402-410(2009)和第二次(L.C.Lambert, A.S.Fauci, Influenza vaccines for the future.N Engl J Med363,2036-2044(2010))免疫后3和2周收集免疫血清。數(shù)據(jù)以具有均值線(η = 6)的盒須圖(box-and-whiskers)呈現(xiàn)。(b)保護(hù)經(jīng)免疫的白鼬免于不匹配的2007Bris病毒攻擊。在第二次免疫后5周用106 550%雞胚感染劑量(egg infectious dose) (EID50)的2007Bris病毒攻擊白鼬。通過(guò)50%組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID5tl)測(cè)定法(左側(cè))測(cè)定攻擊后1、3和5天的鼻清洗中的病毒效價(jià)。經(jīng)TIV免疫組中的6只白鼬中的I只在第5天顯示可測(cè)量的病毒。在經(jīng)HA-np免疫的組中第3天時(shí)6只白鼬中的4只和第5天時(shí)6只白鼬中的6只中的病毒效價(jià)在檢測(cè)限?102)下。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)均值病毒載量及標(biāo)準(zhǔn)差(s.d.)繪圖(η = 6)。還監(jiān)測(cè)病毒攻擊后的體重變化(右側(cè))。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表從預(yù)攻擊(第O天)起的體重均值百分比變化。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)均值體重變化及標(biāo)準(zhǔn)差(s.d.)繪圖(η = 6)。
[0040]圖8:針對(duì)莖和RBS的抗體的改善的中和寬度和檢測(cè)。(a)白鼬中免疫血清的中和寬度。針對(duì)一組HlNl假型病毒(左側(cè))的IC5tl中和效價(jià)和針對(duì)1934PR8和2007Bris HlNl病毒(右側(cè))的HAI效價(jià)。HAI效價(jià)以具有均值線(η = 6)的盒須圖呈現(xiàn)。(b)通過(guò)HA_np免疫引發(fā)的針對(duì)莖和RBS的抗體。將白鼬免疫血清(以1:100稀釋)用Λ莖HA表達(dá)細(xì)胞預(yù)吸附，并通過(guò)ELISA分析其對(duì)WT或Λ莖HA的結(jié)合(左側(cè))。將免疫血清(以1: 1，000稀釋)用ARBS HA表達(dá)細(xì)胞預(yù)吸附，并通過(guò)ELISA分析其對(duì)WT或ARBS HA的結(jié)合(中間)。將均值終點(diǎn)稀釋效價(jià)與s.d.一起繪圖(η = 6)。用針對(duì)莖的單抗CR6261進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)ELISA(右側(cè))。在存在同種型對(duì)照IgG或CR6261的情況中對(duì)用Λ莖預(yù)吸附的免疫血清測(cè)試對(duì)HA的結(jié)合。每個(gè)符號(hào)代表單個(gè)白鼬的效價(jià)(η = 6)。(c)用WT、Δ莖或Λ RBS HA蛋白的中和競(jìng)爭(zhēng)(左側(cè))。在存在無(wú)關(guān)蛋白(對(duì)照)、WT、Δ莖或ARBS HA作為競(jìng)爭(zhēng)物的情況中測(cè)量針對(duì)1986Sing、1995北京、1999NC和2007Bris的HA_np免疫血清的中和。將血清稀釋 1:200 (1986Sing, 2007Bris) ,1:800 (1995 北京)或 1: 3，200 (1999NC)的百分比中和繪圖。每個(gè)符號(hào)代表單個(gè)白鼬血清，并且均值與s.d.—起以紅線標(biāo)示(對(duì)于1986Sing，1995北京和1999NC，n = 6 ;對(duì)于2007Bris，n = 3)。通過(guò)每種競(jìng)爭(zhēng)物蛋白質(zhì)的中和抑制測(cè)定針對(duì)莖和RBS的中和的相對(duì)貢獻(xiàn)(右側(cè))。將中和每種病毒中的均值百分比貢獻(xiàn)以堆積柱狀圖繪圖(η = 6).[0041]圖9:ARBS HA探針的表征。(a)與抗 RBS 單抗 CH65Fab (PDB: 3sm5)的 HA (甲型/所羅門群島/3/2006)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(J.R.Whittle等，Broadly neutralizinghuman antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza virushemagglutinin.Proc Natl Acad Sci USA108, 14216-14221 (2011))(左側(cè))。CH65 接觸區(qū)的特寫視圖(右側(cè))。已經(jīng)突變?yōu)樵讦?RBS突變體中糖基化的殘基HA1190是突出顯示的。CH65Fab結(jié)合的HAl啟動(dòng)子是變暗的。(b)來(lái)自1999NC和2007Bris的WT和Λ RBS HA的可溶性三聚體的表征。將WT和ARBS HA蛋白用抗RBS(CH65)、莖(CR6261)和對(duì)照(抗HIV，VRCOI)單抗免疫沉淀。然后，將免疫復(fù)合物在Lamini緩沖液中溶解，并通過(guò)SDS-PAGE分析?？贵w重鏈和輕鏈分別標(biāo)記為HC和LC。
[0042]圖10:HA-np的純化。通過(guò)常規(guī)的碘克沙醇(iodixanol)梯度超速離心常規(guī)純化ΗΑ-ηρο通過(guò)SDS-PAGE和使用針對(duì)1999NC HA的單抗的Western印跡確認(rèn)含有HA_np的級(jí)分。HA-np以約1.15g/ml的密度在級(jí)分中富集。
[0043]圖11:使用泛組 IHA-鐵蛋白np免疫小鼠和白鼬的方案。用PBS(對(duì)照)或Ribi中的6.8ug(l.7ug每種HA-鐵蛋白np)泛組I疫苗將小鼠肌內(nèi)注射兩次(第O周和第4周)。用PBS (對(duì)照)或Ribi中的IOug (2.5ug每種HA-鐵蛋白np)泛組I疫苗將白鼬肌內(nèi)注射兩次(第O周和第4周)。
[0044]圖12:針對(duì)組IHA假型病毒的小鼠抗血清的中和活性。針對(duì)指定HA假型病毒的來(lái)自對(duì)照或泛組1ΗΑ-ηρ免疫小鼠的鼠抗血清的中和活性。對(duì)所有組顯示IC50效價(jià)。
[0045]圖13:針對(duì)組IHA假型病毒的白鼬抗血清的中和活性。針對(duì)指定HA假型病毒的來(lái)自對(duì)照或泛組1ΗΑ-ηρ免疫白融的白融抗血清的中和活性。對(duì)所有組顯示IC50效價(jià)。
[0046]圖14:使用獲自鐵蛋白免疫研究的血清實(shí)施HlHAI測(cè)定法。使用真實(shí)的Hl病毒實(shí)施這些研究，并使用HA-鐵蛋白np實(shí)施H2和H5HAI。
[0047]圖15:保護(hù)白鼬免于甲型/布里斯班/59/2007Brisbane (HlNl) (2007Bris)流感的病毒攻擊。將兩組白鼬(對(duì)于對(duì)照為η = 6且對(duì)于泛組I免疫為η = 5)用泛組IHA np疫苗或PBS (對(duì)照)免疫，并用異源2007Bris病毒(IO6 5EID5tl)攻擊。在攻擊后第3天和第5天收集的鼻試樣中測(cè)量病毒效價(jià)。在MDCK細(xì)胞中使用終點(diǎn)滴定測(cè)定效價(jià)。
[0048]圖16:保護(hù)白鼬免于甲型/墨西哥/2009 (HlNl) (2009Mex)流感的病毒攻擊。將兩組白鼬(η = 6)用泛組IHA np疫苗或PBS (對(duì)照)免疫，并用異源2009Mex病毒(IO6 5EID5tl)攻擊。在攻擊后第3天和第5天收集的鼻試樣中測(cè)量病毒效價(jià)。在MDCK細(xì)胞中使用終點(diǎn)滴定測(cè)定效價(jià)。
[0049]圖17:流感HA莖區(qū)的保守性。(左側(cè)，右側(cè))與組I和組2病毒兩者起反應(yīng)的中和性抗體在圖中顯示的易損性位點(diǎn)處起作用。(右側(cè))流感HA蛋白的空間填充模型，其顯不了超過(guò)800種人HlNl株中的氣基酸序列保守性。明売的殘基標(biāo)不100%保守的殘基。黑暗的殘基指不變異位點(diǎn)。
[0050]圖18:HA穩(wěn)定化莖蛋白的設(shè)計(jì)。(A)與HA(頂部)相比HA SS(底部)的示意圖。通過(guò)將GWG接頭插入HAlRBD頭部(替換HA2的殘基59到93而插入的gp41融合后三聚化基序)的殘基42和314之間，將GG接頭插入HA2和gp41HR2螺旋之間，并將NGTGGGSG接頭插入兩個(gè)gp41螺旋之間構(gòu)建HA SS0在補(bǔ)充材料中提供H1NC99SS的基因序列。(B)與HASS模型比較的HA(PDB條目1RU7)的三聚體和單體表示。分別對(duì)上述小圖著色，單體表示也以黃色顯示CR6261表位，并且在穩(wěn)定化HA莖中省略的HA殘基為灰色。(C)根據(jù)ELISA，CR6261、FI6v3、和VHl-69Ab70-5B03的種系對(duì)HA和SS具有類似的親和力。HA SS與CR6261競(jìng)爭(zhēng)(D)對(duì)HA的結(jié)合和(E)與可溶性HA三聚體類似的HlNl假病毒的中和。
[0051]圖19。HA和HA SS探針的大小排阻層析譜。在曲線上以垂直線顯示校正標(biāo)準(zhǔn)品。
[0052]圖20:對(duì)納米顆粒的電子顯微術(shù)分析。將純化的SS-np進(jìn)行透射電子顯微術(shù)分析。將樣品用鑰酸銨負(fù)染色，并在Tecnai T12顯微鏡(FEI)上以80kV用CXD照相機(jī)(AMTCorp.)記錄圖像 。顯示了較低(左側(cè))和較高(右側(cè))放大率的圖像。SS刺突從顆粒核心垂直突出，并且明顯可見。
[0053]圖21:HA SS-鐵蛋白np的抗原性表征。通過(guò)ELISA表征純化的HA SS和HA SS-np結(jié)合單克隆抗體CR6261(左側(cè))和FI6v3(右側(cè))的能力。HA和HIV gpl20蛋白充當(dāng)對(duì)照。
[0054]圖22:用HA-np引發(fā)劑和HA SS-np加強(qiáng)劑異源免疫的小鼠的免疫血清對(duì)保守的HA莖表位是反應(yīng)性的。通過(guò)疫苗接種引發(fā)的抗體靶向保守的HA莖表位，因?yàn)閱为?dú)的小鼠在wt和Λ莖HA變體之間擁有差異結(jié)合(終點(diǎn)稀釋的最小值2倍差異)。在匹配的wt和Λ莖構(gòu)建體上方給予展示差異結(jié)合的小鼠的百分比。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0055]圖23:用HA SS免疫的小鼠的免疫血清中和多種多樣的假病毒株。針對(duì)Hl同亞型(homosubtypic)毒株和H2、H5和H9組-1異亞型(heterosubtypic)毒株對(duì)單獨(dú)的小鼠顯示IC50值。虛線代表測(cè)定的最低稀釋(50)。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0056]圖24:用HA SS-ηρ加強(qiáng)提高白鼬中針對(duì)HlNl新喀里多尼亞(New Calendonia)的中和效價(jià)。對(duì)來(lái)自單個(gè)小鼠的免疫前、HA FL-np引發(fā)的、和HA SS-ηρ加強(qiáng)的血清計(jì)算假病毒中和性效價(jià)。誤差棒代表數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0057]圖25:CMV8x/R-HlNC HA(517)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0058]圖26:CMV8x/R-HlCA HA(518)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0059]圖27:CMV8x/R-H2Sing HA(514)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0060]圖28:CMV8x/R-H3HK HA(519)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。[0061]圖29:CMV8x/R-H3Bris HA(519)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0062]圖30:CMV8x/R-H5Indo HA(520)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0063]圖31:CMV8x/R-B.Florida HA (534)_SGG_egm 和相關(guān) HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0064]圖32:CMV8x/R-H3珀斯HA (519)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0065]圖33:CMV8x/R-HlBris HA(517)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0066]圖34:CMV8x/R-B.Bris HA(535)_SGG_egm和相關(guān)HA-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0067]圖35:CMV8x/R-HlNC SS Gen4.55_SGG_egm和相關(guān)HA SS-鐵蛋白融合蛋白的圖譜和序列。
[0068]圖36:CMV/R HlCA SS/Gen4.55/鐵蛋白的圖譜和序列。
[0069]圖37:CMV/R HlBris SS/Gen4.55/鐵蛋白的圖譜和序列。
[0070]圖38:CMV/R H2Sing SS/Gen4.55/ 鐵蛋白的圖譜和序列。
[0071]圖39:CMV/R H3Bris SS/Gen4.55/鐵蛋白的圖譜和序列。
[0072]圖40:CMV/R H3珀斯SS/Gen4.55/鐵蛋白的圖譜和序列。
[0073]圖41:CMV/R H3HK68SS/Gen4.55/ 鐵蛋白的圖譜和序列。
[0074]圖42:CMV/R H5Indo SS/Gen4.55/ 鐵蛋白的圖譜和序列。
[0075]圖43:CMV/R B Bris SS/Gen4.55/鐵蛋白的圖譜和序列。
[0076]圖44:CMV/R B FL SS/Gen4.55/鐵蛋白的圖譜和序列。
[0077]發(fā)明詳述
[0078]本發(fā)明涉及流感病毒的新穎疫苗。更具體地，本發(fā)明涉及新穎的、基于流感血凝素蛋白的疫苗，其引發(fā)針對(duì)一大批流感病毒的免疫應(yīng)答。它還涉及基于自身裝配的鐵蛋白的納米顆粒，該納米顆粒在其表面上展示流感血凝素蛋白的免疫原性部分。此類納米顆?？捎糜卺槍?duì)流感病毒對(duì)個(gè)體接種疫苗。因而，本發(fā)明還涉及用于生成此類納米顆粒的融合蛋白和編碼此類蛋白質(zhì)的核酸分子。另外，本發(fā)明涉及生成本發(fā)明的納米顆粒的方法，及使用此類納米顆粒對(duì)個(gè)體接種疫苗的方法。
[0079]在進(jìn)一步描述本發(fā)明前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于描述的具體實(shí)施方案，因此當(dāng)然可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文中使用的術(shù)語(yǔ)僅為了描述具體的實(shí)施方案，而并不意圖為限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅會(huì)以權(quán)利要求書為限。
[0080]應(yīng)當(dāng)注意到，如本文中及所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，核酸分子指一種或多種核酸分子。因此，術(shù)語(yǔ)“ 一個(gè)”、“ 一種”、“ 一個(gè)/種或多個(gè)/種”和“至少一個(gè)/種”可以互換使用。類似地，術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”和“具有”可以互換使用。進(jìn)一步注意到，權(quán)利要求書可以撰寫為排除任何任選要素。因此，此陳述意圖充當(dāng)與權(quán)利要求要素的敘述結(jié)合使用排除術(shù)語(yǔ)，如“單獨(dú)”、“僅”等，或者使用“負(fù)”限定的前置基礎(chǔ)。[0081]在上文外，除非另有明確定義，本文中公開的各個(gè)實(shí)施方案共同的下列術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)如下定義:
[0082]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)免疫原性指特定蛋白質(zhì)或其特定區(qū)域引發(fā)對(duì)特定蛋白質(zhì)，或包含與特定蛋白質(zhì)具有高度同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的能力。依照本發(fā)明，兩種具有高度同一性的蛋白質(zhì)具有至少80%相同，至少85%相同，至少87%相同，至少90%相同，至少92%相同，至少94%相同，至少96%相同，至少98%相同或至少99%相同的氨基酸序列。
[0083]如本文中使用的，對(duì)本發(fā)明的疫苗或納米顆粒的免疫應(yīng)答是受試者中形成對(duì)疫苗中存在的血凝素蛋白的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。出于本發(fā)明的目的，“體液免疫應(yīng)答”指由抗體分子，包括分泌性(IgA)或IgG分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而“細(xì)胞免疫應(yīng)答”指由T-淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫的一個(gè)重要方面牽涉細(xì)胞裂解T細(xì)胞(“CTL”)的抗原特異性應(yīng)答。CTL對(duì)與由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合呈遞，并且在細(xì)胞表面上表達(dá)的肽抗原具有特異性。CTL幫助誘導(dǎo)并促進(jìn)對(duì)胞內(nèi)微生物的破壞，或者此類微生物感染的細(xì)胞的裂解。細(xì)胞免疫的另一個(gè)方面牽涉輔助T細(xì)胞的抗原特異性應(yīng)答。輔助T細(xì)胞作用為幫助刺激功能，并且聚焦非特異性效應(yīng)細(xì)胞針對(duì)在其表面上展示與MHC分子結(jié)合的肽抗原的細(xì)胞的活性。細(xì)胞免疫應(yīng)答還涉及生成由活化的T細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞，包括那些自CD4+和CD8+T細(xì)胞衍生的細(xì)胞生成的細(xì)胞因子、趨化因子和其它此類分子。
[0084]因此，免疫學(xué)應(yīng)答可以是刺激CTLjP /或輔助T細(xì)胞生成或活化的應(yīng)答。也可以刺激趨化因子和/或細(xì)胞因子的生成。疫苗也可以引發(fā)抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，免疫學(xué)應(yīng)答可以包括下列一種或多種效應(yīng):B細(xì)胞的抗體(例如IgA或IgG)生成；和/或特異性針對(duì)疫苗中存在的血凝素蛋白的抑制、細(xì)胞毒性、或輔助T細(xì)胞和/或T細(xì)胞的活化。這些應(yīng)答可以用來(lái)中和感染性，和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體，或抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)以對(duì)經(jīng)免疫個(gè)體提供保護(hù)。可以使用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定法和中和測(cè)定法測(cè)定此類應(yīng)答。
[0085]依照本發(fā)明，用于分類流感病毒的所有命名是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的。因此，流感病毒的類型或組指甲型流感、乙型流感或丙型流感。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，病毒稱為特定類型指相應(yīng)Ml (基質(zhì))蛋白或NP (核蛋白)的序列差異。甲型流感病毒進(jìn)一步分成組I和組2。這些組進(jìn)一步分成亞型，其涉及基于其HA蛋白序列的病毒分類。目前公認(rèn)的亞型的例子是HI, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H8, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 或 H16。組 I 流感亞型是 HI, H2, H5, H7 和 H9。組 2 流感亞型是 H4, H4, H6, H8, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 和H160最后，術(shù)語(yǔ)毒株指亞型內(nèi)彼此的差異在于它們?cè)谄浠蚪M中具有小的遺傳變異的病毒。
[0086]如本文中使用的，中和性抗體指阻止流感病毒完成一輪復(fù)制的抗體。如本文中定義的，一輪復(fù)制指病毒的生命周期，其以病毒附著宿主細(xì)胞開始并且以新形成的病毒從宿主細(xì)胞中出芽結(jié)束。此生命周期包括但不限于附著細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞，HA蛋白的切割和重排，病毒膜與內(nèi)體膜的融合，病毒核糖核蛋白釋放入胞質(zhì)中，新病毒顆粒的形成和病毒顆粒從宿主細(xì)胞膜中出芽的步驟。
[0087]如本文中使 用的，廣泛中和性抗體指中和超過(guò)一種流感病毒類型、亞型和/或毒株的抗體。例如，針對(duì)來(lái)自甲型流感病毒的HA蛋白引發(fā)的廣泛中和性抗體可以中和乙型或丙型病毒。作為別的例子，針對(duì)來(lái)自組I流感病毒的HA蛋白引發(fā)的廣泛中和性抗體可以中和組2病毒。作為別的例子，針對(duì)來(lái)自一種病毒亞型或毒株的HA蛋白引發(fā)的廣泛中和性抗體可以中和另一種病毒亞型或毒株。例如，針對(duì)來(lái)自Hl流感病毒的HA蛋白引發(fā)的廣泛中和性抗體可以中和來(lái)自一種或多種選自下組的亞型的病毒:H2，H3, H4, H5, H6, H7, H8, H8, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15 或 H16。
[0088]如本文中使用的，流感血凝素蛋白或HA蛋白指全長(zhǎng)流感血凝素蛋白或其任何部分，其能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。優(yōu)選的HA蛋白是那些能夠形成三聚體的。全長(zhǎng)流感血凝素蛋白的表位指此類蛋白質(zhì)中能引發(fā)針對(duì)同源流感毒株，即衍生HA的毒株的中和性抗體應(yīng)答的部分。在一些實(shí)施方案中，此類表位也能引發(fā)針對(duì)異源流感毒株，即與免疫原的HA的毒株具有不同HA的毒株的中和性抗體應(yīng)答。
[0089]就血凝素蛋白而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，來(lái)自不同流感病毒的血凝素蛋白由于蛋白質(zhì)突變(插入、缺失)而可以具有不同長(zhǎng)度。因此，提及相應(yīng)區(qū)域指另一種蛋白質(zhì)中與比較的區(qū)域在序列、結(jié)構(gòu)和/或功能上相同或幾乎相同(例如至少95%相同，至少98%相同或至少99%相同)的區(qū)域。例如，就血凝素蛋白的莖區(qū)而言，另一種血凝素蛋白中的相應(yīng)區(qū)域不能具有相同的殘基數(shù)目，但是會(huì)具有幾乎相同的序列，且會(huì)實(shí)施相同的功能。為了更好闡明病毒間的序列比較，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用編號(hào)系統(tǒng)，其相對(duì)于參照序列敘述氨基酸位置。因此，來(lái)自不同流感毒株的血凝素蛋白中的相應(yīng)氨基酸殘基就其與蛋白質(zhì)N端氨基酸的距離而言可以沒(méi)有相同的殘基號(hào)。例如，使用H3編號(hào)系統(tǒng)，提及甲型/新喀里多尼亞/20/1999 (1999NC，Hl)中的殘基100不意味著其是距N端氨基酸的第100個(gè)殘基。取而代之，甲型/新喀里多尼亞/20/1999 (1999NC, Hl)的殘基100與流感H3N2毒株的殘基100比對(duì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解此類編號(hào)系統(tǒng)的使用。除非另有記錄，使用H3編號(hào)系統(tǒng)對(duì)本文中的血凝素蛋白中的氨基酸進(jìn)行提及。
[0090]依照本發(fā)明，三聚化域是在與蛋白質(zhì)或肽連接(又稱為融合)時(shí)容許融合蛋白與其它含有三聚化域的融合蛋白相互作用，使得形成三聚體結(jié)構(gòu)的一系列氨基酸。任何已知的三聚化域可以用于本發(fā)明。三聚化域的例子包括但不限于HIV-lgp41三聚化域、SIVgp41三聚化域、埃博拉(Ebola)病毒gp-2三聚化域、HTLV-lgp-21三聚化域、T4纖維蛋白(fibritin)三聚化域(即折疊子(foldon))、酵母熱休克轉(zhuǎn)錄因子三聚化域、和人膠原三聚化域。
[0091]如本文中使用的，變體指在序列上與參照序列相似但不相同的蛋白質(zhì)或核酸分子，其中變體蛋白質(zhì)(或由變體核酸分子編碼的蛋白質(zhì))的活性沒(méi)有顯著改變。這些序列變異可以是天然存在的變異或者它們可以經(jīng)由使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳工程化技術(shù)來(lái)工程化改造。此類技術(shù)的例子可見Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T等,于 Molecular Cloning—A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989, pp.9.31-9.57), 或于 Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, N.Y.(1989),6.3.1_6.3.6，這兩篇的完整內(nèi)容通過(guò)提及并入本文。
[0092]就變體而言，氨基酸或核酸序列的任何類型變化是可允許的，只要所得的變體蛋白質(zhì)保留引發(fā)針對(duì)流感病毒的中和性抗體的能力。此類變異的例子包括但不限于缺失、插入、取代及其組合。例如，就蛋白質(zhì)而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，一個(gè)或多個(gè)(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)氨基酸經(jīng)?？梢詮牡鞍踪|(zhì)的氨基和/或羧基端末端除去，而不顯著影響所述蛋白質(zhì)的活性。類似地，一個(gè)或多個(gè)(例如2，3，4，5，6，7，8，9或10)氨基酸經(jīng)?？梢圆迦氲鞍踪|(zhì)中，而不顯著影響蛋白質(zhì)的活性。
[0093]如記錄的，相對(duì)于本文中公開的流感HA蛋白，本發(fā)明的變體蛋白質(zhì)可以含有氨基酸取代。任何氨基酸取代是可允許的，只要蛋白質(zhì)的活性不受顯著影響。在這點(diǎn)上，本領(lǐng)域中應(yīng)當(dāng)理解，氨基酸可以基于其物理特性而分成組。此類組的例子包括但不限于帶電荷的氨基酸、不帶電荷的氨基酸、極性不帶電荷的氨基酸、和疏水性氨基酸。含有取代的優(yōu)選變體是那些其中的氨基酸用來(lái)自相同組的氨基酸取代的變體。此類取代稱為保守取代。
[0094]天然存在的殘基可以基于共同的側(cè)鏈特性而分成類:
[0095]I)疏水性:Met, Ala, Val, Leu, He ；
[0096]2)中性親水性:Cys, Ser, Thr ；
[0097]3)酸性:Asp, Glu ；
[0098]4)堿性:Asn, Gin, His, Lys, Arg ；
[0099]5)影響鏈取向的殘基:Gly, Pro ;和
[0100]6)芳香基:Trp, Tyr, Phe。
[0101]例如，非保守取代可以牽涉用這些類別之一的成員替換來(lái)自另一類別的成員。
[0102]在進(jìn)行氨基酸變化中，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。基于每種氨基酸的疏水性和電荷性質(zhì)，已給每種氨基酸的親水指數(shù)賦值。親水指數(shù)是:異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘 氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。本領(lǐng)域一般了解親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用性生物學(xué)功能中的重要性(Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157:105-31)。已知可以用某些氨基酸替代其它具有相似親水指數(shù)或分值的氨基酸，而仍然保留相似的生物學(xué)活性。在進(jìn)行基于親水指數(shù)的變化中，親水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，在± I之內(nèi)的那些氨基酸取代是特別優(yōu)選的，且在±0.5之內(nèi)的那些氨基酸取代是甚至更特別優(yōu)選的。
[0103]本領(lǐng)域還了解可以基于疏水性有效地進(jìn)行類似氨基酸的取代，特別是在意圖將由此產(chǎn)生的生物功能等同性蛋白質(zhì)或肽用于結(jié)合免疫學(xué)發(fā)明(本案就是如此)的情況中。蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性(如由其相鄰氨基酸的親水性所決定的)與其免疫原性和抗原性，即與蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性相關(guān)聯(lián)。已將下列親水性數(shù)值(hydrophilicity value)賦予這些氨基酸殘基:精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。在進(jìn)行基于相似親水性數(shù)值的變化時(shí)，親水性數(shù)值在±2之內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，在± I之內(nèi)的那些氨基酸取代是特別優(yōu)選的，且在±0.5之內(nèi)的那些氨基酸取代是甚至更特別優(yōu)選的。還可以基于親水性鑒定來(lái)自一級(jí)氨基酸序列的表位。[0104]在期望此類取代時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定期望的氨基酸取代(無(wú)論是保守的還是非保守的)。例如，可以使用氨基酸取代來(lái)鑒定HA蛋白的重要?dú)埢蛘咛岣呋蚪档捅疚闹忻枋龅腍A蛋白的免疫原性、溶解度或穩(wěn)定性。下文在表1中顯示了例示性的氨基酸取代。
[0105]表1
【權(quán)利要求】
1.一種包含融合蛋白的納米顆粒，其中所述融合蛋白包含與第一流感血凝素(HA)蛋白連接的至少25個(gè)來(lái)自單體鐵蛋白亞基蛋白的連續(xù)氨基酸，使得所述納米顆粒在其表面上包含流感病毒HA蛋白三聚體。
2.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述納米顆粒形成八面體。
3.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述八面體由24個(gè)具有432對(duì)稱的亞基組成。
4.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述單體鐵蛋白亞基蛋白選自下組:細(xì)菌鐵蛋白、植物鐵蛋白、藻鐵蛋白、昆蟲鐵蛋白、真菌鐵蛋白和哺乳動(dòng)物鐵蛋白。
5.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述單體鐵蛋白亞基蛋白是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)鐵蛋白蛋白質(zhì)的單體亞基。
6.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述單體鐵蛋白亞基蛋白包含選自下組的氨基酸序列的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸:SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5。
7.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述單體鐵蛋白亞基蛋白包含與選自下組的氨基酸序列至少約80%相同的氨基酸序列:SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5。
8.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述單體亞基包含與SEQID NO:2的氨基酸5-167對(duì)應(yīng)的區(qū)域。
9.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述單體亞基包含選自下組的氨基酸序列:SEQIDNO:2 和 SEQ ID NO:5。
10.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含來(lái)自選自下組的流感病毒的血凝素蛋白的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸:甲型/新喀里多尼亞(NewCaledonia) /20/1999 (1999NC, HI)、甲型 / 加利福尼(California) /04/2009 (2009CA, HI)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亞 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛羅里達(dá) /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班 /60/2008 (2008Bris, B)。
11.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含與選自下組的氨基酸序列至少約80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQID NO:20, SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQID N0:38。
12.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含選自下組的氨基酸序列:SEQIDNO:8，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23，SEQ IDNO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:38。
13.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白能夠引發(fā)對(duì)包含選自下組的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQID NO:20, SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQID N0:38。
14.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含選自下組的區(qū)域:能夠容許血凝素三聚體形成的區(qū)域、莖區(qū)、胞外結(jié)構(gòu)域(ectodomain)、和包含從剛好在第二螺旋卷曲螺旋的最后一個(gè)氨基酸的遠(yuǎn)端的氨基酸殘基至跨膜域的第一個(gè)氨基酸的近端的氨基酸殘基的氨基酸序列的區(qū)域。
15.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含與選自下組的氨基酸序列至少約80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98。
16.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含選自下組的氨基酸序列:SEQIDNO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:86, SEQ IDNO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98。
17.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含與SEQID NO:8的氨基酸1-519對(duì)應(yīng)的區(qū)域。
18.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含血凝素刺突域。
19.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述血凝素蛋白包含選自下組的氨基酸序列:SEQIDNO:8 的氨基酸 1-519 和 SEQ ID NO: 11。
20.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述融合蛋白包含接頭序列。
21.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感血凝素莖區(qū)的免疫應(yīng)答。
22.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感血凝素刺突的免疫應(yīng)答。
23.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒株的免疫應(yīng)答，所述流感病毒株對(duì)于獲得所述血凝素蛋白的流感病毒株而言是異源的。
24.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答，所述流感病毒與獲得所述血凝素蛋白的流感病毒在抗原性上是趨異的。
25.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述融合蛋白包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ IDNO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。
26.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列:SEQIDNO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ IDNO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68。
27.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述融合蛋白包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO: 110SEQ IDNO:113SEQ ID NO:116SEQ ID NO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。
28.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述納米顆粒包含第二融合蛋白，該第二融合蛋白包含第二流感血凝素蛋白，其中所述第一和第二流感血凝素蛋白來(lái)自不同流感病毒類型。
29.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述納米顆粒包含第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含第二流感血凝素蛋白，其中所述第一和第二流感血凝素蛋白來(lái)自不同流感病毒亞型。
30.權(quán)利要求1的納米顆粒，其中所述納米顆粒包含第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含第二流感血凝素蛋白，其中所述第一和第二流感血凝素蛋白來(lái)自不同流感病毒株。
31.一種疫苗組合物，其包含權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的納米顆粒。
32.權(quán)利要求31的疫苗組合物，其進(jìn)一步包含至少一種別的納米顆粒，其中所述別的納米顆粒包含至少一種血凝素蛋白，該血凝素蛋白與所述第一血凝素蛋白和所述第二血凝素蛋白來(lái)自不同流感毒株。
33.一種生成針對(duì)流感病毒的疫苗的方法,該方法包括a)在一定的條件下表達(dá)融合蛋白，使得所述融合蛋白形成在其表面上展示血凝素三聚體的納米顆粒，所述融合蛋白包含與流感血凝素蛋白連接的單體鐵蛋白蛋白質(zhì)，并b)回收所述納米顆粒。
34.一種針對(duì)流感對(duì)個(gè)體接種疫苗的方法，該方法包括對(duì)個(gè)體施用納米顆粒，使得所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答，其中所述納米顆粒包含與流感血凝素蛋白連接的鐵蛋白單體亞基，且其中所述納米顆粒在其表面上展示流感血凝素三聚體。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒株的免疫應(yīng)答，所述流感病毒株對(duì)于獲得所述血凝素蛋白的流感病毒亞型而言是異源的。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒株的免疫應(yīng)答，所述流感病毒株對(duì)于獲得血凝素蛋白的流感病毒株而言是異源的。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答，所述流感病毒與獲得所述血凝素蛋白的流感病毒在抗原性上是趨異的。
38.權(quán)利要求34的方法，其中施用包括對(duì)所述個(gè)體施用第一疫苗組合物，然后在后來(lái)的時(shí)間，施用包含納米顆粒的第二疫苗組合物，所述納米顆粒包含HA-SS-鐵蛋白融合蛋白。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述HASS-鐵蛋白融合蛋白包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:80，SEQID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:98，其中所述HA SS-鐵蛋白融合蛋白弓丨發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述HASS-鐵蛋白融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:83, SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95 和 SEQ ID NO:98。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述HASS-鐵蛋白融合蛋白包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO: 110SEQID NO:113SEQ ID NO:116SEQ ID NO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO: 125和SEQ ID NO: 128，其中所述HA SS-鐵蛋白融合蛋白弓丨發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述HASS-鐵蛋白融合蛋白包含選自下組的序列:SEQID NO:101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO:110SEQ ID NO:113SEQ ID NO:116SEQID NO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128。
43.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一疫苗組合物包含納米顆粒，該納米顆粒包含來(lái)自選自下組的流感病毒的血凝素蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域:甲型/新喀里多尼亞 /20/1999 (1999NC, Hl)、甲型 / 加利福尼 /04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing，H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK，H3)、甲型 / 布里斯班/10/2007 (2007Bris，H3)、甲型 / 印度尼西亞 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛羅里達(dá) /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班 /60/2008 (2008Bris, B)。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一疫苗組合物蛋白質(zhì)的血凝素包含與選自下組的氨基酸序列至少約80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQID NO:17，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQID NO:35 和 SEQ ID NO:38。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一疫苗組合物蛋白質(zhì)的血凝素包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:20, SEQID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:38。
46.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一疫苗組合物包含HA-鐵蛋白融合蛋白，該HA-鐵蛋白融合蛋白包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID N0:41,SEQ IDNO:44，SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:59, SEQ IDNO:62, SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:68，其中所述納米顆粒引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。
47.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一疫苗組合物包含HA-鐵蛋白融合蛋白，該HA-鐵蛋白融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ IDNO:47，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ IDNO:65 和 SEQ ID NO:68。
48.權(quán)利要求38的方法，其中在施用所述第一疫苗組合物后10天-4周施用所述第二疫苗組合物。
49.一種融合蛋白，其包含與流感血凝素蛋白連接的單體鐵蛋白亞基蛋白。
50.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述單體鐵蛋白亞基蛋白選自下組:細(xì)菌鐵蛋白、植物鐵蛋白、藻鐵蛋白、昆蟲鐵蛋白、真菌鐵蛋白和哺乳動(dòng)物鐵蛋白。
51.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述單體亞基是幽門螺桿菌鐵蛋白蛋白質(zhì)的單體亞基。
52.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述單體鐵蛋白亞基蛋白包含容許所述融合蛋白自身裝配成納米顆粒的域。
53.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述單體鐵蛋白亞基蛋白包含至少25個(gè)來(lái)自選自下組的序列的連續(xù)氨基酸:SEQ ID NO:2和SEQ I NO:5，其中所述融合蛋白能夠自身裝配成納米顆粒。
54.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述單體亞基包含與選自下組的序列至少約80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5，其中所述融合蛋白能夠自身裝配成納米顆粒。
55.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述單體亞基包含與SEQID NO:2的氨基酸5-167對(duì)應(yīng)的區(qū)域。
56.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述單體亞基包含選自下組的氨基酸序列:SEQIDNO:2 和 SEQ ID NO:5。
57.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含至少25個(gè)來(lái)自選自下組的流感病毒的氨基酸:甲型/新喀里多尼亞/20/1999 (1999NC, Hl)、甲型/加利福尼 /04/2009 (2009CA，Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing，H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亞 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛羅里達(dá) /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯/16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班 /59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班/60/2008(2008Bris, B)。
58.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含與選自下組的氨基酸序列至少約80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:8，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 17，SEQID NO:20, SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQID NO:38。
59.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白能夠引發(fā)針對(duì)包含選自下組的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答:SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: `17，SEQID NO:20, SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35和SEQID NO:38。
60.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含與選自下組的氨基酸序列至少約80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68。
61.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列:SEQIDNO:41, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ IDNO:59，SEQ I D NO:62，SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:68。
62.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含選自下組的區(qū)域:能夠容許所述血凝素蛋白三聚化的區(qū)域、莖區(qū)、胞外結(jié)構(gòu)域、和包含從剛好在第二螺旋卷曲螺旋的最后一個(gè)氨基酸的遠(yuǎn)端的氨基酸殘基至跨膜域的第一個(gè)氨基酸的近端的氨基酸殘基的氨基酸序列的區(qū)域。
63.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含與SEQID NO:8的氨基酸1-519對(duì)應(yīng)的區(qū)域。
64.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含血凝素刺突域。
65.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含選自下組的氨基酸序列:SEQID NO:8 的氨基酸 1-519 和 SEQ ID NO: 11。
66.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含來(lái)自選自下組的流感病毒的莖區(qū):甲型/新喀里多尼亞/20/1999 (1999NC, Hl)、甲型/加利福尼/04/2009 (2009CA, Hl)、甲型 / 新加坡 1/1957 (1957Sing, H2)、甲型 / 香港 /1/1968 (1968HK, H3)、甲型 / 布里斯班 /10/2007 (2007Bris, H3)、甲型 / 印度尼西亞 /05/2005 (2005Indo, H5)、乙型 / 佛羅里達(dá) /4/2006 (2006Flo, B)、甲型 / 珀斯 /16/2009 (2009Per, H3)、甲型 / 布里斯班/59/2007 (2007Bris, HI)、乙型 / 布里斯班 /60/2008 (2008Bris, B)。
67.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述血凝素蛋白包含與SEQID NO:71, SEQ IDNO:74，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:89，SEQ IDNO:92, SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:98至少約80%相同的氨基酸序列。
68.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)接頭序列。
69.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO: 110SEQ IDNO:113SEQ ID NO:116SEQ ID NO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128。
70.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自下組的序列:SEQIDNO:101, SEQ ID N0:104SEQ ID N0:107SEQ ID NO:110SEQ ID NO:113SEQ ID NO:116SEQ IDNO:119SEQ ID NO:122SEQ ID NO:125 和 SEQ ID NO:128。
71.—種編碼權(quán)利要求49-70中任一項(xiàng)的融合蛋白的核酸分子。
72.權(quán)利要求71的核酸分子，其中所述核酸分子與啟動(dòng)子在功能上連接。
73.—種重組細(xì)胞，其包含權(quán)利要求71的核酸分子。
74.—種重組病毒,其包含權(quán)利要求71的核酸分子。
75.一種蛋白質(zhì)，其包含與選自下組的序列至少80%相同的氨基酸序列:SEQ IDNO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:86, SEQ IDNO:89，SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:98，其中所述蛋白質(zhì)與一個(gè)或多個(gè)三聚化域連接。
76.權(quán)利要求75的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與流感血凝素蛋白的頭區(qū)的至少一部分連接。
77.權(quán)利要求75的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)接頭區(qū)。
78.權(quán)利要求75的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)引發(fā)針對(duì)流感病毒的免疫應(yīng)答。
【文檔編號(hào)】A61K9/14GK103957891SQ201280057703
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月23日
【發(fā)明者】G.J.M.D.納貝爾, M.卡尼基尤, C-J.韋, P.M.麥克塔姆尼, H.M.亞西尼, J.C.博英格頓 申請(qǐng)人:美利堅(jiān)合眾國(guó) 由健康及人類服務(wù)部部長(zhǎng)代表