使用唾液酸酶抑制劑改進(jìn)的血小板保存的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種血小板添加液(PAS)，這種血小板添加液具有一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑；以及一種或多種PAS組分，所述組分包括一種鹽、一種檸檬酸鹽源、一種碳源、以及它們的任何組合。本發(fā)明還涉及多種方法、組合物和試劑盒，它們用于通過將分離的血小板與一種或多種唾液酸酶抑制劑一起保存來增加血小板的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。另外，本發(fā)明涉及多種方法和組合物，它們用于降低在來自一個(gè)或多個(gè)供體的血小板產(chǎn)品制劑中的唾液酸酶活性并且抑制一種或多種細(xì)菌的細(xì)菌增殖。
【專利說明】使用唾液酸酶抑制劑改進(jìn)的血Λ?、板保存
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)是2012年5月17日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/474，473的一個(gè)部分繼續(xù)申請(qǐng)；2012年5月17日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/474,627的一個(gè)部分繼續(xù)申請(qǐng)；以及2012年5月17日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/474,679的一個(gè)部分繼續(xù)申請(qǐng)，并且要求以下美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)柕臋?quán)益:2012年3月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/613，876 ;2012年3月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/613，837 ;2011年7月I日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/503，984 ;以及2011年5月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/487，077。
[0003]以上申請(qǐng)的全部教授內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。
[0004]政府支持
[0005]本發(fā)明全部或部分得到美國(guó)國(guó)家心肺及血液研究所(National Heart, Lung, andBlood Institute)的批準(zhǔn)號(hào)3R01HL089224-03S1的支持。該政府部門享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0006]發(fā)明背景
[0007]預(yù)期用于輸注的收集的血小板極易腐壞。血小板是無核骨髓來源的血細(xì)胞，它通過粘附至血管損傷位點(diǎn)并通過促進(jìn)血漿纖維蛋白凝塊的形成而保護(hù)受傷的哺乳動(dòng)物免于失血。由于骨髓衰竭而耗盡循環(huán)血小板的人遭受威脅生命的自發(fā)性出血，并且不太嚴(yán)重的血小板缺乏導(dǎo)致創(chuàng)傷或手術(shù)之后的出血并發(fā)癥。
[0008]隨著循環(huán)血小板計(jì)數(shù)降低(例如，約70，000個(gè)/μ L)，患者變得越來越容易皮膚出血。血小板計(jì)數(shù)少于20，000個(gè)/ μ L的患者極易出現(xiàn)粘膜表面的自發(fā)性出血，尤其是在骨髓障礙或衰竭引起血小板減少的時(shí)候。與骨髓障礙(如再生障礙性貧血、急性和慢性白血病、轉(zhuǎn)移癌)相關(guān)的血小板缺乏以及由癌癥治療(如電離輻射或化學(xué)療法)引起的缺乏都導(dǎo)致了重大公共衛(wèi)生問題。罹患與大手術(shù)、損傷以及敗血癥相關(guān)的血小板減少的患者也需要輸注大量的血小板。
[0009]半個(gè)世紀(jì)以前，在醫(yī)療護(hù)理方面的主要進(jìn)步是發(fā)展血小板輸注來矯正這類血小板缺乏，這使得在美國(guó)在現(xiàn)有輸注率下每年有大約260萬血小板輸注。然而，收集用來輸注的血小板極易腐壞，因?yàn)楫?dāng)保存在室溫或低于室溫下時(shí)，它們很快失去體內(nèi)止血活性。止血活性廣義地是指血小板群介導(dǎo)出血停止的能力。
[0010]血小板與所有其他可移植的組織不同，它們不能耐受冷藏并且如果經(jīng)受即使非常短時(shí)間的冷凍也會(huì)迅速從接受者的循環(huán)中消失。重要的是，使血小板存活變短的冷卻效應(yīng)被認(rèn)為是不可逆的并且冷卻的血小板變得不適合用于輸注。血小板損傷的第一可見效應(yīng)之一是從盤狀形態(tài)向球形形狀的不可逆轉(zhuǎn)換，以及由于鈣依賴性凝溶膠蛋白活化和磷酸肌醇介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚合所致的血小板表面上的刺狀突起外觀。當(dāng)血小板暴露在低于20°C的溫度下時(shí)，它們?cè)谛螤钌涎杆俳?jīng)歷這些改變。
[0011]在輸注之前將血小板保持在室溫下的這一需要施加了對(duì)血小板保存的獨(dú)特的一套昂貴且復(fù)雜的后勤需要(logistical requirement)。因?yàn)檠“逶谑覝叵率谴x活躍的，它們需要在氣體可滲透的容器中持續(xù)攪拌以允許氣體交換，從而防止代謝性酸中毒的毒性后果。室溫保存條件導(dǎo)致大分子降解和血小板止血功能降低，這一組缺點(diǎn)被稱為“保存損害”。此外，在室溫下保存促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，從而引起更高的細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)，這有效地將這種保存的持續(xù)時(shí)間限制為約5天。就此方面，到目前為止血小板的細(xì)菌污染是最頻繁的血液組分使用的感染性并發(fā)癥。在目前的比率下，I, OOO單位之一至2，000單位之一的血小板被細(xì)菌充分污染，從而對(duì)接受者造成重大風(fēng)險(xiǎn)。
[0012]因此，仍然存在著開發(fā)出改善或延長(zhǎng)人血小板在室溫或低于室溫下保存時(shí)體內(nèi)止血活性的藥劑、溶液和方法的迫切需要。存在著這樣做并且抑制細(xì)菌增殖的另一種更重要的需要。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明涉及一種血小板添加液(PAS)，該血小板添加液包含一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑；以及一種或多種包含以下各項(xiàng)的PAS組分:鹽(例如，鈉源、氯化物源、鉀源、鎂源、鈣源以及它們的組合)、檸檬酸鹽源(例如，檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸以及它們的組合)和/或碳源(例如，乙酸鹽、葡萄糖、蔗糖及其任意組合)。本發(fā)明的PAS維持在范圍在大約6.4與大約7.6之間的pH下。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的PAS進(jìn)一步包括磷酸鹽源(例如，單磷酸鈉、二磷酸鈉、三磷酸鈉以及它們的組合)。乙酸鹽源可包括例如乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸鎂或其組合。在一方面，鈉源可以是氯化鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉或其組合。類似地，氯化物源可以是氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀或其組合。在一個(gè)實(shí)例中，鉀源可以是氯化鉀、檸檬酸鉀、乙酸鉀、磷酸鉀、硫酸鉀或其組合。鎂源的實(shí)例包括氯化鎂、檸檬酸鎂、硫酸鎂以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，鈣源涵蓋氯化鈣、乙酸鈣、檸檬酸鈣或其組合。
[0015]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的PAS包含一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑；在約IOOmM與約300mM之間的范圍內(nèi)的量的鈉源；在約40mM與約IlOmM之間的范圍內(nèi)的量的氯化物源；在約2mM與約20mM之間的范圍內(nèi)的量的檸檬酸鹽源；在約IOmM與約50mM之間的范圍內(nèi)的量的乙酸鹽源；在約5mM與約50mM之間的范圍內(nèi)的量的磷酸鹽源；在約0.5mM與約IOmM之間的范圍內(nèi)的量的鉀源；在約0.5mM與約2.5mM之間的范圍內(nèi)的量的鎂源；以及在約0.5mM與約2.5mM之間的范圍內(nèi)的量的鈣源；其中該P(yáng)AS維持在約6.4與約7.6之間范圍內(nèi)的pH下(例如，約7.1至約7.4，或約7.2)。
[0016]在又另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明是涉及具有分離的血小板的血小板組合物；本發(fā)明的PAS ;以及血漿，其中該血小板組合物被維持在約6.4與約7.6之間范圍內(nèi)的pH下。在一方面，該血漿以按體積計(jì)約I %與約50 %之間范圍內(nèi)的量存在(例如，在20 %與40 %之間的血漿，或30%的血漿)。在又一個(gè)實(shí)施例中，血小板添加液以按體積計(jì)約50%與約99%之間的范圍內(nèi)的量存在。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步涉及適合于血小板保存的具有本發(fā)明的PAS的袋或容器。該袋或容器可進(jìn)一步包含分離的血小板并且/或者維持在約6.4與約7.6之間的范圍內(nèi)的pH下。
[0018]本發(fā)明涉及一種保存血小板的方法，其中分離的血小板是從一個(gè)或多個(gè)供體中獲得的。該方法包括使分離的血小板與在此描述的PAS接觸的步驟。該唾液酸酶抑制劑可以是例如胎球蛋白，2，3_脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)或其藥學(xué)上可接受的鹽；奧司他韋(Oseltamivir) ((3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基_3_(戊-3-基氧基)-環(huán)己-1-烯-1-羧酸)乙酯；扎那米韋(Zanamivir) ((2R，3R，4S)-4-胍基 _3_(丙-1-稀-2-基氛基)-2-((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羥基丙基)-3,4- 二氧-2H-批喃-6-羧酸)；拉尼娜米韋(Laninamivir) ((4S, 5R, 6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亞胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羥基-2-甲氧基丙基]-5,6- 二氧-4H-批喃-2-竣酸)；以及帕拉米韋(Peramivir) ((lS，2S，3S，4R)-3-[(lS)-l-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-( 二氨基亞甲基氨基)-2-羥基-環(huán)戊烷-1-羧酸)或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一個(gè)實(shí)施例中，唾液酸酶抑制劑是2，3_脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸的鈉鹽。該方法允許分離的血小板保存約I天至約21天的一段時(shí)間。該分離的血小板被保存在約1°C與約24°C之間的溫度下。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括以下步驟:冷卻血小板組合物至低于室溫的溫度；保存該血小板組合物一段時(shí)間；并且然后使該血小板組合物復(fù)溫回至室溫。在一方面，在一個(gè)時(shí)間段內(nèi)將血小板群用唾液酸酶抑制劑進(jìn)行處理，其中該時(shí)間段是在約I分鐘至約8小時(shí)之間的范圍內(nèi)。
[0019]本發(fā)明涉及用于制備血小板以供保存的方法，其中分離的血小板是從一個(gè)或多個(gè)供體中獲得的。這些方法包括使分離的血小板與如在此所述的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑接觸。該聚糖修飾劑可以是例如CMP唾液酸、CMP唾液酸前體、UDP半乳糖或其組合。在一方面，還可以將使CMP唾液酸前體轉(zhuǎn)化為CMP唾液酸的酶添加到血小板中。
[0020]本發(fā)明還涉及制備血小板以供保存的方法。該方法包括以下步驟:從一位或多位個(gè)體中分離血小板；并且使所分離的血小板與唾液酸酶抑制劑接觸,該唾液酸酶抑制劑的量足以減少唾液酸殘基從血小板表面聚糖上的水解。在一方面，出現(xiàn)了血小板受體損失(例如，GPIba損失、GPV損失或者兩者)的減少。
[0021]本發(fā)明 涵蓋用于增加分離的血小板的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的方法。這些方法包括以下步驟:從一位或多位個(gè)體獲得分離的血小板；用一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑來處理血小板，從而獲得處理的血小板；并且將處理的血小板輸注到有需要的個(gè)體中，從而獲得輸注的血小板。與沒有經(jīng)受唾液酸酶抑制劑的血小板相t匕，這些輸注的血小板的循環(huán)時(shí)間是更長(zhǎng)的。在一方面，這些方法包括將該血小板組合物保存在室溫下一段時(shí)間。在另一方面，這些方法包括冷卻該血小板組合物至低于室溫的溫度；保存該血小板組合物一段時(shí)間；并且然后使該血小板組合物復(fù)溫回至室溫。
[0022]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例包括具有唾液酸酶抑制劑和血小板群的血小板制劑；其中穩(wěn)定的血小板制劑通過以下方法來制備:從一個(gè)供體中獲得血小板群；并使用有效量的唾液酸酶抑制劑處理血小板。這種血小板制劑適合于在保存之后給予人體，而與未處理的血小板相比在人體中沒有止血功能的顯著損失或者沒有血小板清除的顯著增加。類似地，本發(fā)明的血小板制劑還包括從供體中分離的血小板；以及一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑。
[0023]本發(fā)明進(jìn)一步涉及試劑盒和系統(tǒng)。本發(fā)明的試劑盒包括能夠接收和容納血小板群的無菌容器，其中該容器是大致上與環(huán)境隔離的，以及如在此所述的無菌量的唾液酸酶抑制劑和任選地適合的包裝材料和使用說明書。在一個(gè)實(shí)例中，該容器適合于冷保存血小板。該試劑盒可進(jìn)一步包含一定量的至少一種聚糖修飾劑，如CMP唾液酸、CMP唾液酸前體、UDP半乳糖或其組合。類似地，本發(fā)明包括一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有適合于血液保存的一個(gè)無菌袋或容器；以及一定量的如在此所述的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑。
[0024]本發(fā)明涉及用于降低在來自一個(gè)或多個(gè)供體的血小板產(chǎn)品制劑中的唾液酸酶活性并抑制一種或多種細(xì)菌增殖的方法。這些方法包括以下步驟:使該血小板產(chǎn)品制劑與一定量的如在此所述的唾液酸酶抑制劑接觸，從而獲得唾液酸酶處理的血小板產(chǎn)品制劑；其中與未經(jīng)受唾液酸酶抑制劑的血小板產(chǎn)品制劑相比，唾液酸酶活性降低并且一種或多種細(xì)菌的增殖受到抑制。抑制的細(xì)菌的類型包括通常在血小板產(chǎn)品制劑中找到的那些細(xì)菌。這類細(xì)菌的實(shí)例包括:曲霉菌(Aspergillus)、芽孢桿菌屬(Bacillussp)、艾氏擬桿菌(Bacteroides eggerthii)、白色念珠菌(Candida albicans)、梓樣酸桿菌屬(Citrobacter sp)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp)、類白喉菌(Diphtheroid)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogene) >河生腸桿菌(Enterobacter amnigenus)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、鳥腸球菌(Enterococcus avium)、幾腸球菌(Enterococcus faecalis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、梭形桿菌屬(Fusobacterium spp.)、Btt鄰顆粒鏈菌(Granulicatella adiacens)、幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)、克雷伯菌屬(Klebsiella sp)、(肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)、產(chǎn)酸克雷伯菌(K.0xytoca))、乳酸桿菌屬(Lactobacillus sp)、李斯特菌屬(Listeria sp)、微球菌屬(Micrococcus sp)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp)、Pseudomys oralis、丙酸桿菌屬(Propionibacterium sp)、沙門菌屬(Salmonella sp)、沙雷菌屬(Serratia sp)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)、葡萄球菌屬(Staplhylococcus sp)(凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、鏈球菌屬(Streptococcus sp)、(解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、牛鏈球菌(S.bovis)、釀膿鏈球菌(S.pyogenes)、草綠色鏈球菌(S.viridans))、以及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)。這些方法進(jìn)一步包括以下步驟:評(píng)定唾 液酸酶抑制劑處理的血小板產(chǎn)品制劑的細(xì)菌增殖以及將該評(píng)定與一個(gè)對(duì)照進(jìn)行比較?？梢詫⒁环N或多種聚糖修飾劑添加到血小板中。這類聚糖修飾劑包括例如CMP唾液酸、CMP唾液酸前體、UDP半乳糖或其組合。在一方面，可以將使CMP唾液酸前體轉(zhuǎn)化為CMP唾液酸的酶添加到血小板中。
[0025]本發(fā)明涵蓋用于在保存過程中抑制血小板中的細(xì)菌增殖的方法，其中分離的血小板是從一個(gè)或多個(gè)供體中獲得的。這些方法包括使分離的血小板與一定量的如在此所述的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑接觸；并且在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)定在分離的血小板中的細(xì)菌增殖；其中分離的血小板中的細(xì)菌增殖受到抑制。在一方面，使該血小板制劑與唾液酸酶抑制劑接觸，該唾液酸酶抑制劑的量足以減少唾液酸殘基從血小板表面聚糖上的水解。在一個(gè)實(shí)施例中，分離的血小板可以保存約I天至約21天的一段時(shí)間。分離的血小板可以例如在約1°C與約24°C之間的溫度下保存。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法涉及在室溫下保存血小板組合物一段時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括冷卻該血小板組合物至低于室溫的溫度；保存該血小板組合物一段時(shí)間；并且然后在輸注到個(gè)體中之前使該血小板組合物復(fù)溫回至室溫。
[0026]本發(fā)明的又另一個(gè)實(shí)施例涉及制備供保存的血小板的方法，在此過程中唾液酸酶活性降低并且細(xì)菌增殖受到抑制，其中分離的血小板是從一個(gè)或多個(gè)供體中獲得的。該方法包括以下步驟:使分離的血小板與一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑接觸；并且評(píng)定在分離的血小板中的細(xì)菌增殖，其中與對(duì)照相比，在分離的血小板中的細(xì)菌增殖受到抑制。本發(fā)明進(jìn)一步包括以下方法:通過從一位或多位個(gè)體中獲得血小板群來增加血小板群的保存時(shí)間；并且用有效量的唾液酸酶抑制劑處理血小板，從而獲得處理的血小板。在一方面，在一個(gè)時(shí)間時(shí)間范圍內(nèi)使用唾液酸酶抑制劑處理該血小板群，其中該時(shí)間時(shí)間范圍是在約I分鐘至約8小時(shí)之間的范圍內(nèi)。這些步驟還可以用于通過降低唾液酸酶活性并抑制細(xì)菌增殖來增加血小板群的保存時(shí)間的方法。
[0027]本發(fā)明還涵蓋輸注分離的血小板的方法。這些方法包括以下步驟:從一位或多位個(gè)體中獲得分離的血小板；使用一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑來處理血小板，從而獲得展現(xiàn)出抑制的細(xì)菌增殖的處理的血小板；并且將處理的血小板輸注到有需要的個(gè)體中；其中與未經(jīng)受唾液酸酶抑制劑的血小板相比，細(xì)菌增殖受到抑制。
[0028]本發(fā)明涉及維持在保存之后被輸注到接受者中的血小板的止血活性的方法。此方法通過以下方式來進(jìn)行:使分離的血小板與一定量的唾液酸酶抑制劑接觸從而獲得處理的血小板；保存處理的血小板約I天與14天之間的一段時(shí)間；將所保存的、處理的血小板輸注到有需要的接受者中，從而獲得輸注的血小板；其中這些輸注的血小板與未經(jīng)受唾液酸酶抑制劑的血小板相比可以活化并形成凝塊。
[0029]本發(fā)明還涵蓋血小板制劑。這些血小板制劑包括唾液酸酶抑制劑和血小板群；其中這種穩(wěn)定的血小板 制劑是通過在此所述的方法制備的。另外，本發(fā)明的血小板制劑包括從供體中分離的血小板；以及一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑；其中這些血小板制劑與未用唾液酸酶抑制劑處理的血小板制劑相比展現(xiàn)出抑制的細(xì)菌增殖。
[0030]附圖簡(jiǎn)要說明
[0031]圖1A至圖1C是描繪含有細(xì)胞內(nèi)唾液酸酶的唾液酸化血小板和含唾液酸酶的細(xì)菌的圖示。(A)細(xì)菌和血小板來源的唾液酸酶兩者都從血小板表面除去了唾液酸，從而導(dǎo)致功能受損的血小板形成(I)。釋放的唾液酸支持污染細(xì)菌的增殖(短虛線和2)，這導(dǎo)致血小板活化(3)、血小板-細(xì)菌聚集體形成(3)以及生物膜形成(長(zhǎng)虛線和4)。(B)在輸注時(shí)，巨噬細(xì)胞識(shí)別去唾液酸化的血小板并將它們從循環(huán)中除去。(C)添加唾液酸酶抑制劑DANA (2, 3-脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸的鈉鹽)抑制了來源于血小板和細(xì)菌的唾液酸酶活性、防止了血小板去唾液酸化，使得在輸注之后血小板不被巨噬細(xì)胞識(shí)別。
[0032]圖2是顯示人血小板在4°C下保存過程中損失唾液酸的條形圖。在外源性核苷酸糖(a)缺乏、CMP唾液酸(CMP-SA)和UDP半乳糖(UDP-Gal) (b)或單獨(dú)的UDP半乳糖(c)存在下，在4°C下保存血小板濃縮物(A:供體A和B:供體B) 5天。將第O天的血小板的唾液酸含量設(shè)為100%。
[0033]圖3是顯示人血小板唾液酸酶表面活性在冷保存之后增加的線形圖。(A)描繪了在有或沒有透化作用的情況下新鮮血小板的分析。(B)描繪了在pH5和6下新鮮完整的血小板(供體A和B)的分析。(C)描繪了在4°C保存5天之后的完整血小板(供體A和B)的相應(yīng)分析。
[0034]圖4示出了固定的、未透化的、靜息室溫(RT)(左圖)和冷藏(右圖)的人血小板的免疫熒光顯微照片，表明在血小板的表面上存在唾液酸酶Neu3，但是不存在Neul。血小板冷藏(48h)增加了唾液酸酶(Neul)表面熒光，即暴露。在上圖中使用了抗Neul抗體。在下圖中使用了抗Neu3抗體。
[0035]圖5顯示了在冷保存48h并復(fù)溫之后小鼠血小板唾液酸酶表面活性增加。在室溫下持續(xù)O至2.5h以熒光(吸收強(qiáng)度(Al))來測(cè)量血小板來源的唾液酸酶活性。將保存在低溫(4°C，較暗的圓圈)下的血小板與新鮮血小板(RT，較淡的圓圈)進(jìn)行比較。作為對(duì)照，測(cè)量唾液酸酶活性(產(chǎn)氣莢膜梭菌(組分H))持續(xù)相同的時(shí)間段(插圖)。
[0036]圖6顯示在血小板保存過程中胎球蛋白競(jìng)爭(zhēng)唾液酸酶表面活性并因此抑制唾液酸從血小板聚糖上水解。左側(cè)豎條對(duì)表示在胎球蛋白缺乏(對(duì)照)或存在胎球蛋白(胎球蛋白)下在新鮮血小板(O)上的β-半乳糖暴露。右側(cè)豎條對(duì)表示血小板冷藏48h之后在胎球蛋白缺乏(對(duì)照)或存在下的β_半乳糖。通過RCA I結(jié)合來測(cè)量唾液酸損失，即β -半乳糖暴露。
[0037]圖7顯示唾液酸酶抑制劑DANA增加了小鼠血小板的體內(nèi)壽命。底線表示對(duì)照血小板壽命(對(duì)照)。頂線表示添加DANA(DANA)后的血小板壽命。
[0038]圖8(A)表示原始GPIba結(jié)構(gòu)以及O-連接的聚糖和N-連接的聚糖的圖示結(jié)構(gòu)。(B)表示末端GalP l、4GlcNAc (乳糖胺聚糖/LacNAc)以及核心_10_聚糖的生物合成修飾。
[0039]圖9顯示經(jīng)總血小板溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡分析人血小板含有唾液酸酶Neul和Neu30
[0040]圖10顯示在長(zhǎng)期冷藏后人血小板釋放Neul到血漿中，如通過蛋白質(zhì)印跡所分析的。在第O天和血小板冷藏I天、2天和5天之后分析血小板和它們相應(yīng)的血漿。
[0041]圖1l(A)描繪了血小板糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)的特征。使人總血小板溶解產(chǎn)物經(jīng)受SDS-PAGE并使用以下單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡:抗-GalNAc轉(zhuǎn)移酶(GalNAc_Tl、-T2、-T3)、β 4Gal-轉(zhuǎn)移酶I ( β 4Gal-Tl)以及唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal_l (B)血小板分泌GT。靜息的血小板在37°C下維持5分鐘或者經(jīng)由凝血酶受體PAR-1與25 μ M TRAP活化5分鐘。I分鐘之后觀察到最大的釋放。在沉淀的血小板部分(P)中或者在其相應(yīng)沐浴介質(zhì)(M)中測(cè)量每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)的酶活性。將該介質(zhì)在100，OOOxg下澄清90分鐘以在活性測(cè)量之前消除微顆粒。
[0042]圖12描繪了內(nèi)源性血小板唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸并入血小板表面受體中。(A)活性人血小板表面唾液酸轉(zhuǎn)移酶使FITC-結(jié)合的CMP-SA (FITC-SA)并入靜息的(虛線)或TRAP-活化的血小板中。將單獨(dú)的FITC (對(duì)照)添加到靜息(虛線)或TRAP活化的血小板(實(shí)線)中。⑶顯示來自靜息的(靜息)或TRAP-活化的血小板(TRAP)的溶解產(chǎn)物的免疫印跡，所述血小板用FITC(C)或FITC-CMP唾液酸⑶處理或者未用針對(duì)FITC、GPIb α、a IIb以及vWf的抗體進(jìn)行處理(_)。這些顯示的印跡表示兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。肌動(dòng)蛋白被顯示為加載對(duì)照。
[0043]圖13顯示在室溫(A)或冷藏(B)下保存的過程中血小板損失了 GPIb α和GPV受體。在將血小板保存在冷處之前和之后的指定時(shí)間點(diǎn)通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量小鼠vWf受體復(fù)合物組分(GPIba、GPIbP、GPIX、GPV)、GPVI和aIIb@3的表達(dá)。結(jié)果表示為平均值土SD，η = 5。將新鮮分離的血小板上的糖蛋白表達(dá)設(shè)為100%。
[0044]圖14顯示僅抑制金屬蛋白酶介導(dǎo)的GPIb α脫落并不改善小鼠血小板的恢復(fù)和存活。通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)定(A)GPIba和(B)GPV的表面表達(dá)。在DMSO(對(duì)照)或100 μ M金屬蛋白酶抑制劑GM6001(n = 6)存在下，在4°C保存野生型小鼠富含血小板的血漿Oh、24h和48h。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定在來自TACE+/+和ΤΑ(:ΕΔΖη/ΔΖη小鼠的新鮮分離的或冷藏24h和48h的富含血小板的血漿上的(C)GPIba和(D)GPV的表面表達(dá)。結(jié)果是平均值土平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差(s.e.m.)。η = 5。(C，插圖)在來自保存在冷處3h、24h和48h的TACE+/+和TACEAZn/AZn血小板的溶解產(chǎn)物中的GPIba的免疫印跡。(E)將熒光標(biāo)記(5_氯甲基熒光素二乙酸酯，CMFDA)的新鮮PRP(RT)或者來自在100 μ M GM6001缺乏(48h)或存在(48h+GM6001)下保存的富含血小板的血漿的血小板注入到野生型小鼠中(IO8個(gè)血小板/IOgm體重)。在指定時(shí)間點(diǎn)采集血液并且立即通過流式細(xì)胞術(shù)分析血小板。結(jié)果是平均百分比CMFDA-標(biāo)記的血小板土平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。將輸注后5分鐘時(shí)間的CMFDA陽性新鮮血小板百分比設(shè)為100%。η = 5。*Ρ < 0.05。比較冷保存的血小板。(F)將熒光標(biāo)記(CMFDA)的新鮮血小板(TACE+/+RT和TACE+RT)或者來自保存的富含血小板的血漿的血小板(TACE+/+48h和TACEvISh)靜脈注入到野生型小鼠中(IO8個(gè)血小板/IOgm體重)。在指定時(shí)間點(diǎn)采集血液并且立即通過流式細(xì)胞術(shù)分析血小板。結(jié)果是平均百分比CMFDA-標(biāo)記的血小板土平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。將輸注后5分鐘時(shí)的CMFDA陽性新鮮TACE+/+血小板百分比設(shè)為 100%。η = 5。
[0045]圖15顯示唾液酸酶處理的TACEAZn/AZn血小板被迅速地從循環(huán)中清除。(A)糖蛋白上的β_半乳糖暴露的流式細(xì)胞分析，如使用ECL FITC-標(biāo)記的凝集素所檢測(cè)的。結(jié)合至用或者未用a 2-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)處理的TACE+/+(白色條)或TACEAZn/AZn(黑色條)血小板的凝集素。顯示了結(jié)合至未處理的TACE+/+血小板的平均熒光強(qiáng)度的比率。直方圖報(bào)告了三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的平均值土平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P < 0.05、**P < 0.01、***P< 0.001。(B)通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)定GPIb a、GPV和a IIb β 3表面表達(dá)。用唾液酸酶(5mU/mL)(黑色條)或者未用唾液酸酶(白色條)處理的TACE+/+(未顯示)和TACEAZn/AZn血小板。結(jié)果相對(duì)于在TACEAZn/AZn血小板上的GPIba量來表示(相對(duì)于對(duì)照的平均值％ 土平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差)。η = 3。(C)將用a 2-3,6,8,9-唾液酸酶(5mU/mL)(實(shí)心符號(hào))處理或者未處理(空心符號(hào))的 新鮮、室溫和熒光標(biāo)記的(CMFDA) TACE+/+和TACEazivaZn血小板靜脈注入到TACE+/+小鼠中(IO8個(gè)血小板/IOg體重)。在指定時(shí)間點(diǎn)采集血液并且立即通過流式細(xì)胞術(shù)分析血小板。結(jié)果表示為平均百分比CMFDA-標(biāo)記的血小板土平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。將輸注后5分鐘時(shí)的CMFDA陽性未處理的TACE+/+血小板百分比設(shè)為100%。每點(diǎn)表示4只小鼠。n.s.不顯著，< 0.0001。比較唾液酸酶處理過的TACE+/+和TACEAZn/AZn。
[0046]圖16顯示血小板的神經(jīng)氨酸酶處理增加了 β -半乳糖暴露(唾液酸的損失)，如通過ECL熒光凝集素結(jié)合所測(cè)量的。在血小板糖蛋白上的β_半乳糖或β-GlcNAc暴露的流式細(xì)胞分析，如用ECL I (空心條)或s-WGA (實(shí)心條)FITC-標(biāo)記的凝集素所檢測(cè)的。在來自產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Neu)的指定濃度的a 2-3，6，8，9-唾液酸酶存在和缺乏下的凝集素與新鮮小鼠血小板的結(jié)合，η = 5。
[0047]圖17顯示了隨著神經(jīng)氨酸酶濃度增加,血小板GPIb α和GPV受體的劑量依賴性損失。通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)定了在新鮮分離的小鼠血小板上的GPIb α和GPV表面表達(dá)。在指定濃度的a 2-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)存在和缺乏下的表面受體表達(dá)。將O時(shí)間的受體表達(dá)的平均熒光設(shè)為100%。η = 4。[0048]圖18顯示DANA抑制了由神經(jīng)氨酸酶處理所致的β -半乳糖暴露。對(duì)小鼠血小板糖蛋白上的半乳糖或0-61(3嫩(:暴露的流式細(xì)胞分析，如上文在51^(12-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)和競(jìng)爭(zhēng)性唾液酸酶抑制劑DANA(Neu+DANA)存在(Neu)和缺乏(對(duì)照)下所檢測(cè)的。η = 4。
[0049]圖19顯示DANA抑制了由神經(jīng)氨酸酶處理所誘導(dǎo)的血小板GPIb a、GPV、GPIX以及Cillb β3受體的損失。在5mUa 2-3，6，8，9-唾液酸酶存在(灰色條)和缺乏(空心條)下通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量在小鼠血小板上的表面受體表達(dá)(GPIb a、GPV、GPIX和a IIb β 3)。還顯示了用唾液酸酶和DANA處理的血小板上的受體表達(dá)(黑色條)。將未處理的血小板上的受體表達(dá)的平均熒光設(shè)為100%。η = 4。
[0050]圖20描繪了總血小板溶解產(chǎn)物(INPUT)、上清液(SUPERNATANT)和相對(duì)應(yīng)的血小板沉淀(PELLET)的非誘導(dǎo)的免疫印跡法印跡，其顯示DANA抑制了由神經(jīng)氨酸酶(NA)誘導(dǎo)的血小板GPIb α的損失。對(duì)照表不未處理的樣品。
[0051]圖21是顯示添加DANA完全救助了用神經(jīng)氨酸酶處理的小鼠血小板的體內(nèi)恢復(fù)和存活的圖。對(duì)照描繪了未處理的新鮮室溫的血小板的存活。
[0052]圖22是顯示在室溫下保存的過程中血小板GPIb α和GPV受體損失因?yàn)樘砑覦ANA而受到抑制的圖。
[0053]圖23是描繪了在100 μ M金屬蛋白酶(MP)抑制劑GM6001存在下神經(jīng)氨酸酶處理對(duì)β-半乳糖暴露的作用的條形圖。通過熒光標(biāo)記的RCA-1凝集素結(jié)合來測(cè)量β-半乳糖暴露。
[0054]圖24是描繪了在 100 μ M金屬蛋白酶(MP)抑制劑GM6001存在下神經(jīng)氨酸酶處理對(duì)血小板GPIb α和GPV受體表面表達(dá)的作用的條形圖。將MP抑制劑-神經(jīng)氨酸酶上的受體表達(dá)設(shè)為100%。
[0055]圖25 是描繪了重組 TACE (ADAM17) (TACE)和重組 TACE 和 DANA (TACE+DANA)對(duì)血小板GPIb α和GPV受體表面表達(dá)的作用的條形圖。唾液酸損失的抑制防止由金屬蛋白酶TACE所致的受體裂解這個(gè)事實(shí)顯示唾液酸必須在GPIb α和GPV蛋白水解之前從糖蛋白上水解。用重組TACE進(jìn)行處理沒有影響受體GPIX和a IIb β 3 (未顯示)。
[0056]圖26是描繪了對(duì)在新鮮的血小板樣品和在4°C和RT下保存指定的時(shí)間點(diǎn)的樣品中的游離唾液酸(FSA)進(jìn)行定量的條形圖。在每個(gè)條形圖的頂部還顯示了 FSA濃度。注意，當(dāng)與在4°C下保存相等時(shí)間段的樣品比較時(shí)，在RT保存的血小板樣品中檢測(cè)的FSA顯著更聞。
[0057]圖27是顯示檢測(cè)在唾液酸酶抑制劑DANA存在或缺乏下保存在4°C或RT下的血小板樣品(顏色檢測(cè)時(shí)間=TOCD)中的細(xì)菌所需要的時(shí)間的照片。在測(cè)試樣品中的細(xì)菌濃度與顯色的起始時(shí)間成反比，即更短的顏色檢測(cè)時(shí)間=更高的細(xì)菌濃度；更長(zhǎng)的顏色檢測(cè)時(shí)間=更低的細(xì)菌濃度。顯示了所選擇的第9天樣品分析的圖片(A-C)。使用如在實(shí)例6所述的測(cè)定技術(shù)來檢測(cè)細(xì)菌。D是顯示對(duì)在唾液酸酶抑制劑DANA存在或缺乏下保存在4°C或RT下的血小板樣品中的細(xì)菌分析進(jìn)行定量的條形圖。針對(duì)血小板樣品繪制TOCD(min)。注意的是，在DANA存在下RT保存的樣品所需要的時(shí)間等于4°C保存的樣品，這表明DANA與4°C保存一樣有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。
[0058]圖28是描繪在ImM DANA缺乏(48h)或存在(48h+DANA)下在保存溶液中冷藏保存48h的小鼠血小板的存活的線形圖。顯示新鮮的、分離的血小板(RT)存活用于比較，對(duì)于每個(gè)存活圖，η = 7。
[0059]圖29是新鮮血小板(新鮮血小板)大小和密度(A)的流式細(xì)胞分析以及DANA、唾液酸乳糖和葡萄糖對(duì)穩(wěn)定的RT保存的小鼠血小板完整性的組合作用，如通過它們的大小(FSC)和密度(SSC)所判斷的。在唾液酸乳糖、葡萄糖和DANA缺乏(_防腐劑)(B)和存在(+防腐劑)(C)下在RT保存48h的小鼠血小板的分析。在點(diǎn)圖下方顯示了相應(yīng)的血小板數(shù)。還顯示了防腐劑濃度。
[0060]圖30是在指定濃度的DANA缺乏(OmM DANA)或存在下在RT保存48h的小鼠血小板的流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖分析。注意的是，0.1mM DANA有效地保護(hù)了血小板的大小和密度，如通過點(diǎn)圖分析(上圖)所判斷的。還顯示了血小板計(jì)數(shù)和微珠(參照)的相應(yīng)的流式細(xì)胞術(shù)直方圖(下圖)。
[0061]圖31是描繪了在96孔PVC板(圖A)的孔中存在或不存在ImM DANA下在不同介質(zhì)中生長(zhǎng)48h的粘質(zhì)沙雷菌的細(xì)胞密度的條形圖。圖31在圖B中描繪了在96孔PVC板的孔中在存在或不存在ImM DANA下在不同介質(zhì)中孵育48h的粘質(zhì)沙雷菌的生物膜形成。在圖B中還顯示，用結(jié)晶紫將在每個(gè)孔中的生物膜染色，回收該染料并在595nm下進(jìn)行測(cè)量。在595nm處的吸收(A595nm)與生物膜中的細(xì)菌細(xì)胞成比例。
[0062]圖32是顯示在從健康受試者中分離的新鮮血小板上的末端β -半乳糖含量的差異的條形圖。通過流式細(xì)胞術(shù)使用β_半乳糖特異性凝集素ECL來測(cè)量血小板表面末端半乳糖暴露，如在凝集素與聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合的示意圖中所描繪的。
[0063]圖33 是在添加劑(InterSol)缺乏、ImM DANA (InterSol+DANA)、IOmM 葡萄糖(InterSol+Glucose)以及 ImM DANA 加上 IOmM 葡萄糖(InterSol +DANA+Glucose)存在下在RT保存于按體積計(jì)30% 血漿和70% PAS(被稱為INTERS0L?溶液)中的小鼠血小板的流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖分析和相應(yīng)的流式細(xì)胞術(shù)(A)。注意的是，血小板群顯得靜息，如通過其前向散射和側(cè)向散射特征所判斷的。B是顯示在具有DANA、葡萄糖或兩者的InterSol溶液的門控血小板群中獲取的事件的百分比的條形圖。
[0064]圖34是在0.5mM DANA缺乏((-)DANA)或存在((+) DANA)下保存的血小板的代表性流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖分析(上圖A)。還顯示了血小板計(jì)數(shù)對(duì)側(cè)向散射(SSC)的相應(yīng)直方圖(下圖B)。該表表示在DANA缺乏或存在下在側(cè)向散射(SSC-H(MFI))中測(cè)量的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
[0065]圖35的圖A是如圖34中所述在DANA缺乏或存在下在血漿中保存人血小板之后的表面P選擇素暴露的代表性流式細(xì)胞術(shù)直方圖分析。使用針對(duì)P選擇素的單克隆FITC結(jié)合抗體(⑶62P-FITC)測(cè)量P選擇素暴露。圖35的圖B顯示了定義為M2的P選擇素陽性血小板(如圖35圖A所示)和相應(yīng)的MFI的定量。
[0066]圖36是在O、0.1和0.5mM DANA存在下在30%血漿和70% PAS溶液(按體積計(jì))(PASa,7.15mM Na2HPO4,2.24mM NaH2P04、IOmM 檸檬酸鈉、30mM 乙酸鈉、79.2mM NaCl、5.0mMKCl、以及1.5mM MgCl2, pH7.2)中在RT保存7天的人血小板的流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖分析。血小板定義為‘G1’，而血小板微顆粒定義為‘G2’。顯示每個(gè)點(diǎn)圖的門統(tǒng)計(jì)。
[0067]發(fā)明詳細(xì)說明
[0068]以下是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的說明。[0069]血小板添加液(PAS)
[0070]從供體中獲得血小板之后，可以將它們懸浮在被稱為血小板添加液(PAS)的流體中?；旧?PAS替代了血漿的一部分，其中在血液成分單采(apheresis)過程中放置了分離的血小板。PAS是一種介質(zhì)，該介質(zhì)通常是一種生理上相容的水性電解質(zhì)溶液。除了通?？梢匀缫韵滤龅牟煌M合和濃度存在于這些溶液中的某些試劑之外，本發(fā)明的PAS溶液包括一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑。
[0071]迄今為止，使用PAS溶液是因?yàn)槿藗兿嘈潘鼈儨p少了過敏性和發(fā)熱性輸血反應(yīng)、促進(jìn)了 ABO不相容的血小板輸注、使得能夠使用病原體滅活技術(shù)并且使得更多血漿可用于其他目的(例如，用于分級(jí)分離)。
[0072]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例包括具有唾液酸酶抑制劑以及任選地一種聚糖修飾劑的一種PAS溶液。更確切地說，本發(fā)明包括具有一種唾液酸酶抑制劑和/或一種聚糖修飾劑的一種PAS組合物以及一種或多種PAS組分(例如，鹽類、緩沖液、營(yíng)養(yǎng)素及其任何組合)。本發(fā)明的PAS可以包括多種組分，如一種或多種鹽(例如，NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2以及MgSO4)、一種或多種緩沖液(例如，乙酸鹽、碳酸氫鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽)、以及營(yíng)養(yǎng)素(例如，乙酸鈉、葡萄糖酸鈉、葡萄糖、麥芽糖或甘露醇)。
[0073]本發(fā)明的術(shù)語“血小板添加液”或“PAS”是指具有至少一種或多種唾液酸酶抑制劑、一種或多種保存介質(zhì)組分、以及任選地一種或多種聚糖修飾劑的溶液或介質(zhì)。“本發(fā)明的組合物”包括一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑。短語“血小板組合物”或“血小板保存組合物”是指所得的保存組合物(在輸注到接受者中之前)，其包含本發(fā)明的PAS、血小板以及任選地任何相關(guān)血漿和/或抗凝劑。
[0074]本發(fā)明的PAS的介質(zhì)包含生理上相容的水性電解質(zhì)溶液。這類溶液可含有如鈉源、鉀源、鎂源、鈣源、氯化物源以及磷酸鹽源的溶液中的離子元素。本發(fā)明的PAS還可以含有例如可以按檸檬酸或鈉 鹽的形式添加的檸檬酸鹽源。本發(fā)明的溶液進(jìn)一步包含例如碳源或營(yíng)養(yǎng)素源，如乙酸鹽、葡萄糖或葡萄糖酸鹽，并且可以與一種鹽組合而存在。在一個(gè)實(shí)施例中，可以包含磷酸鹽源以幫助維持ATP的產(chǎn)生。這些元素可以按從約5mM至約450mM(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450mM)的范圍內(nèi)的量存在于本發(fā)明的溶液中。該溶液維持在從6.4與約7.6 (例如，約7.1至約7.4)的范圍內(nèi)的PH下，并且優(yōu)選維持在約7.2的pH下。
[0075]在一個(gè)實(shí)施例中，鈉(Na)源可以按在約100與300mM之間(例如，在約150mM與約250mM之間)的量存在于本發(fā)明的PAS中。在一個(gè)具體實(shí)施例中，鈉源以約190mM存在。鈉可以作為鹽或者組合地作為緩沖液或碳源而存在。例如，鈉可以按氯化鈉(NaCl)、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉或其組合的形式而存在。其他適合的鈉源可以用于本發(fā)明的PAS中，包括本領(lǐng)域已知或者后來發(fā)現(xiàn)的鈉源。
[0076]氯(Cl)源也可以按在約40mM與約IlOmM之間(例如，在約60mM與約90mM之間)的量存在于本發(fā)明的PAS中。在一個(gè)具體方面，氯化物源以約87.2mM存在。氯可以按氯化鈉(NaCl)、氯化鎂(MgCl2)、氯化鉀(KCl)或其組合的形式而存在。本領(lǐng)域已知或后來發(fā)現(xiàn)的任何氯化物源都可以用于本發(fā)明，只要其適合與本發(fā)明的PAS—起使用。主要處于NaCl形式的Na+和Cl—是張度調(diào)節(jié)劑，它有助于血小板添加液的等滲性。
[0077]在一個(gè)實(shí)施例中，鉀源可存在于本發(fā)明的PAS中。它可以按在約0.5mM與約IOmM之間并且例如在約3mM與約8mM之間范圍內(nèi)的量存在。在一個(gè)具體實(shí)施例中，鉀以約5mM的量存在。鉀源包括氯化鉀、檸檬酸鉀、乙酸鉀、磷酸鉀、硫酸鉀或其組合。本領(lǐng)域已知或后來發(fā)現(xiàn)的其他鉀源可以用于本發(fā)明。在某些方面，在介質(zhì)中鉀離子的存在可以幫助維持細(xì)胞內(nèi)的鎂離子濃度。鉀離子還可涉及將丙酮酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通過線粒體膜以用于檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))中的氧化磷酸化。此外，K+通過有助于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的電連續(xù)性而在膜穩(wěn)定性中起重要作用。
[0078]鎂是可包含在本發(fā)明的PAS中的另一種鹽。鎂源可以按在約0.5mM與約2.5mM之間范圍內(nèi)的量并且具體地說按在約ImM與2mM之間的范圍內(nèi)的量而存在。在一個(gè)實(shí)施例中，鎂以約1.5mM存在于本發(fā)明的PAS中。鎂源包括氯化鎂、檸檬酸鎂、硫酸鎂以及它們的組合?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知或后來發(fā)現(xiàn)的鎂源。在一個(gè)實(shí)施例中，鎂離子可以按接近血漿水平、將為約3mEq/L(1.5mM)的濃度存在于本發(fā)明的PAS中。Mg2+可能是維持膜ATP酶活性所必須的。在一方面，介質(zhì)中的鎂離子會(huì)維持血小板中的最佳細(xì)胞間鎂水平并且可以促進(jìn)血小板中的氧化磷酸化，并且這樣做幫助維持介質(zhì)的pH。而且，Mg2+通過有助于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的電連續(xù)性而在膜穩(wěn)定性中起重要作用。
[0079]鈣也是可包含在本發(fā)明的PAS中的另一種鹽。鈣源可以按在約0.5mM與約2.5mM之間(例如，在約ImM與2mM之間)范圍的量而存在。在某個(gè)實(shí)施例中，鈣以約1.5mM存在于本發(fā)明的PAS中。鈣源包括氯化鈣、乙酸鈣、檸檬酸鈣或其組合。可以使用本領(lǐng)域已知或后來發(fā)現(xiàn)的鈣源。
[0080]檸檬酸鹽可用于緩沖該溶液。檸檬酸鹽源以在約2mM與約20mM之間范圍內(nèi)的量并且例如以5mM和約15mM的量存在于本發(fā)明的PAS中。在一方面，本發(fā)明的PAS包含約IOmM的檸檬酸鹽。可在本發(fā)明中使用的檸檬酸鹽源的實(shí)例包括檸檬酸鈉(例如，檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、檸檬酸三鈉)、檸檬酸、檸檬酸鉀、檸檬酸鎂以及它們的組合。可以使用其他檸檬酸鹽源，包括本領(lǐng) 域已知或后來發(fā)現(xiàn)的檸檬酸鹽源，只要它們適合于與本發(fā)明的PAS一起使用。檸檬酸鹽在本發(fā)明的PAS起到多種作用:作為抗凝劑、用于TCA循環(huán)的碳源以及緩沖液。
[0081]乙酸鹽也是本發(fā)明的PAS的另一種組分。乙酸鹽是用作分離的血小板的營(yíng)養(yǎng)素的一種碳源。乙酸鹽源可以按在約IOmM與約50mM之間范圍內(nèi)的量并且例如按在約25mM與約45mM之間范圍內(nèi)的量而存在。本發(fā)明的PAS包含約30mM的乙酸鹽。乙酸鹽源包括乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸鎂或其組合。可以使用其他乙酸鹽源，包括本領(lǐng)域已知或后來發(fā)現(xiàn)的乙酸鹽源，只要它們適合于與本發(fā)明的PAS —起使用。乙酸用作碳和緩沖液。
[0082]在本發(fā)明的PAS中，可以提供一種營(yíng)養(yǎng)素源?？梢詥为?dú)或者以各種組合來使用乙酸鹽和其他碳水化合物如葡萄糖或蔗糖以及檸檬酸鹽，以通過作為在檸檬酸循環(huán)中產(chǎn)生能量的中間代謝物源而為保存中的血小板提供能源。可以使用碳源的組合。在使用葡萄糖和/或蔗糖的情況下，該濃度可以按從約0.5mM至約25mM(例如，約2mM至約22mM)范圍內(nèi)的量而存在。
[0083]其他營(yíng)養(yǎng)素可以取代本發(fā)明的PAS的乙酸鹽或與其一起被包含在內(nèi)。例如，草酰乙酸鹽可以存在于本發(fā)明的PAS中，或者在已經(jīng)將本發(fā)明的PAS添加到富含血小板的部分中之后，可以將其添加到血小板懸浮液中。草酰乙酸鹽是線粒體中發(fā)現(xiàn)的四碳分子，它與乙酰CoA縮合而形成TCA循環(huán)(檸檬酸循環(huán))的第一個(gè)反應(yīng)。草酰乙酸鹽可以直接或者以前體氨基酸如天冬氨酸的形式供應(yīng)給保存的血小板。在一些實(shí)施例中，草酰乙酸鹽可以按從約IOmM至約45mM存在于本發(fā)明的PAS中。更具體地說，草酰乙酸鹽可以按從約20mM至約40mM、或者從約24mM至約36mM、或者從約28mM至約33mM存在于本發(fā)明的PAS中。
[0084]磷酸鹽(PO4)是本發(fā)明的PAS中可使用的另一種組分。磷酸鹽源可以按在約5mM與約50mM之間(例如，在約20mM與40mM之間)范圍內(nèi)的量存在于本發(fā)明的PAS中。在一個(gè)具體實(shí)施例中，磷酸鹽源以約28mM存在。磷酸鹽的形式包括單磷酸鈉、二磷酸鈉、三磷酸鈉或其組合?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的或在未來發(fā)現(xiàn)的其他磷酸鹽源。
[0085]組分如乙酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽可以與一種或多種鹽(如鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽或鈉鹽或者這些鹽的任意子組合)組合地添加以平衡緩沖溶液的摩爾滲透壓濃度。
[0086]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的PAS包含一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑、以及下表1中描述的組分:
[0087]表1:
[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種血小板添加液(PAS)，包含:a)一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑；以及 b)一種或多種PAS組分，所述PAS組分包括一種鹽、一種檸檬酸鹽源、一種碳源、以及它們的任何組合。
2.如權(quán)利要求1所述的PAS，其中該P(yáng)AS被維持在范圍在約6.4與約7.6之間的pH下。
3.如權(quán)利要求1所述的PAS，進(jìn)一步包含一種磷酸鹽源。
4.如權(quán)利要求3所述的PAS，其中該磷酸鹽源選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:單磷酸鈉、二磷酸鈉、三磷酸鈉、以及它們的組合。
5.如權(quán)利要求1所述的PAS，其中該檸檬酸鹽源選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸、以及它們的組合。
6.如權(quán)利要求1所述的PAS，其中該碳源選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:乙酸鹽、葡萄糖以及蔗糖。
7.如權(quán)利要求6所述的PAS，其中該乙酸鹽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸鎂、以及它們的組合。
8.如權(quán)利要求1所述的PAS，其中該鹽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:一種鈉源、氯化物源、鉀源、鎂源、鈣 源、以及它們的組合。
9.如權(quán)利要求8所述的PAS，其中該鈉源選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:氯化鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉、以及它們的組合。
10.如權(quán)利要求8所述的PAS，其中該氯化物源選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、以及它們的組合。
11.如權(quán)利要求8所述的PAS，其中該鉀源選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:氯化鉀、檸檬酸鉀、乙酸鉀、磷酸鉀、硫酸鉀、以及它們的組合。
12.如權(quán)利要求8所述的PAS，其中該鎂源選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:氯化鎂、檸檬酸鎂、硫酸鎂、以及它們的組合。
13.如權(quán)利要求8所述的PAS，其中該鈣源選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:氯化鈣、乙酸鈣、檸檬酸鈣、以及它們的組合。
14.如權(quán)利要求1所述的PAS，其中一種或多種PAS組分包含: a)在約IOOmM與約300mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鈉源； b)在約40mM與約IlOmM之間的范圍內(nèi)的量的一種氯化物源； c)在約2mM與約20mM之間的范圍內(nèi)的量的一種檸檬酸鹽源； d)在約IOmM與約50mM之間的范圍內(nèi)的量的一種乙酸鹽源； e)在約5mM與約50mM之間的范圍內(nèi)的量的一種磷酸鹽源； f)在約0.5mM與約IOmM之間的范圍內(nèi)的量的一種鉀源； g)在約0.5mM與約2.5mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鎂源；以及 h)在約0.5mM與約2.5mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鈣源。
15.一種血小板組合物，包含: a)分離的血小板； b)一種PAS，該P(yáng)AS包含: i)一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑；和ii) 一種或多種PAS組分，該P(yáng)AS組分包括一種鹽、一種檸檬酸鹽源、一種碳源、以及它們的任何組合；以及c)血漿； 其中該血小板組合物被維持在范圍在約6.4與約7.6之間的pH下。
16.如權(quán)利要求15所述的血小板組合物，其中該血漿以按體積計(jì)在約1%與約50%之間范圍內(nèi)的量存在。
17.如權(quán)利要求15所述的血小板組合物，其中該血小板添加液以按體積計(jì)在約50%與約99 %之間范圍內(nèi)的量存在。
18.如權(quán)利要求15所述的血小板組合物，其中該一種或多種PAS組分包含: i)在約IOOmM與約300mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鈉源； ii)在約40mM與約IlOmM之間的范圍內(nèi)的量的一種氯化物源； iii)在約2mM與約20mM之間的范圍內(nèi)的量的一種檸檬酸鹽源； iv)在約IOmM與約50mM之間的范圍內(nèi)的量的一種乙酸鹽源； V)在約5mM與約50mM之間的范圍內(nèi)的量的一種磷酸鹽源； vi)在約0.5mM與約IOmM之間的范圍內(nèi)的量的一種鉀源； vii)在約0.5mM與約2.5mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鎂源； viii)在約0.5mM與約2.5mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鈣源； 其中該血小板組合物被維持在約6.4與約7.6之間范圍內(nèi)的pH下。
19.一種袋或容器，包括: a)適合用于血小板保存的一個(gè)袋或容器；以及 b)一種PAS，該P(yáng)AS包含: i)一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑；和 ii)一種或多種PAS組分，該P(yáng)AS組分包括一種鹽、一種檸檬酸鹽源、一種碳源、以及它們的任何組合。
20.如權(quán)利要求19所述的袋或容器，進(jìn)一步包含分離的血小板。
21.如權(quán)利要求19所述的袋或容器，其中該P(yáng)AS被維持在約6.4與約7.6之間范圍內(nèi)的pH下。
22.如權(quán)利要求19所述的袋或容器，其中一種或多種PAS組分 i)在約IOOmM與約300mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鈉源； ii)在約40mM與約IlOmM之間的范圍內(nèi)的量的一種氯化物源； iii)在約2mM與約20mM之間的范圍內(nèi)的量的一種檸檬酸鹽源； iv)在約IOmM與約50mM之間的范圍內(nèi)的量的一種乙酸鹽源； V)在約5mM與約50mM之間的范圍內(nèi)的量的一種磷酸鹽源； vi)在約0.5mM與約IOmM之間的范圍內(nèi)的量的一種鉀源； vii)在約0.5mM與約2.5mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鎂源； viii)在約0.5mM與約2.5mM之間的范圍內(nèi)的量的一種鈣源； 其中該血小板組合物被維持在約6.4與約7.6之間范圍內(nèi)的pH下。
23.如權(quán)利要求19所述的袋或容器，進(jìn)一步包含分離的血小板。
24.一種保存血小板的方法，其中分離的血小板是從一個(gè)或多個(gè)供體獲得的，該方法包括: a)使分離的血小板與一種PAS接觸，這種PAS包含: i)一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑；和 ii)一種或多種PAS組分，該P(yáng)AS組分包括一種鹽、一種檸檬酸鹽源、一種碳源、以及它們的任何組合。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該唾液酸酶抑制劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胎球蛋白，2，3_脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)或其藥學(xué)上可接受的鹽；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基_3_(戊-3-基氧基)-環(huán)己-1-烯-1-羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基 _3_ (丙-1-稀-2-基氛基)~2~ ((IR, 2R) -1，2, 3- 二羥基丙基)-3，4- 二氫-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亞胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羥基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亞甲基氨基)-2-羥基-環(huán)戊烷-1-羧酸，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中該唾液酸酶抑制劑是2，3-脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸的鈉鹽。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其中分離的血小板被保存約I天至約21天的一段時(shí)間。
28.如權(quán)利要求24所述的方法，其中分離的血小板在約2°C與約25°C之間的溫度下保存。
29.如權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括將該血小板組合物冷卻至低于室溫的溫度；保存該血小板組合物一段時(shí)間；并且然后將該血小板組合物復(fù)溫回至室溫。
30.如權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括在一段時(shí)間內(nèi)用該唾液酸酶抑制劑處理該血小板群，其中該時(shí)間段是在約I分鐘至約8小時(shí)之間的范圍內(nèi)。
31.一種制備血小板以供保存的方法，其中分離的血小板是從一個(gè)或多個(gè)供體獲得的，該方法包括: 使分離的血小板與一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑接觸。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中該唾液酸酶抑制劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胎球蛋白，2，3_脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)或其藥學(xué)上可接受的鹽；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基_3_(戊-3-基氧基)-環(huán)己-1-烯-1-羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基 _3_ (丙-1-稀 ~2~ 基氛基)_2_ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羥基丙基)-3，4- 二氫-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基_4_氨基甲酸亞胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羥基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S, 4R) _3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亞甲基氨基)-2-羥基-環(huán)戊烷-1-羧酸，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中該唾液酸酶抑制劑是2，3-脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸的鈉鹽。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中該聚糖修飾劑是CMP唾液酸或一種CMP唾液酸前體。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，進(jìn)一步包含一種酶，該酶將該CMP唾液酸前體轉(zhuǎn)化為CMP唾液酸。
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其中該聚糖修飾劑是UDP半乳糖。
37.如權(quán)利要求31所述的方法，其中這些聚糖修飾劑是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
38.一種制備血小板以供保存的方法，該方法包括: a)從一位或多位個(gè)體分離出血小板； b)使分離的血小板與一種唾液酸酶抑制劑接觸，該抑制劑處于足以減少唾液酸殘基從血小板表面聚糖上的水解的量。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中血小板受體損失發(fā)生降低。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該血小板受體損失的降低包括GPIbα損失、GPV損失或這兩者的降低。
41.一種增加分離的血小板的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的方法，該方法包括: a)從一位或多位個(gè)體獲得分離的血小板； b)用一定量的一種或 多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑處理血小板，以便由此獲得處理過的血小板； c)將處理的血小板輸注到有此需要的個(gè)體的體內(nèi)，以便由此獲得輸注的血小板； 其中與未經(jīng)受步驟a)的血小板相比，所輸注的血小板的循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，進(jìn)一步包括在室溫下保存該血小板組合物一段時(shí)間。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，進(jìn)一步包括將該血小板組合物冷卻至低于室溫的溫度；保存該血小板組合物一段時(shí)間；并且然后將該血小板組合物復(fù)溫回至室溫。
44.一種血小板制劑,包含一種唾液酸酶抑制劑和一個(gè)血小板群；其中該穩(wěn)定的血小板制劑是通過以下方法制備的: a)從一個(gè)供體獲得一個(gè)血小板群；并且 b)用有效量的一種唾液酸酶抑制劑處理血小板；并且 其中該血小板制劑適合用于在保存之后給予人體而與未處理的血小板相比在人體中沒有止血功能的顯著損失或沒有血小板清除的顯著增加。
45.一種血小板制劑,包含: i)從一個(gè)供體中分離的血小板；和 ii)一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑。
46.一種試劑盒，包括:能夠接收和容納一個(gè)血小板群的一個(gè)無菌容器，該容器是基本上與環(huán)境隔離的；以及一定無菌量的一種唾液酸酶抑制劑。
47.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中該容器適合用于血小板的冷保存。
48.如權(quán)利要求46所述的試劑盒，其中該唾液酸酶抑制劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胎球蛋白，2，3_脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)或其藥學(xué)上可接受的鹽；(3R，4R，5S) -5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-環(huán)己-1-烯-1-羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)~2~ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羥基丙基)-3，4- 二氫-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亞胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羥基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亞甲基氨基)-2-羥基-環(huán)戊烷-1-羧酸，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
49.如權(quán)利要求48所述的試劑盒，其中該唾液酸酶抑制劑是2，3-脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸的鈉鹽。
50.如權(quán)利要求46所述的試劑盒,進(jìn)一步包含有效量的至少一種聚糖修飾劑。
51.如權(quán)利要求50所述的試劑盒，其中該聚糖修飾劑是CMP唾液酸或一種CMP唾液酸前體。
52.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，進(jìn)一步包含一種酶，該酶將該CMP唾液酸前體轉(zhuǎn)化為CMP唾液酸。
53.如權(quán)利要求50所述的試劑盒，其中該聚糖修飾劑是UDP半乳糖。
54.如權(quán)利要求50所述的試劑盒，其中這些聚糖修飾劑是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
55.—種無菌袋或容器,包括: a)適合用于血液保存的一個(gè)無菌袋或容器；以及 b)一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑。
56.一種用于在來自一個(gè)或多個(gè)供體的血小板產(chǎn)品制劑中降低唾液酸酶活性并且抑制一種或多種細(xì)菌的增殖的方法，該方法包括以下步驟: a)使該血小板產(chǎn)品制劑與一定量的一種唾液酸酶抑制劑接觸，以便由此獲得一種唾液酸酶處理過的血小板產(chǎn)品制劑； 其中與未經(jīng)受步驟a)的血小板產(chǎn)品制劑相比，該唾液酸酶活性被降低并且一種或多種細(xì)菌的增殖被抑制。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中該被抑制的細(xì)菌包括在血小板產(chǎn)品制劑中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌。
58.如權(quán)利要求56所述的方法，其中該被抑制的細(xì)菌選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:曲霉菌屬(Aspergillus)、芽抱桿菌屬(Bacillus sp)、艾氏擬桿菌(Bacteroideseggerthii)、白色念珠菌(Candida albicans)、朽1 樣酸桿菌屬(Citrobacter sp)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp)、類白喉菌(Diphtheroid)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogene)、河生腸桿菌(Enterobacteramnigenus)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、鳥腸球菌(Enterococcus avium)、幾腸球菌(Enterococcus faecalis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、梭形桿菌屬(Fusobacterium spp.)、Htt 鄰顆粒鏈菌(Granulicatella adiacens)、幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)、克雷伯菌屬(Klebsiella sp)、(肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)、產(chǎn)酸克雷伯菌(K.0xytoca))、乳酸桿菌屬(Lactobacillus sp)、李斯特菌屬(Listeriasp)、微球菌屬(Micrococcus sp)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp)、Pseudomys oralis、丙酸桿菌屬(Propionibacterium sp)、沙門菌屬(Salmonella sp)、沙雷菌屬(Serratia sp)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)、葡萄球菌屬(Staplhylococcus sp)(凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、鏈球菌屬(Streptococcus sp)、(解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)、牛鏈球菌(S.bovis)、釀膿鏈球菌(S.pyogenes)、草綠色鏈球菌(S.viridans))、以及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)。
59.如權(quán)利要求56所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟:評(píng)定該唾液酸酶抑制劑處理過的血小板產(chǎn)品制劑的細(xì)菌增殖，并且將該評(píng)定與一個(gè)對(duì)照進(jìn)行比較。
60.如權(quán)利要求56所述的方法，其中該唾液酸酶抑制劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胎球蛋白，2，3_脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)或其藥學(xué)上可接受的鹽；(3R，4R，5S) -5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-環(huán)己-1-烯_1_羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基 _3_ (丙-1-稀-2-基氛基)_2_ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羥基丙基)-3，4- 二氫-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亞胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羥基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亞甲基氨基)-2-羥基-環(huán)戊烷-1-羧酸，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中該唾液酸酶抑制劑是2，3-脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸的鈉鹽。
62.如權(quán)利要求56所述的方法，進(jìn)一步包括使該血小板產(chǎn)品制劑與一種或多種聚糖修飾劑接觸，其中該聚糖修飾劑是CMP唾液酸或一種CMP唾液酸前體。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，進(jìn)一步包括將該血小板產(chǎn)品制劑與一種酶接觸，該酶將該CMP唾液酸前體轉(zhuǎn)化為CMP唾液酸。
64.如權(quán)利要求56所述的方法，進(jìn)一步包括使該血小板產(chǎn)品制劑與一種或多種聚糖修飾劑接觸，其中該聚糖修飾劑是Μ)Ρ半乳糖。
65.如權(quán)利要求56所述的方法，進(jìn)一步包括使該血小板產(chǎn)品制劑與兩種聚糖修飾劑接觸，其中這些聚糖修飾劑是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
66.一種降低在來自個(gè)體的血小板制劑或血小板樣品中的唾液酸酶活性并且抑制細(xì)菌增殖的方法，其中該細(xì)菌選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:曲霉菌屬、芽孢桿菌屬、艾氏擬桿菌、白色念珠菌、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣莢膜梭菌、棒狀桿菌屬、類白喉菌、產(chǎn)氣腸桿菌、河生腸桿菌、陰溝腸桿菌、鳥腸球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、梭形桿菌屬、Btt鄰顆粒鏈菌、幽門螺桿菌、克雷伯菌屬、(肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌)、乳酸桿菌屬、李斯特菌屬、微球菌屬、消化鏈球菌、普通變形桿菌、假單胞菌屬、Pseudomys oralis、丙酸桿菌屬、沙門菌屬、沙雷菌屬、粘質(zhì)沙雷菌、葡萄球菌屬(凝固酶陰性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌)、鏈球菌屬、(解沒食子酸鏈球菌、牛鏈球菌、釀膿鏈球菌、草綠色鏈球菌)、以及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；該方法包括以下步驟: a)使至少一種唾液酸酶抑制劑與該制劑接觸； 其中與未經(jīng)受步驟a)的制劑相比，該唾液酸酶活性被降低并且一種或多種細(xì)菌的增殖是被抑制。
67.一種抑制在保存期間血小板中的細(xì)菌增殖的方法，其中分離的血小板是從一個(gè)或多個(gè)供體中獲得的，該方法包括: a)使分離的血小板與一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑接觸；并且 b)在一個(gè)或多個(gè)時(shí)點(diǎn)評(píng)定分離的血小板中的細(xì)菌增殖； 其中在分離的血小板中的細(xì)菌增殖被抑制。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中使該血小板制劑與該唾液酸酶抑制劑接觸，該抑制劑處于足以減少唾液酸殘基從血小板表面聚糖上的水解的量。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其中分離的血小板被保存約I天至約21天的一段時(shí)間。
70.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該唾液酸酶抑制劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胎球蛋白，2，3_脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)或其藥學(xué)上可接受的鹽；(3R，4R，5S) -5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-環(huán)己-1-烯_1_羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基 _3_ (丙-1-稀-2-基氛基)_2_ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羥基丙基)-3，4- 二氫-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亞胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羥基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亞甲基氨基)-2-羥基-環(huán)戊烷-1-羧酸，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中該唾液酸酶抑制劑是2，3-脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸的鈉鹽。
72.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該聚糖修飾劑是CMP唾液酸或一種CMP唾液酸前體。
73.如權(quán)利要求67所述的方法，進(jìn)一步包含一種酶，該酶將該CMP唾液酸前體轉(zhuǎn)化為CMP唾液酸。
74.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該聚糖修飾劑是Μ)Ρ半乳糖。
75.如權(quán)利要求67所述的方法，其中分離的血小板在約1°C與約24°C之間的溫度下保存。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，進(jìn)一步包括在室溫下保存該血小板組合物一段時(shí)間。
77.如權(quán)利要求75所述的方法，進(jìn)一步包括將該血小板組合物冷卻至低于室溫的溫度；保存該血小板組合物一段時(shí)間；并且然后將該血小板組合物復(fù)溫回至室溫。
78.一種制備血小板以供保存的方法，在保存期間唾液酸酶活性被降低并且細(xì)菌增殖被抑制，其中分離的血小板是從一個(gè)或多個(gè)供體中獲得的，該方法包括: a)使分離的血小板與一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑接觸；并且 b)評(píng)定分離的血小板中的細(xì)菌增殖，其中與一個(gè)對(duì)照相比，在分離的血小板中的細(xì)菌增殖被抑制。
79.—種增加血小板群的保存時(shí)間的方法，該方法包括: a)從一位或多位個(gè)體中獲得一個(gè)血小板群；并且 b)用有效量的一種唾液酸酶抑制劑處理血小板，從而獲得處理過的血小板。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，進(jìn)一步包括在一段時(shí)間范圍內(nèi)用該唾液酸酶抑制劑處理該血小板群，其中該時(shí)間范圍是在約I分鐘至約8小時(shí)之間的范圍內(nèi)。
81.如權(quán)利要求79所述的方法，進(jìn)一步包括在室溫下保存該血小板組合物一段時(shí)間。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，進(jìn)一步包括將該血小板組合物冷卻至低于室溫的溫度；保存該血小板組合物一段時(shí)間；并且然后將該血小板組合物復(fù)溫回至室溫。
83.—種通過降低唾液酸酶活性和抑制細(xì)菌增殖來增加血小板群的保存時(shí)間的方法，該方法包括:a)從一位或多位個(gè)體中獲得一個(gè)血小板群；并且 b)用有效量的一種唾液酸酶抑制劑處理血小板，從而獲得處理過的血小板， 其中與未經(jīng)受唾液酸酶抑制劑的血小板相比，該細(xì)菌增殖被抑制。
84.—種用于輸注分離的血小板的方法,該方法包括: a)從一位或多位個(gè)體中獲得分離的血小板； b)用一定量的一種或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑處理血小板，從而獲得展現(xiàn)出抑制的細(xì)菌增殖的處理過的血小板；并且 c)將處理過的血小板輸注到有此需要的個(gè)體中； 其中與未經(jīng)受步驟b)的血小板相比，該細(xì)菌增殖被抑制。
85.一種用于維持在保存之后輸注到一個(gè)接受者中的血小板的止血活性的方法，其中血小板是從一個(gè)供體中獲得和分離的，從而獲得分離的血小板，該方法包括: a)使分離的血小板與一定量的一種唾液酸酶抑制劑接觸,從而獲得處理過的血小板； b)將處理過的血小板保存約I天與14天之間的一段時(shí)間； c)將這些保存的、處理過的血小板輸注到有此需要的接受者中，從而獲得輸注的血小板； 其中與未經(jīng)受步驟a)的血小板相比，輸注的血小板可以活化并形成凝塊。
86.—種血小板制劑,包含一種唾液酸酶抑制劑和一個(gè)血小板群；其中該穩(wěn)定的血小板制劑是通過以下方法制備的: a)從一個(gè)供體中獲得一個(gè)血小板群；并且 b)用有效量的一種唾液酸酶抑制劑處理血小板；并且 其中該血小板制劑適合用于在保存之后給予人體而與未處理的血小板相比在人體中沒有止血功能的顯著損失或沒有血小板清除的顯著增加；并且 其中該血小板制劑展現(xiàn)出抑制的細(xì)菌增殖，如與未用唾液酸酶抑制劑處理的一種血小板制劑相比。
87.如權(quán)利要求86所述的血小板制劑，其中，在處理血小板之后，該制備進(jìn)一步包括以下另外的步驟: a)在室溫下保存該血小板制劑一段時(shí)間。
88.如權(quán)利要求86所述的血小板制劑，其中，在處理血小板之后，該制備進(jìn)一步包括以下另外的步驟: a)將該穩(wěn)定的血小板制劑冷卻至低于室溫的溫度； b)保存該血小板制劑一段時(shí)間； c)將該血小板制劑復(fù)溫回至室溫；并且 d)評(píng)定該血小板制劑的細(xì)菌增殖。
89.如權(quán)利要求86所述的血小板制劑，其中該唾液酸酶抑制劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胎球蛋白，2，3-脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸(DANA)或其藥學(xué)上可接受的鹽；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基_3_(戊-3-基氧基)-環(huán)己-1-烯-1-羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)~2~ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羥基丙基)-3，4- 二氫-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基_4_氨基甲酸亞胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羥基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亞甲基氨基)-2-羥基-環(huán)戊烷-1-羧酸，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
90.如權(quán)利要求89所述的血小板制劑，其中該唾液酸酶抑制劑是2，3-脫氫-2-脫氧-N-乙酰神經(jīng)氨酸的鈉鹽。
91.如權(quán)利要求89所述的血小板制劑，進(jìn)一步包含有效量的至少一種聚糖修飾劑。
92.如權(quán)利要求91所述的血小板制劑，其中該聚糖修飾劑是CMP唾液酸或一種CMP唾液酸前體。
93.如權(quán)利要求89所述的血小板制劑，進(jìn)一步包含一種酶，該酶將該CMP唾液酸前體轉(zhuǎn)化為CMP唾液酸。
94.如權(quán)利要求91所述的血小板制劑，其中該聚糖修飾劑是UDP半乳糖。
95.如權(quán)利要求91所述的血小板制劑，其中這些聚糖修飾劑是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
96.—種血小板制劑,包含: i)從一個(gè)供體分離的血小板；以及 ii)一定量的一種 或多種唾液酸酶抑制劑以及任選地一種或多種聚糖修飾劑； 其中該血小板制劑展現(xiàn)出抑制的細(xì)菌增殖，如與未用唾液酸酶抑制劑處理的一種血小板制劑相比。
【文檔編號(hào)】A61K35/14GK103702556SQ201280023800
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月17日
【發(fā)明者】啟勇彼得·劉, K·霍夫麥斯特, R·薩克斯坦 申請(qǐng)人:維利科醫(yī)療公司, 布賴漢姆婦女醫(yī)院