用于產(chǎn)生唾液酸化聚糖之具有轉(zhuǎn)唾液酸酶活性的突變體唾液酸酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有轉(zhuǎn)唾液酸酶（trans-sialidase)活性的酶（EC3. 2. 1. 18)， 其通過突變衍生自錐蟲（Trypanosomal)唾液酸酶。通過突變獲得的酶特別可用 于產(chǎn)生多樣的唾液酸化的半乳寡糖（galacto-oligosaccharide，G0S)和果寡糖 (fructo-oligosaccharideFOS)，這些是嬰兒配方食品（infantformula)、益生元營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充 劑和食品補(bǔ)充劑中的重要添加劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 益生元是促進(jìn)結(jié)腸中選定組的微生物之生長(zhǎng)的膳食物質(zhì)并且另外可具有 其他健康益處。半乳寡糖（G0S)、果寡糖（F0S)、乳果糖（lactulose)和異麥芽寡糖 (isomaltooligosaccharide，ΙΜ0)是少數(shù)經(jīng)充分確定的益生元。在人乳中，寡糖構(gòu)成第 三大組分，在圍產(chǎn)期以高達(dá)20g/l至25g/l的量存在，隨后下降至5g/L至15g/L。除少數(shù) 例外，所有已知的人乳寡糖（ΗΜ0)具有乳糖核心并通過與一個(gè)或更多個(gè)半乳糖和N-乙酰 葡糖胺單元連接而延長(zhǎng)，并且可用幾個(gè)唾液酸和巖藻糖殘基進(jìn)行修飾。已經(jīng)鑒定了超過 100種不同的這類聚糖結(jié)構(gòu)，這些中約10%至20%被唾液酸化（Bode，2012,Glycobiology 22(9) :1147-1162)。許多這些ΗΜ0的唾液酸化和/或巖藻糖基化似乎傳達(dá)重要的功能特 性。例如，ΗΜ0可與人病原體結(jié)合，例如，大腸桿菌K1(EscherichiacoliK1)、流感嗜血 菌（Haemophilusinfluenzae)、多殺巴斯德氏菌（Pasteurellamultocida)、腦膜炎奈瑟 氏球菌（Neisseriameningitidis)、空腸彎曲桿菌（Campylobacterjejuni)、霍亂弧菌 (Vibriocholerae)、幽門螺桿菌（Helicobacterpylori)和無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)，從而降低嬰兒中腹瀉和其他疾病的發(fā)病率。ΗΜ0作為人病原體的可溶性 誘餌受體起作用的這種能力很可能通過其多樣性而增強(qiáng)，因?yàn)楹事短堑奶堑鞍?、唾?酸化的聚糖和巖藻糖基化的聚糖各自革G向病原體的不同亞群（Kunz等，2000Ann.Rev. Nutrition20 :699-722)。此外，唾液酸化的ΗΜ0可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)；例如T細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn) 生受到體外唾液酸化的ΗΜ0的刺激（Eiwegger等，2004,PediatricRev. 56 :536-540)。在大 多數(shù)情況下，尚未鑒定活性的ΗΜ0分子，但在壞死性小腸結(jié)腸炎（一種嬰兒中頻繁發(fā)生且常 常是致命性的疾病）的情況下，最近使用大鼠模型顯示了由于單個(gè)分子二唾液酸乳-N-四 糖而產(chǎn)生的保護(hù)作用（Jantscher-Krenn等，2012,Gut61:1417-1425)。
[0003] 與人乳相比，形成多數(shù)嬰兒配方食品之基礎(chǔ)的牛乳具有非常低的寡糖含量，具有 不同的唾液酸化和巖藻糖基化譜。在模擬人乳的組成的嘗試中，奶粉配方目前補(bǔ)充有（非 ΗΜ0的）G0S和F0S。然而，由于其缺乏唾液酸殘基，所添加的G0S和F0S不可能提供如上所 述的ΗΜ0的治療益處（Bode，2012,同上）。
[0004] 試圖使G0S和F0S唾液酸化依賴于聚糖唾液酸化，這可以化學(xué)地實(shí)現(xiàn)以及使用 不同類型的酶以酶促法實(shí)現(xiàn)[1]。例如，來自克氏錐蟲（Trypansomacruzi)(查加斯病 (Chagasdisease)的病原體）的轉(zhuǎn)唾液酸酶（trans-sialidaseenzyme) (TcTS)已用于將 唾液酸從供體轉(zhuǎn)移到接受體聚糖[2]。然而，在工業(yè)生產(chǎn)食品級(jí)HMO的情況下，克氏錐蟲 (T.cruzi)轉(zhuǎn)唾液酸酶有一個(gè)主要的缺點(diǎn)，即它構(gòu)成了克氏錐蟲內(nèi)的一種重要的毒力因子
[3]。
[0005] 在非致病性讓氏錐蟲（Trypanosomarangeli)中發(fā)現(xiàn)的天然唾液酸酶（TrSA)已 用作生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)唾液酸酶活性的突變體酶的起點(diǎn)[4]。雖然該唾液酸酶與TcTS的序列共 有70 %的序列同一性并且具有相同的整體三級(jí)結(jié)構(gòu)，但是它是嚴(yán)格的水解酶，具有不可檢 測(cè)的轉(zhuǎn)唾液酸酶活性[4]。唾液酸酶TrSA以及轉(zhuǎn)唾液酸酶TcTS與作為催化性親核體的酪 氨酸共享共同的雙替換機(jī)制[5] [6]。在TcTS中，接受體結(jié)合位點(diǎn)由與接受體糖形成堆積相 互作用的Tyrll9和Trp312組成[7]。在TrSA中，發(fā)現(xiàn)Trp313(對(duì)應(yīng)于TcTS中的Trp312) 由于在284位的Gin而以不同的構(gòu)象存在，然而它在120位具有Ser殘基，對(duì)應(yīng)于TcTS中的 Tyrl19 [8]。除了接受體結(jié)合位點(diǎn)的這些差異之外，在這兩種酶中，對(duì)唾液酸保守的Asp96 氫鍵有差異，這可能是由于兩個(gè)殘基Val96Met和Pro98Ala有差異。初步嘗試基于TrSA單 個(gè)點(diǎn)突變體，但未能產(chǎn)生具有任何轉(zhuǎn)唾液酸酶活性的酶。隨后的研究揭示了需要5個(gè)點(diǎn)突 變TrSA的組合，其包括在接受體結(jié)合位點(diǎn)的Serl20Tyr、Gly249Tyr和Gln284Pro以及在 唾液酸結(jié)合袋（pocket)的Met96Val和Ala98Pro來賦予TrSA轉(zhuǎn)唾液酸酶活性（TcTS的 1% )。另外的單個(gè)突變Ile37Leu將轉(zhuǎn)唾液酸酶活性的水平提高至克氏錐蟲轉(zhuǎn)唾液酸酶的 10% [4]。此外，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明與TcTS相比，這些TrSA突變體對(duì)于乳糖顯示出>25倍更 低的親和力和對(duì)不期望的競(jìng)爭(zhēng)性水解作用有> 100倍更高的轉(zhuǎn)換（kcat) [4]，表明在這種 酶對(duì)轉(zhuǎn)唾液酸化有任何實(shí)際價(jià)值之前還需要相當(dāng)大的改進(jìn)。
[0006] 盡管TrSA和TcTS之間有相對(duì)接近的序列同源性，但是沒有證據(jù)表明由讓氏錐蟲 表達(dá)的天然唾液酸酶具有任何轉(zhuǎn)唾液酸酶活性。由Smith等報(bào)道了來自讓氏錐蟲的TrSA基 因的分離和表達(dá)[31]。分離的TrSA基因編碼無(wú)活性的蛋白質(zhì)，可能是由于嚴(yán)格保守的精氨 酸被半胱氨酸殘基替換，其通過協(xié)調(diào)唾液酸的羧基而發(fā)揮功能[31]。Smith等還向GenBank 提交了編碼唾液酸酶（Q08672)的TrSA基因，預(yù)測(cè)該基因是脫水唾液酸酶[32]。除了缺乏 協(xié)調(diào)唾液酸的羧基所需的Arg殘基之外，這種唾液酸酶（Q08672)缺乏建立接受體結(jié)合位點(diǎn) 所需的突變S119Y和Q284P，并且由于這個(gè)原因不能用作轉(zhuǎn)唾液酸酶。
[0007]Buschiazzo等[33]報(bào)道了預(yù)計(jì)編碼TrSA，UNIPR0T:Q08672的讓氏錐蟲基因的分 離，其與TcTS具有70 %的序列同一性，這是僅具有水解活性的其他TrSA的共同特征。發(fā)現(xiàn) 對(duì)于獲得具有可測(cè)量轉(zhuǎn)唾液酸酶活性的突變體TrSA所必需的TrSA-級(jí)序列中的一個(gè)氨基 酸替換是Gly249-Tyr，這降低了水解活性[4]。與Tyr120組合的第二個(gè)突變ne-37Leu顯 著增強(qiáng)了這個(gè)突變體中轉(zhuǎn)唾液酸酶的活性[4]。在TrSA，UNIPR0T:Q08672中沒有發(fā)現(xiàn)這些 突變。
[0008] 在人乳中，多種長(zhǎng)度的乳糖或ΗΜ0可在α 2-3或α 2-6鍵處被唾液酸化，然后可以 添加至末端半乳糖或近末端Ν-乙?；?葡糖胺，從而有助于存在的ΗΜ0的多樣性。嘗試模 擬這類復(fù)雜的寡糖組合物需要可以將唾液酸轉(zhuǎn)移至多種不同的接受體基團(tuán)的轉(zhuǎn)唾液酸酶。 雖然公認(rèn)TcTS可唾液酸化聚糖的末端半乳糖，但是沒有文件記載可使用其他接受體基團(tuán) 的轉(zhuǎn)唾液酸酶，如果經(jīng)合成獲得ΗΜ0的多樣性，使用其他接受體基團(tuán)的轉(zhuǎn)唾液酸酶是必要 的。
[0009] 因此，仍然需要具有轉(zhuǎn)唾液酸酶活性的酶，其既不是毒力因子，也不衍生自致病性 生物體；并且還不具有顯著的唾液酸酶水解活性，以及可將唾液酸部分轉(zhuǎn)移至一系列存在 于聚糖分子中的不同接受體基團(tuán)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 根據(jù)第一實(shí)施方案，本發(fā)明提供了突變體多肽，其與SEQIDN0 :2的28至372位 氨基酸殘基具有至少80%的氨基酸序列同一性，并且其中SEQIDN0. 2的197至203位殘 基包含一個(gè)或更多個(gè)經(jīng)替換的氨基酸殘基，導(dǎo)致SEQIDN0. 2的197至203位殘基產(chǎn)生至 少+3的凈正電荷，并且其中所述突變體多肽的序列中的37、96、98、120、249、284位氨基酸 殘基與SEQIDN0. 2中對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基具有100%的序列同一性，其中所述多肽具有轉(zhuǎn)唾 液酸酶活性（EC3. 2. 1. 18)。與具有SEQIDN0 :2的28至372位氨基酸殘基之序列的多 肽相比，本發(fā)明的多肽中SEQIDN0. 2的197至203位殘基至少+2,優(yōu)選+3的凈正電荷賦 予了降低的水解酶活性?？赏ㄟ^SEQIDN0 :2的突變獲得突變體多肽，并且所述多肽的氨 基酸序列可與SEQIDN0 :2具有序列同一性，不同之處在于SEQIDN0. 2的197至203位 殘基包含一個(gè)或更多個(gè)經(jīng)替換的氨基酸殘基，導(dǎo)致197至203位殘基產(chǎn)生至少+2,優(yōu)選+3 的凈正電荷。
[0011] 根據(jù)第二實(shí)施方案中，突變體多肽另外包含選自以下的C末端接頭和碳水化合物 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（carbohydrate-bindingdomain) :a)包含SEQIDN0. 2 的 373 至 638 位氨 基酸殘基的讓氏錐蟲轉(zhuǎn)唾液酸酶的C末端接頭肽和碳水化合物結(jié)合肽；b)克氏錐蟲轉(zhuǎn)唾 液酸酶的C末端接頭肽和碳水化合物結(jié)合肽（SEQIDNO. 8) ;c)剛果錐蟲（Trypanosoma congolense)轉(zhuǎn)唾液酸酶的C末端接頭肽和碳水化合物結(jié)合肽（SEQIDN0.9) ;d)布氏錐蟲 (Trypanosomabrucei)轉(zhuǎn)唾液酸酶的C末端接頭肽和碳水化合物結(jié)合肽（SEQIDNO. 10)。
[0012] 突變體多肽可表達(dá)為融合蛋白，其包含同源或異源氨基末端信號(hào)肽和/或用于多 肽的純化的具有選擇性底物結(jié)合親和力的異源氨基末端肽或羧基末端肽。
[0013] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了包含具有編碼根據(jù)第一或第二實(shí)施方案的突 變體多肽的核酸序列之DNA正鏈的DNA分子。
[0014] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，DNA分子可具有編碼具有選自以下氨基酸序列之突變體多 肽的核苷酸序列：
[0015]a)SEQIDN0.4的48至372位氨基酸殘基；b)SEQIDN0.4的21至372位氨基酸 殘基；c)SEQIDN0.4的48至638位氨基酸殘基；和d)SEQIDN0.4的21至638位氨基酸 殘基。
[0016] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了包含編碼突變體多肽之DNA分子的重組宿主 細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞并且選自細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞和真菌細(xì)胞。所述 DNA分子可整合到宿主細(xì)胞的基因組中或者可整合到宿主細(xì)胞中自我復(fù)制的質(zhì)粒中。
[0017] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的突變體多肽的方法，其包 括以下步驟：
[0018]a)提供重組宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含DNA分子，所述DNA分子包含編碼本發(fā)明 突變體多肽的核酸序列，和b)在宿主細(xì)胞能夠表達(dá)所述突變體多肽的培養(yǎng)基中孵育所述 宿主細(xì)胞，以及c)從所述培養(yǎng)基中回收步驟a)中由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的所述突變體多肽。
[0019] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明突變體多肽的酶組合物，其中所 述組合物被配制為干粉、片劑或作為液體。
[0020] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生唾液酸化的單糖和/或寡糖的方 法，其包括以下步驟：
[0021] a)提供唾液酸供體分子和包含能夠被轉(zhuǎn)唾液酸化的接受體單糖和/或寡糖的分 子；b)使（a)的分子與本發(fā)明突變體多肽在水性溶液中相接觸。
[0022] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了包含通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的唾液酸化的單糖 和寡糖的組合物，其中所述組合物選自嬰兒配方食品、益生元營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和食品補(bǔ)充劑。
【附圖說明】
[0023] 圖1.A.唾液酸酶（EC3. 2. 1. 18)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，以克氏錐蟲轉(zhuǎn)唾液酸酶（TcTS) 為例。催化結(jié)構(gòu)域位于左側(cè)（淺灰色），碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域在右側(cè)（深灰色），這兩個(gè) 結(jié)構(gòu)域通過肽接頭（黑色）連接在一起。結(jié)合在活性位點(diǎn)中的配體（唾液酸乳糖）以黑色 棒示出。B.本發(fā)明的突變體轉(zhuǎn)唾液酸酶的卡通，示出了結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)（催化結(jié)構(gòu)域肽；接頭 肽；凝集素肽（碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域））和突變的基序（197至203位氨基酸）的一個(gè)實(shí) 例以及關(guān)于SEQIDN0:2的氨基酸殘基位置。
[0024]圖 2.來自Tr6(具有第六位點(diǎn)突變I37L的TrSA5niut[PDB:1WCS];SEQIDN0.2 的 26至372位氨基酸殘基）的唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域與相關(guān)轉(zhuǎn)唾液酸酶的序列比對(duì)。使用 ClustalW比對(duì)了來自克氏錐蟲（SEQIDN0. 5)、剛果錐蟲（SEQIDN0.6)和布氏錐蟲（SEQ IDN0. 7)的Tr6和轉(zhuǎn)唾液酸酶。唾液酸結(jié)合位點(diǎn)在14蓋內(nèi)的氨基酸以粗體示出。用實(shí)心 圓表示七個(gè)氨基酸基序，用三角形