專利名稱：一種連續(xù)分離唾液酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種連續(xù)分離唾液酸的方法，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
唾液酸(Sialic Acid，SA)是九碳糖神經(jīng)氨酸?；锏目偡Q，它廣泛存在于多種生物組織中。在大部分哺乳動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)的唾液酸主要是N-乙酰神經(jīng)氨酸，所以通常把 N-乙酰神經(jīng)氨酸稱為唾液酸。唾液酸在自然界分布很廣，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多生物體內(nèi)存在唾液酸，它通常位于細(xì)胞膜最外層的糖類部分和分泌的糖復(fù)合物(糖脂、糖蛋白和脂多糖)的關(guān)鍵位置，是糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能多樣化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
唾液酸的生物學(xué)功能有兩大類，即唾液酸本身能被識(shí)別的受體作用和掩蓋其它分子的掩蔽作用。近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)，唾液酸及其衍生物在各種生命活動(dòng)調(diào)節(jié)中起著重要的作用， 與許多疾病密切相關(guān)，在抑制唾液酸轉(zhuǎn)移酶和抗癌轉(zhuǎn)移、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增長(zhǎng)與抗老年癡呆癥、抑制唾液酸酶與抗病毒、抑制白細(xì)胞薪附與抗炎等方面，此外唾液酸在控制細(xì)胞黏液濃度、抗識(shí)別、抗腫瘤等生理功能上也具有很大作用。
關(guān)于唾液酸的工業(yè)化制備方法主要有天然物抽提法和酶法合成。由于唾液酸在天然原料中含量比較低，天然物抽提法的分離提純過(guò)程比較復(fù)雜，收率較低，同時(shí)需要一些特殊的設(shè)備，造成的污染較大，這必然影響到唾液酸衍生物的開(kāi)發(fā)和利用。酶法生產(chǎn)唾液酸具有轉(zhuǎn)化率高、提取簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)合成所用原料要求高，價(jià)格較為昂貴，與此同時(shí)唾液酸醛縮酶不易獲得，限制了生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大。
在唾液酸酶法轉(zhuǎn)化液中，除了反應(yīng)底物丙酮酸鈉、N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)胺以及反應(yīng)產(chǎn)物唾液酸，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)等主要成分外，還有微生物細(xì)胞及其碎片、雜蛋白、無(wú)機(jī)鹽和色素等多種成分。因此選擇經(jīng)濟(jì)合理的唾液酸的提取工藝對(duì)提高唾液酸的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力十分重要。已有報(bào)道的提取方法和分離方法主要有
1韓孝清(專利02110607. χ)發(fā)明了一種從蛋黃粉中提取唾液酸的方法。首先將蛋黃粉水解，水解液經(jīng)加熱和絮凝除去蛋白，用強(qiáng)酸、弱堿樹(shù)脂除離子；再以強(qiáng)堿樹(shù)脂吸附唾液酸，甲酸做洗脫劑；最后洗脫液經(jīng)濃縮結(jié)晶，烘干得到唾液酸成品。
2韓孝大(專利03115456. 5)選用乳清粉做原料，用超濾的方法除蛋白，后續(xù)提取步驟與韓孝清的類似。
3許平(專利200410024222. 3)等發(fā)明了一種以廉價(jià)乳酸鈉為前體，經(jīng)多步耦聯(lián)生物轉(zhuǎn)化合成唾液酸以及通過(guò)離子交換分離純化唾液酸的方法。轉(zhuǎn)化液經(jīng)酸化離心等預(yù)處理后，直接采用離子交換柱分離唾液酸，所用樹(shù)脂為ΗΖ201χ8，330和717等商業(yè)化強(qiáng)堿樹(shù)脂。 樹(shù)脂需先用1Ν-2Ν的NaOH溶液處理；再水洗；最后用1Ν-3Ν的甲酸溶液處理使樹(shù)脂轉(zhuǎn)成甲酸型。洗脫時(shí)，先用水，再用0. 5-3Ν的甲酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集1Ν-3Ν的洗脫流出液。 流出液經(jīng)真空冷凍結(jié)晶得到唾液酸成品。
但從操作工藝和提取的經(jīng)濟(jì)性分析，以上方法具有一定的缺陷。首先在現(xiàn)有的唾液酸生產(chǎn)工藝中，采用固定床離子交換技術(shù)，所采用的是間歇式操作方式，該技術(shù)存在多種弊端，由于該過(guò)程不連續(xù)，造成產(chǎn)率低，上柱樹(shù)脂的利用率低，洗脫劑消耗大，樹(shù)脂用量大， 廢水排放量大等缺點(diǎn)。同時(shí)，選用甲酸型樹(shù)脂做分離介質(zhì)，樹(shù)脂預(yù)處理和再生步驟繁瑣，且甲酸具有腐蝕性，易污染唾液酸。因此發(fā)展高效率、低成本的唾液酸提取方法對(duì)促進(jìn)唾液酸的產(chǎn)業(yè)化顯得至關(guān)重要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中使用固定床離子交換技術(shù)分離唾液酸過(guò)程中存在生產(chǎn)成本大、操作繁瑣、分離純化效果不佳、不易規(guī)?；?、只能間歇操作、不適宜工業(yè)化生產(chǎn)的不足。擬選用一種新型的分離介質(zhì)，并基于這種介質(zhì)開(kāi)發(fā)一種連續(xù)分離唾液酸的方法。該工藝可以提高樹(shù)脂的利用率(接近95%)、減少洗脫劑的消耗，同時(shí)避免了樹(shù)脂的活化、再生，節(jié)約了酸堿的消耗，減少了廢液的排放。從而實(shí)現(xiàn)低成本、高收率、連續(xù)生產(chǎn)唾液酸的目的。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
一種連續(xù)分離唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸鈉為底物通過(guò)微生物發(fā)酵制得，將發(fā)酵液通過(guò)過(guò)濾、超濾處理后得唾液酸清液，泵入裝有OH-型陰離子交換樹(shù)脂的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中進(jìn)行吸附，去離子水進(jìn)行洗雜，氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，氫氧化鈉溶液進(jìn)行樹(shù)脂再生，收集含有唾液酸的洗脫液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析結(jié)晶，晶體減壓干燥后即得唾液酸純品。
其中，所述的唾液酸的微生物發(fā)酵制備方法，是通過(guò)對(duì)含有sir (表達(dá)異構(gòu)酶)的重組大腸桿菌和含有NanA(表達(dá)醛縮酶)的重組大腸桿菌的分別進(jìn)行高密度培養(yǎng)，獲得兩種高表達(dá)的大腸桿菌菌體。37°C下，以N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)和過(guò)量的丙酮酸鈉為底物，加入獲得的兩種重組大腸桿菌混合培養(yǎng)3 催化合成唾液酸，具體參考文獻(xiàn)(Yinan Zhang, Fei Tao, Miaofen Du et al (2010) An efficient method for N-acetyl-D-neuraminic acid production using coupled bacterial cells with a safe temperature-induced system Appl Microbiol Biotechnol 86 :481-489)。
其中，所述的乳清酸水解液中，唾液酸的濃度為1 20g/L。
其中，所述的超濾處理，截留分子量為1萬(wàn) 8萬(wàn)道爾頓。
其中，所述的陰離子交換樹(shù)脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物為骨架，以季胺基 (-N+R3)為功能基團(tuán)。
其中，所述的陰離子交換樹(shù)脂粒度為0. 315-1. 25mm，濕視密度為0. 66-0. 75g/ml， 含水量為42-48%。
其中，所述的連續(xù)離子交換系統(tǒng)是由6-60根離子交換柱串聯(lián)的連續(xù)操作的離子交換系統(tǒng)，通過(guò)組合式閥門(mén)將離子交換過(guò)程中的吸附、洗雜、洗脫和再生四個(gè)工段之間按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹(shù)脂吸附飽和后立刻移出吸附段送入洗雜段進(jìn)行洗雜，洗雜結(jié)束后立刻移出洗雜段進(jìn)入洗脫段進(jìn)行洗脫，洗脫完成后立刻移出洗脫段送入再生段進(jìn)行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再進(jìn)行吸附，如此循環(huán)的操作過(guò)程，且每個(gè)工段的第1根離子交換柱的狀態(tài)切換同步進(jìn)行，并保證至少有一根離子交換柱處于吸附階段。
上述連續(xù)離子交換系統(tǒng)優(yōu)選5-40根離子交換柱串聯(lián)，更優(yōu)選8-M根離子交換柱串聯(lián)。
所述的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中，吸附段、洗雜段、洗脫段和再生段的陰離子交換柱各自為1-20根，優(yōu)選1-10根，更優(yōu)選2-6根。
所述的連續(xù)離子交換色譜技術(shù)是采用轉(zhuǎn)盤(pán)帶動(dòng)樹(shù)脂柱連續(xù)旋轉(zhuǎn)，并通過(guò)不同的分離區(qū)。樹(shù)脂柱連續(xù)變址通過(guò)每個(gè)槽口，通過(guò)槽口的物料及流量由各槽口分別控制。分配閥隨之同步轉(zhuǎn)動(dòng)，將液體分配至樹(shù)脂柱中，并收集最終的產(chǎn)品。當(dāng)吸附飽和的樹(shù)脂柱離開(kāi)吸附區(qū)時(shí)，經(jīng)再生和洗滌的新鮮樹(shù)脂床即隨即進(jìn)入吸附區(qū)。在試驗(yàn)中可以采用串聯(lián)方式來(lái)調(diào)整樹(shù)脂柱的數(shù)量，以確保出料質(zhì)量和濃度的連續(xù)穩(wěn)定。
其中，所述的氯化鈉溶液濃度為0. 001-2M，優(yōu)選地0. 1-0. 8M ；所述的氫氧化鈉溶液濃度為0. 001-2M，優(yōu)選地0. 1-2M。
其中，所述的乙醇水溶液濃度為5_40g/L，乙醇水溶液的加入量為洗脫液體積的 1-2 倍。
其中，乙酸乙酯加入量為乙醇水溶液與洗脫液混合體積的0. 1-1倍。
有益效果本發(fā)明所述的利用連續(xù)離子交換分離純化唾液酸的方法具有如下優(yōu)占.^ \\\ ·
1)與傳統(tǒng)的離子交換系統(tǒng)相比，其設(shè)備緊湊，系統(tǒng)簡(jiǎn)化，管道縮減，減少了 40%的占地面積，具有更好的靈活性，減少移動(dòng)部件。
2)樹(shù)脂用量節(jié)約了 65%。其中樹(shù)脂總處于執(zhí)行一項(xiàng)功能狀態(tài)。20%的樹(shù)脂總是處在吸附再生狀態(tài)，20%再生，30%洗雜/洗脫。
3)采用了堿類再生劑，提高了利用率而用量減少了 40%以上，產(chǎn)品收率達(dá)到99% 以上。
4)減少了 30-40%的再生液，40-50%的洗脫液，減少了 60%的廢液量。洗脫產(chǎn)率提高2-3倍，洗脫液的濃度提高了 5-10倍。
因此本發(fā)明的分離純化方法簡(jiǎn)便易行，效果好，不僅其設(shè)備投資、運(yùn)行成本低廉， 而且可以根據(jù)分離量的多少，實(shí)現(xiàn)從公斤級(jí)到噸級(jí)的分離，通過(guò)本發(fā)明所得產(chǎn)品在收率和產(chǎn)品質(zhì)量方面都獲得了極好的結(jié)果，保證了產(chǎn)品品質(zhì)。同時(shí)最大限度的減少再生液，洗雜液和洗脫液的用量。同時(shí)提高了分離產(chǎn)物的濃度，可以直接進(jìn)行結(jié)晶純化。


圖1是本發(fā)明的連續(xù)離子交換系統(tǒng)處于狀態(tài)1的示意圖。
圖2是本發(fā)明的連續(xù)離子交換系統(tǒng)處于狀態(tài)2的示意圖。
圖3是pH值對(duì)唾液酸吸附量的影響示意圖。
圖4唾液酸的洗脫圖。
圖5唾液酸的生物合成圖。其中，兩種高表達(dá)的大腸桿菌菌體分別為E. coli K12/ pBVS, E. coli K12/pVN，差向異構(gòu)酶為GlcNAc 2-異構(gòu)酶，酸縮酶為Neu5Ac酸縮酶。
具體實(shí)施方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
唾液酸的純度是通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)得到。唾液酸的高效液相色譜分離的最佳條件為色譜柱a Bio-Rad Aminex HPX-87H column (300 X 7. 8mm)，流動(dòng)相IOmM H2SO4,流速0. 4ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫55°C，進(jìn)樣體積為20 μ L。采用外標(biāo)法定量。
以下實(shí)施例所用的陰離子交換樹(shù)脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物為骨架，以季胺基為功能基團(tuán)，粒度為0. 315-1. 25mm，濕視密度為0. 66-0. 75g/ml，含水量為42-48%，由南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。
以下實(shí)施例所用的連續(xù)離子交換系統(tǒng)是由6-60根離子交換柱串聯(lián)的連續(xù)操作的離子交換系統(tǒng)，通過(guò)組合式閥門(mén)將離子交換過(guò)程中的吸附、洗雜、洗脫和再生四個(gè)工段之間按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹(shù)脂吸附飽和后立刻移出吸附段送入洗雜段進(jìn)行洗雜，洗雜結(jié)束后立刻移出洗雜段進(jìn)入洗脫段進(jìn)行洗脫，洗脫完成后立刻移出洗脫段送入再生段進(jìn)行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再進(jìn)行吸附，如此循環(huán)的操作過(guò)程，且每個(gè)工段的第1根離子交換柱的狀態(tài)切換同步進(jìn)行，并保證至少有一根離子交換柱處于吸附階段。例如，采用吸附區(qū)為4根、洗雜區(qū)為4根、洗脫區(qū)為6根，再生區(qū)為4根的工藝形式。圖1、2表示了這種工藝形式的連續(xù)離子交換系統(tǒng)的運(yùn)行過(guò)程，其中分別標(biāo)注了吸附區(qū)，洗雜區(qū)，洗脫區(qū)，再生區(qū)，在圖1中，吸附區(qū)的離子交換柱中的第四根離子交換柱能保護(hù)整個(gè)離子交換柱的吸附區(qū)不會(huì)被上柱液穿透而造成損失，當(dāng)吸附區(qū)的第一根離子交換柱即柱4吸附飽和后就會(huì)被移出吸附區(qū)，進(jìn)入洗雜區(qū)進(jìn)行洗雜，成為洗雜區(qū)的最后一根柱 (即圖2的狀態(tài))，而洗雜區(qū)的第一根離子交換柱8此時(shí)在洗雜流速的控制下剛好洗雜完成，進(jìn)入洗脫區(qū)，成為洗脫區(qū)的最后一根柱(即圖2的狀態(tài))并且通過(guò)控制洗脫流速使得洗脫區(qū)的第一根柱14也洗脫結(jié)束，移入再生區(qū)的最后一根進(jìn)行樹(shù)脂再生(即圖2的狀態(tài))，再生段的第一根即柱18也再生完畢，移入吸附區(qū)的最后一根進(jìn)行吸附(即圖2的狀態(tài))。這樣通過(guò)控制各區(qū)的流速和閥門(mén)的切換，可以實(shí)現(xiàn)四個(gè)區(qū)保持同樣的節(jié)奏進(jìn)行工作。各區(qū)的流速受各工段條件的影響，原則上是保證各工段同步運(yùn)行，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)樹(shù)脂的狀態(tài)調(diào)整流動(dòng)相的流速。通過(guò)控制各區(qū)流速及各區(qū)離子交換柱的根數(shù)來(lái)確定進(jìn)出口切換時(shí)間，最終使整個(gè)系統(tǒng)各個(gè)區(qū)達(dá)到同步切換。
以下實(shí)施例唾液酸發(fā)酵液的制備方法如下
培養(yǎng)大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為普通的LB培養(yǎng)基(基于培養(yǎng)基的重量百分比計(jì)，胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，PH值為7. 5，同時(shí)有必要的話可以添加0. lg/L 的青霉素)。培養(yǎng)方法E. coli K12來(lái)自于美國(guó)菌種保藏中心(簡(jiǎn)稱ATCC-2M04，將其作為初始菌種構(gòu)建重組的質(zhì)粒，這些大腸桿菌菌種在37°C下培養(yǎng))然后對(duì)通過(guò)對(duì)含有sir (表達(dá)異構(gòu)酶)的重組大腸桿菌和含有NanA (表達(dá)醛縮酶)的重組大腸桿菌的分別進(jìn)行高密度培養(yǎng)，獲得兩種高表達(dá)的大腸桿菌菌體，37°C下，以44. 24g/L N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)和過(guò)量的2. 2M的丙酮酸鈉作為底物和碳源，加入獲得的兩種重組大腸桿菌混合培養(yǎng)3 催化合成唾液酸。上述反應(yīng)中唾液酸的產(chǎn)量為21. 2g/L。
實(shí)施例1
將發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾后再經(jīng)截留分子量為1萬(wàn)道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質(zhì)， 將清液稀釋至唾液酸濃度為5g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹(shù)脂的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中。 采用由12根陰離子交換柱構(gòu)成的連續(xù)離子交換系統(tǒng)，吸附區(qū)為3根，洗雜區(qū)為3根，洗脫區(qū)為4根，再生區(qū)為2根。其中每個(gè)區(qū)都可以采用串聯(lián)方式，以此來(lái)提高目標(biāo)產(chǎn)物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填I(lǐng)OOg樹(shù)脂。吸附流速為3ml/min，吸附容量為0. 341g/g濕樹(shù)脂； 洗雜液為去離子水，流速為;3ml/min，洗雜到流出液無(wú)雜質(zhì)為止(用HPLC檢測(cè)確定洗雜區(qū)的第一根離子交換柱無(wú)雜質(zhì)流出)；洗脫液為0. lmol/L的氯化鈉溶液，洗脫流速為-l/min， 洗脫完全(用HPLC檢測(cè)確定洗脫區(qū)的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時(shí)將向位于再生區(qū)的離子交換柱中泵入濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用10g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的1倍， 浸取后用0. 2倍體積乙酸乙酯溶析結(jié)晶，得到純度為96%的唾液酸，收率為97. 2%。其中樹(shù)脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉216ml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 40%的再生液，同時(shí)洗脫用去0. IN氯化鈉210ml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 30%的洗脫液。洗脫產(chǎn)率為0. 055g (唾液酸)/ g (樹(shù)脂的量)*min，相對(duì)于單柱洗脫產(chǎn)率提高了 1. 375倍，洗脫出來(lái)的唾液酸的濃度為原溶液的4倍。
實(shí)施例2
將發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾后再經(jīng)截留分子量為3萬(wàn)道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質(zhì)， 將清液稀釋至唾液酸濃度為10g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹(shù)脂的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中。采用由14根陰離子交換柱構(gòu)成的連續(xù)離子交換系統(tǒng)，吸附區(qū)為4根，洗雜區(qū)為3根，洗脫區(qū)為4根，再生區(qū)為3根。其中每個(gè)區(qū)都可以采用串聯(lián)的方式，以此來(lái)提高目標(biāo)產(chǎn)物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填400g樹(shù)脂。吸附流速為15ml/min，吸附容量為0. M4g/g濕樹(shù)脂；洗雜液為去離子水，洗雜流速為25ml/min，洗雜到流出液無(wú)雜質(zhì)為止(用HPLC檢測(cè)確定洗雜區(qū)的第一根離子交換柱無(wú)雜質(zhì)流出)；洗脫液為0. 5mol/L的氯化鈉溶液，洗脫流速為15ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測(cè)確定洗脫區(qū)的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時(shí)將向位于再生區(qū)的離子交換柱中泵入濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用15g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的1. 2倍，浸取后用0. 5倍體積乙酸乙酯溶析結(jié)晶，得到純度為97. 5%的唾液酸， 收率為98. 1%。其中樹(shù)脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉208ml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 42%的再生液，同時(shí)洗脫用去0. IN氯化鈉200ml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 34%的洗脫液。洗脫產(chǎn)率為 0. 075g (唾液酸)/g (樹(shù)脂的量)*min，相對(duì)于單柱洗脫產(chǎn)率提高了 1. 875倍，洗脫出來(lái)的唾液酸的濃度為原溶液的5倍。
實(shí)施例3
將發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾后再經(jīng)截留分子量為4萬(wàn)道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質(zhì)， 將清液稀釋至唾液酸濃度為15g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹(shù)脂的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中。采用由14根陰離子交換柱構(gòu)成的連續(xù)離子交換系統(tǒng)，吸附區(qū)為4根，洗雜區(qū)為3根，洗脫區(qū)為4根，再生區(qū)為3根。其中每個(gè)區(qū)都可以采用串聯(lián)的方式，以此來(lái)提高目標(biāo)產(chǎn)物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填1. 2Kg樹(shù)脂。吸附流速為60ml/min，吸附容量為0. 244g/ g濕樹(shù)脂；洗雜液去離子水，洗雜流速為50ml/min，洗雜到流出液無(wú)雜質(zhì)為止(用HPLC檢測(cè)確定洗雜區(qū)的第一根離子交換柱無(wú)雜質(zhì)流出)；洗脫液為0. 8mol/L的氯化鈉溶液，洗脫流速為60ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測(cè)確定洗脫區(qū)的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時(shí)將向位于再生區(qū)的離子交換柱中泵入濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用20g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的1. 5倍，浸取后用0. 8倍體積乙酸乙酯溶析結(jié)晶，得到純度為98%的唾液酸，收率為98. 1%。其中樹(shù)脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉200ml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 44%的再生液，同時(shí)洗脫用去0. IN氯化鈉19^11，相對(duì)于單柱節(jié)約了 36%的洗脫液。洗脫產(chǎn)率為 0. 085g (唾液酸)/g (樹(shù)脂的量)*min，相對(duì)于單柱洗脫產(chǎn)率提高了 2. 125倍，洗脫出來(lái)的唾液酸的濃度為原溶液的6倍。
實(shí)施例4
將發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾后再經(jīng)截留分子量為6萬(wàn)道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質(zhì)， 將清液稀釋至唾液酸濃度為20g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹(shù)脂的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中。采用由16根陰離子交換柱構(gòu)成的連續(xù)離子交換系統(tǒng)，吸附區(qū)為4根，洗雜區(qū)為4根，洗脫區(qū)為4根，再生區(qū)為4根。其中每個(gè)區(qū)都可以采用串聯(lián)的方式，以此來(lái)提高目標(biāo)產(chǎn)物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填4Kg樹(shù)脂。吸附流速為200ml/min，吸附容量為0.308g/ g濕樹(shù)脂；洗雜液為去離子水，洗雜流速為160ml/min，洗雜到無(wú)雜質(zhì)為止(用HPLC檢測(cè)確定洗雜區(qū)的第一根離子交換柱無(wú)雜質(zhì)流出)；洗脫液為0. 5mol/L的氯化鈉溶液，洗脫流速為200ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測(cè)確定洗脫區(qū)的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時(shí)將向位于再生區(qū)的離子交換柱中泵入濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用30g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的1.8倍，浸取后用1倍體積乙酸乙酯溶析結(jié)晶，得到純度為99.4%的唾液酸，收率為98. 8%。其中樹(shù)脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉IMml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 46%的再生液，同時(shí)洗脫用去0. IN氯化鈉185ml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 38. 5%的洗脫液。洗脫產(chǎn)率為 0. 105g (唾液酸)/g (樹(shù)脂的量)*min，相對(duì)于單柱洗脫產(chǎn)率提高了 2. 265倍，洗脫出來(lái)的唾液酸的濃度為原溶液的8倍。
實(shí)施例5
將發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾后再經(jīng)截留分子量為8萬(wàn)道爾頓的超濾膜去除大部分蛋白質(zhì)， 將清液稀釋至唾液酸濃度為10g/L左右，泵入裝入陰離子交換樹(shù)脂的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中。采用由18根陰離子交換柱構(gòu)成的連續(xù)離子交換系統(tǒng)，吸附區(qū)為4根，洗雜區(qū)為4根，洗脫區(qū)為6根，再生區(qū)為4根。其中每個(gè)區(qū)都可以采用串聯(lián)的方式，以此來(lái)提高目標(biāo)產(chǎn)物流出液的濃度。每根離子交換柱裝填8Kg樹(shù)脂。吸附流速為400ml/min，吸附容量為0. 328g/g濕樹(shù)脂，洗雜液為去離子水，洗雜流速為320ml/min ；洗雜到流出液無(wú)雜質(zhì)為止(用HPLC檢測(cè)確定洗雜區(qū)的第一根離子交換柱無(wú)雜質(zhì)流出)；洗脫液為0. 8mol/L氯化鈉的溶液，洗脫流速為400ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測(cè)確定洗脫區(qū)的第一根離子交換柱洗脫完全)；同時(shí)將向位于再生區(qū)的離子交換柱中泵入濃度為1.5mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行再生，再生完成后用去離子水淋洗至中性。唾液酸的洗脫液用40g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的體積為洗脫液的2倍，浸取后用0. 8倍體積乙酸乙酯溶析結(jié)晶，得到純度為99. 5%的唾液酸， 收率為99. 1%。其中樹(shù)脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉180ml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 50%的再生液，同時(shí)洗脫用去0. IN氯化鈉180ml，相對(duì)于單柱節(jié)約了 40%的洗脫液。洗脫產(chǎn)率為 0. 125g (唾液酸)/g (樹(shù)脂的量)*min，相對(duì)于單柱洗脫產(chǎn)率提高了 3. 125倍，洗脫出來(lái)的唾液酸的濃度為原溶液的10倍。
對(duì)比例1
與實(shí)施例5對(duì)比，進(jìn)行單柱固定床吸附，洗雜和洗脫實(shí)驗(yàn)，樹(shù)脂的填充量100g。唾液酸的發(fā)酵液上柱濃度5g/L，吸附流速為3mL/min，吸附容量為0. ^9g/g濕樹(shù)脂；洗雜區(qū)洗雜溶液為去離子水，流速為3ml/min，洗雜至無(wú)雜質(zhì)為止(用HPLC檢測(cè)確定洗雜無(wú)雜質(zhì)流出)；洗脫液為0. lmol/L氯化鈉溶液，洗脫流速為％il/min，洗脫完全(用HPLC檢測(cè)確定洗脫無(wú)唾液酸流出)；最后泵入濃度為1. Omol/L的氫氧化鈉溶液到需再生的離子交換柱進(jìn)行再生，再生完成后用去離子水淋洗。唾液酸的洗脫液用10g/L無(wú)水乙醇浸取后用0. 2倍體積乙酸乙酯溶析結(jié)晶，得到純度為98. 6%的唾液酸，收率為97. 9%。而且實(shí)施例5樹(shù)脂再生用去1. Omol/L的氫氧化鈉200ml，對(duì)比例用去360ml，同時(shí)實(shí)施例5中洗脫用去0. IN氯化鈉 180ml，對(duì)比例中用去300ml。此時(shí)單柱的洗脫產(chǎn)率為0. 04g(唾液酸)/g (樹(shù)脂的量)*min。
權(quán)利要求
1.一種連續(xù)分離唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸鈉為底物通過(guò)微生物發(fā)酵制得，其特征在于，將發(fā)酵液通過(guò)過(guò)濾、超濾處理后得唾液酸清液，泵入裝有OH—型陰離子交換樹(shù)脂的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中進(jìn)行吸附，去離子水進(jìn)行洗雜，氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，氫氧化鈉溶液進(jìn)行樹(shù)脂再生，收集含有唾液酸的洗脫液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析結(jié)晶，晶體減壓干燥后即得唾液酸純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的唾液酸清液中， 唾液酸的濃度為1 20g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的超濾處理去除大部分蛋白質(zhì)，采用截留分子量為1萬(wàn) 8萬(wàn)道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的陰離子交換樹(shù)脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物為骨架，以季胺基為功能基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的陰離子交換樹(shù)脂粒度為0. 315-1. 25mm，濕視密度為0. 66-0. 75g/ml，含水量為42-48 %。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的連續(xù)離子交換系統(tǒng)是由6-60根離子交換柱串聯(lián)的連續(xù)操作的離子交換系統(tǒng)，通過(guò)組合式閥門(mén)將離子交換過(guò)程中的吸附、洗雜、洗脫和再生四個(gè)工段之間按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹(shù)脂吸附飽和后立刻移出吸附段送入洗雜段進(jìn)行洗雜，洗雜結(jié)束后立刻移出洗雜段進(jìn)入洗脫段進(jìn)行洗脫，洗脫完成后立刻移出洗脫段送入再生段進(jìn)行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再進(jìn)行吸附，如此循環(huán)的操作過(guò)程，且每個(gè)工段的第1根離子交換柱的狀態(tài)切換同步進(jìn)行，并保證至少有一根離子交換柱處于吸附階段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中，吸附段、洗雜段、洗脫段和再生段的陰離子交換柱各自為1-20根。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的氯化鈉溶液濃度為0. 001-2M ；所述的氫氧化鈉溶液濃度為0. 001-2M。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，所述的乙醇水溶液濃度為5-40g/L，乙醇水溶液的加入量為洗脫液體積的1-2倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)分離唾液酸的方法，其特征在于，乙酸乙酯加入量為乙醇水溶液與洗脫液混合體積的0.1-1倍。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種連續(xù)分離唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸鈉為底物通過(guò)微生物發(fā)酵制得，將發(fā)酵液通過(guò)過(guò)濾、超濾處理后得唾液酸清液，泵入裝有OH-型陰離子交換樹(shù)脂的連續(xù)離子交換系統(tǒng)中進(jìn)行吸附，去離子水進(jìn)行洗雜，氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，氫氧化鈉溶液進(jìn)行樹(shù)脂再生，收集含有唾液酸的洗脫液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析結(jié)晶，晶體減壓干燥后即得唾液酸純品。本發(fā)明的分離純化方法簡(jiǎn)便易行，效果好，不僅運(yùn)行成本低廉，而且可以根據(jù)分離量的多少，實(shí)現(xiàn)從公斤級(jí)到噸級(jí)的分離，通過(guò)本發(fā)明所得產(chǎn)品在收率和產(chǎn)品質(zhì)量方面都獲得了極好的結(jié)果，保證了產(chǎn)品品質(zhì)。
文檔編號(hào)C07H7/033GK102532208SQ20121000265
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者吳菁嵐, 應(yīng)漢杰, 柏建新, 王裴, 胡亞南, 謝婧婧, 陳勇, 陳曉春 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)