針對cd74的人抗體和抗體-藥物綴合物的制作方法
【專利摘要】本文公開了與人CD74結(jié)合的分離的人單克隆抗體及相關的抗體-藥物綴合物。還公開了包含抗體或抗體-藥物綴合物的藥物組合物，以及使用該抗體和/或抗體-藥物綴合物的治療和診斷方法。
【專利說明】針對CD74的人抗體和抗體-藥物綴合物
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及⑶74特異性抗體及其抗體-藥物綴合物(ADCs)，這些抗體或ADCs的藥物組合物，及其在治療應用中的用途。
[0002]發(fā)明背景
[0003]人白細胞抗原(HLA) 11類組織相容性抗原Y鏈，也稱HLA-DR抗原相關不變鏈、Ia抗原相關不變鏈、Ii和CD74，是一種具有短細胞質(zhì)內(nèi)尾巴的跨膜蛋白。CD74的主要功能是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)室中負載到主要組織相容性復合體(MHC)II類異二聚體上的肽。
[0004]細胞表面上僅表達少部分的總細胞⑶74。細胞表面的⑶74會在結(jié)合和不結(jié)合CD74抗體的情況下被非?？焖俚貎?nèi)化(Roche PA et al., PNAS1993; 90:8581-8585;HansenHJ et al., Biochem J1996;320:293-300;Ong GL et al.，Immunologyl999;98:296-302)。因此細胞表面CD74的穩(wěn)態(tài)水平相當?shù)?，在單核細胞中，從每個細胞有數(shù)百個到數(shù)千個分子。
[0005]細胞表面上表達的⑶74的確切功能未知，但是研究證明⑶74發(fā)揮前炎性細胞因子巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)膜受體的作用。結(jié)合⑶74的MIF通過MAPK和Akt通路激活下游信號，并促進細胞增殖和存活。這種內(nèi)化很可能也受到所存在的作為輔助受體的CD44、CXCR2 或 CXCR4 的調(diào)節(jié)。
[0006]⑶74的上調(diào)已經(jīng)在許多類型的癌癥以及某些感染和炎癥中被觀察到。各種形式的人源化CD74特異性單克隆抗體，hLLl，已經(jīng)被提出用于治療CD74陽性腫瘤(Chang CH et al.,Bl ood2005;106:4308-4314;Sapra P et al., Clin CanRes2005;11:5257-5264;Stein R et al., Blood2004;104:3705-11;Govindan SV etal.J Nucl Med2000;41:2089-2097;Hertlein E et al.,Blood2010;I16:2554-2558;Stein R et al., Clin Cancer Res2009;15:2808-2817;SharkeyRM et al., J NuclMed2009;50:444-453;Lundberg BB et al., Drug Deliv2007;14:171-175;Griffiths GLet al., Int J Cancerl999;81:985-992;Griffiths GL etal., Cancer Res2003;9:6567-6571;Ochakovskaya R et al., Clin Cancer Res2001;7:1505-1510;Shih L et al., CancerTmmunol Immunother;Burton JD et al., Clin Cancer Res2004;10:6606-6611;LundbergBB et al., J Control Release2004;94:155-161)。
[0007]盡管已經(jīng)取得了很多進展，但是仍然需要有改進的基于治療抗體和ADCs用于治療嚴重疾病的方法，例如改進的癌癥治療。
發(fā)明概要
[0008]本發(fā)明的一個目的是提供一種新型高特異性和有效的單克隆CD74特異性抗體和這些⑶74特異性抗體的ADC。本發(fā)明的抗體或ADC對表達⑶74的細胞上顯示與本領域已經(jīng)描述的抗體不同的CD74結(jié)合特征或其它效應。特別地，抗體的特征是，在與CD74抗原結(jié)合后會被快速內(nèi)化，使它們適合于以ADC的形式用于治療應用，或者用于其它快速內(nèi)化有優(yōu)勢的應用。該新型ADC的特征是可高效殺傷表達CD74的腫瘤細胞。[0009]抗體和相應的ADC可以以多種形式提供，包括但不限于，抗體片段和雙特異性抗體形式。在優(yōu)選實施方案中，抗體是人抗體。
[0010]本發(fā)明的另一個目的是提供基于這些⑶74特異性抗體的ADC，用于醫(yī)學用途，提供高效且選擇性地導致腫瘤細胞死亡的途徑。
[0011]本發(fā)明的這些和其它方面在下文將更加詳細地說明。
[0012]附圖簡述
[0013]圖1是實施例中使用的重組⑶74蛋白的氨基酸序列的圖。⑶74vl和-v2, CD74del2-36vl 和-v2,以及 HisCD74vl 和 _ v2 分別相應于 SEQ ID N0S: 1-6。
[0014]圖2:是本發(fā)明抗體可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)序列的比對結(jié)果的圖。每個VH/VL序列的SEQ ID NO列舉在序列右側(cè)的圓括號內(nèi)。根據(jù)MGT命名系統(tǒng)的互補決定區(qū)(CDR)突出顯示如下:斜體序列代表CDR1，下劃線序列代表CDR2，粗體序列代表CDR3。
[0015]圖3:是ELISA確定的⑶74特異性抗體與代表性變體I和2同種型胞外域的重組蛋白(CD74vl和CD74v2)結(jié)合的圖。所有人抗體都是通過用相關重鏈和輕鏈表達載體瞬時共轉(zhuǎn)染HEK-293F細胞產(chǎn)生的。
[0016]圖4:是FACS確定的⑶74特異性抗體與Raji細胞上的細胞⑶74結(jié)合的圖。所有人抗體通過用相關重鏈和輕鏈表達載體瞬時共轉(zhuǎn)染HEK-293F細胞產(chǎn)生。
[0017]圖5:⑶74特異性抗體與食蟹猴⑶74的交叉反應性。人扁桃體(上圖)和食蟹猴淋巴結(jié)(下圖)用⑶74特異性抗體染色。*:生發(fā)中心；Mf:巨噬細胞;#:外套層(Mantle zone)B細胞。
[0018]圖6:抗-K -ETA’-預溫育的⑶74特異性抗體劑量依賴性誘導細胞死亡。顯示了一次代表實驗。數(shù)據(jù)顯示了 用抗-K -ETA’-預溫育的⑶74HuMab抗體處理兩個復孔細胞的平均百分比活力。百分比活力的計算如實施例14所述。
[0019]圖7:由 ELISA 確定的 CD74HuMab 抗體 005 和 006 (A)和 011 (B)及相應 ADC 與⑶73vl胞外域重組蛋白的結(jié)合。顯示了一次代表性實驗。
[0020]圖8:由對Daudi細胞的FACS分析確定的CD74HuMab抗體005和006⑷和011 (B)及相應ADC與表面表達的CD74的結(jié)合。所示數(shù)據(jù)是從三次獨立實驗計算得到的平均熒光強度(MFI)。
[0021]圖9:⑶74特異性ADC劑量依賴性誘導細胞殺傷。對下述每種細胞系顯示了一個代表性實驗=Daudi (A)，Raji (B)，M4A4 (C)和NC1-H747 (D)細胞。所示數(shù)據(jù)是用CD74特異性ADC處理的兩個復孔細胞的百分比存活。
[0022]圖10:⑶74特異性抗體治療性處理SCID小鼠體內(nèi)Daud1-1uc異種移植物的體內(nèi)功效。帶有確立的Daud1-1uc腫瘤的小鼠用⑶74特異性ADC處理。所示數(shù)據(jù)是每組的平均生物發(fā)光成像(BLI)信號土S.E.Μ.(每組η=7只小鼠)。
[0023]圖11:⑶74特異性ADC治療SCID小鼠體內(nèi)Raj1-1uc異種移植物的體內(nèi)功效。帶有確立的Raj1-1uc腫瘤的小鼠用⑶74特異性ADC處理。所示數(shù)據(jù)是每組的平均BLI信號土 S.E.M.(每組η=7只小鼠)。
[0024]圖12:⑶74特異性ADC治療SCID小鼠體內(nèi)Raj i異種移植物的體內(nèi)功效。已經(jīng)皮下建立Raji腫瘤的小鼠用⑶74特異性ADC處理。所示數(shù)據(jù)是每組的平均腫瘤體積土 S.E.M.(每組n=6只小鼠)。[0025]圖13:CD74特異性ADC治療SCID小鼠體內(nèi)M4A4異種移植物的體內(nèi)功效。已經(jīng)建立M4A4腫瘤的小鼠用⑶74特異性ADC處理。所示數(shù)據(jù)是每組的平均腫瘤體積土S.E.Μ.(每組η=7只小鼠)。
[0026]圖14:⑶74特異性HuMab抗體的解離速率的確定。顯示了一次代表性實驗。所示數(shù)據(jù)是將三個復孔的細胞與Alexa Fluor 488?染料標記的⑶74HuMab抗體溫育，隨后用未標記的⑶74HuMab抗體溫育指定的時間間隔，而確定的平均熒光強度(MFI)。
[0027]圖15 -M -⑶74HuMab抗體的時間依賴性內(nèi)化和積累。每個細胞系顯示了一次典型的實驗結(jié)果。所示的數(shù)據(jù)是用Alexa-488-標記的抗⑶74HuMab抗體溫育的三個復孔的細胞的平均熒光強度(MFI)。Daudi細胞在4°C (A)或37°C⑶用Alexa-488-標記的抗⑶74HuMab抗體溫育。Raji細胞(C)和M4A4細胞⑶在37°C下溫育。
[0028]圖16:抗_CD74HuMab抗體預防性治療SCID小鼠體內(nèi)的Daudi Iuc異種移植物的體內(nèi)功效。在對小鼠靜脈內(nèi)接種Daudi Iuc腫瘤后I小時內(nèi)，用抗CD74HuMab抗體處理小鼠。所示數(shù)據(jù)是每組的平均BLI信號土S.E.M.(每組n=7只小鼠)。
[0029]發(fā)明詳細說明`
[0030]定義
[0031 ] 術語“⑶74”和“⑶74抗原”在這里可以互換使用。除非特別指出，該術語包含人CD74的任何變體、異構(gòu)體和種屬同源體，其是細胞自然表達的或者在被CD74基因轉(zhuǎn)染的細胞上表達。已知存在至少4種人類同種型:p43, p41, p35和pp33 (Borghese F et al., ExpertOpin Ther Targets2011; 15 (3): 237-251)。這些來自于可變轉(zhuǎn)錄本剪接和兩個翻譯起始位點。p43(也稱作CD74同種型I,同種型a,或“長”;見UniProt條目P04233-1和NCBI參考序列NP001020330)含有296個氨基酸，其中殘基73-296形成細胞外部分。具有同種型I的胞外部分的⑶74蛋白構(gòu)建體在這里稱作“變體I”或“⑶74vl”。ρ35 (也稱作⑶74同種型2，同種型b或“短”;見Uniprot條目P04233-2和NCBI參考序列NP004346)由于可變剪接而缺少細胞外部分的殘基209-272。具有同種型2的細胞外部分的CD74蛋白構(gòu)建體在這里稱作“變體2”或“⑶74v2”。p41和p33來自于一個替代翻譯起始位點(下游48bp ;短16個氨基酸的蛋白)，導致變體缺少存在于這16個氨基酸內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號，但是具有分別與P43和p35相同的細胞外部分。NP001020329提供了另一個同種型(也稱作同種型3和同種型c)的序列，其中殘基148-160被取代，殘基161-296缺失。在例如NCBI參考序列XP_001099491.2和NCBI參考序列XP_002804624.1中提供了食蟹猴CD74同源體的序列。
[0032]術語“免疫球蛋白”是指一類結(jié)構(gòu)相關的糖蛋白，由兩對多肽鏈構(gòu)成，一對輕(L)低分子量鏈和一對重(H)鏈，所有四條鏈都通過二硫鍵交叉連接。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被良好表征。見例如 Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, ff., ed., 2nd ed.RavenPress, N.Y.(1989))。簡而言之，每條重鏈通常包含一個重鏈可變區(qū)(這里簡寫為Vh或VH)和一個重鏈恒定區(qū)(Ch*CH)。重鏈恒定區(qū)通常包括三個結(jié)構(gòu)域:Ch1，Ch2，和Ch3。每條輕鏈通常包括一個輕鏈可變區(qū)(這里簡寫為'或VL)和一個輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)通常包含一個結(jié)構(gòu)域從或稱CL。典型地，恒定區(qū)內(nèi)氨基酸殘基的編號根據(jù)Kabatet al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealthServicej National Institutes of Health, Bethesdaj MD.(1991)所述中的 EU-索引實施。VH和VL區(qū)可以進一步再分成超變性區(qū)(或超變區(qū)，其在序列上和/或結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)的形式方面具有高度可變性)，也稱作互補決定區(qū)(CDR)，中間被稱作框架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域隔開。每個Vh和\通常由三個CDR和四個FR構(gòu)成，以如下的次序從氨基端向羧基端排列:FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (另見 Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196，901917(1987))。
[0033]術語“抗體”或“ Ab ”，在本發(fā)明的上下文中，是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子片段或其任一個的衍生物，其能夠在通常的生理條件下特異結(jié)合抗原，并具有顯著的半衰期,例如至少大約30分鐘，至少大約45分鐘，至少大約I小時，至少大約2小時，至少大約4小時，至少大約8小時，至少大約12小時，大約24小時或更長，大約48小時或更長，大約
3、4、5、6、7或更多天，或者任何其它相關的功能限定的周期(例如足以誘導、促進、提高和/或調(diào)節(jié)與結(jié)合于抗原的抗體有關的生理響應，和/或足以使抗體招募效應器活性的時間)。免疫球蛋白分子重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w(Abs)的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與 宿主組織或因子的結(jié)合，宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應細胞)和補體系統(tǒng)的組分,例如Clq——經(jīng)典補體激活途徑中的第一個組分?？贵w還可以是多特異性的，對兩個或多個不同表位，通常是不重疊的表位，具有特異性。多特異性抗體的實例包括雙特異性抗體、二價抗體和類似的抗體分子。如上所示，除非另外指出或者在上下文中明顯地存在矛盾，否則這里的術語“抗體”包括抗體的保持與抗原特異結(jié)合能力的片段。已經(jīng)顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段，例如Fab和F(ab’ )2片段，來發(fā)揮。還應當理解，除非特別指出，否則術語抗體還包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、抗體樣多肽如嵌合抗體和人源化抗體。所產(chǎn)生的抗體可以具有任何同種型。
[0034]如這里所使用的，術語“人抗體”、“人Ab ”或“HuMab ”意圖包括具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包含不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或定點突變或者通過體內(nèi)的體細胞突變引入的突變)。然而，如這里所使用的，術語“人抗體”并不意圖包括如下的抗體:其中來自另一哺乳動物物種，例如小鼠，的CDR序列被嫁接到人框架序列上。
[0035]如這里所使用的，如果人抗體是從使用人免疫球蛋白序列的系統(tǒng)，例如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或通過篩選人免疫球蛋白基因文庫而獲得的，并且其中所選人抗體的氨基酸序列與由種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，或者例如至少99%相同，則人抗體“來源于”的種系序列。典型地，在重鏈⑶R3之外，來源于特定人種系序列的人抗體與由種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列顯示不超過20個氨基酸的差異，例如不超過10個氨基酸差異，例如不超過9、8、7、6或5個氨基酸差異，例如不超過4、3、2或I個氨基酸差異。
[0036]如這里所使用的，術語“單克隆抗體”、“單克隆Ab”、“單克隆抗體組合物”、“mAb”等是指具有單一分子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體組合物顯示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。因此，術語“人單克隆抗體”是指顯示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。人單克隆抗體可以通過雜交瘤產(chǎn)生，其包括從轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)獲得的B細胞，該B細胞具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，并與永生細胞融合。
[0037]當在本文中使用時，“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的免疫球蛋白類別(例如 IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE,或 IgM)。[0038]當在本文中使用時，術語“全長抗體”是指含有在該同種型抗體中通常發(fā)現(xiàn)的全部重鏈和輕鏈恒定域和可變域的抗體。
[0039]當在本文中使用時，除非在上下文中有矛盾，否則術語“Fab-臂”或“臂”是指一個重鏈-輕鏈對。
[0040]當在這里使用時，除非在上下文中有矛盾，否則術語“Fe區(qū)”是指包含至少一個鉸鏈區(qū)、一個Ch2區(qū)和一個Ch3區(qū)的抗體區(qū)域。
[0041]“缺少效應功能的抗體”或“效應功能缺陷抗體”是指這樣的抗體，它激活一種或多種效應機制(例如補體活化或Fe受體結(jié)合)的能力顯著降低或者沒有該能力。因此，效應功能缺陷抗體介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒(CDC)的能力顯著降低或者沒有這些能力。這種抗體的一個實例是IgG4同種型抗體或其鉸鏈穩(wěn)定化(hinge-stabilized)形式。另一個實例是在Fe區(qū)中引入突變,其會強烈減少補體蛋白與 Fe 受體之間的相互作用。見例如 Bolt S et al., Eur J Immunol 1993, 23:403-411; Oganesyan, Acta Crys.2008, D64, 700 - 704;and Shields et al.，JBC2001, 276:6591 - 6604。
[0042]如這里所使用的，術語“效應細胞”是指如下的免疫細胞，其參與免疫響應的效應期，而不是免疫響應的認知期或活化期。實例免疫細胞包括骨髓或淋巴來源的細胞，例如淋巴細胞(如B細胞和T細胞，包括細胞毒T細胞(CTLs))、殺傷細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞和粒細胞，例如中性粒細胞、嗜酸粒細胞和嗜堿粒細胞。一些效應細胞表達特異的Fe受體(FcRs)并進行特定的免疫功能。在一些實施方案中，效應細胞能夠誘導ADCC，例如自然殺傷細胞。例如，表達FcRs的單核細胞、巨噬細胞參與特異殺傷靶細胞，并向免疫系統(tǒng)的其它組分呈遞抗原。在一些實施方案中，效應細胞可能吞噬靶抗原或靶細胞。效應細胞上特定FcR的表達可以受到體液因子例如細胞因子的調(diào)節(jié)。效應細胞能夠吞噬靶抗原，或者吞噬或裂解靶細胞。
[0043]在本發(fā)明的上下文中，“ADC”是指抗體-藥物綴合物，在本發(fā)明的上下文中，特別指CD74特異性抗體，其與另 一個基團綴合，如本專利申請中所述。
[0044]“CD74 抗體”、“抗-CD74 抗體'“CD74Ab，，、“CD74 特異性抗體”或“抗 _CD74Ab” 是一種如上所述的抗體，其特異結(jié)合抗原CD74。
[0045]在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是分離的。如這里所使用的，“分離的Ab ”意圖指示如下的抗體，其基本上沒有其它具有不同抗原特異性的抗體(例如特異結(jié)合CD74的分離抗體基本上沒有特異結(jié)合除CD74之外抗原的抗體)。然后，特異結(jié)合人CD74的表位、同種型或變體的分離抗體可以和其它相關抗原，例如來自其它物種(例如CD74物種同源體)的相關抗原具有交叉反應性。而且，分離抗體可以基本上沒有其它細胞材料和/或化學物。在本發(fā)明的一個實施方案中，兩個或多個“分離的”具有不同抗原結(jié)合特異性的單克隆抗體被組合在良好限定的組合物中。
[0046]當在本文中使用時，在兩個或多個抗體的上下文中，術語“與……競爭”或“與……交叉競爭”是指兩個或多個抗體競爭結(jié)合CD74，例如結(jié)合CD74變體I和/或2。例如，實施例I中所述的構(gòu)建體能夠在這種測定中使用。在一個示例類型的測定中，CD74被涂布在平板上，并讓其與第一抗體結(jié)合，之后添加第二種已標記抗體。如果第一抗體的存在會減少第二抗體的結(jié)合，則抗體相互競爭。當在本文中使用時，術語“彼此競爭”還意圖涵蓋抗體的組合，其中一種抗體會減少另一種抗體的結(jié)合，但是當抗體以相反順序添加時則觀察不到競爭。
[0047]術語“表位”的意思是能夠特異結(jié)合抗體的蛋白決定簇(determinant)。表位通常由分子的表面集團構(gòu)成，例如氨基酸或糖側(cè)鏈，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。構(gòu)型和非構(gòu)型表位的區(qū)別在于，在去污劑的存在下，前者的結(jié)合消失而后者不會消失。表位可以包含直接參與結(jié)合的氨基酸殘基和其它不直接參與結(jié)合的氨基酸殘基，例如被特定抗原結(jié)合肽效果上封閉或覆蓋的氨基酸殘基(換言之，氨基酸殘基位于特定抗原結(jié)合肽的足跡(footprint)內(nèi)。
[0048]如這里所使用的，在抗體與預定抗原或表位結(jié)合的上下文中，術語“結(jié)合”是指，當通過例如表面等離子體共振(SPR)技術在BIAcOre3000裝置內(nèi)使用抗原的可溶形式作為配體、以抗體作為分析物進行測定時，以相當于大約10_7M或更小，例如大約10_8M或更小，例如大約10_9M或更小，大約ΙΟ,Μ或更小，或者大約10_ηΜ或更小的Kd的親和力結(jié)合。通常，抗體與預定抗原的結(jié)合親和力所對應的Kd值比與和預定抗原不同的或不緊密相關的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結(jié)合所對應的Kd值至少低10倍，例如至少低100倍，例如至少低1，000倍，例如至少低10，000倍，例如至少低100，000倍。當抗體的Kd值非常低(即抗體具有高親和力)時，其結(jié)合抗原的Kd值通常比對非特異性抗原的Kd值低至少10，000倍。
[0049]如這里所使用的，術語“kd”(sec—1)，是指特定Ab-抗原相互作用的解離速率常數(shù)。所述數(shù)值還稱作koff值。
[0050]如這里所使用的，術語“ka” (M-1X sec—1)，是指特定Ab-抗原相互作用的結(jié)合速率常數(shù)。
[0051]如本文中所使用的，術語“KD” (M)是指指特定Ab-抗原相互作用的解離平衡速率常數(shù)。
[0052]如本文中所使用的，術語“!(/’(Μ—1)是指指特定Ab-抗原相互作用的結(jié)合平衡速率常數(shù)，并通過ka除以kd獲得。
[0053]如本文中所使用的，當在CD74抗體的上下文中使用時，“內(nèi)化”包括抗體從細胞表面被內(nèi)化到表達CD74的細胞內(nèi)部的任何機制?？贵w的內(nèi)化可以在間接測定中評估，所述測定通過預溫育測量內(nèi)化的Ab-毒素綴合物或特異與抗體特異結(jié)合的毒素的效果(例如實施例14的抗-κ-ΕΤΑ’測定)。
[0054]如本文中所使用的，術語“抑制生長”(例如指細胞，如腫瘤細胞)意圖包括，與CD74抗體或ADC接觸的細胞與不和CD74抗體或ADC接觸的相同細胞的生長相比，生長的任何可測量的降低，例如抑制細胞培養(yǎng)物生長至少大約10%，20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,99%,或100%。這種細胞生長降低可以通過各種機制發(fā)生，例如內(nèi)化、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒(ADCC)、補體依賴性細胞毒(CDC)、藥物介導的細胞殺傷和/或細胞凋亡。
[0055]本發(fā)明還提供了如下的抗體，其包含實施例的抗體八區(qū)、Vl區(qū)或一個或多個⑶R的功能性變體。在CD74抗體上下文中使用的Vu Vh,或CDR的功能變體仍允許抗體保留親本抗體至少相當比例(至少大約50%，60%, 70%, 80%, 90%, 95%或更多)的親和力/結(jié)合力和/或特異性/選擇性，在一些情況下，這種CD74抗體可能有比親本Ab更大的親和力、選擇性和/或特異性。
[0056]這些功能變體通常與親本Ab保持顯著的序列同一性。兩個序列之間的百分比同一性，是在考慮為實現(xiàn)兩個序列最優(yōu)比對而需要引入的缺口的數(shù)目和每個缺口的長度的條件下，序列所共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即％同源性=#相同位置/總#位置xlOO)。兩個序列之間序列的比較和百分比同一性的確定可以使用數(shù)學算法加以實現(xiàn)，如下面的非限制性實例所述。
[0057]兩個核苷酸序列的百分比同一性可以使用GCG軟件包中的GAP程序(可以在http:"www.gcg.com 獲得)確定，使用 NWSgapdna、CMP 矩陣，缺口權重為 40, 50, 60, 70,或80，長度權重為1，2，3，4，5，或6。兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性還可以使用 E.Meyers 和 ff.Miller (Comput.Appl.Biosci4, 11-17 (1988))所述的算法加以確定，其已經(jīng)整合在ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120權重殘基表，缺口長度罰分為12，缺口罰分為4。此外，兩個氨基酸序列之間的百分比同一'I"生可以使用Needleman和Wunsch算法(Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.48，444-453 (1970))加以確定，其被包含在 GCG 軟件包的GAP程序(可以在http://www.gcg.com獲得)中，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，缺口權重為16，14，12，10,8,6,或4，長度權重為1,2, 3,4, 5,或6。
[0058]CDR變體的序列可以基于大體保守的替換而與親本抗體序列的CDR序列不同；例如變體中的替換有至少大約35%，大約50%或更多，大約60%或更多，大約70%或更多，大約75%或更多，大約80%或更多，大約85%或更多，大約90%或更多，(例如大約65_90%，例如大約92%，93%或94%)是保守的氨基酸替換。
[0059]CDR變體的序列可以基于大體保守的替換而與親本抗體序列的CDR序列不同；例如變體中的替換有至少10個，例如至少9，8，7，6，5，4，3，2或I個是保守的氨基酸替換。
[0060]術語“穩(wěn)定化非人IgG4抗體”是指已被修飾從而減少半分子交換(half-moleculeexchange)的IgG4抗體(見例如國際專利申請公開W02008145142,或van der NeutKolfschoten M et al.(2007) Sciencel4; 317 (5844)及其中的參考文獻)。
[0061]在本發(fā)明的上下文中，保守替換可以由下面三個表中的一個或多個所反映的氨基酸類被內(nèi)的替換來限 定:
[0062]用于保守替換的氨基酸類別
[0063]
【權利要求】
1.一種分離抗體，其與至少一種選自下組的抗體結(jié)合相同的人⑶74變體I和2上的表位: (a)包括含有SEQID NO: 19序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NO:26序列的VL區(qū)的抗體[011]； (b)包括含有SEQID NO:7序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NO:23序列的VL區(qū)的抗體[005]； (c)包括含有SEQID NO: 11序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NO:26序列的VL區(qū)的抗體[006];和 (d)包括含有SEQID NO: 15序列的VH區(qū)和含有SEQ ID NO:26序列的VL區(qū)的抗體[008]。
2.一種抗體，其結(jié)合⑶74變體I和2，并包含選自下組的Vh⑶R3區(qū):SEQ IDNO:22, 10，14，或 18。
3.前述任一權利要求的抗體，當如實施例11所述地測定時，該抗體 (a)以小于大約500ng/mL,小于大約400ng/mL,小于大約350ng/mL,或小于大約330ng/mL的EC5tl值與⑶74變體I的胞外域結(jié)合； (b)以小于大約400ng/mL,小于大約300ng/mL,小于大約250ng/mL,或小于大約220ng/mL的EC5tl值與⑶74變體2的胞外域結(jié)合；或
(c)(a)和(b)。
4.前述任一權利要求的抗體，當如實施例11所述進行測定時，該抗體以小于大約400ng/mL,小于大約300ng/mL,小于大約250ng/mL,或小于大約200ng/mL的EC5tl值與Raji細胞上的⑶74結(jié)合。
5.前述任一權利要求的抗體，其與食蟹猴CD74結(jié)合。
6.前述任一權利要求的抗體，其在與細胞表面上表達的CD74結(jié)合之后被內(nèi)化。
7.權利要求6的抗體，其中所述細胞是Raji細胞。
8.前述任一權利要求的抗體，其在如實施例14所述進行測定時,在抗kappaETA’測定中誘導殺傷Raji細胞的EC5tl值小于大約60ng/mL,小于大約40ng/mL,小于大約30ng/mL,或大約25ng/mL或者更低。
9.前述任一權利要求的抗體，其在O°C下的解離速率為0.02-1.0mirT1, 0.03-大約0.30min_1, 0.04-0.10 或者 0.15-0.SOmirT1。
10.前述任一權利要求的抗體，其包括:包含⑶Rl、2和3序列SEQID NO: 24、AAS和SEQ ID NO:25 的 Vl 區(qū)，以及 a)包含CDRU2 和 3 序列 SEQ ID N0:20、21 和 22 的 Vh 區(qū)(011)； b)包含CDRl、2 和 3 序列 SEQ ID NO:8、9 和 10 的 Vh 區(qū)(005)；
c)包含CDRU2 和 3 序歹Ij SEQ ID NO: 12、13 和 14 的 Vh 區(qū)(006)； d)包含CDRl、2 和 3 序列 SEQ ID NO: 16、17 和 18 的 Vh 區(qū)(008);或 e)任一所述抗體的變體，該變體優(yōu)選在Vh和/或\區(qū)中具有最多1、2或3個氨基酸修飾，更優(yōu)選氨基酸替換，例如所述序列中的保守氨基酸替換。
11.根據(jù)前述任一權利要求的抗體，其包含這樣的Vh區(qū)，所述Vh區(qū) a)與選自SEQ ID NOS: 7, 11，15和19的Vh區(qū)序列具有至少80%同一性，例如至少90%，至少95%，或至少98%，或100%同一性，或者 b)與選自SEQ ID NOS: 7, 11，15和19的Vh區(qū)序列相比，具有最多20個，例如15或10或5、4、3、2或I個氨基酸修飾，更優(yōu)選氨基酸替換，例如保守氨基酸替換。
12.根據(jù)前述任一權利要求的抗體，其包含這樣的\區(qū)，所述\區(qū) a)與選自SEQID N0S: 23和26的\區(qū)序列具有至少80%同一性，例如至少90%，至少95%，或至少98%，或100%同一性，或者 b)與選自SEQID N0S:23和26的Vl區(qū)序列相比，具有最多20個，例如15或10或5、4、3、2或I個氨基酸修飾，更優(yōu)選氨基酸替換，例如保守氨基酸替換。
13.一種抗體，其結(jié)合⑶74變體I和2，并且包括: (a)包含SEQID NO: 19序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID N0:26序列的Vl區(qū)[011]； (b)包含SEQID NO:7序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID N0:26序列的Vl區(qū)[005/011]； (c)包含SEQID NO:7序列的Vh區(qū)和包含SEQ ID NO:23序列的Vl區(qū)[005]； (d)包含SEQID NO: 11序列的Vh 區(qū)和含有SEQ ID NO:26序列的Vl區(qū)[006];或 (e)包含SEQID NO: 15序列的VHg和含有SEQ ID N0:26序列的八區(qū)[008]。
14.前述任一權利要求的抗體，其是人單克隆抗體。
15.前述任一權利要求的抗體，其具有選自IgGl和IgG4的同種型。
16.前述任一權利要求的抗體，其與治療模塊綴合。
17.權利要求16的抗體，其通過附接于該抗體中的巰基殘基的接頭與所述治療模塊綴合，所述巰基殘基是該抗體的至少部分還原獲得的。
18.權利要求16和17中任一項的抗體，其中所述治療模塊是細胞毒性模塊、放射性同位素、化療劑、裂解肽或細胞因子。
19.權利要求18的抗體，其與細胞毒性模塊綴合。
20.權利要求19的抗體，其中細胞毒性模塊選自下組:紫杉醇；細胞松弛素B;短桿菌肽D ;溴化乙錠；依米丁 ；絲裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；長春新堿；長春堿；秋水仙堿；多柔比星；柔紅霉素；二羥基炭疽菌素二酮；美登素或其類似物或衍生物；auriStatin或其功能性肽類似物或衍生物如單甲基auristatin E(MMAE)或F(MMAF);多拉司他汀10或15或其類似物；伊立替康或其類似物；米托蒽醌；光神霉素；放線菌素D ；1-脫氫睪酮；糖皮質(zhì)激素；普魯卡因；地卡因；利多卡因；普萘洛爾；嘌呤霉素；卡里奇霉素或其類似物或衍生物；抗代謝藥物如氨甲喋呤，6-巰基嘌呤，6-硫代鳥嘌呤，阿糖胞苷，氟達拉濱，5-氟尿喃唳，氮烯咪胺，羥基脲，天冬酰胺酶，吉西他濱，或克拉屈濱；燒化劑如氮芥，thioepa,苯丁酸氮芥，美法侖，卡莫司汀(BSNU)，洛莫司汀(CCNU)，環(huán)磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，鏈唑霉素，達卡巴嗪(DTIC)，丙卡巴肼，絲裂霉素C ;鉬衍生物如順鉬或卡鉬；duocarmycinA (duocarmycin A)，duocarmycin SA (duocarmycin SA)，rachelmycin (CC-1065)，或其類似物或衍生物；抗生素如放線菌素D，博萊霉素，柔紅霉素，多柔比星，伊達比星，光神霉素，絲裂霉素，米托蒽醌，普卡霉素，氨茴霉素(AMC);吡咯并[2，l-c][l，4]_苯并二氮卓類藥物(PDB);白喉毒素及相關分子如白喉毒素A鏈及其活性片段和雜交分子，蓖麻毒蛋白毒素例如蓖麻毒蛋白A或去糖基化的蓖麻毒蛋白A鏈毒素,霍亂毒素,志賀樣毒素如SLT I, SLTII，SLT IIV, LT毒素，C3毒素,志賀毒素，百日咳毒素，破傷風毒素，大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制劑，假單胞菌外毒素，alorin，皂草素，蒴蓮根毒素，gelanin，相思豆毒蛋白A鏈，蒴蓮根毒素A鏈，α-帚曲霉毒素，油桐蛋白，石竹素蛋白，美洲商陸蛋白如PAPI，PAPII和PAP-S,苦瓜抑制物,麻瘋樹毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥阜草(sapaonaria officinali)抑制物，白樹毒素，mitogellin,局限曲菌素,酹霉素,和依諾霉素毒素；核糖核酸酶(RNA酶);DNA酶I，葡萄球菌腸毒素A ;商陸抗病毒蛋白；白喉毒素毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。
21.權利要求19的抗體，其與選自下組的細胞毒模塊綴合:蒽環(huán)類抗生素，吡咯并[2, 1-c] [1, 4]-苯并二氮卓類藥物，美登素，卡里奇霉素，duocarmycin, rachelmycin(CC-1065),多拉司他汀10或15,伊立替康,單甲基auristatin E和單甲基auristatin F,或其類似物、衍生物或前藥。
22.權利要求19的抗體，其中細胞毒性模塊是auristatin或其功能肽類似物或衍生物，其任選地通過附接于該抗體中一個或多個半胱氨酸殘基的接頭與該抗體綴合。
23.權利要求19的抗體，其與MMAE(式I)綴合。
24.權利要求19的抗體，其與vcMMAE(式IV)綴合。
25.權利要求19的抗體，其與MMAF(式II)綴合。
26.權利要求19的抗體，其與vcMMAF(式III)或mcMMAF(式V)綴合。
27.權利要求16-26中任一項的抗體，其在如實施例18所述進行測定時，誘導殺傷Raji, Daudi或M4A4細胞的IC5tl值小于大約0.5 μ g/mL,小于大約0.3 μ g/mL,小于大約0.2 μ g/mL,或小于大約 0.1 μ g/mL。
28.權利要求18的抗體，其與選自下組的細胞因子綴合:IL-2、IL-4、IL_6、IL-7、IL-10、 IL-12、 IL-13、 IL-15、 IL-18、 IL-23、 IL-24、 IL-27、 IL_28a、 IL_28b、 IL-29、 KGF、IFNa、IFNβ、IFN gamma、GM-CSF、CD40L、Flt3 配體、干細胞因子、安西司亭、和 TNFa。
29.前述任一權利要求的抗體，其是多特異性抗體，包括如前述任一權利要求定義的抗體的第一抗原結(jié)合區(qū)，和至少一個具有不同結(jié)合特異性的第二抗原結(jié)合區(qū)。
30.權利要求29的抗體，其是一種雙特異性抗體，任選地，其中第二抗原結(jié)合區(qū)對人效應細胞例如人T細胞上的抗原具有結(jié)合特異性。
31.權利要求29和30中任一項的抗體，其是雙特異性抗體，其中 第一抗原結(jié)合區(qū)與第一 Fe區(qū)連接，所述第一 Fe區(qū)在選自下組的位置處具有氨基酸替換:366，368，370，399，405，407和409，第二抗原結(jié)合區(qū)與第二 Fe區(qū)連接，所述第二 Fe區(qū)在選自下組的位置處具有氨基酸替換:366，368，370, 399，405, 407和409，并且 所述第一和第二 Fe區(qū)不在相同的位置具有替換。
32.—種抗獨特型抗體，其針對前述任一權利要求的抗體，任選地針對根據(jù)權利要求13的抗體。
33.一種表達載體,其包含編碼一種或多種選自下組的氨基酸序列的核苷酸序列:SEQID NOS:7, 11，15，19，23 和 26，或其任意組合。
34.根據(jù)權利要求34的表達載體，其還包含編碼人抗體輕鏈恒定區(qū)、人抗體重鏈恒定區(qū)、或兩者的核苷酸序列。
35.一種重組真核或原核宿主細胞,其產(chǎn)生權利要求1-16或18-32中任一項的抗體。
36.一種藥物組合物，其包括權利要求1-32中任一項的抗體和藥學可接受的載體。
37.權利要求1-32中任一項的抗體，供用作藥物。
38.權利要求1-32中任一項的抗體，供用于癌癥治療。
39.權利要求1-32中任一項的抗體，其用于癌癥預防。
40.用于權利要求39的抗體，其中所述癌癥預防包括如下的一種或多種:減少癌癥發(fā)生的風險，減少癌癥進展的風險，和/或減少緩解過程中癌癥復發(fā)的風險。
41.用于權利要求37-40中任一項的抗體，其中所述癌癥選自下組:乳腺癌，結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜/宮頸癌，胃癌，頭頸癌，肺癌，惡性膠質(zhì)瘤，惡性黑色素瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，腎癌，肝癌，胸腺癌，惡性纖維組織肉瘤，聽神經(jīng)鞘瘤，垂體腺瘤和腺瘤。
42.用于權利要求37-40中任一項的抗體，其中所述癌癥選自下組:惡性淋巴瘤，B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)，急變期的慢性粒細胞白血病(CML)，非何杰金氏淋巴瘤(NHL),多發(fā)性骨髓瘤(麗)，單核細胞樣B細胞淋巴瘤(MBCL)，毛細胞白血病(HCL)，和T細胞淋巴瘤。
43.用于權利要求42的抗體，其中所述癌癥是NHL。
44.用于權利要求42的抗體，其中所述癌癥是MM。
45.用于權利要求41的抗體，其中所述癌癥是卵巢癌。
46.用于權利要求41的抗體，其中所述癌癥是乳腺癌。
47.用于權利要求41的抗體，其中所述癌癥是胰腺癌。
48.用于權利要求41的抗體，其中所述癌癥選自前列腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌。
49.用于權利要求37的抗體，其供用于治療自身免疫性疾病。
50.用于權利要求37-49中任一項的抗體，其與至少一種其他治療劑組合。
51.權利要求50的抗體，其中該至少一種其他治療劑選自下組:第二種抗體或ADC;化療劑；血管發(fā)生、新生血管化和/或其它血管化的抑制劑；抗癌免疫原；細胞因子或趨化因子；細胞周期控制或細胞凋亡調(diào)節(jié)劑；激素調(diào)節(jié)劑；抗無反應性劑；含腫瘤抑制基因的核酸或載體；抗癌核酸；病毒或病毒蛋白；免疫系統(tǒng)細胞；分化誘導劑；CD74上調(diào)劑；抗炎、免疫抑制和/或免疫調(diào)節(jié)劑；或其任何組合。
52.用于權利要求51的抗體，其中至少一種治療劑選自下組:⑶20特異性抗體、⑶138特異性抗體、CD38特異性抗體、抗VEGF-A抗體、美法侖、來那度胺、硼替佐米、氟尿嘧啶、吉西他濱、伊立替康、順鉬，或其衍生物或類似物。
53.權利要求1-32中任一項的抗體用于制造治療癌癥的藥物的用途。
54.權利要求53的用途，其包含權利要求36-52中任一項的附加特征。
55.一種用于誘導表達CD74的細胞的死亡、抑制其生長和/或抑制其增殖的方法，包括施用權利要求16-29中任一項的抗體。
56.—種用于治療權利要求37-52中任一項的疾病的方法,所述方法通過向有需要的個體施用有效量的根據(jù)權利要求1-32中任一項的抗體，任選地與根據(jù)權利要求51和52中任一項的其他治療劑組合來進行。
【文檔編號】A61P35/00GK103458930SQ201280015984
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年2月1日 優(yōu)先權日:2011年2月1日
【發(fā)明者】S.弗普洛根, M.奧弗迪克, R.V.迪杰庫伊曾, W.K.布里克, P.v.伯克爾, P.帕倫, S.里斯比 申請人:根馬布股份公司