專利名稱：治療心腦血管疾病的組合物及其制備與檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療心血管疾病和腦血管疾病的組合物及其制備與檢驗(yàn)方法，具體的說涉及包含牡荊素和甘露醇的混合組合物，該組合物在抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、改善血流動(dòng)力學(xué)以及抗腦缺血等方面，效果顯著。
背景技術(shù)：
根據(jù)最近的世界衛(wèi)生報(bào)告，冠心病發(fā)病及死亡率近年呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球因病死亡中每3個(gè)中就有I個(gè)死于心血管疾病，預(yù)計(jì)到2020年心血管死亡率將增加50%，悉尼大學(xué)的流行病學(xué)專家MacMahon教授指出，2020年心肌梗死與腦卒中將從目前死因的第5與第6位上升至第I和第4位。在我國，12個(gè)城市的統(tǒng)計(jì),本病人口死亡率為29. 6/10萬，其中以北京、天津兩市最高。20世紀(jì)80年代中期，北京、上海、廣州三市本病人口死亡率分別為21. 7/10萬、15. 7/10萬、4. 1/10萬，20世紀(jì)90年代中期分別增至62. 0/10萬、37. 4/10萬、19. 8/10萬，其趨勢(shì)北方高于南方。動(dòng)脈硬化、血栓、冠心病、心絞痛是高發(fā)性、高病死率、高殘障性疾病，給一個(gè)人、家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)，是全球衛(wèi)生保健和衛(wèi)生資源的巨大負(fù)擔(dān)。據(jù)WHO預(yù)計(jì)，心腦血管疾病每年至少造成全球1200萬人死亡，已成為人類健康的頭號(hào)敵人。在2005年全球10大暢銷藥物中，心腦血管類藥物占到了 4個(gè)。2004年，全球心腦血管藥物銷售額為608億美元，預(yù)計(jì)2008年將上升至912億美元，而2010年這一數(shù)字將有可能竄升為1044億美元。據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計(jì)，我國心腦血管病藥物市場(chǎng)的規(guī)模約有160億 180億元人民幣，其中西藥與中藥制劑各占半壁江山。在過去10年內(nèi)，抗心腦血管病中藥(尤以中藥注射劑為主)早已成為國內(nèi)醫(yī)院的常用臨床治療劑。預(yù)計(jì)2020年隨著人口老齡化到來，我國和其他發(fā)展中國家將會(huì)迎來冠心病流行高峰，此類藥物將繼續(xù)顯示強(qiáng)勁的增長(zhǎng)勢(shì)頭。`臨床實(shí)踐證明，中藥注射劑治療心腦血管疾病具有化學(xué)藥產(chǎn)品不可替代的獨(dú)特功效，也有中藥其他劑型難以具備的優(yōu)勢(shì)，市場(chǎng)前景廣闊，有望成為未來中藥生產(chǎn)企業(yè)研發(fā)的熱點(diǎn)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)最為激烈的領(lǐng)域，也是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展和現(xiàn)代化可能的重要方向。不得不承認(rèn)的是，盡管國內(nèi)每年都有一些新的治療冠心病中藥應(yīng)用于臨床，但除極少數(shù)藥物外，大多數(shù)中藥始終未能踏進(jìn)國際市場(chǎng)的大門，其原因除藥理學(xué)研究、有效藥物成分、藥代過程并不十分明確外，更主要是因?yàn)闆]有充分采用國際統(tǒng)一的療效標(biāo)準(zhǔn)，很難證明中藥在治療冠心病方面的療效和安全性優(yōu)勢(shì)。無論是最佳劑量還是給藥途徑，或是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)過程，目前的研究還不能給出最具說服力的解釋。目前臨床使用頻率較高的中成藥品種包括丹參注射液、川芎嗪注射液、生脈注射液、燈盞花素注射液、黃芪注射液、參脈注射液、參附注射液、葛根素注射液等。山楂葉制劑無論在國內(nèi)還是在國外，在心血管疾病治療上都有著廣范應(yīng)用。據(jù)了解，在歐洲，山楂果、葉和花的混合提取物用于穩(wěn)定性心絞痛患者取得了肯定療效，山楂葉制劑對(duì)早期老年慢性心力衰竭的治療也取得顯著療效。在國內(nèi)，山楂葉現(xiàn)已收載于《中國藥典》2005年及2010年一部，山楂葉提取物及制劑益心酮片也已均收載于《中國藥典》2005年及2010年一部。益心酮片作為藥品上市最早收載中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第六冊(cè)151頁。功能主治活血化瘀，宣通血脈。用于瘀血阻脈所致的胸痹，癥見胸悶憋氣、心前取刺痛、心悸健忘、眩暈耳鳴；冠心病心絞痛、高脂血癥、腦動(dòng)脈供血不足見上述癥候著?，F(xiàn)代研究表明山楂葉提取物具有降血壓、降低外周血管阻力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈流量、降低心肌耗氧量、強(qiáng)心、增加心輸出量、抗心肌缺血，抗血小板聚集、改善血液流變性，消除氧自由基、降膽固醇和甘油三脂、增強(qiáng)耐缺氧能力和利尿等藥理作用。臨床應(yīng)用于冠心病心絞痛及各種原因引起的早搏有明顯療效，有效地緩解心絞痛及心悸、胸悶等癥狀，改善心電圖，降低血脂，提高HDL，改善微循環(huán)和血流變，增加腦血流量，抗脂質(zhì)過氧化，且安全，未見毒副作用。牡荊素為黃酮類化合物C苷，口服制劑，其生物利用度低，不利于本品臨床療效發(fā)揮，故我們將牡荊素制與甘露醇成凍干粉針組合物。即利于臨床療效最大發(fā)揮，又利于運(yùn)輸、忙藏，方便臨床用藥。社會(huì)人口老齡化即將到來，冠心病、心絞痛、腦中風(fēng)患者日益增多，且有年輕化的趨勢(shì)，對(duì)此類藥物需求日益增大，已上市臨床運(yùn)用藥物隨著患者使用增多，各種不良反應(yīng)也隨著增加。臨床費(fèi)用居高不下，市場(chǎng)急需療效確切不良反應(yīng)少，毒副作用低，價(jià)格相對(duì)便宜的藥物。牡荊素、甘露醇組合物，質(zhì)量穩(wěn)定可控，療效確切體內(nèi)作用清楚，不良反應(yīng)少，毒副作用低，物美價(jià)廉是普通百姓都能用得起的藥。本品開發(fā)上市將能更好的滿足廣大患者需要，解決患者身心痛苦，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種新的臨床用于治療心腦血管疾病的藥物，該藥物效果確切，作用速度快，毒副作用低。本發(fā)明還提供了牡荊素和甘露醇的混合組合物的制備方法、檢驗(yàn)方法。本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)

治療心腦血管疾病的組合物，其活性成分為治療有效量的牡荊素和甘露醇的混合組合物。治療心腦血管疾病的組合物是通過在干重的基礎(chǔ)上，按照1:6 10重量比的牡荊素和甘露醇來制備的，具體步驟如下a、稱取處方量甘露醇、牡荊素原料混合，加注射用水，攪拌均勻，再加0. lmol/L的氫氧化鈉溶液，攪拌溶解，再用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)至PH在8. 5±0. 5左右，加0. 04-0. 05%的針用活性炭，攪拌10-15分鐘，微孔鈦過濾器減壓粗濾，脫炭，檢查含量、pH合格后，再經(jīng)0. 2-0. 25 um微孔濾膜終端過濾后，分裝于西林瓶中，低溫冷凍干燥；b、預(yù)凍把分裝好的藥品放入凍干箱內(nèi)隔板上預(yù)凍開始至+25°C _40°C ；C、升華干燥將冷凝器溫度下降至_45°C以下，啟動(dòng)真空泵，待真空度達(dá)到一定數(shù)值后，緩緩打開蝶閥，當(dāng)干燥箱內(nèi)的真空度達(dá)13. 33Pa即0.1mmHg以下關(guān)閉冷凍機(jī)，通過隔板下的加熱系統(tǒng)緩緩加熱，使凍結(jié)產(chǎn)品的溫度逐漸升高至22-25°C ；d、再干燥在25-30°C下干燥，干燥失重符合規(guī)定，在無菌條件下加蓋膠塞，軋蓋，包裝，檢驗(yàn)，入庫。
治療心腦血管疾病的組合物的檢驗(yàn)方法，包括以下過程(I)取本品適量，加乙醇制成每Iml含主藥20呢溶液，作為供試品溶液，另取牡荊素對(duì)照品同法制成對(duì)照品溶液，按照2010年版中國藥典一部附錄薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5W，分別點(diǎn)于同一聚酰胺膜上，以36%醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；(2)取本品適量，加乙醇制成每Iml含主藥10吒的溶液，按照2010年版中國藥典一部附錄紫外-可見分光光度法測(cè)定，在270nm波長(zhǎng)處有最大吸收；(3)有關(guān)物質(zhì)取本品內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取約相當(dāng)于牡荊素25mg的樣品，置50ml量瓶中，加60%乙醇IOml使溶解后用流動(dòng)相稀釋制成每Iml中含500 y g的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動(dòng)相稀釋制成每I ml中含10 ii g的溶液，作為對(duì)照溶液；另精密稱取葒草素對(duì)照品適量，用流動(dòng)相使溶解并定量稀釋制成每Iml中含g的溶液作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液，按照(5)含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，精密量取對(duì)照品溶液20 Ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20% ;再精密量取供試品溶液20 u I注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時(shí)間4倍，供試品溶液色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，含雜質(zhì)葒草素按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過0. 6%，在供試品溶液中任何小于對(duì)照溶液主峰面積0. 01倍的峰可忽略不計(jì)的情況下，所有各雜質(zhì)量的總和不得過2. 0% ；(4)甘露醇取本品適量,約相當(dāng)于甘露醇0. 2g，精密稱定，置250ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10ml，置碘瓶中，精密加高碘酸鈉溶液[取硫酸溶液(1 — 20) 90ml與高碘酸鈉溶液(2. 3 — 1000) IlOml混合制成]50ml，置水浴上加熱15分鐘，放冷，加碘化鉀試液10ml，密塞，放置5分鐘，用0. 05mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液1ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每Iml硫代硫酸鈉滴定液相當(dāng)于0 . 9109mg的C6H14O6，含甘露醇應(yīng)為標(biāo)示量的90. 0 110. 0% ；(5)牡荊素含量測(cè)定按照2010年版中國藥典一部附錄高效液相色譜法測(cè)定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水-冰醋酸為18 82 1為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm。理論板數(shù)按牡荊素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500,牡荊素峰與雜質(zhì)峰的分離度均應(yīng)符合要求；測(cè)定法取本品內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取約相當(dāng)于牡荊素25mg的樣品，置50ml量瓶中，加60%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取Iml置IOml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取20沿注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取牡荊素對(duì)照品適量，精密稱定，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含牡荊素(C21H2tlOltl)應(yīng)為標(biāo)示量的90. 0 110. 0%。本發(fā)明治療心腦血管疾病的牡荊素和甘露醇的混合組合物在抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、改善血流動(dòng)力學(xué)以及抗腦缺血等方面，療效確切顯著，作用速度快，質(zhì)量穩(wěn)定可控，無不良反應(yīng)，毒副作用低，成本較低，能更好的滿足廣大患者需要，解決患者身心痛苦，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方式
以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例1 :注射用牡荊素甘露醇的制備a、稱取牡荊素30g、甘露醇180g原料均勻混合，加600ml注射用水，攪拌均勻，再加0. lmol/L的氫氧化鈉溶液1500ml，攪拌溶解，再用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)至PH在8. 5左右，加注射用水至3000ml，加0. 05%的針用活性炭，攪拌10分鐘，微孔鈦過濾器減壓粗濾，脫炭，檢查含量、pH合格后，再經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜終端過濾后，分裝于IOml西林瓶中，每瓶裝3ml,低溫冷凍干燥。b、預(yù)凍把分裝好的藥品放入凍干箱內(nèi)隔板上預(yù)凍開始至+25°C -40°C，2小時(shí);-40°C，3小時(shí)。C、升華干燥將冷凝器溫度下降至_45°C以下，啟動(dòng)真空泵，待真空度達(dá)到一定數(shù)值后，緩緩打開蝶閥，當(dāng)干燥箱內(nèi)的真空度達(dá)13. 33Pa (0.1mmHg)以下關(guān)閉冷凍機(jī)，通過隔板下的加熱系統(tǒng)緩緩加熱，使凍結(jié)產(chǎn)品的溫度逐漸升高至-20°C，再由-20°C逐漸升高至25°C。整個(gè)升華干燥過程約26小時(shí)。d、再干燥在25°C下干燥約5小時(shí)，干燥失重符合規(guī)定，在無菌條件下加蓋膠塞，軋蓋，包裝，檢驗(yàn)，入庫。實(shí)施例2 :注射用牡荊素甘露醇的檢驗(yàn)(I)取本品14. Omg,加乙醇制成每Iml含牡荊素20呢溶液,作為供試品溶液；另取牡荊素對(duì)照品同法制成對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5W，分別點(diǎn)于同一聚酰胺膜上，以36%醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；

(2)取本品7. Omg，加乙醇制成每Iml含主藥10吒的溶液，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2010年版一部附錄V A)測(cè)定，在270nm波長(zhǎng)處有最大吸收；( 3 )有關(guān)物質(zhì)取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于牡荊素25mg)，置50ml量瓶中，加60%乙醇IOml使溶解后用流動(dòng)相稀釋制成每Iml中含500 y g的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動(dòng)相稀釋制成每I ml中含IOii g的溶液，作為對(duì)照溶液。另精密稱取葒草素對(duì)照品適量，用流動(dòng)相使溶解并定量稀釋制成每Iml中含g的溶液作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液。照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，精密量取對(duì)照品溶液20ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20% ;再精密量取供試品溶液20 u I注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時(shí)間4倍，供試品溶液色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，含雜質(zhì)葒草素按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過0. 6%，所有各雜質(zhì)量的總和不得過2. 0%。(供試品溶液中任何小于對(duì)照溶液主峰面積0. 01倍的峰可忽略不計(jì))；(4)甘露醇取本品233. 3mg，約相當(dāng)于甘露醇0. 2g，精密稱定，置250ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10ml，置碘瓶中，精密加高碘酸鈉溶液[取硫酸溶液(I — 20)90ml與高碘酸鈉溶液(2. 3 — 1000)110ml混合制成]50ml，置水浴上加熱15分鐘，放冷，加碘化鉀試液10ml，密塞，放置5分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0. 05mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液lml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每Iml硫代硫酸鈉滴定液(0. 05mol/L)相當(dāng)于0. 9109mg的C6H14O6，含甘露醇應(yīng)為標(biāo)示量的100. 1%。(5)牡荊素含量測(cè)定按照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測(cè)定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水-冰醋酸(18 82 :1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm。理論板數(shù)按牡荊素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500,牡荊素峰與雜質(zhì)峰的分離度均應(yīng)符合要求；測(cè)定法取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于牡荊素25mg)，置50ml量瓶中，加60%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取Iml置IOml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取20W注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取牡荊素對(duì)照品適量，精密稱定，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含牡荊素(C21H20O10)應(yīng)為標(biāo)示量的 90. 0 110. 0%。實(shí)施例3 :注射用牡荊 素甘露醇的臨床使用靜脈滴注,一次I瓶,一日I次；用150ml生理鹽水溶解后使用。具體用法是取無菌注射針管吸取3 5ml注射用水，注入裝有牡荊素、甘露醇組合物的西林瓶中，搖勻使溶解，再用無菌針管吸取注入150ml生理鹽水中，搖勻后，用靜脈滴注的方法，滴入患者靜脈血管內(nèi)。實(shí)施例4 :注射用牡荊素甘露醇的臨床使用靜脈滴注,一次2瓶,一日I次；用150ml生理鹽水溶解后使用。具體用法是取無菌注射針管吸取3 5ml注射用水，注入裝有牡荊素、甘露醇組合物的西林瓶中，搖勻使溶解，再用無菌針管吸取注入150ml生理鹽水中，搖勻后，用靜脈滴注的方法，滴入患者靜脈血管內(nèi)。實(shí)施例5 :注射用牡荊素甘露醇的臨床使用靜脈滴注,一次2瓶,一日I次；用250ml生理鹽水溶解后使用。具體用法是取無菌注射針管吸取3 5ml注射用水，注入裝有牡荊素、甘露醇組合物的西林瓶中，搖勻使溶解，再用無菌針管吸取注入250ml生理鹽水中，搖勻后，用靜脈滴注的方法，滴入患者靜脈血管內(nèi)。本發(fā)明藥物組合物具有活血化瘀，宣通血脈。用于瘀血阻脈所致的胸悶胸痛、肢體麻木、中風(fēng)偏癱；腦中風(fēng)、冠心病、心絞痛見上述癥候者。本發(fā)明藥效、藥理、毒理等試驗(yàn)詳見下述試驗(yàn)例1:動(dòng)物心血管藥效研究1、動(dòng)物心血管藥效學(xué)研究結(jié)果(I)試驗(yàn)材料牡荊素、甘露醇混合組合物由合肥七星醫(yī)藥科技有限公司提供，批號(hào)101109(凍干粉針，為淡黃色疏松塊狀物，規(guī)格30mg/每瓶)，臨用前用生理鹽水(NS)溶解至所需濃度；昆明種小白鼠(體重18 — 24g)及Wistar大鼠(體重200 320g)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)第01號(hào)，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度22±2°C ;家兔(體重2.0 2.5 kg)和雜種狗(體重7. 5 12.0 kg):安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)試驗(yàn)方法
小鼠氣管夾閉心肌缺氧模型昆明種小鼠50只，體重18 24g。隨機(jī)分為5組NS對(duì)照組、牡荊素、甘露醇混合組合物(12，6，3 mg .kg—1) 3個(gè)劑量組以及葛根素(60mg -kg-1)陽性藥對(duì)照組，每組10只，早^各半。小鼠尾靜脈注射給予(iv)受試藥物后背位固定于蛙板上，做頸部正中切口，分離氣管，并連接ECG。給藥后20min夾閉氣管，同時(shí)開始記時(shí)，以ECG II導(dǎo)聯(lián)持續(xù)出現(xiàn)一平直線(即心電消失)作為小鼠死亡的標(biāo)志。記錄小鼠夾閉氣管后II導(dǎo)聯(lián)心電持續(xù)的時(shí)間(min)。大鼠急性心肌缺血模型大鼠60只隨機(jī)分為6組假手術(shù)(Sham)組；NS模型對(duì)照組；牡荊素、甘露醇混合組合物(6，3，1. 5 mg個(gè)劑量組以及葛根素(30 mg .1 1)陽性藥對(duì)照組，每組10只，早6各半。大鼠以10%水合氯醛(0.3ml .lOOg —O腹腔注射(ip)麻醉，仰臥位固定，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，行氣管插管，接人工呼吸機(jī)(呼吸時(shí)比為1. 5 I，60次^min-S潮氣量70次^min-0，于胸骨左緣3 5肋打開胸腔，暴露心臟，在肺動(dòng)脈圓錐左緣與左心耳下緣2_處經(jīng)淺層心肌穿一 3/8絲線。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，造成心肌缺血。其中，Sham組及模型組舌下靜脈注射(iv) NS，且Sham組只穿線不結(jié)扎，其它各受試藥組大鼠于冠脈結(jié)扎前20min iv相應(yīng)的受試藥物。實(shí)驗(yàn)過程中，定期監(jiān)測(cè)II導(dǎo)聯(lián)ECG，30min后經(jīng)右側(cè)CCA插管取血，3000rpm離心lOmin，取上清液待測(cè)LDH和CK活力；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即摘取心臟，留取左心室稱重，并將其橫切成6 8片，置入0.2% NBT染液中，37°C染色20min后，分離梗死心肌并稱重，以計(jì)算梗死心肌占左心室肌濕重的百分比。Iso誘發(fā)大鼠急性心肌缺血模型50只大鼠(體重220 240g)隨機(jī)分為模型組(iv NS + sc Iso)、牡荊素、甘露醇混合組合物(6，3，1. 5 mg-kg—1) 3個(gè)劑量組(iv牡荊素、甘露醇混合組合物+ sc Iso)及葛根素30 mg*kg^1i(iv葛根素+ sc Iso)，共5組，每組10只，早^各半。其中，Iso (注射劑量為5 mg kg-1)于各組受試藥物iv給藥后20min時(shí)于背部皮下注射給予，以誘發(fā)出現(xiàn)急性心肌缺血，并產(chǎn)生缺血ECG波形(II導(dǎo)聯(lián)，ST段抬高或壓低)。各組于注射Iso前及注射后30’，I’，2’，5’，10’，20’分別記錄一次ECG (II導(dǎo)聯(lián))，以ST段偏移基線的高度的總和2 ST的mv數(shù)以及ST段偏移的平均值作為心肌缺血損傷程度的指標(biāo)。20min后處死大鼠，迅速摘取完整心肌組織，剪取心尖部固定部位心肌組織稱濕重；80°C烘烤15小時(shí)后，再稱`其干重。計(jì)算心肌含水量(MWC)。MWC =(濕重-干重)/濕重X 100%。犬急性實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞實(shí)驗(yàn)健康成年雜種犬36只，體重7. 5 12. Okgo隨機(jī)分成6組Sham組、NS模型組、牡荊素、甘露醇混合組合物(4，2，Img kg—1) 3個(gè)劑量組及葛根素15mg k^1組，每組6只，早古兼用，早未孕。將犬以3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，右側(cè)位固定于手術(shù)臺(tái)上，行氣管插管并連接人工呼吸機(jī)維持呼吸。左側(cè)第四肋間開胸，暴露心臟，分離冠狀動(dòng)脈左前降支中下1/3處，穿線以備結(jié)扎。按梗死區(qū)、梗死周圍及正常組織部位固定30個(gè)心外膜電圖電極，于冠脈結(jié)扎后即刻，5，15，30，45，60，90，120min等時(shí)刻描記心電圖，以ST段升高總電壓數(shù)表示心肌缺血程度(I ST)，以ST段升高大于2mv的導(dǎo)聯(lián)數(shù)，計(jì)算心肌缺血范圍(N-ST)。結(jié)扎前20min用藥組經(jīng)股靜脈注入所試藥物(給藥容積為lml/kg)。結(jié)扎2h時(shí)取血待測(cè)CK，LDH活性，并迅速于左心室注入碳素墨水后處死，取出心臟，生理鹽水洗凈瘀血，剪下左心室，濾紙吸干后稱重。分離缺血區(qū)(白色)與非缺血區(qū)(黑色)，稱取缺血心肌重量。再將缺血心肌切成等厚的幾片，置于0.2 %NBT中，37°C染色20min，剪下梗死心肌(不染色或灰黃色)稱重。以缺血心肌重/左室重X100%代表缺血范圍；以梗死心肌重/缺血心肌重X100%代表梗塞范圍。并計(jì)算心梗指數(shù)，心梗指數(shù)=梗死區(qū)重量/左室重X100%。雜種犬血流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)選用健康雜種犬30只，體重7. 5 12. 0kg。隨機(jī)分成5組NS對(duì)照組、牡荊素、甘露醇混合組合物(4，2，Img kg-1) 3個(gè)劑量組及葛根素15mg kg—1組，每組6只，早6兼用，雌性未孕。以3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉，取仰臥位固定。頸部正中切口，暴露并切開氣管，接氣管插管；分離右側(cè)頸靜脈以備冠狀靜脈竇插管進(jìn)行血氧含量測(cè)定用；分離左下肢股動(dòng)脈，接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)描記血壓；分離右下肢股動(dòng)脈以備采血進(jìn)行動(dòng)脈血氧含量測(cè)定；分離左下肢股靜脈，緩慢恒速輸入生理鹽水(約lml/min)以補(bǔ)充丟失的體液；四肢皮下固定針式電極，描記標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)ECG，以計(jì)算心率；然后動(dòng)物取前肢右臥位，胸前區(qū)去毛，于左四、五肋間，沿第四肋下緣切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露胸膜后，接人工呼吸機(jī)，充分止血后切開胸膜，提起心包膜切開并作心包床，小心分離冠狀動(dòng)脈左旋支和主動(dòng)脈根部后留預(yù)置線，根據(jù)冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈的粗細(xì)，選擇并連接合適的多普勒超聲血流儀MP100探頭(2mm，12mm);左心室插管(管內(nèi)充滿肝素生理鹽水)經(jīng)左心室心尖部插入左心室內(nèi)，接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)量左室內(nèi)壓、左室舒張末期壓；從右頸靜脈插管至冠狀靜脈竇(心導(dǎo)管內(nèi)注入肝素生理鹽水抗凝)；上述操作結(jié)束后，靜脈注射肝素進(jìn)行全身肝素化(5mg/kg)。待動(dòng)物穩(wěn)定30分鐘后，觀察并記錄血壓、ECG、冠狀動(dòng)脈流量和主動(dòng)脈流量，并從股動(dòng)脈和冠狀靜脈竇取血進(jìn)行血氧含量測(cè)定，作為給藥前的正常值。然后根據(jù)不同組別和劑量靜脈注射給藥(給藥容積為lml/kg)，于給藥后5，15，30，45，60，90和120 min時(shí)分別測(cè)定冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈血流量、血壓以及ECG等，并于給藥后30min，60min分別采血測(cè)冠狀靜脈竇和股動(dòng)脈血氧含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出心臟稱重。根據(jù)結(jié)果，將血壓、心率、左室內(nèi)壓、冠狀動(dòng)脈血流量、主動(dòng)脈血流量及血氧含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，并根據(jù)公式計(jì)算出心搏出量、心臟指數(shù)、心搏指數(shù)、左室作功、每分鐘100克心肌血流量、冠脈阻力、總外周阻力、心肌耗氧量、心肌氧利用率及心肌耗氧指數(shù)等。二級(jí)指標(biāo)計(jì)算公式如下(I)體表面積=(體重 kg) 2/3X0. 11
(2)心搏出量=心輸出量(ml/min) +心率(beat/min)(3)心臟指數(shù)=心輸出量(ml/min) +體表面積(m2)(4)心搏指數(shù)=心臟指數(shù)(L/min/m2) + 心率(beat/min) XlO3(5)左室作功=心臟指數(shù)X1. 052 X (血壓_5) X 13. 6+ IO3(6)每分鐘每IOOg心肌血流量=冠脈血流量(ml/min) +1/3心臟重量X 100(7)冠脈阻力=血壓(mmHg) +每分鐘每IOOg心肌血流量(8)總外周阻力=血壓(mmHg) X79.92+心輸出量(L/min)(9)心肌耗氧量=(動(dòng)脈血氧量-冠狀竇靜脈血氧量)X冠脈血流量(ml/min)X 10_2(10)心肌氧利用率=(動(dòng)脈血氧量-冠狀竇靜脈血氧量)+動(dòng)脈血氧量XlOO(11)心肌耗氧指數(shù)=心率(beat/min) X 血壓(mmHg) XlCT2(12)血流量=流速(cm/sec) X3. 14X 半徑(cm)2X60 (sec)(3)試驗(yàn)結(jié)果牡荊素、甘露醇混合組合物對(duì)氣管夾閉小鼠心電持續(xù)時(shí)間的影響結(jié)果如表I所示，氣管夾閉后，NS對(duì)照組小鼠在9. 26±1. 14min時(shí)相繼死亡，而牡荊素、甘露醇混合組合物12，6，3 mg-kg^1 3個(gè)劑量組小鼠心電消失的時(shí)間均顯著長(zhǎng)于NS對(duì)照組，最多可延長(zhǎng)約32. 94%，差異具有高顯著性(P〈0. 01)，效果優(yōu)于陽性藥。提示牡荊素、甘露醇混合組合物可顯著提高小鼠心臟耐缺氧的能力。表I牡荊素、甘露醇混合組合物對(duì)氣管夾閉小鼠心電持續(xù)時(shí)間的影響(；±S，n=10)
權(quán)利要求
1.一種治療心腦血管疾病的組合物，其特征在于，其活性成分為治療有效量的牡荊素和甘露醇的混合組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療心腦血管疾病的組合物，其特征在于，所述的牡荊素和甘露醇的重量比為1:6 10。
3.—種如權(quán)利要求1所述的治療心腦血管疾病的組合物的制備方法，其特征在于，所述的藥物組合物是通過在干重的基礎(chǔ)上，按照1:6 10重量比的牡荊素和甘露醇來制備的，具體步驟如下 a、稱取處方量甘露醇、牡荊素原料混合，加注射用水，攪拌均勻，再加0.lmol/L的氫氧化鈉溶液，攪拌溶解，再用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)至PH在8. 5 ±0. 5左右，加0. 04-0. 05%的針用活性炭，攪拌10-15分鐘，微孔鈦過濾器減壓粗濾，脫炭，檢查含量、pH合格后，再經(jīng)0. 2-0. 25 um微孔濾膜終端過濾后，分裝于西林瓶中，低溫冷凍干燥； b、預(yù)凍把分裝好的藥品放入凍干箱內(nèi)隔板上預(yù)凍開始至+25°C -40°C； C、升華干燥將冷凝器溫度下降至-45°C以下，啟動(dòng)真空泵，待真空度達(dá)到一定數(shù)值后，緩緩打開蝶閥，當(dāng)干燥箱內(nèi)的真空度達(dá)13. 33Pa即0.1mmHg以下關(guān)閉冷凍機(jī)，通過隔板下的加熱系統(tǒng)緩緩加熱，使凍結(jié)產(chǎn)品的溫度逐漸升高至22-25°C ； d、再干燥在25-30°C下干燥，干燥失重符合規(guī)定，在無菌條件下加蓋膠塞，軋蓋，包裝，檢驗(yàn)，入庫。
4.一種如權(quán)利要求1所述的治療心腦血管疾病的組合物的檢驗(yàn)方法，其特征在于包括以下過程 (1)取本品適量,加乙醇制成每Iml含主藥20呢溶液，作為供試品溶液，另取牡荊素對(duì)照品同法制成對(duì)照品溶液，按照2010年版中國藥典一部附錄薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5W，分別點(diǎn)于同一聚酰胺膜上，以36%醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)； (2)取本品適量，加乙醇制成每Iml含主藥10呢的溶液，按照2010年版中國藥典一部附錄紫外-可見分光光度法測(cè)定，在270nm波長(zhǎng)處有最大吸收； (3)有關(guān)物質(zhì)取本品內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取約相當(dāng)于牡荊素25mg的樣品，置50ml量瓶中，加60%乙醇IOml使溶解后用流動(dòng)相稀釋制成每Iml中含500 u g的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動(dòng)相稀釋制成每I ml中含IOii g的溶液，作為對(duì)照溶液；另精密稱取葒草素對(duì)照品適量，用流動(dòng)相使溶解并定量稀釋制成每Iml中含3 ii g的溶液作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液，按照(5)含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，精密量取對(duì)照品溶液20 Ul注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20% ;再精密量取供試品溶液20 u I注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時(shí)間4倍，供試品溶液色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，含雜質(zhì)葒草素按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過0. 6%，在供試品溶液中任何小于對(duì)照溶液主峰面積0. 01倍的峰可忽略不計(jì)的情況下，所有各雜質(zhì)量的總和不得過2. 0% ； (4)甘露醇取本品適量，約相當(dāng)于甘露醇0.2g，精密稱定，置250ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10ml，置碘瓶中，精密加高碘酸鈉溶液[取硫酸溶液(I — 20) 90ml與高碘酸鈉溶液(2. 3 — 1000) IlOml混合制成]50ml，置水浴上加熱15分鐘，放冷，加碘化鉀試液10ml，密塞，放置5分鐘，用0. 05mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液1ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正；每Iml硫代硫酸鈉滴定液相當(dāng)于0. 9109mg的C6H14O6，含甘露醇應(yīng)為標(biāo)示量的90. 0 110. 0% ； (5)牡荊素含量測(cè)定按照2010年版中國藥典一部附錄高效液相色譜法測(cè)定； 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水-冰醋酸為18 82 1為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm ;理論板數(shù)按牡荊素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500,牡荊素峰與雜質(zhì)峰的分離度均應(yīng)符合要求； 測(cè)定法取本品內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取約相當(dāng)于牡荊素25mg的樣品，置50ml量瓶中，加60%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取Iml置IOml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密量取20W注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取牡荊素對(duì)照品適量，精密稱定，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含牡荊素(C21H2tlOltl)應(yīng)為標(biāo)示量的 90. 0 110. 0%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療心血管疾病和腦血管疾病的組合物及其制備與檢驗(yàn)方法，該組合物是通過在干重的基礎(chǔ)上，按照1:6～10重量比的牡荊素和甘露醇來制備的。本發(fā)明治療心腦血管疾病的牡荊素和甘露醇的混合組合物在抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、改善血流動(dòng)力學(xué)以及抗腦缺血等方面，療效確切顯著，作用速度快，質(zhì)量穩(wěn)定可控，無不良反應(yīng)，毒副作用低，成本較低，能更好的滿足廣大患者需要，解決患者身心痛苦，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61P9/10GK103054849SQ20121055920
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者邵旭, 何萬龍, 牛海軍, 李曉亮 申請(qǐng)人:合肥七星醫(yī)藥科技有限公司