專利名稱：參與細(xì)胞周期調(diào)控的tRNA結(jié)合蛋白、編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的tRNA結(jié)合蛋白、編碼基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上受到復(fù)雜而精密的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄水平上涉及到的各種因子和機(jī)制在很大程度上已經(jīng)得到了闡釋，而對轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控則了解的很少。類似于通過對各種轉(zhuǎn)錄因子的研究闡述轉(zhuǎn)錄機(jī)制，對于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的研究則需要探討各種RNA結(jié)合蛋白的作用。與轉(zhuǎn)錄因子的作用相仿，RNA結(jié)合蛋白主要涉及到從RNA轉(zhuǎn)錄到蛋白表達(dá)這一過程的調(diào)控，它可以通過多種機(jī)制來決定與之結(jié)合的RNA (包括mRNA或非編碼的RNA)的命運(yùn)，例如，RNA的剪切機(jī)制的改變，RNA穩(wěn)定性的增加或者減少，翻譯效率的改變以及RNA在細(xì)胞內(nèi)的不同定位等。在所有的RNA中，非編碼的RNA(noncoding RNA,ncRNA) 數(shù)目眾多，其轉(zhuǎn)錄水平在不同的環(huán)境下變化很大，而且有許多證據(jù)表明這些變化往往與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。RNA結(jié)合蛋白對轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控在生物體處于不利條件時進(jìn)行的應(yīng)激反應(yīng)中起到重要作用，許多RNA結(jié)合蛋白通過調(diào)控非編碼RNA幫助其識別它們的mRNA靶目標(biāo)實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。在受到遺傳毒性或其它環(huán)境壓力時，酵母細(xì)胞的tRNA在細(xì)胞核內(nèi)累積，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白合成停止，細(xì)胞停滯在Gl期，影響到細(xì)胞周期。這些非編碼的RNA如何參與調(diào)控基因表達(dá)正在引起越來越多研究者的注意。生物體內(nèi)的非編碼RNA主要來自RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，對應(yīng)的結(jié)合蛋白家族 La蛋白在調(diào)控這些蛋白的成熟、定位和轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用。tRNA作為一種重要的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，最近的研究顯示其成熟和定位可能對細(xì)胞周期以及細(xì)胞對外界環(huán)境的適應(yīng)起到調(diào)控作用。鹵蟲具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，在不同的環(huán)境下采用不同的生殖方式。既可以在環(huán)境適宜的條件下通過卵胎生的途徑直接產(chǎn)下無節(jié)幼體，也可以在環(huán)境惡化時通過卵生途徑產(chǎn)下包被堅(jiān)硬外殼的休眠卵，通過這獨(dú)特的休眠胚胎來抵御惡劣環(huán)境。與以往用于研究細(xì)胞周期的模式生物相比，鹵蟲的休眠卵長時間停滯于細(xì)胞周期的Gl期，為細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的研究提供了一個優(yōu)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)素材。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種參與鹵蟲休眠卵形成及維持的一種新型的tRNA結(jié)合蛋白及其編碼基因，該蛋白通過與tRNA結(jié)合使其定位于細(xì)胞核，從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的tRNA結(jié)合蛋白(Afu蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。該蛋白具有tRNA結(jié)合活性，定位于細(xì)胞核，參與調(diào)控tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)并造成細(xì)胞周期停滯。本發(fā)明還涉及一種所述tRNA結(jié)合蛋白的編碼基因。該cDNA全長142^p，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)有4(Maa。
具體的，所述基因序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明還涉及所述的tRNA結(jié)合蛋白在制備調(diào)控腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種參與鹵蟲休眠卵形成及維持的一種新型的tRNA結(jié)合蛋白及其編碼基因，對該蛋白通過控制tRNA的運(yùn)輸以調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的功能進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有tRNA結(jié)合活性，定位于細(xì)胞核，參與調(diào)控tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)并造成細(xì)胞周期停滯，可用于制備調(diào)控腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的藥物，為腫瘤藥物研究提供了新的方向。


圖1為Afu基因及編碼蛋白的電泳圖；a為Afu基因編碼區(qū)PCR產(chǎn)物，c為純化的 GST融合的Afu蛋白，b為GST蛋白對照；圖2為Afu基因的干涉對鹵蟲發(fā)育的影響；，a為使用不同量的Afu雙鏈RNA干涉后檢測的Afu mRNA的變化，b為干涉后Afu蛋白的表達(dá)量變化，c說明在800ng雙鏈RNA 干涉后鹵蟲產(chǎn)生的休眠卵的休眠狀態(tài)被打破；圖3為Afu蛋白與tRNA的體外結(jié)合活性；a為使用GoldView染色檢測，b為使用不同tRNA探針檢測的結(jié)果；圖4為GFP融合的Afu蛋白在不同的腫瘤細(xì)胞中的核定位；標(biāo)尺，50 μ m ；圖5為Afu蛋白與tRNA的體內(nèi)結(jié)合活性；a為Afu蛋白與tRNA在不同發(fā)育時期的鹵蟲細(xì)胞中結(jié)合活性，b為GFP融合的蛋白與tRNA在HeLa細(xì)胞中的結(jié)合活性；圖6為GFP融合的Afu蛋白在HeLa細(xì)胞中表達(dá)后，細(xì)胞中tRNA分布的變化；a為使用正常tRNA探針(可以同時檢測含有intron以及不含intron的tRNA)，b為intron區(qū)探針；標(biāo)尺，IOOym ；圖7為使用BrdU檢測GFP融合的Afu蛋白在不同的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)后，細(xì)胞周期的變化；當(dāng)細(xì)胞中能檢測到BrdU信號時，說明細(xì)胞可以通過S期，反之說明細(xì)胞停滯在Gl/ S期；標(biāo)尺，100 μ m。圖8為使用流式細(xì)胞分析檢測GFP融合的Afu蛋白在HeLa細(xì)胞中表達(dá)后，細(xì)胞周期的變化；a為處理的細(xì)胞中DNA含量的變化，b為HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后18h到Mh間Gl，S 和G2/M期細(xì)胞所占比例的變化；圖9為Afu蛋白對HeLa細(xì)胞增殖的影響；圖10為GFP融合的Afu蛋白在爪蟾和斑馬魚幼體細(xì)胞中的表達(dá)及其造成的細(xì)胞周期的停滯；箭頭指示的為BrdU的檢測信號，只在對照組細(xì)胞中出現(xiàn)；圖11為鹵蟲不同發(fā)育時期以及GFP融合的Afu蛋白在HeLa細(xì)胞中表達(dá)Mh，36h 和4 后，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)及磷酸化水平的變化；圖12為預(yù)測的Afu蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期的信號通路；圖13為Afu蛋白對裸鼠皮下腫瘤的生長抑制及細(xì)胞周期調(diào)控。a，Afu蛋白抑制了 HeLa和HT1080兩種腫瘤的生長。b，使用BrdU檢測Afu蛋白在不同的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)后，細(xì)胞周期的變化；當(dāng)細(xì)胞中能檢測到BrdU信號時，說明細(xì)胞可以通過S期，反之說明細(xì)胞停滯在G1/S期；標(biāo)尺，50 μ m。c, Afu蛋白在腫瘤細(xì)胞中后，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)及磷酸化水平的變化。 具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 :Afu基因及編碼蛋白的獲得1.獲得Afu基因的材料、方法及結(jié)果1. 1.利用Trizol試劑提供的方法，提取卵生途徑鹵蟲的總RNA，并以此為模板利用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA。1. 2.根據(jù)抑制性消減雜交得到的差異表達(dá)基因的EST序列數(shù)據(jù)庫中獲得一種在鹵蟲無節(jié)幼體發(fā)育過程中表達(dá)量下調(diào)的基因的部分序列設(shè)計一對特異性引物rbpFl =TAG TCT CCC TTC CAA ATACAAAiPrbpRl :TAC CTA AAC TGA GTG CGG ACA T01. 3.以第一鏈cDNA為模板，rbpFl和rbpRl為引物完成PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為 cDNA 模板 1 μ L，引物各 1 μ L, 10XPCR Buffer 2. 5 μ L，Mcgl2 1. 5 μ L，dNTPs 1 μ L, TaqE 0. 25 μ L，去離子水補(bǔ)足25 μ L。PCR程序?yàn)?95C變性5min,接著30個擴(kuò)增循環(huán)(95C變性 30sec, 58C 退火 30sec, 72C 延伸 30sec)，最后 72C 延伸 lOmin。序列連接到pMD18-T載體，測序。1. 4.根據(jù)測序得到的序列，設(shè)計一對特異性引物rbpF2 =ACG AGG GACATA TAA AGG TAA T禾口 rbpR2 :CGG ACA TCC TCT TTT GTGACT Τ。采用1. 3中的PCR體系及程序擴(kuò)增部分片段，并利用DIG High prime labeling試劑盒提供的方法標(biāo)記成篩選探針。1. 5.利用ZAP-eDNA synthesis Kit試劑盒及其提供的方法，構(gòu)建卵生途徑鹵蟲的cDNA文庫。1. 6.使用1. 4中的探針從1. 5構(gòu)建的文庫中篩選得到陽性信號并測序，得到完整的Afu基因序列5’ -GGCACGAGGGCAAATGCGAGTTTCCTTACAAGAAGAAAAAGAAATGGCAGAAAATATCCAACATGATGAACGCATACTTCGAAAAGTTAGGAAGCAAATTGAATTTTACTTAAGTGATGCAAACTTGTCTAAAGACCGGGTAACTTGCTGTACTTACTCTGAGGCCATCTCAAGTGGAGGTATTCCCGCAGATTTCTTCTTGAAATGCAATAGAGTAAAAGAACGCATTACAACAGTTGCTGAAATTGAAGAAGCGCT
GAAGACATCTAAATATTTGCAATTTGCAGATGGAAAAGTCTCCAGAAAATTTCCTTTTCAACCTCGAACAAACCAGGATAGATGCACCATTTATGTGGAAAATATTCCCACGTATGCAACGCAAGAGAAAGTTCGTAAATGGTTCCGACCTTACGGAAAGGTAGTTTATGTCTCCCTTCCTAAATCAAAAGTAGGGACAATTAAAGGATATGCTTTTGTTGAGTTCAATACAGAAGAAGAAGCAGAAATCTGCATGTTATCCTATCAAGAATCTGGGAGATATATTGAAAACCGTGACCCAGCGGAGCTGTTATCAGTTAAAACGTTTGAAGGATTTGAAGATGCTGAGGTTGAAACTGAAACAGCGGAACCTGAATATCAGCCCTTTGAG
AGCGCTGAAGAGGCCCATCCTCAGGAAGTCACAAAAGAGGATGTCACCACTCAGTTTAGGATTCTTAGTAGGAACGATTGGAAAAAGGAGAGAAACAAGTACCTGAATAACTGGAGGAAAGAAGGAAAGGCACGTAGGCAAGAAATTTGGAGGCAGCAGATGAAAATTAACCGAAGGAGGAAAATAGCCGAGGAGGAAAAAGCTTTACAGCCTAAAACGGAACTAAACTTCCAAAGCGGCTTGATTGTCAAGATTTCTTTGAAGGAAGAAATTCATGATCCAAAATCTATAAAGGAACAATTAAAAGCTATTGGCGGCATAAAATATGTTGAAGCCATGCAAGGTGCAGTGGAAGCAATTGTCCGTACAGAAAGCCCAGATGTGGCCAGCTCACTTATCAAAAATCCATTAGGAAAGGGTGAAGTCCTTACTGGTGCTGAGGAACTAGAATATTGGTTTAAAATACTTTCAGGCAAGGAAGCGAAGCTTTCGGCATCAAAAGAAGTCAATAAAGTAAAGGTGAAGAAGAAGAAGAAAAAGGCTCAGCATATTCGGTTTGATGATGATGAAAATACAAAATCGGAAATAGAAACAACAGACGTGATTTGATAAGCTGTTTTCCGAAAAGCGTAGTTTATTGACGTGCATTATTTTTTTATGTATTTTACTTTTTTACTTTTTACAATATTTATTTTTTACTTTCTTGTAAGATTACATTTATACGTCAATACATTACATGATTAATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID No. 2)該基因全長為1425bp,由43_bp的5，非翻譯區(qū)(5，-UTR)，167-bp的3，非翻譯區(qū) (3’-UTR)和1215bp的開放閱讀框組成。其中開放閱讀框可以編碼404個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，推測的分子量為46. 81kDa，等電點(diǎn)為8. 6，其氨基酸序列為MAENIQHDERILRKVRKQIEFYLSDANLSKDRVTCCTYSEAISSGG
IPADFFLKCNRVKERITTVAEIEEALKTSKYLQFADGKVSRKFPFQPRTNQDRCTIYVENIPTYATQEKVRKWFRPYGKVVYVSLPKSKVGTIKGYAFVEFNTEEEAEICMLSYQESGRYIENRDPAELLSVKTFEGFEDAEVETETAEPEYQPFESAEEAHPQEVTKEDVTTQFRILSRNDWKKERNKYLNNWRKEGKARRQEIffRQQMKINRRRKIAEEEKALQPKTELNFQSGLIVKISLKEEIHDPKSIKEQLKAIGGIKYVEAMQGAVEAIVRTESPDVASSLIKNPLGKGEVLTGAEELEYWFKILSGKEAKLSASKEVNKVKVKKKKKKAQHIRFDDDENTKSEIETTDVI*(SEQ ID No. 1)2. Afu蛋白的表達(dá)與純化2. 1.根據(jù)獲得的Afu基因序列，設(shè)計一對含有酶切位點(diǎn)的引物rbpeF =CCG GGA TCC TAGCGA GAA ATA TAC CAA CTA 和 rbpeR :CCG CTC GAG TTA TCAATA CAC GTC TGT TGT TTC0以測序質(zhì)粒為模板，rbpeF和rbpeR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過BamHI和 XhoI雙酶切后連接到含有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-4T-l中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有 ileX和argU基因的質(zhì)粒pSJS1240的E.coli BL21(DE3)細(xì)胞中，測序鑒定。2. 2.利用終濃度為0. ImM的IPTG在25C下誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的DE3細(xì)胞，表達(dá)具有活性的GST融合的Afu蛋白。2. 3.表達(dá)產(chǎn)物利用谷胱甘肽kperose 4B純化，其電泳結(jié)果見圖1。實(shí)施例2 RNA干涉對Afu功能的驗(yàn)證1.根據(jù)獲得的Afu基因序列，設(shè)計一對含有酶切位點(diǎn)的引物RNAif =CGT CTA GAA CCT CGA ACA AAC CAG GTA AGA 禾口 RNAir :GGA TAT CTA TTT TTA CGC CGC ATAACG TT。以測序質(zhì)粒為模板，RNAif和RNAir為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物)(bal和EcoRI雙酶切后連入pET-T7載體，構(gòu)建出針對tRBP基因的dsRNA表達(dá)質(zhì)粒。對照質(zhì)粒為GFP基因序列。2.將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli HT115菌株。在LB培養(yǎng)基(含100ug/ml Amp, 10ug/ml Ter)中培養(yǎng)至OD600為0. 4，加入IPTG使其終濃度為0. 4mM，37°C誘導(dǎo)4h。3.使用苯酚(pH4. 5)氯仿抽提純化雙鏈RNA，溶解到50ul DEPC處理水中，電泳檢測，測定濃度，保存在-20°C。4.使用顯微注射儀 UltraMicroPump II equipped with the Micro4TM MicroSyringe Pump Controller對出現(xiàn)卵囊前的鹵蟲個體進(jìn)行顯微注射。注射量為每只 800ng雙鏈RNA或?qū)φ针p鏈RNA。注射后的鹵蟲在8%人工海水、^°C、短光照周期(光照 4h，黑暗20h)下進(jìn)行培養(yǎng)。觀察其生長發(fā)育及產(chǎn)卵情況，結(jié)果見圖2。結(jié)論由圖2可見，800ng雙鏈RNA干涉后鹵蟲產(chǎn)生的休眠卵中Afu mRNA的量只有對照組的15%，其蛋白表達(dá)量通過western blotting幾乎檢測不到。產(chǎn)出卵的休眠狀態(tài)被打破，可以直接孵化成幼蟲。結(jié)果表明Afu蛋白在維持鹵蟲休眠卵的休眠狀態(tài)中起到關(guān)鍵作用。實(shí)施例3 =Afu蛋白與tRNA的體外結(jié)合活性研究(凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn))1.將GST融合的Afu蛋白與tRNA在如下體系中混合Yeast tRNAs20ug,GST-Afu/ GST對照體蛋白 0-10ug，20XRNA Binding Buffer (RBB) Iul, RiboLockTM RNase inhibitor 0. 5ul，使用DEPC處理水將體系調(diào)整至20ul。2.將結(jié)合體系輕柔混勻，室溫結(jié)合30min后，上樣到非變性的聚丙烯酰胺膠，80V 下電泳約池。3.電泳后的凝膠分別進(jìn)行1. GoldView染色分析；2.轉(zhuǎn)到尼龍膜使用tRNA特異性探針 tRNA Arg ACG (gR-ACG :TAT AGA AGT CAGACG CGT TCG CTA TAC CGC ACG CG)，tRNA Ile ATA(gI-TAT :TTA CGA CGG TCG CTT MC CAA CTG GCG CAA GAG AC), tRNA Leu CAA(gL-CM CTA AGA GTA TCG AAC TCT TCG TACTTA CGA TAC CT)，tRNA Lys TTT (gK-TTT :AAA CGC GAA CCGTCT ACC AAC TGA CGT AAC AAG GA)，tRNA Tyr GTA (gY-GTA :CAG TCT TCG CGC TTAAAC CMCTT GCG TAC CGAGA)，以及 tRNA Ser AGA (gS-AGA :TCG AGT CTC TCG CCT TAA CCA CTCGCG CTAAGT CG)進(jìn)行 Northern blotting 分析，結(jié)果見圖 3。結(jié)論由圖3可見，與Afu蛋白共同孵育后，tRNA的電泳速度慢于自由的tRNA，表明Afu蛋白與tRNA在體外結(jié)合形成了復(fù)合物，Afu蛋白具有tRNA結(jié)合活性。實(shí)施例4 =Afu基因轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞及Afu蛋白的核定位1.根據(jù)獲得的Afu基因序列，設(shè)計一對含有酶切位點(diǎn)的引物GFPz-rbpeF =CCG CTC GAG AAA TGG CAG AAA TAA TCC AACTA和 GFPz_rbpeR :CCG GGA TCC TTA TCA ATA CAC GTC TGTTGT TTC0以測序質(zhì)粒為模板，GFPz-rbpeF和GFPz-rbpeR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物使用》ιοΙ和BamHI雙酶切后連入pEGFP-Cl載體，構(gòu)建出可以在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)GFP融合的Afu蛋白的質(zhì)粒，測序鑒定。2.在腫瘤細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右時，使用Lipfectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，對于每孔(6孔板)細(xì)胞，取4ug質(zhì)粒DNA，IOulLipfectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于250ul無血清的培養(yǎng)基中，輕輕混勻；室溫放置5min后混合，靜置20min后加入到正常培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-4 后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖4。結(jié)論在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的Afu蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。實(shí)施例5 =Afu蛋白與tRNA的體內(nèi)結(jié)合活性研究(免疫共沉淀實(shí)驗(yàn))1.在保持蛋白質(zhì)相互作用的條件下，使用不同的方法分別獲取鹵蟲休眠卵和轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解液。對鹵蟲休眠卵，首先使用50%的次氯酸鈉脫殼，然后在含有 0. 1% Triton X-100和1 %脫氧膽酸鈉的裂解液作用下研磨收集細(xì)胞裂解液；而對于HeLa 細(xì)胞則使用0. 5%的NP40進(jìn)行裂解。裂解體系中均加入適量的蛋白酶抑制劑和RNA酶抑制劑。2.加入50 μ 1 proteinA sepharose在4°C下?lián)u濁，對細(xì)胞裂解液進(jìn)行預(yù)沉淀。3.在裂解液中加入15 μ g Anti-Afu兔源抗體，4°C搖過夜。4.力口入 200μ1 proteinA s印harose，4°C搖 4h 收集復(fù)合體。5.抽提RNA，轉(zhuǎn)膜后使用tRNA探針檢測，結(jié)果見圖5。結(jié)論免疫共沉淀結(jié)果顯示，Afu蛋白在活體細(xì)胞核中是以復(fù)合體的形式存在的， 這種復(fù)合體可能參與了 tRNA在細(xì)胞核質(zhì)間運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控。實(shí)施例6 通過熒光原位雜交研究Afu蛋白對tRNA在細(xì)胞核質(zhì)間轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控1.將滅過菌的蓋玻片放入6孔板的培養(yǎng)孔中；2.將細(xì)胞按正常比例傳代到蓋玻片上，將細(xì)胞置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h至細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；3.當(dāng)融合蛋白表達(dá)后(約18_24h)，棄去培養(yǎng)基，用PBS漂洗1次；4.用4%的多聚甲醛室溫固定lh，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，每次15min;5.加入2ml預(yù)冷的丙酮，-20°C處理;3min ；隨后用PBS漂洗2次，每次5min ；6.加入2ml預(yù)雜交液，39°C作用Ih ；7. 75°C處理lOmin，立即置于冰上；8.加入 DIG 標(biāo)記的 tRNA 探針(tRNA Leu CAA(hL_CAA :TTG AGTCTG CGG CCT TAG ACC ACT CGG CCA TCC TGA C)，tRNA TyrGTA(hY-GTA :CTA CAG TCC TCC CGT CTA CCG CTG ACG TTACGA AGG), tRNA Gly CGC (hG-CGC :TCG TAT GCG CGG GAATCG MC CCG GG), tRNA Phe GAA QiF-GAA :CCG TCT CCCAAC TGA CGT TAT TCG CG)，tRNA Ser AGAQiS-AGA :CGC TTAACC ACT CGG CCA CGA CTA C),tRNA Lys CTT(hK-CTT :TCGTCT ACC GAC TGA CGT ACG CGG CG), 以及前體 tRNA LeuCAA (hL-CAA-pre :CAG ATA CCC CAC CCG GGA GGA ACG TTACGT TGA)，前體 tRNA Tyr GTA (hY-GTA-pre :AAG GTA GCG CACGGG CCG CGG CCT ACA G))，39°C 雜交過夜；9.分別用2XSSC漂洗3次，45°C，每次IOmin ；用IXSSC漂洗3次，室溫，每次 IOmin ；用含有 Triton X-100 的 4XSSC 漂洗 1 次；10.加入含有 BSA 的 4XSSC 封閉 2h ；
11.加入含有羅丹明標(biāo)記的anti-DIG抗體，避光(以下步驟都要避光)作用池；12.分別用4XSSC漂洗2次，室溫，每次IOmin ；用含有Triton X-100的 4 X SSC漂洗2次，每次IOmin ；用4 X SSC漂洗1次后，加入IOOul DAPI作用15min染細(xì)胞核；13.用PBS漂洗一次，在載玻片上滴加抗熒光淬滅封片液，蓋上附有細(xì)胞的蓋玻片，指甲油封片后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖6。結(jié)論由熒光原位雜交結(jié)果可見，定位于細(xì)胞核的Afu蛋白與細(xì)胞核內(nèi)的tRNA結(jié)合形成復(fù)合體后，將tRNA滯留于細(xì)胞核內(nèi)，限制了 tRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致了細(xì)胞質(zhì)中成熟tRNA的減少。實(shí)施例7 通過BrdU標(biāo)記檢測Afu蛋白對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期的調(diào)控1.將滅過菌的蓋玻片放入6孔板的培養(yǎng)孔中，按正常比例將細(xì)胞傳代到蓋玻片上，置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h至細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；2.將轉(zhuǎn)染后24h的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基換成含有12mM BrdU的DMEM培養(yǎng)基，37°C繼續(xù)培養(yǎng)2 Ih ；3.細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定Ih ；4.室溫下用PBS漂洗15min ；5.加入適量3%濃度的H202，37°C作用IOmin ；6.室溫下用PBS漂洗3次，共15min，加入適量2N HC1，37°C作用30min ；7.室溫下用PBS徹底漂洗干凈，加入封閉液(1% BSA, 0.5% Tween 20，0. 疊氮化鈉，5% FBS)，37°C作用 15min ；8.換成BrdU單克隆抗體，37°C繼續(xù)作用2h，回收抗體；9.室溫下用PBS漂洗3次，共15min，然后加入羅丹明標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗， 37°C作用2h，回收二抗；10.室溫下用PBS漂洗3次，共15min，加DAPI染細(xì)胞核，室溫作用15min ；11.室溫下用PBS漂洗，在載玻片上滴加抗熒光淬滅封片液，蓋上附有細(xì)胞的蓋玻片，指甲油封片后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖7。結(jié)論由圖7可見，在表達(dá)有Afu蛋白的細(xì)胞中，幾乎檢測不到BrdU的信號，表明這些細(xì)胞沒有能夠通過細(xì)胞周期的DNA復(fù)制階段，即細(xì)胞沒有能夠通過S期。結(jié)果顯示，Afu 蛋白的表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂周期受到了調(diào)控，細(xì)胞停滯在G1/S期。實(shí)施例8 通過流式細(xì)胞分析檢測Afu蛋白對細(xì)胞周期的調(diào)控1.取轉(zhuǎn)染后1 和24h的HeLa細(xì)胞，用0.25%的胰酶室溫處理消化下來之后，加血清終止反應(yīng)。收集的細(xì)胞用PBS溶液清洗3-5次，輕輕吹打，鏡檢細(xì)胞并計數(shù)；2.所得單細(xì)胞懸液用70%乙醇4°C固定過夜；3.離心收集固定后的細(xì)胞，用PBS溶液清洗2次；4.加入 RNase A(100ug/ml) 37°C反應(yīng) 30min ；5.加入 PI 染料(50ug/ml)4°C避光反應(yīng) 30min ；6. Ih內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，使用Cell QuestTM software version 3. 1軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。每個時期的樣品重復(fù)制備三次，結(jié)果見圖8。結(jié)論由圖8可見，，處于G1/G0期的Afu-Hela和GFP細(xì)胞分別減少了 10. 34%(50. 83% -40. 49% )和 18. 73% (68. 20%-49. 47% )，說明 Afu 蛋白使得 Hela 細(xì)胞傾向于停滯在G1/G0期而不向S期轉(zhuǎn)變。與之形成明顯對比的是Afu-Hela細(xì)胞中G2/M期的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后18h到24h之間幾乎沒有變化，并且維持一個極低的比例(2. 9% -3. 77% )，而對照細(xì)胞中G2/M期的細(xì)胞在起始比例幾乎相同的情況下增長了 15. 71% (2. 92% -18. 63% )。 說明在表達(dá)Afu蛋白的腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期通過S期向G2/M期轉(zhuǎn)變的過程受到了阻滯。實(shí)施例9 =Afu蛋白對HeLa細(xì)胞增殖的調(diào)控取轉(zhuǎn)染后Mh的HeLa細(xì)胞，用0. 25%的胰酶室溫處理消化下來之后，加血清終止反應(yīng)。收集的細(xì)胞稀釋后計數(shù)，取4000個細(xì)胞重懸于含有0.35% soft agar的DMEM培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)在底層含有0. 5% soft agar的35mm培養(yǎng)板上。4周后觀察其形成細(xì)胞群落的情況，結(jié)果見圖9。結(jié)論由圖9可見，經(jīng)過4周的生長之后，表達(dá)有Afu蛋白的腫瘤細(xì)胞幾乎沒有分裂形成細(xì)胞群落，而對照細(xì)胞的分裂正常。實(shí)施例10 通過BrdU標(biāo)記檢測Afu蛋白對爪蟾和斑馬魚胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期的調(diào)控1.將選取的爪蟾和斑馬魚的受精卵移到培養(yǎng)皿中，于一細(xì)胞期之前使用 UltraMicroPump II equipped with the Micro4 MicroSyringe Pump Controller顯微注射儀注射外源DNA，濃度為0. 15 μ g/ μ L，DNA體積約2. 3nL。受精卵的動物極注射完畢后， 慢慢抽出注射針，將受精卵放入裝有l(wèi)XHalf’ s培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，使其恢復(fù)發(fā)育。2.將經(jīng)過顯微注射后的幼體(爪蟾19期，斑馬魚14h)放置于含有3mM BrdU的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3d(爪蟾40期，斑馬魚72h)。3.取出處理后的個體用4%多聚甲醛固定過夜4.用含0. 5% NP40的PBS溶液漂洗2次，每次IOmin ；5.依次使用25%，50%，75%，100%的乙醇(稀釋在PBS中)脫水，每個梯度處理時間為15min，冰上操作；6.用5%的H202在4°C漂白l_2h，室溫?fù)u動；7.乙醇漂洗IOmin后依次使用25%，50%，75%，100%的PBS (稀釋在乙醇中)脫水，每個梯度處理時間為15min，冰上操作；8.用 PBSST (PBS 中加入 5% sera,0. 1% Triton)漂洗，4°C Ih ；9.加入含有BrdU —抗的PBSST，4°C過夜，對照組不加一抗；10.用PBSST漂洗2次，每次15min，室溫?fù)u動；繼續(xù)漂洗4次，每次15min，4°C搖動；11.加入含有二抗(AP-conjugtaed gota anti-mouse IgG)的 PBSST，4°C過夜；12.用PBSST漂洗2次，每次15min，室溫?fù)u動，然后在4°C繼續(xù)漂洗4次；13.用TM緩沖液漂洗15min后加入NBT/BCIP顯色，結(jié)果見圖10。結(jié)論在對照個體尾端有絲分裂旺盛的區(qū)域可以檢測到BrdU的摻入，而在表達(dá) Afu蛋白的個體中則檢測不到，說明這些細(xì)胞沒有完成DNA復(fù)制而通過S期。這一結(jié)果證明，無論在腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞中，tRBP蛋白都能夠造成細(xì)胞周期的紊亂。實(shí)施例11 通過Wfestern blotting分析Afu蛋白對細(xì)胞周期調(diào)控涉及的信號通路檢測不同發(fā)育時期的鹵蟲個體(a)以及表達(dá)Afu蛋白24h，3 和4 后的HeLa細(xì)胞(b)中如下細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)及磷酸化情況(圖11)，尋找這一調(diào)控過程所涉及的信號通路:cyclinA, cyclin Dl, D2, D3, cyclinE2, CDK4, CDK6, chk2，4EBPl，E2F1, E2F2, E2F3, pl5, c-Jun and phosphor-specific antibodies against Rb(T356, S807/811and T780), Akt(T308), ERK1/2(T202/Y204)， F0X03a(T32, S318/321, and S253)， RSK(S221 and S380), MEK(T286, T292 and S298)，p38 (T180/Y182)，JNK(T183/Y185)，F(xiàn)os(S32)， FOXOl (S256) and RNA POL II (S2)。關(guān)于Afu蛋白參與調(diào)控的信號通路簡示如圖12。結(jié)論Afu蛋白在細(xì)胞核內(nèi)累積，調(diào)控tRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)并由此調(diào)控腫瘤的細(xì)胞周期在 G1/S 期的停滯是通過 MAPK，PI3K-AKT and FKHR/FoxO to cyclin D/CDK6/Rb 等信號通路完成的。實(shí)施例12 =Afu蛋白對裸鼠皮下腫瘤的生長抑制及細(xì)胞周期調(diào)控1.使用Adenovirus Dual Expression Kit將Afu基因連接到Ad5病毒載體中，包裝，純化至109pfu ；2.收集HeLa及HT1080細(xì)胞，注射到BALB/c裸鼠皮下，成瘤后將腫瘤剪成小塊擴(kuò)大到各30只小鼠；3.選擇荷有IOOmm3腫瘤的小鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，分別注射IOSpfu的含有Afu 基因的腺病毒及對照病毒，每周2次。測定腫瘤大小；4.最后一次注射病毒前，向小鼠腹腔注射BrdU(50mg/kg)，10小時后取樣，多聚甲醛固定后石蠟包埋切片，檢測BrdU的摻入；5.取未經(jīng)BrdU處理的腫瘤進(jìn)行信號通路蛋白的Wfestern blotting檢測。結(jié)果見圖13。結(jié)論Afu蛋白對兩種腫瘤細(xì)胞的生長都有明顯的抑制效果，通過BrdU檢測表明， 表達(dá)有Afu蛋白的腫瘤細(xì)胞均無DNA復(fù)制，即停滯在G1/S期。Western blotting的檢測表明，Afu蛋白對腫瘤的細(xì)胞周期調(diào)控及生長抑制是通過MAPK，PII-AKT and FKHR/FoxO to cyclin D/CDK6/Rb等信號通路完成的。
權(quán)利要求
1.一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的tRNA結(jié)合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.—種權(quán)利要求1所述tRNA結(jié)合蛋白的編碼基因。
3.如權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述基因序列如SEQID No. 2所示。
4.如權(quán)利要求1所述的tRNA結(jié)合蛋白在制備調(diào)控腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種參與鹵蟲休眠卵形成及維持的一種新型的tRNA結(jié)合蛋白及其編碼基因，該蛋白通過與tRNA結(jié)合使其定位并滯留于于細(xì)胞核，通過MAPK，PI3K-AKT and FKHR/FoxO to cyclin D/CDK6/Rb等信號通路參與細(xì)胞周期的調(diào)控，使細(xì)胞(正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞)停滯于G1/S期。這一機(jī)制將為腫瘤藥物研究提供新的方向。
文檔編號A61P35/00GK102558331SQ20121003362
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月15日
發(fā)明者楊衛(wèi)軍, 陳佃福 申請人:浙江大學(xué)