用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，該方法包括：用測試物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞；和核實在前一步驟中用所述測試物質(zhì)處理過的皮膚細(xì)胞內(nèi)的DUOX1基因的相對表達(dá)水平。本發(fā)明也涉及用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查試劑盒，該試劑盒包括用于核實皮膚細(xì)胞內(nèi)的DUOX1基因的相對表達(dá)水平的裝置。本發(fā)明又涉及一種組合物，該組合物包含作為活性成分的能夠增加DUOX1基因表達(dá)的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化、保濕皮膚、增強皮膚屏障功能以及降低或治療特應(yīng)性癥狀的物質(zhì)。
【專利說明】用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮為皮膚的最外層，而角質(zhì)層是表皮的最外層。當(dāng)由角質(zhì)形成細(xì)胞組成的角質(zhì)層處于正常狀態(tài)時，表皮才能充當(dāng)身體的主要屏障，從而能夠防御各種刺激并防止身體水分的發(fā)散。表皮形成細(xì)胞在皮膚最下層，即在基底層中進(jìn)行增殖，然后通過棘層和顆粒層逐漸進(jìn)行分化。通過這種角化過程，表皮形成細(xì)胞會產(chǎn)生天然保濕因子(NMFs)和脂質(zhì)(神經(jīng)酰胺、膽固醇或脂肪酸)，進(jìn)而形成角質(zhì)層。通過這種角質(zhì)層的正常形成，皮膚的屏障功能可以正常工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]技術(shù)問題
本發(fā)明在于提供用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法及其試劑盒。進(jìn)一步，本發(fā)明在于提供一種組合物，該組合物可以促進(jìn)皮膚細(xì)胞的分化，滋潤皮膚，增強皮膚屏障功能，或者降低或治療特應(yīng)性癥狀。
[0004]技術(shù)方案
在一方面，本發(fā)明提供用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，其包括:用測試物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞；以及核實在前一步驟中經(jīng)測試物質(zhì)處理過的皮膚細(xì)胞內(nèi)的雙氧化酶I(DUOXl)基因的相對表達(dá)水平。
[0005]在另一方面，本發(fā)明提供用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查試劑盒，其包括可核實皮膚細(xì)胞內(nèi)DUOX I基因的相對表達(dá)水平的裝置。
[0006]在又一方面，本發(fā)明提供用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞的分化、滋潤皮膚、增強皮膚屏障功能或者降低或治療特應(yīng)新癥狀的組合物，該組合物包含作為活性成分的可增加DUOXl基因表達(dá)的物質(zhì)。
[0007]有益效果
根據(jù)在此公開的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，待用所述測試物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞后，該方法可通過檢測DUOXl基因的相對表達(dá)水平來便捷且有效地核實用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1展示了根據(jù)正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的DUOXl基因表達(dá)水平。
[0009]圖2展示了當(dāng)用DUOXl或DU0X2 siRNA處理皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞時，與未用它們處理時相比，DUOX I或DUOX 2的表達(dá)水平。
[0010]圖3和圖4展示了在用DUOXl或DU0X2 siRNA處理皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞時，與未用它們處理時相比，纖聚蛋白(filaggrin)和5?甲蛋白(1ricrin)(圖3),以及角蛋白(keratin) I和角蛋白10 (圖4)的表達(dá)水平。
[0011]圖5和圖6展示了當(dāng)用三百草或楝屬(melia)的提取物處理皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞時，與未用它們處理時相比，DUOXl和纖聚蛋白(圖5)，以及角蛋白I和角蛋白10 (圖6)的表達(dá)水平。
【具體實施方式】
[0012]雙氧化酶也被稱作Duoxl或ThOXl (甲狀腺氧化酶，Thyroid oxidase),是DUOXl基因編碼而成的。它被首次發(fā)現(xiàn)于甲狀腺中。人體內(nèi)有兩種同源物，即hDUOX I和hDUOX2，hDUOXl大量表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞內(nèi)，而hDU0X2則大量表達(dá)于唾液腺和胃腸道中。DUOXl屬于NADPH氧化酶(NOX)，并且具有共7種同源物(Noxl、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、Duoxl和Duox2 )。其中，NOX在吞噬細(xì)胞的吞噬作用中作為產(chǎn)生活性氧簇(ROS)的蛋白質(zhì)被人們做了大量研究，然而，最近在細(xì)胞組織內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了 NOX并對其進(jìn)行了研究，而不是在免疫細(xì)胞。已知，N0X/DU0X族將通過產(chǎn)生活性氧的生物作用參與高血壓(N0X1)、免疫(N0X2/DU0X)、耳朵的形成(Ν0Χ)、甲狀腺激素的產(chǎn)生(DU0X1和2)等當(dāng)中。
[0013]構(gòu)成皮膚屏障的最外層的角質(zhì)層是由天然保濕因子、脂質(zhì)等組成的。纖聚蛋白通過轉(zhuǎn)錄后修飾過程降解為多種親水性氨基酸，而且已知由此形成的氨基酸池將構(gòu)成天然保濕因子(NMFS)，NMFS會幫助維持角質(zhì)層的水分。進(jìn)一步，亦知，纖聚蛋白基因的突變是重要的遺傳危險因素，其通過減·少皮膚保濕因子，破壞皮膚屏障功能，降低對過敏原或微生物的皮膚防御能力以及激活T細(xì)胞群來引發(fā)特應(yīng)性濕疹，進(jìn)而引發(fā)由自身免疫機制引起的慢性炎癥。但是對其的治療或預(yù)防方法還尚未出現(xiàn)。
[0014]下面，將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0015]本發(fā)明人已檢測了 DU0X1的表達(dá)在正常人皮膚的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)相對會多，而且其表達(dá)水平在分化過程中會增加。進(jìn)一步，通過刪除DU0X1 (siRNA)來證實各種分化基因的標(biāo)記如兜甲蛋白、角蛋白I和角蛋白10的表達(dá)水平能與纖聚蛋白基因的表達(dá)水平一同增加，從而確認(rèn)了 DU0X1的表達(dá)與參與皮膚細(xì)胞分化的纖聚蛋白、兜甲蛋白、角蛋白I和角蛋白10基因的表達(dá)相關(guān)。基于此，可以判斷出，能增加皮膚細(xì)胞內(nèi)DU0X1基因的表達(dá)水平的物質(zhì)也就是用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。亦即，通過用某一物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞后檢查DU0X1基因的相對表達(dá)水平，可簡單地證實所述某一物質(zhì)是否為用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。
[0016]本發(fā)明的一個實施例提供用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，該方法包括:用測試物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞的步驟；和檢測在用前一步驟中的測試物質(zhì)處理過的皮膚細(xì)胞內(nèi)的雙氧化酶I (DU0X1)基因(基因庫登記號:NM_017434)的相對表達(dá)水平的步驟。
[0017]在本說明書中，術(shù)語“皮膚”指覆蓋動物身體表面的組織，而且是最廣義的概念，其包括頭皮和頭發(fā)，以及覆蓋臉和身體的表面的組織。
[0018]在本發(fā)明的一個實施例中，所述皮膚細(xì)胞包括表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個實施例中，所述皮膚細(xì)胞包括人的皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。在本發(fā)明的又一個實施例中，所述皮膚細(xì)胞包括人的正常的皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。
[0019]在本說明書中，術(shù)語“相對表達(dá)水平”可以為與在未經(jīng)測試物質(zhì)處理的皮膚細(xì)胞內(nèi)的DU0X1基因表達(dá)的表達(dá)水平相比時的表達(dá)水平。所述表達(dá)水平包括表達(dá)量和表達(dá)質(zhì)量。[0020]待檢測完本發(fā)明一個實施例的DUOX I基因的相對表達(dá)水平后，可以進(jìn)一步包括將增加DUOXl基因表達(dá)水平的物質(zhì)判斷為用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的步驟。具體地，當(dāng)DUOXl基因在經(jīng)所述測試物質(zhì)處理的皮膚細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平高于在未經(jīng)所述測試物質(zhì)處理的皮膚細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平時，可判斷出用來處理的測試物質(zhì)能夠增加DUOXl基因的表達(dá)水平。反之，當(dāng)DUOXl基因在經(jīng)所述測試物質(zhì)處理的皮膚細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平低于在未經(jīng)所述測試物質(zhì)處理的皮膚細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平時，可判斷出用來處理的測試物質(zhì)不能增加DUOXl基因的表達(dá)水平。綜上所述，可將所述能夠增加DUOXl基因的表達(dá)水平的用來處理的測試物質(zhì)判斷為用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。
[0021]根據(jù)本發(fā)明一個實施例，在經(jīng)所述測試物質(zhì)處理的細(xì)胞內(nèi)檢測DUOX I基因的相對表達(dá)水平的步驟中，所述相對表達(dá)水平可以用RT-PCR、ELISA或western印跡(免疫印跡)法來檢測。
[0022]除了檢測DUOX I基因的相對表達(dá)水平外，本發(fā)明一個實施例的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法可進(jìn)一步包括，在用所述測試物質(zhì)處理的皮膚細(xì)胞內(nèi)檢測選自纖聚蛋白、兜甲蛋白、角蛋白I和角蛋白10中至少一種基因的相對表達(dá)水平的步驟。通過對參與皮膚細(xì)胞表達(dá)中的基因標(biāo)記的相對表達(dá)水平，可明確地判斷出所述目標(biāo)測試物質(zhì)是否為用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。
[0023]根據(jù)本發(fā)明一個實施例，待檢測完選自纖聚蛋白、兜甲蛋白、角蛋白I和角蛋白10中至少一種基因的相對表達(dá)水平后，可進(jìn)一步包括將增加所選取的至少一種基因的表達(dá)水平的物質(zhì)判斷為用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞的分化的物質(zhì)的步驟。具體地，當(dāng)在經(jīng)所述測試物質(zhì)處理的皮膚細(xì)胞中選取的至少一種基因的表達(dá)水平高于在未經(jīng)所述測試物質(zhì)處理的皮膚細(xì)胞中選取的至少一種基因的表達(dá)水平時，就可判斷出所述用來處理的測試物質(zhì)可增加所選取的至少一種基因的表達(dá)水平。綜上所述，可將所述能夠增加所選取的至少一種基因的表達(dá)水平的用來處理的測試物質(zhì)判斷為用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。
[0024]如果皮膚細(xì)胞分化不當(dāng)，皮膚的角質(zhì)層就會無法正常工作。因此，皮膚的保濕能力會下降，且皮膚的屏障功能可能會退化。進(jìn)一步，由于各種因素而無法維持正常皮膚角質(zhì)層的功能時，將引起皮膚疾 病如特應(yīng)性，其主要癥狀是皮膚炎癥和皮膚干燥。因此，用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)可表現(xiàn)出保濕皮膚、增強皮膚屏障功能以及降低或治療特應(yīng)性癥狀的效果。亦即，根據(jù)本發(fā)明一個實施例，可通過使用用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法來檢測用于保濕皮膚、增強皮膚屏障功能以及降低或治療特應(yīng)性癥狀的物質(zhì)。
[0025]本發(fā)明的一個實施例提供用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查試劑盒，該試劑盒包括能檢測在皮膚細(xì)胞內(nèi)DUOX I基因的相對表達(dá)水平的裝置。通過使用所述檢測試劑盒可檢測皮膚細(xì)胞內(nèi)DUOX I基因的相對表達(dá)水平，從而可便捷并有效地檢測出用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。
[0026]如上述可知，能夠增加DUOX I基因表達(dá)的物質(zhì)表現(xiàn)出了促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化、保濕皮膚、增強皮膚屏障功能以及降低或治療特應(yīng)性癥狀的效果。因此，本發(fā)明的一個實施例提供用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的組合物、用于保濕皮膚的組合物、用于增強皮膚屏障功能的組合物以及用于降低或治療特應(yīng)性癥狀的組合物，這些組合物包含作為活性成分的能夠增加DUOX I基因表達(dá)的物質(zhì)。本發(fā)明的另一個實施例提供用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的組合物、用于保濕皮膚的組合物、用于增強皮膚屏障功能的組合物以及用于降低或治療特應(yīng)性的癥狀的組合物，這些組合物包含作為活性成分的能夠增加所檢測到的DUOXl基因表達(dá)的物質(zhì)。
[0027]在一個實施例中，所述組合物可以為化妝品組合物。在另一個實施例中，所述組合物可以為藥物組合物。在又一個實施例中，所述組合物可以為保健食品組合物。
[0028]現(xiàn)在起描述所述實施例。以下實施例僅作說明為目的，不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0029]【實施例1】對根據(jù)鈣濃度的DUOXl基因表達(dá)變化的評估
通常，已知當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度高時能夠促進(jìn)皮膚細(xì)胞的分化。本實驗在于，通過用不同濃度的鈣處理細(xì)胞來改變皮膚細(xì)胞的分化程度后評估DUOXl基因的表達(dá)水平。
[0030]從龍沙公司(Lonza，Inc.，美國馬里蘭州沃克斯維爾)購買正常人的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(人表皮新生角質(zhì)形成細(xì)胞)并進(jìn)行繼代培養(yǎng)(subculture)，然后在37° C和5%C02的C02培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)龍沙公司(美國馬里蘭州沃克斯維爾)的說明書，準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)。在KBM-2 (Clonetics CC-3103)培養(yǎng)基(500ml)中加入KGM-2子彈套件【牛垂體提取物(BPE，2ml)、人表皮成長因子(hEGF，0.5ml)、胰島素(0.5ml)、氫化可的松(0.5ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,0.5ml)、腎上腺素(0.5ml),硫酸慶大霉素 + amphofericin BCGA-1000,
0.5ml)】。
[0031]在所述人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)基中分別加入120 μ M和1.2mM的鈣并培養(yǎng)24小時。將它們用作低鈣組(對照組)和高鈣組(測試組)。待用白細(xì)胞間介素處理完24小時后，用IOml的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗所述細(xì)胞2次,然后用Trizol試劑(Invitrogen,美國加利福尼亞洲卡爾斯巴德)從所述細(xì)胞中分離出細(xì)胞內(nèi)所有的RNA。用RNA試劑盒(QiagenRNeasy試劑盒，Qiagen,加利福尼亞洲瓦倫西亞)再次提純所述分離出的RNA,然后用安捷倫 2100 生物分析儀(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies,美國加利福尼亞州圣克拉拉)檢測RNA質(zhì) 量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Superscript Reverse Transcriptase(RT) II kit, Invitrogen,加利福尼亞洲卡爾斯巴德)從分離出的RNA中合成cDNA,而后通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(real time -reverse transcription polymerasechain reaction，Q-RT-PCR)對各種NOX基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。使用TaqMan?基因表達(dá)檢測試劑盒(Applied Biosystems公司，加利福尼亞洲福斯特市)評估NOXl (Hs00246589_ml)、N0X2 (Hs00166163_ml)、N0X3 (Hs00210462_ml )、N0X4 (Hs00276431_ml )、N0X5(Hs00225846_ml)、DU0X1 (Hs00213694_ml)和 DU0X2 (Hs00204187_ml)的表達(dá)模式的變化。其結(jié)果在圖1中展示。
[0032]如圖1所示，在正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，DU0X1基因的表達(dá)水平基本上會高，而且當(dāng)利用鈣增加皮膚細(xì)胞分化時，更能顯著地增加DUOX I基因的表達(dá)。亦即，可以確認(rèn)的是，DU0X1基因與皮膚細(xì)胞分化有關(guān)，更為具體地，DU0X1基因表達(dá)的增加與皮膚細(xì)胞分
化有關(guān)。
[0033]【實施例2】對根據(jù)刪除DU0X1時纖聚蛋白基因和各種分化標(biāo)記的表達(dá)的變化的評估
從Dharmacone購買能夠抑制DU0X1或DU0X2基因的表達(dá)的siRNA (SMARTP00L)。
[0034]如同實施例1，培養(yǎng)正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，而后在6孔板上以2X 104cells/cm2標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行培養(yǎng)。待24小時后，用RNAi MAX試劑(Invitrogen)將50nM的DU0X1或DU0X2的siRNA分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。6小時后更換細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染完24小時后，用IOml的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗所述細(xì)胞2次,然后用Trizol試劑(Invitrogen,美國加利福尼亞洲卡爾斯巴德)從所述細(xì)胞中分離出細(xì)胞內(nèi)所有的RNA。用RNA試劑盒(Qiagen RNeasy試劑盒，Qiagen，加利福尼亞洲瓦倫西亞)再次提純所述分離出的RNA，然后用安捷倫2100生物分析儀(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies,美國加利福尼亞州圣克拉拉)檢測 RNA 質(zhì)量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Superscript Reverse Transcriptase (RT) IIkit, Invitrogen公司，加利福尼亞洲卡爾斯巴德)從分離出的RNA中合成cDNA,而后用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(real time -reverse transcription polymerasechain reaction, Q-RT-PCR)進(jìn)行定量分析。使用TaqMan?基因表達(dá)檢測試劑盒(AppliedBiosystems公司，加利福尼亞洲福斯特市)評估DU0X1 (Hs00213694_ml)和作為人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分化的標(biāo)記基因的纖聚蛋白(基因庫登記號:NM_002016) (Hs00856927_gl)、兜甲蛋白(基因庫登記號:NM_000427) (Hs01894962_sl)、角蛋白I (基因庫登記號:NM_006121)(Hs00196158_ml)、角蛋白10 (基因庫登記號:NM_000421) (Hs00166289_ml)的表達(dá)模式的變化。其結(jié)果在圖2-4中展示。
[0035]圖2為展示了 DU0X1或DU0X2的表達(dá)水平在用DU0X1或DU0X2 siRNA處理時相比未經(jīng)處理的對照組時的圖表。圖3為展示了纖聚蛋白和兜甲蛋白基因的表達(dá)水平在用DUOXI或DUOX 2 siRNA處理時相比未經(jīng)處理的對照組時的圖表，圖4為以相同方法展示角蛋白I和角蛋白10基因的表達(dá)水平的圖表。
[0036]如上述結(jié)果所示，當(dāng)用DU0X1或DU0X2 siRNA處理時DU0X1或DU0X2基因的表達(dá)水平會下降。進(jìn)一步，與未用DU0X1或DU0X2的siRNA處理時相比，纖聚蛋白、兜甲蛋白、角蛋白I和角蛋白10基因的表達(dá)水平都會下降。亦即，可以確定的是，當(dāng)刪除DU0X1時參與皮膚細(xì)胞分化的基因的表達(dá)水平會下降。
[0037]【實施例3】對測試物質(zhì)的如DU0X1和纖聚蛋白的基因的表達(dá)水平的評估
已知，三百草或楝屬(melia)的提取物能夠促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化，通過使用三百草和楝屬的提取物檢測DU0X1、纖聚蛋白、角蛋白I和角蛋白10的表達(dá)水平。
[0038]從龍沙公司(Lonza，Inc.，美國馬里蘭州沃克斯維爾)購買正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，在37° C和5%C02的C02培養(yǎng)箱內(nèi)的KBM-2 (Clonetics CC-3103)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0039]將未經(jīng)處理的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)組(對照組)和用10 μ M的三百草或楝屬的提取物處理的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)組分別培養(yǎng)24小時。所述三百草和楝屬的提取物是從韓國Plank提取庫購買的。待用三百草或楝屬的提取物處理完24小時后，用IOml的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗所述細(xì)胞,然后用Trizol試劑(Invitrogen,美國加利福尼亞洲卡爾斯巴德)從此細(xì)胞中分離出細(xì)胞內(nèi)的所有RNA。用RNA試劑盒(Qiagen RNeasy試劑盒，Qiagen，加利福尼亞洲瓦倫西亞)再次提純所述分離出的RNA，然后用安捷倫2100生物分析儀(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies,美國加利福尼亞州圣克拉拉)檢測RNA質(zhì)量和濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Superscript Reverse Transcriptase (RT)II kit, Invitrogen公司，加利福尼亞洲卡爾斯巴德)從分離出的RNA中合成cDNA,通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time -reverse transcription polymerase chainreaction，Q-RT-PCR)對基因表達(dá)的變化進(jìn)行定量分析。使用TaqMan?基因表達(dá)檢測試劑盒(Applied Biosystems公司，加利福尼亞洲福斯特市)評估DU0Xl(Hs00213694—ml)和作為人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分化的標(biāo)記基因的纖聚蛋白(Hs00856927—gl)、角蛋白I (Hs00196158—ml)、角蛋白10 (Hs00166289_ml)的基因表達(dá)模式的變化。其結(jié)果在圖5和圖6中展示。
[0040]圖5為展示了 DUOX I和纖聚蛋白的表達(dá)水平在用三百草或楝屬的提取物處理皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞時相比未經(jīng)處理時的圖表，而圖6為以相同方法展不角蛋白I和角蛋白10基因的表達(dá)水平的圖表。
[0041]如上述結(jié)果所示，三百草或楝屬的提取物能顯著地增加人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的DUOXl基因、纖聚蛋白、角蛋白I和角蛋白10基因的表達(dá)水平。亦即，可以確定的是，具有皮膚細(xì)胞分化促進(jìn)效果的物質(zhì)，進(jìn)一步具有皮膚保濕、增強皮膚屏障功能以及降低或治療特應(yīng)性癥狀的效果的物質(zhì)可 以增加所述基因的表達(dá)水平。
【權(quán)利要求】
1.用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，包括: 用測試物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞；和 核實用所述測試物質(zhì)處理過的皮膚細(xì)胞內(nèi)雙氧化酶I (DUOXl)基因(基因庫登記號:NM_017434)的相對表達(dá)水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，其特征在于，還包括:在核實DUOXl基因的相對表達(dá)水平后，將使DUOXl基因的表達(dá)水平上升的物質(zhì)判斷為用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，其特征在于，該方法除了核實DUOXl基因的相對表達(dá)水平外，還包括核實用所述測試物質(zhì)處理過的皮膚細(xì)胞內(nèi)的選自纖聚蛋白、兜甲蛋白、角蛋白I和角蛋白10的至少一種基因的相對表達(dá)水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，其特征在于，還包括:在核實選自纖聚蛋白、兜甲蛋白、角蛋白I和角蛋白10的至少一種基因的相對表達(dá)水平后，將使至少一種選定基因的表達(dá)水平上升的物質(zhì)判斷為用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，其特征在于，所述皮膚細(xì)胞為角質(zhì)形成細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5中的任何一項所述的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，其特征在于，該方法為用于通過促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化來保濕皮膚的物質(zhì)的篩查方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?·5中任何一項所述的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，其特征在于，該方法為用于通過促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化來增強皮膚屏障功能的物質(zhì)的篩查方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?5中任何一項所述的用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查方法，其特征在于，該方法為用于通過促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化來降低或治療特應(yīng)性癥狀的物質(zhì)的篩查方法。
9.用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的物質(zhì)的篩查試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括用于核實皮膚細(xì)胞內(nèi)的DUOXl基因的相對表達(dá)水平的裝置。
10.用于促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的組合物，其特征在于，該組合物包含作為活性成分的能夠增加DUOXl基因的表達(dá)的物質(zhì)。
11.用于保濕皮膚的組合物，其特征在于，該組合物包含作為活性成分的能夠增加DUOXl基因的表達(dá)的物質(zhì)。
12.用于增強皮膚屏障功能的組合物，其特征在于，該組合物包含作為活性成分的能夠增加DUOXl基因的表達(dá)的物質(zhì)。
13.用于降低或治療特應(yīng)性癥狀的組合物，其特征在于，該組合物包含作為活性成分的能夠增加DUOXl基因的表達(dá)的物質(zhì)。
【文檔編號】A61K8/00GK103443291SQ201180065355
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月19日
【發(fā)明者】崔玹, 金潤京, 梁承夏, 李泰龍, 盧旻秀, 申東旭 申請人:株式會社愛茉莉太平洋