由人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞生成神經(jīng)干細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞。還提供使用包含該經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞的適合的制劑來(lái)治療神經(jīng)退化疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，此處所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)尾型同源框2(Cdx2)、Nanog同源框、巢蛋白、八聚物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(Oct-4)、神經(jīng)絲、神經(jīng)原素-3(Ngn3)、新霉素缺失基因(Neo-D)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)、CD133、視黃酸受體β(RARJ3)、類視黃醇X受體α(RXRa)、類視黃醇X受體β(RXRJ3)、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白2(CRABP-2)、細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白l(CRBP-I)、視黃醛脫氫酶2(RALDH-2)或視黃醛脫氫酶3(RALDH-3)中的一種或多種的轉(zhuǎn)錄物。
【專利說(shuō)明】由人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞生成神經(jīng)干細(xì)胞
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0001]本申請(qǐng)主張于2010年11月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/413,892號(hào)以及于2011年I月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/434，790號(hào)的權(quán)益，該申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0002]人類滋養(yǎng)層干(human trophoblast stem, hTS)細(xì)胞能夠在未分化的狀態(tài)下在體外(in vitro)無(wú)限增殖。hTS細(xì)胞維持潛在的多譜系分化能力(potential multilineagedifferentiation capabilities)。hTS細(xì)胞制劑在體外或在體內(nèi)(in vivo)可以被誘導(dǎo)分化成為滋養(yǎng)層譜系的細(xì)胞。進(jìn)一步地，hTS細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)元，諸如多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neurons)。hTS細(xì)胞可以被用來(lái)治療在黑質(zhì)紋狀體途徑(nigrostriatal pathway)中多巴胺能神經(jīng)元的功能異?；蛉笔?諸如人類中的神經(jīng)退化性障石尋(neurodegenerative disorders)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]神經(jīng)退化性障礙在人類族群中具有很深的社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響(socio-economiceffects) ο目前的藥物通過(guò)減輕神經(jīng)退化性障礙[諸如，帕金森氏癥(Parkinson’ sdisease)、阿爾茲海默癥(Alzheimer，s disease)、亨廷頓氏癥(Huntington，s disease)等]的某些癥狀而僅提供有限的益處。帕金森氏癥(PD)是由于黑質(zhì)紋狀體途徑中多巴胺能神經(jīng)元的功能異?；蛉笔斐傻?，并且是在人類中常見的神經(jīng)退化性障礙。此處提供了用于對(duì)哺乳動(dòng)物中的神經(jīng)退化性障礙[包括帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、阿爾茲海默癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、多系統(tǒng)萎縮(multiple systematrophy)、路易氏體癡呆(Lewy body dementia)、周邊感覺神經(jīng)病變(peripheral sensoryneuropathies)或脊髓損傷(spinal cord injuries)]進(jìn)行以細(xì)胞為基礎(chǔ)的替代治療的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞(isolated neural stem cells)。
[0004]在一個(gè)方面，此處提供了經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞衍生自滋養(yǎng)層組織(trophoblast tissue)。在一些實(shí)施方案中，該滋養(yǎng)層組織是人類滋養(yǎng)層組織。
[0005]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處所描述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)尾型同源框2 (caudal type homeobox2, Cdx2)、Nanog 同源框(Nanog homeobox)、巢蛋白(nestin)、八聚物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 4 (octamer-b inding transcription factor4, Oct-4)、神經(jīng)絲(neurofilament)、神經(jīng)原素-3 (neurogenin_3, NgN3)、新霉素缺失基因(Neo-D)、微管相關(guān)蛋白-2 (microtubule-associated protein-2, MAP-2)、CD133、視黃酸受體 β (retinoicacid receptor beta, RAR β )、類視黃醇 X 受體 a (retinoid Xreceptor alpha, RXR α )、類視黃醇X受體β (retinoid X receptor beta, RXRP )、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白2 (cellularretinoic acid binding protein2, CRABP-2)、細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白 I (cellular retinolbinding proteinl, CRBP-1)、視黃醒脫氫酶 2 (retinaldehyde dehydrogenase2, RALDH-2)或視黃醒脫氫酶3 (retinaldehyde dehydrogenase3, RALDH-3)中的一種或多種的轉(zhuǎn)錄物(transcript)。
[0006]在一個(gè)實(shí)施方案中，該經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞是人類神經(jīng)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞具有正常的核型(karyotype)。在另一實(shí)施方案中，該經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞具有一種或多種免疫豁免的特性(immune-privileged characteristics)。在另一實(shí)施方案中，該一種或多種免疫-豁免的特性包含不存在⑶33的表達(dá)和/或⑶133的表達(dá)。
[0007]此處進(jìn)一步提供了將該經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元(neuixms)的方法，該方法包括:將所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞施用至哺乳動(dòng)物的腦中，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元。在另一實(shí)施方案中，該神經(jīng)元是多巴胺能神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元(glutaminergic neuron)、5_ 輕色胺能神經(jīng)兀(serotonergic neuron)或 GABA 能(Y-氨基丁酸)神經(jīng)元。
[0008]在一個(gè)實(shí)施方案中，該經(jīng)施用的(例如，經(jīng)移植的)經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞在所述施用之前用誘導(dǎo)藥物(induction drug)進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)。在另一實(shí)施方案中，該經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞在所述施用之前不用誘導(dǎo)藥物進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述施用之前，所述哺乳動(dòng)物的腦被損害或已蒙受神經(jīng)元缺失(neuronal loss)。在另一實(shí)施方案中,所述損害是針對(duì)多巴胺能神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元或GABA能(Y-氨基丁酸)神經(jīng)元的。在另一實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元缺失是針對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方案中,用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。
[0011]在另一實(shí)施方案中，該經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，在被施用至所述個(gè)體的腦中之后，移轉(zhuǎn)至該個(gè)體的腦的黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta, SNC)區(qū)域。在另一實(shí)施方案中，所述施用改善 所述哺乳動(dòng)物中的感覺運(yùn)動(dòng)功能(sensorimotor function)。在另一實(shí)施方案中，所述施用導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物的僵硬(rigidity)、運(yùn)動(dòng)失能癥(akinesia)或平衡障礙(balance impairment)的減輕。
[0012]此處提供了將經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化成多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括:將所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞施用至哺乳動(dòng)物的腦中，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct_4、神經(jīng)絲、NgN3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一種或多種的轉(zhuǎn)錄物，其中所述哺乳動(dòng)物的腦被損害或已蒙受神經(jīng)元缺失，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞中的一種或多種分化成多巴胺能神經(jīng)元。
[0013]此處提供了將經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化成多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括:將所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞施用至哺乳動(dòng)物的腦中，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞衍生自滋養(yǎng)層組織，其中所述哺乳動(dòng)物的腦被損害或已蒙受神經(jīng)元缺失，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞中的一種或多種分化成多巴胺能神經(jīng)元。
[0014]在上面所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述施用改善所述哺乳動(dòng)物中的感覺運(yùn)動(dòng)功能。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，所述施用導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物的僵硬、運(yùn)動(dòng)失能癥或平衡障礙的減輕。
[0015]此處提供了將經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，該方法包括:調(diào)節(jié) Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct4、神經(jīng)絲、Ngn_3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRP、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 基因的活性。
[0016]此處提供了將經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，該方法包括:調(diào)節(jié) Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct4、神經(jīng)絲、Ngn_3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRP、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 轉(zhuǎn)錄物的水平。
[0017]此處提供了將經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，該方法包括:調(diào)節(jié) Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct4、神經(jīng)絲、Ngn_3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRP、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 蛋白質(zhì)的水平或活性。
[0018]此處提供了篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法，該方法包括:使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及檢測(cè)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性的改變。在上面所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞相比，所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中的至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性降低。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞相比，所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中的至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性增加。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，該疾病是神經(jīng)退化性障礙。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，該疾病是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、精神分裂癥(schizophrenia)或肌萎縮側(cè)索硬化癥。
[0019]此處提供了篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法，該方法包括:使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及檢測(cè)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中的至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平的改變。在上面所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，與未接觸所述化合物的經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞相比，所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中的至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平降低。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞相比，所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中的至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平增加。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，該疾病是神經(jīng)退化性障礙。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，該疾病是帕金森氏癥、阿`爾茲海默癥、精神分裂癥或肌萎縮側(cè)索硬化癥。
[0020]此處提供了針對(duì)在細(xì)胞中誘導(dǎo)改變的能力而篩選化合物的方法，該方法包括:使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及檢測(cè)對(duì)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)。
[0021]此處提供了針對(duì)在細(xì)胞中誘導(dǎo)改變的能力而篩選化合物的方法，該方法包括:使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及檢測(cè)對(duì)所述神經(jīng)干細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)。
[0022]此處提供了篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法，該方法包括:使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及檢測(cè)所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性的改變。在上面所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞相比，所述神經(jīng)干細(xì)胞中的至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性降低。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞相比，所述神經(jīng)干細(xì)胞中的至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性增加。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，該疾病是神經(jīng)退化性障礙。在特定的實(shí)施方案中，該疾病是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、精神分裂癥或肌萎縮側(cè)索硬化癥。
[0023]此處提供了篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法，該方法包括:使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及檢測(cè)所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平的改變。在上面所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞相比，所述神經(jīng)干細(xì)胞中的至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平降低。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞相比，所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平增加。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，該疾病是神經(jīng)退化性障礙。在上面所述的方法的另一實(shí)施方案中，該疾病是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、精神分裂癥或肌萎縮側(cè)索硬化癥。
[0024]此處所提供的一個(gè)實(shí)施方案描述了一種治療有此需要的哺乳動(dòng)物中的神經(jīng)障礙(neurological disorder)的方法，其包括:將至少一神經(jīng)干細(xì)胞施用至所述哺乳動(dòng)物，其中該細(xì)胞是經(jīng)免疫豁免的。在另一實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠、豬、犬、猴、猩猩或人猿。在另一實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人類。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有此需要的哺乳動(dòng)物具有一種或多種與神經(jīng)障礙有關(guān)的癥狀。在另一實(shí)施方案中，所述一種或多種癥狀選自于由下列所構(gòu)成的群組:僵硬、運(yùn)動(dòng)失能癥、平衡障礙、震顫(tremor)、步態(tài)障礙(gait disorder)、不良性步態(tài)(maldispositional gait)、癡呆(dementia)、過(guò)度月中脹(excessive swelling)[水月中(edema)]、肌無(wú)力(musc le weakness)、下肢萎縮(atrophy in the lower extremity)、運(yùn)動(dòng)障礙(movement disorder)[舞蹈病(chorea)]、肌肉僵直(muscle rigidity)、物理運(yùn)動(dòng)的減慢[運(yùn)動(dòng)遲緩(bradykinesia)]、物理運(yùn)動(dòng)的缺失(運(yùn)動(dòng)失能癥)、健忘(forgetfulness)、認(rèn)知(智能)損傷[cognitive (intellectual) impairment]、辨識(shí)的缺失(loss of recognition)[失識(shí)癥(agnosia)]、受損的功能(諸如決策與計(jì)劃)、單側(cè)面麻瘦(hemifacial paralysis)、感覺缺失(sensory deficits)、麻木(numbness)、剌痛感(tingling)、四肢的疼痛感覺異常(painful paresthesias in the extremities)、虛弱(weakness)、腦神經(jīng)麻瘦(cranial nerve palsies)、語(yǔ)言障礙(difficultywith speech)、眼球運(yùn)動(dòng)(eye movements)、視野缺損(visual field defects)、失明(blindness)、出血(hemorrhage)、分泌物(exudates)、近端肌萎縮(proximal musclewasting)、運(yùn)動(dòng)困難癥(dyskinesia)、四肢肌肉張力的異常(abnormality of tonus inlimb muscles)、肌強(qiáng)直減少(decrease in myotony)、動(dòng)作失調(diào)(incoordination)、在手指-手指測(cè)試或手指-鼻測(cè)試中錯(cuò)誤的指示、辨距不良(dysmetria)、霍-斯二氏現(xiàn)象(Holmes-Stewart phenomenon)、不完全的或完全的全身性麻瘦(incomplete orcomplete systemic paralysis)、視神經(jīng)炎(optic neuritis)、視物顯多癥(multiplevision)、眼球運(yùn)動(dòng)障礙(ocular motor disturbance)[諸如眼球震顫(nystagmus)]、疫攣性麻瘦(spastic paralysis)、痛苦的強(qiáng)直發(fā)作(painful tonic seizure)、萊爾米特綜合征(Lhermitte syndrome)、共濟(jì)失調(diào)(ataxia)、語(yǔ)言困難(mogilalia)、膀胱直腸障石辱(vesicorectal disturbance)、起立性低血壓(orthostatic hypotension)、運(yùn)動(dòng)功能的減退(decrease in motor function)、尿床(bed wetting)、貧乏的言語(yǔ)表達(dá)(poor verbalization)、不充足的睡眠型態(tài)(poor sleep patterns)、睡眠障礙(sleepdisturbance)、食欲障礙(appetite disturbance)、體重改變(change inweight)、精神運(yùn)動(dòng)性激動(dòng)或遲滯(psychomotor agitation or retardation)、減少的活力(decreased energy)、無(wú)價(jià)值的感受或過(guò)度或不適當(dāng)?shù)膬?nèi)疚、思考或全神貫注的困難、反復(fù)的死亡意圖或者自殺的意念或企圖、害怕(fearfulness)、焦慮(anxiety)、興奮增盛(irritability)、沉思的或強(qiáng)迫性沉思(brooding or obsessive rumination)、過(guò)度擔(dān)心身體健康(excessive concern with physical health)、恐慌發(fā)作(panic attacks)以及恐懼癥(phobias)。在另一實(shí)施方案中，所述神經(jīng)障礙是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(Friedreich’ s ataxia)、路易氏體癥(Lewy body disease)、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy)、多系統(tǒng)萎縮、癡呆、精神分裂癥、麻痹(paralysis)、多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis)、脊髓損傷、腦損傷(brain injuries)[例如，中風(fēng)(stroke)]、腦神經(jīng)障礙(cranial nervedisorders)、周邊感覺神經(jīng)病變、癲癇(epilepsy)、朊病毒障礙(prion disorders)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、阿爾拍斯病(Alper's disease)、小腦 / 脊髓小腦退化(cerebellar/spinocerebellar degeneration)、巴滕病(Batten disease)、皮質(zhì)基底核退化(corticobasal degeneration)、貝爾氏麻痹(Bell ’ s palsy)、格林-巴利綜合征(Guillain-Barre Syndrome)、皮克病(Pick’s disease)以及自閉癥(autism)。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處還提供了一種治療有此需要的哺乳動(dòng)物中的神經(jīng)障礙的方法，該方法包括:將至少一種神經(jīng)干細(xì)胞施用至所述哺乳動(dòng)物，其中該細(xì)胞是經(jīng)免疫豁免的并且衍生自滋養(yǎng)層組織。在另一實(shí)施方案中，該經(jīng)免疫豁免的細(xì)胞具有低水平的CD33表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該經(jīng)免疫豁免的細(xì)胞具有低水平的CD133表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該神經(jīng)元祖干細(xì)胞(neuronal progenitor stem cell)不會(huì)引起免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該神經(jīng)元祖干細(xì)胞不會(huì)形成腫瘤。在另一實(shí)施方案中，該神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神經(jīng)絲、NgN3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARP ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一種或多種的轉(zhuǎn)錄物。
[0027]在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括:將所述一種或多種神經(jīng)干細(xì)胞施用至哺乳動(dòng)物的腦中，其中該細(xì)胞分化成神經(jīng)元。在另一實(shí)施方案中，所述施用包括注射(injecting)或植入(implanting)。在另一實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元是多巴胺能神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元或GABA能(Y-氨基丁酸)神經(jīng)元。在另一實(shí)施方案中，所述祖細(xì)胞(progenitor cell)在所述施用之前用誘導(dǎo)藥物進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處還提供了一種誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法，該方法包括:(a)使該干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸；(b)在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物來(lái)調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)包括:無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)2B (Wnt2B)、卷曲蛋白家族受體6 (Fzd6)、散亂蛋白3 (disheve11ed3，Dvl3)、晚期T細(xì)胞淋巴瘤常見重排蛋白I (FRATl)、糖原合酶激酶3 β (651(3 0)、組蛋白脫乙酰酶6 010六06)、β-聯(lián)蛋白、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白亞基α IIGq類(G a q/11)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β (Gi3)、類視黃醇X受體a (RXR α )、視黃酸受體β (RAR β )、谷氨酸受體I (GLuRl)、磷酸肌醇_3_激酶(PI3K)、rac-a絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKtl)、rac_i3絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKt2)、rac- Y絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKt3)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素革巴蛋白(mTOR)、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白(EIF4EBP)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白I (CREBl)、酪氨酸羥化酶(TH)、磷脂酶Ci3 (PLC-β)、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴型蛋白激酶II抑制劑2(〇&1?11)、真核翻譯起始因子48伍正48)、帕金蛋白(parkin)、α-突觸核蛋白(SNCA)、微管蛋白(tubulin)、鈣依賴磷酸酶(calcineurin)、腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2 (CRMP-2)、活化的T細(xì)胞的核因子(NFAT1)、輸入蛋白(importin)、淋巴樣細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合因子I (LEFl)、垂體同源框2(Pitx2)、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(MEF2A)或ElA結(jié)合蛋白p300 (EP300);以及(c)誘導(dǎo)或促進(jìn)該干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞。[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(mammalian induced pluripotent stem cell)。在另一實(shí)施方案中，其中該干細(xì)胞是內(nèi)胚層、中胚層、外胚層或間質(zhì)干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞來(lái)自小鼠、大鼠、人類、黑猩猩、大猩猩、犬、豬、山羊、海豚或牛。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞來(lái)自人類。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞是人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、多巴胺生成細(xì)胞(dopamine producing cell)、多巴胺能神經(jīng)元、單極神經(jīng)兀(unipolar neuron)、雙極神經(jīng)兀(bipolar neuron)、多極神經(jīng)兀(multipolar neuron)、維體細(xì)胞(pyramidal cell)、浦肯野細(xì)胞(Purkinje cell)以及前角細(xì)胞(anterior horncell)、籃狀細(xì)胞(basket cell)、貝茨細(xì)胞(betz cell)、閏紹細(xì)胞(Renshaw cell)、顆粒細(xì)胞(granule cell)或中等棘細(xì)胞(medium spiny cell)。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)藥物包括:視黃酸(retinoic acid)、煙酰胺(nicotinamide)或 β -疏基乙酉享(beta-mercaptoethanol)、維生素 B12(vitaminB12)、肝素(heparin)、腐胺(putrescine)、生物素(biotin)或 Fe2+、丁基羥基苯甲醚(butylated hydroxyanisole) > 丙戍酸(valproic acid)、福司柯林(forskolin) >5_氮胞苷(5-azacytidine)、Π引哚美辛(indomethacin)、異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine)或胰島素(insulin)。在另一實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)包括:增加該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的活性。在另一實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)包括:增加該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加表達(dá)包括:增加編碼該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的mRNA的量，或者增加由mRNA翻譯而來(lái)的該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的量。在另一實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)包括:降低該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的活性。在另一實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)包括:減少該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，減少表達(dá)包括:減少編碼該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的mRNA的量，或者減少由mRNA翻譯而來(lái)的該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的量。
[0031]此處還描述了誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法，其中該神經(jīng)元特性包括多巴胺(dopamine)、谷氨酸N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受體的亞基(subunits of the glutamate NMDA receptor)、突觸蛋白 I (synapsin I)、a丐離子通道標(biāo)記(calcium channel marker)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43 (GAP-43)、電壓依賴的K+通道、電壓依賴的Ca+通道或電壓依賴的Na+通道的表達(dá)。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法包括:在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)是Wnt2B。在另一實(shí)施方案中，Wnt2B被活化。在另一實(shí)施方案中，Wnt2B被去活化。在另一實(shí)施方案中，fct2B被活化，然后被去活化。在另一實(shí)施方案中，fct2B被去活化，然后被活化。在另一實(shí)施方案中，fct2B促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。在另一實(shí)施方案中，Wnt2B促進(jìn)或誘導(dǎo)多巴胺表達(dá)。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法包括:在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)是GSK3i3。在另一實(shí)施方案中，GSK3i3被活化。在另一實(shí)施方案中，GSK3 β被去活化。在另一實(shí)施方案中，GSK30被活化，然后被去活化。在另一實(shí)施方案中，GSK3 0被去活化，然后被活化。在另一實(shí)施方案中，GSK3 0促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。在另一實(shí)施方案中，GSK3 3調(diào)節(jié)微管裝配(microtubule assembly)。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法包括:在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)是CREB1。在另一實(shí)施方案中，CREBl被活化。在另一實(shí)施方案中，CREBl被去活化。在另一實(shí)施方案中，CREBl被活化，然后被去活化。在另一實(shí)施方案中，CREBl被去活化，然后被活化。在另一實(shí)施方案中，CREBl促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。在另一實(shí)施方案中，CREBl促進(jìn)或誘導(dǎo)多巴胺表達(dá)。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法包括:在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)是CaMKII。在另一實(shí)施方案中，CaMKII被活化。在另一實(shí)施方案中，CaMKII被去活化。在另一實(shí)施方案中，CaMKII被活化，然后被去活化。在另一實(shí)施方案中，CaMKII被去活化，然后被活化。在另一實(shí)施方案中，CaMKII促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。在另一實(shí)施方案中，CaMKII調(diào)節(jié)微管裝配。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法包括:在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)是MAPT。在另一實(shí)施方案中，MAPT被活化。在另一實(shí)施方案中，MAPT被去活化。在另一實(shí)施方案中，MAPT被活化，然后被去活化。在另一實(shí)施方案中，MAPT被去活化，然后被活化。在另一實(shí)施方案中，MAPT促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。在另一實(shí)施方案中，MAPT調(diào)節(jié)微管裝配。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了一種誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性(immunogenicity)的細(xì)胞的方法,該方法包括:(a)使該干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸；(b)在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一或多種蛋白質(zhì)包括:fct2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3 β、HDAC6、β _ 聯(lián)蛋白、G a q/11、G β、RXRa、RARβ、GLuRl、ΡΙ3Κ、AKtl、AKt2、AKt3、mT0R、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羥化酶)、PLC_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、鈣依賴磷酸酶、CRMP-2、NFATl、輸入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A或EP300 ;以及(c)誘導(dǎo)或促進(jìn)該干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，其中該干細(xì)胞是內(nèi)胚層、中胚層、外胚層或間質(zhì)干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞來(lái)自小鼠、大鼠、人類、黑猩猩、大猩猩、犬、豬、山羊、海豚或牛。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞來(lái)自人類。在另一實(shí)施方案中，該干細(xì)胞是人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞。
[0039]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處描述了誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞的方法，其中該具有降低的免疫原性的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、多巴胺生成細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、單極神經(jīng)元、雙極神經(jīng)元、多極神經(jīng)元、錐體細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞以及前角細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、貝茨細(xì)胞、閏紹細(xì)胞、顆粒細(xì)胞或中等棘細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該具有降低的免疫原性的細(xì)胞不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或者可以抑制免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該具有降低的免疫原性的細(xì)胞不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，或者可以通過(guò)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(macrophage)、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(microglia cell)、肥大細(xì)胞(mast cell)或NK細(xì)胞來(lái)抑制免疫反應(yīng)。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞的方法包括:使該干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸，其中該誘導(dǎo)藥物包括視黃酸、煙酰胺或β_巰基乙醇、維生素Β12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羥基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤或胰島素。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞的方法包括:在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該調(diào)節(jié)包括:增加該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的活性。在另一實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)包括:增加該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該增加表達(dá)包括:增加編碼該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的mRNA的量，或者增加由mRNA翻譯而來(lái)的該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的量。在另一實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)包括:降低該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的活性。在另一實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)包括:減少該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該減少表達(dá)包括:減少編碼該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的mRNA的量，或者減少由mRNA翻譯而來(lái)的該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的量。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞的方法進(jìn)一步包括:誘導(dǎo)或促進(jìn)該干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞，其中該神經(jīng)元特性包括多巴胺、谷氨酸NMDA受體的亞基、突觸蛋白1、α-鈣離子通道標(biāo)記、GAP-43、電壓依賴的K+通道、電壓依賴的Ca+通道或電壓依賴的Na+通道的表達(dá)。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞的方法包括:在該干細(xì)胞中 用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)是NFAT0在另一實(shí)施方案中，NFAT被活化。在另一實(shí)施方案中，NFAT被去活化。在另一實(shí)施方案中，NFAT被活化，然后被去活化。在另一實(shí)施方案中，NFAT被去活化，然后被活化。在另一實(shí)施方案中，NFAT促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。在另一實(shí)施方案中，NFAT調(diào)節(jié)微管裝配。
[0044]此處還描述了誘導(dǎo)或促進(jìn)人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性或者可以抑制免疫反應(yīng)的tNSC (滋養(yǎng)層神經(jīng)干細(xì)胞)的方法，該方法包括:(a)使該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸；(b)在該干細(xì)胞中用該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3P、HDAC6、β _ 聯(lián)蛋白、G a q/11、G β、RXR α、RAR β、GLuRl、ΡΙ3Κ、AKt 1、AKt2、AKt3、mTOR、ELF4EBP、CREBl、TH (酪氨酸羥化酶)、PLC-β、ΡΙΡ2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、鈣依賴磷酸酶、CRMP-2、NFATU輸入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A或EP300 ;以及(c)誘導(dǎo)或促進(jìn)該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成tNSC ο
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)或促進(jìn)人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性或者可以抑制免疫反應(yīng)的tNSC(滋養(yǎng)層神經(jīng)干細(xì)胞)的方法包括:使該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸，其中該誘導(dǎo)藥物包括視黃酸、煙酰胺或β -巰基乙醇、維生素Β12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羥基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤或胰島素。在另一實(shí)施方案中，該tNSC不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，或者可以通過(guò)免疫細(xì)胞來(lái)抑制免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該免疫細(xì)胞是T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肥大細(xì)胞或NK細(xì)胞。
[0046]此處還描述了一種抑制腫瘤細(xì)胞的方法，其包括:使腫瘤細(xì)胞與化合物接觸；調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的芳基烴受體(AhR);以及通過(guò)調(diào)節(jié)來(lái)抑制該腫瘤細(xì)胞。另外，此處描述了減少腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括:使腫瘤細(xì)胞與治療劑接觸；調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的AhR ;以及通過(guò)調(diào)節(jié)來(lái)減少該腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)AhR包括抑制所述細(xì)胞中的AhR蛋白質(zhì)活性。在另一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)AhR包括抑制所述細(xì)胞中的AhR基因表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞被殺死。在另一實(shí)施方案中，腫瘤是肺、乳腺、結(jié)腸、腦、骨、肝、前列腺、胃、食管、皮膚或白血病腫瘤。在另一實(shí)施方案中，腫瘤是實(shí)體或液體腫瘤。在另一實(shí)施方案中，用AhR促效劑調(diào)節(jié)AhR。在另一實(shí)施方案中，用AhR拮抗劑調(diào)節(jié)AhR。在另一實(shí)施方案中，用具有抗雌激素活性的化合物調(diào)節(jié)AhR。在另一實(shí)施方案中，用具有抗雄激素活性的化合物調(diào)節(jié)AhR。在另一實(shí)施方案中，該腫瘤細(xì)胞存在于哺乳動(dòng)物中。在另一實(shí)施方案中，該腫瘤細(xì)胞存在于人類中。
援引并入
[0047]本說(shuō)明書中所提及的所有出版物和專利申請(qǐng)通過(guò)引用以同種程度并入本文，如同各個(gè)個(gè)別的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被特定地以及個(gè)別地指明通過(guò)引用而并入。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]本發(fā)明的新特征在隨附的權(quán)利要求中被詳細(xì)地描述。通過(guò)參考以下對(duì)在其中利用到本發(fā)明原理的說(shuō)明性實(shí)施方案加以闡述的詳細(xì)描述和附圖，可以獲得對(duì)本文所述的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好的理解，在附圖中:
[0049]圖1顯示hTS細(xì)胞中多能性(pluripotence)以及再生(renewal)的特性。(Ia)通過(guò)RT-PCR分析所測(cè)量的，hTS細(xì)胞表達(dá)內(nèi)細(xì)胞群(inner cell mass, I CM)與滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm)這兩者的特定基因。(Ib)說(shuō)明如通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法(immunocytochemical stainin`g)所看見的特異性階段胚胎抗原-1、_3 及-4[specificstage embryonic antigen (SSEA) -1, -3, and-4]的表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)定位(暗化的斑點(diǎn))。在hTS細(xì)胞中(上區(qū))，SSEA-1大部分在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(左上區(qū))，SSEA-3在核中表達(dá)(中間上面區(qū))，而SSEA-4在細(xì)胞質(zhì)以及膜這兩者中表達(dá)(右上區(qū))。這些SSEA-表達(dá)的細(xì)胞在組織學(xué)上與異位絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層(ectopic villous cytotrophoblasts)相同(下區(qū))。(Ic)通過(guò)末端限制片段 Southern 印跡分析[Terminal Restriction Fragment (TRF) Southernblot analysis]所測(cè)量的、第3與第7代hTS細(xì)胞培養(yǎng)物的未改變的端粒(telomere)長(zhǎng)度(上區(qū)及下區(qū))。(Id)文氏圖(Venn diagram)說(shuō)明在hTS (859基因)以及滋養(yǎng)層關(guān)聯(lián)性胎盤衍生的間質(zhì)干細(xì)胞(placenta derived mesenchymal stem cells,PDMS cells) (2449基因)中基因表達(dá)的微陣列分析(microarray analysis)?？倲?shù)為2, 140以及3, 730的基因在hTS細(xì)胞以及滋養(yǎng)層關(guān)聯(lián)性PDMS細(xì)胞中表達(dá)(倍數(shù)變化> 2倍)。(Ie)說(shuō)明來(lái)自于對(duì)不同濃度的白血病抑制因子(LIF)[即500、250、125U/ml ;U:單位/ml，肌動(dòng)蛋白(Actin):β -肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照樣品]反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析的結(jié)果。LIF的撤除在hTS細(xì)胞中抑制0ct4以及Sox2，但是過(guò)度表達(dá)Nanog以及Cdx2。(If)LIF(125U/ml)促進(jìn)hTS細(xì)胞中Nanog、Cdx2、Sox2以及0ct4的表達(dá)的流式細(xì)胞分析(左區(qū))。直方圖顯示在Nanog與Cdx2中負(fù)向劑量-依賴的方式(左區(qū))以及在0ct4與Sox2中正向劑量-依賴的方式(右區(qū))。(Ig)在婦女中輸卵管(fallopian tubes)的不同節(jié)段中LIF水平的生理學(xué)分布圖，特別是輸卵管中從壺腹(ampulla)朝向峽部(isthmus)的LIF水平的生理學(xué)降低。0ct4、Nanog以及Sox2相對(duì)于Cdx2的相對(duì)比例各自在輸卵管的3個(gè)不同節(jié)段中顯示劑量_依賴性(dose-dependency)。(Ih)不同的siRNAs對(duì)于hTS細(xì)胞中特定的轉(zhuǎn)錄物Nanog與Cdx2的效果通過(guò)RT-PCR(左邊)以及流式細(xì)胞分析(右邊)進(jìn)行分析，說(shuō)明了在hTS細(xì)胞的多能性的維持方面Nanog與Cdx2之間的交互關(guān)系。數(shù)據(jù)表示3次分析的平均值土SD。(Ii)基因強(qiáng)度的直方圖在hTS細(xì)胞中顯示均質(zhì)型，而在PDMS細(xì)胞中顯示二相的型態(tài)(biphasic pattern)。
[0050]圖2說(shuō)明視黃酸(RA)誘導(dǎo)hTS細(xì)胞分化成為各種不同的表型的神經(jīng)干細(xì)胞。(2a)各種不同的神經(jīng)祖細(xì)胞亞型(neural progenitor subtypes)的分布，包括神經(jīng)膠質(zhì)限制的前體細(xì)胞(glial restricted precursors, GRP)、神經(jīng)元限制的前體細(xì)胞(neuronal restricted precursors, NRP)、多倉(cāng)泛性神經(jīng)干(multipotent neural stem, MNS)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, AST)以及未定義的滋養(yǎng)層巨細(xì)胞(trophoblast giantcells, TGC)。在隨時(shí)間(例如，1、3、5及7天)的RA誘導(dǎo)期間以一致的比例所分布的hTS細(xì)胞衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞亞型的頻率，分別從第I至第4列顯示。η:表示被計(jì)數(shù)的總細(xì)胞數(shù)。(2b)在I天RA (10 μ Μ)誘導(dǎo)之前與之后hTS細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)的基因的表達(dá)的RT-PCR分析，包括由經(jīng)RA(IOyM)誘導(dǎo)的hTS細(xì)胞所生成的巢蛋白、Oct-4、神經(jīng)絲、Ngn3、Neo-D,MAP-2以及⑶133。(2c)如由流式細(xì)胞分析所觀察到的，3天和5天RA-誘導(dǎo)的hTS細(xì)胞這兩者表達(dá)陽(yáng)性的免疫反應(yīng)性神經(jīng)干細(xì)胞基因，包括神經(jīng)絲蛋白、巢蛋白以及GFAP，它們?cè)诜植忌暇S持相似的比例。(2d)該(神經(jīng)干細(xì)胞)tNSCs所表達(dá)的免疫反應(yīng)性巢蛋白、酪氨酸輕化酶-2(TH_2)以及5-輕色胺(serotonin)的免疫細(xì)胞化學(xué)分析(Immunocytochemicalanalysis)。(2e)通過(guò)流式細(xì)胞分析所進(jìn)行的hTS細(xì)胞、tNSCs以及hES(人類胚胎干)細(xì)胞中的免疫相關(guān)基因的比較性表 達(dá):HLA-ABC(MHC I型)在hTS細(xì)胞(99.4%)以及tNSCs中高度表達(dá)但是在hES細(xì)胞中較低。HLA-DR(MHC II型)在該細(xì)胞中不表達(dá)。(2f)通過(guò)流式細(xì)胞分析所進(jìn)行的hTS細(xì)胞、tNSCs以及hES細(xì)胞中的免疫相關(guān)基因的比較性表達(dá):在該細(xì)胞中CD14以及CD44的表達(dá)上未觀察到差異。增殖因子(Proliferative factor)⑶73在hTS細(xì)胞以及tNSCs中高度表達(dá)，但是在hES細(xì)胞中陰性表達(dá)。(2g)通過(guò)流式細(xì)胞分析所進(jìn)行的hTS細(xì)胞、tNSCs以及hES細(xì)胞中的免疫相關(guān)基因的比較性表達(dá):跨膜受體CD33 (transmembrane receptor CD33)在 hTS 以及 hES 細(xì)胞中表達(dá)但未在 tNSCs 中表達(dá)。⑶45在所述細(xì)胞中不表達(dá)。(2h)通過(guò)流式細(xì)胞分析所進(jìn)行的hTS細(xì)胞、tNSCs以及hES細(xì)胞中的免疫相關(guān)基因的比較性表達(dá):在hTS細(xì)胞、tNSCs以及hES中的間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記⑶105的表達(dá)上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)強(qiáng)度上的差異，然而，相較于hTS細(xì)胞(93.6%)以及hES細(xì)胞(98.8%)，較少的癌癥干細(xì)胞標(biāo)記⑶133 (11.8%)在tNSCs中表達(dá)。
[0051]圖3說(shuō)明RA-誘導(dǎo)的基因表達(dá)。(3a)說(shuō)明RA(10 μ Μ)在活化tNSCs中的c_Src/Stat3/Nanog途徑上的效果。通過(guò)RT-PCR分析所測(cè)定的(n=3), RA誘導(dǎo)c_Src的明顯的表達(dá)，波峰在第15分鐘之時(shí)，然后維持在較低的水平。(3b)通過(guò)Western印跡分析(western blot analysis),顯示RA在第30分鐘、第I小時(shí)、第2小時(shí)以及第4小時(shí)之時(shí)分別刺激RXRa、c-Src以及RARP表達(dá)。RA誘導(dǎo)在30分鐘內(nèi)促進(jìn)G a q/ΙΙ以及G β這兩者的表達(dá)，暗示G蛋白信號(hào)傳遞(G proteins signaling)的涉入。(3c)免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)分析證明RXRa以及RAR0之間經(jīng)RA誘導(dǎo)的直接結(jié)合；然而，此交互作用被C-Src抑制劑PPl類似物阻斷，顯示c-Src涉及RXRα與RAR0的結(jié)合以形成支架蛋白質(zhì)復(fù)合體(scaffolding protein complex)。(3d) IP測(cè)定分析顯示:RXR α具有與Ga q/ll的獨(dú)立的結(jié)合交互作用而RAR0具有與GP的獨(dú)立的結(jié)合交互作用。(3e)說(shuō)明在hTS中經(jīng)RA誘導(dǎo)的c-Src的早期生成、Stat3在Tyr705位點(diǎn)明顯的磷酸化以及Nanog在第I小時(shí)之時(shí)的活化的Western印跡分析；對(duì)照樣品使用β _肌動(dòng)蛋白。(3f)根據(jù)Western印跡分析,此c_Src蛋白質(zhì)的快速生成接著誘導(dǎo)Stat3在Tyr705位點(diǎn)的磷酸化以及Nanog的過(guò)度表達(dá)。根據(jù)Western印跡分析,c-Src抑制劑PPl類似物(4 μ Μ)抑制RA-誘導(dǎo)的Stat3在Tyr705的磷酸化以及Nanog的表達(dá)。添加RA不能回復(fù)這種抑制作用。(3g)說(shuō)明RA刺激Stat3與Nanog啟動(dòng)子的結(jié)合交互作用的染色質(zhì)免疫沉淀(chromatinimmunoprecipitation, ChIP)測(cè)定分析。輸入:裂解產(chǎn)物，C:對(duì)照。
[0052]圖4說(shuō)明雙免疫金突光透射電子顯微術(shù)(double immunogold fluorescencetransmission electron microscopy, IEM)分析結(jié)果。顯示了 RA-誘導(dǎo)的在細(xì)胞質(zhì)膜處小的金粒子標(biāo)記的RXR α (6 μ Μ)與大的金粒子標(biāo)記的G a q/11 (20 μ Μ)之間的結(jié)合交互作用。根據(jù)動(dòng)態(tài)共焦免疫突光顯微術(shù)(dynamic confocal immunofluorescence microscopy),經(jīng)免疫染色的RXRa以及Ga q/ΙΙ在細(xì)胞質(zhì)或核中主要呈現(xiàn)均質(zhì)特征(圖4，上區(qū))。通過(guò)RA處理5分鐘，細(xì)胞溶質(zhì)的RXR α強(qiáng)度在核周區(qū)域增加而核的強(qiáng)度減少(第I列)，顯示在刺激之后的細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)位(cytosolic translocation)。核的RXRa強(qiáng)度在第15分鐘時(shí)變得顯著，而細(xì)胞溶質(zhì)的強(qiáng)度減少。這些現(xiàn)象顯示:核中活性的增加維持細(xì)胞中的穩(wěn)定狀態(tài)。在30分鐘內(nèi)再次觀察到明顯的細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)位。另一方面，Ga q/ΙΙ表達(dá)的區(qū)隔變化與RXRa表達(dá)的區(qū)隔變化相似(第2列)。
[0053]圖5說(shuō)明將GFP-標(biāo)記的tNSCs (3X IO6)移植至帕金森氏癥(PD)大鼠中的分析。(5a)經(jīng)阿樸嗎啡(apomorphine)誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)測(cè)試(rotation test)的分析；a組(深色陰影的圓，n=4)，它是關(guān)于接受tNSC s移植的PD大鼠，顯示從植入后的第3周至第12周在對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)上顯著的減少；b組(淺色陰影的圓，n=4)，它是關(guān)于接受5天RA處理的hTS細(xì)胞的PD大鼠，顯示在植入后的第6周時(shí)最初的顯著改善，但是此改善在經(jīng)過(guò)第12周期間逐漸減少；以及c組(三角形，n=4)，它是關(guān)于作為對(duì)照組的未經(jīng)處理的H)大鼠，顯示沒(méi)有改善。通過(guò)重復(fù)測(cè)量ANOVA所進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:p值=0.001，以及在重復(fù)測(cè)量ANOVA之后的2組之間的LSD事后比較(LSD post hoc comparisons):在第6周時(shí)p=0.037 (a組對(duì)c組)以及ρ=0.008 (b組對(duì)c組)；在第9周時(shí)ρ=0.019 (a組對(duì)c組)；在第12周時(shí)ρ=0.005 (a組對(duì)c組)以及p=0.018 (a組對(duì)b組)。*表示P < 0.05。(5b)說(shuō)明在植入后的第18周時(shí)在a組的損傷的紋狀體(lesioned striatum)中的TH-陽(yáng)性免疫組織化學(xué)染色(上區(qū))；免疫熒光顯微鏡分析顯示:免疫熒光的GFP-標(biāo)記的tNSCs仍然存留在損傷的紋狀體中，在注射部位處具有斑點(diǎn)形成(下區(qū))。(5c)說(shuō)明在植入后的第18周時(shí)在a組的損傷的黑質(zhì)致密(substantia nigra compacta, SNC)中所再生的TH-陽(yáng)性神經(jīng)元(上區(qū));顯示了末端區(qū)域的放大(左下區(qū))，比例尺:100 μ M ;免疫熒光顯微鏡分析顯示:免疫熒光的GFP-標(biāo)記的tNSCs呈散射分布(scattered distribution)存留(右下區(qū)，箭頭表示GFP-標(biāo)記的tNSCs)。(5d)說(shuō)明在植入后的第18周時(shí)b組的免疫組織化學(xué)染色:沒(méi)有TH陽(yáng)性細(xì)胞在左邊損傷的紋狀體(str,上區(qū))或丘腦下核(subthalamic nucleus) (stn,下區(qū))中被發(fā)現(xiàn)。(5e)說(shuō)明在植入后的第18周時(shí)c組的免疫組織化學(xué)染色:沒(méi)有TH染色的細(xì)胞在左邊損傷的紋狀體(str，上區(qū))或損傷的SNC (下區(qū))中被發(fā)現(xiàn)；箭頭表示植入針軌跡。
[0054]圖6說(shuō)明在一個(gè)注射部位將tNSCs (1.5X IO6)移植到“老年(aged) ’TD大鼠(n=16 ；體重，630_490gm)的損傷的紋狀體中的結(jié)果。行為評(píng)估(Behavioral assessments)在植入后每3周進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:從植入后的第3周至第12周所評(píng)估的行為障礙(behavioralimpairments)有顯著的改善。Student t 檢驗(yàn)(Student t test):*p < 0.05 作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。**p < 0.01以及< 0.001。(6a)阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)測(cè)試的分析證明:與作為對(duì)照組的未經(jīng)處理的“老年"PD大鼠(i組；η=8，未經(jīng)填充的圓)相比，接受tNSCs植入的老年H)大鼠(ii組，n=8，經(jīng)填充的圓)從第3周至第12周顯著地改善了旋轉(zhuǎn)數(shù)。(6b)說(shuō)明有關(guān)運(yùn)動(dòng)失能癥(秒)的行為評(píng)估結(jié)果。^c)說(shuō)明有關(guān)步伐長(zhǎng)度(step length) (mm)的行為評(píng)估結(jié)果。(6d)說(shuō)明有關(guān)跨步長(zhǎng)度(stride length) (mm)的行為評(píng)估結(jié)果。(6e)說(shuō)明有關(guān)步行速度(walking speed) (cm/秒)的行為評(píng)估結(jié)果。(6f)說(shuō)明有關(guān)支撐的基礎(chǔ)(_)的行為評(píng)估結(jié)果。^g)說(shuō)明針對(duì)行為評(píng)估所分析的步態(tài):A與正常大鼠相關(guān)，B與在細(xì)胞移植之前的偏側(cè)帕金森氏癥大鼠(hemiparkinsonian rats)相關(guān),且C與在細(xì)胞移植之后的偏側(cè)帕金森氏癥大鼠相關(guān)。
[0055]圖7說(shuō)明在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)之后，hTS細(xì)胞表達(dá)全部3種原胚層(primary germlayers)的組分,包括外胚層(ectoderm)、中胚層(mesoderm)以及內(nèi)胚層(endoderm);各個(gè)區(qū)的左列是關(guān)于在誘導(dǎo)之前的基因表達(dá)；各個(gè)區(qū)的右列是關(guān)于在誘導(dǎo)之后的基因表達(dá)。
[0056]圖8說(shuō)明流式細(xì)胞分析結(jié)果，顯示hTS細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記[⑶90、⑶44、CK7、波形蛋白(Vimentin)以及神經(jīng)絲]并且對(duì)于造血干細(xì)胞標(biāo)記(hematopoietic stem cellmarkers) [CD34、CD45、 a 6-整合蛋白(a 6-1ntegrin)、E_ ?丐黏素(E-cadherin)以及 L-選擇素(L-selectin)]是陰性的。
[0057]圖9顯示在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)下，hTS細(xì)胞會(huì)被分化成為各種不同的特定的細(xì)胞表型(cell phenotypes)。
[0058]圖10說(shuō)明將hTS細(xì)胞皮下移植至雄性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(severe combinedimmune deficiency, SCID)小鼠中在植入后的第6_8周僅造成與類黏液樣奇異型細(xì)胞(myxoid-like bizarre cells)的輕微嵌合反應(yīng)(minor chimeric reaction)的組織學(xué)分析(histological analysis)(經(jīng)填充的、黑色的箭頭標(biāo)示奇異型細(xì)胞；未經(jīng)填充的箭頭標(biāo)示肌纖維；“NT”標(biāo)示針軌跡)。
[0059]圖11染色體分析顯示:hTS細(xì)胞不會(huì)改變核型的型態(tài)(46，XY)。為了檢查世代中的細(xì)胞壽命，根據(jù)Southern印跡分析，在第3與第7代培養(yǎng)物之間未觀察到端粒長(zhǎng)度的顯著縮短(圖1c)。
[0060]圖12說(shuō)明用于細(xì)胞分化的某些培養(yǎng)基。
[0061]圖13說(shuō)明用于RT-PCR的PCR引物。
[0062]圖14說(shuō)明AhR在細(xì)胞質(zhì)膜處作為信號(hào)分子的分析，包括通過(guò)Huh-7細(xì)胞中BBP(I μ M)的導(dǎo)入，在細(xì)胞質(zhì)膜處經(jīng)轉(zhuǎn)染的pGFP-Cl-AhR的活性。(14a)所顯示的圖像是通過(guò)TIRF顯微鏡分析所測(cè)量的GFP-標(biāo)記的AhR的相對(duì)強(qiáng)度的表達(dá)。圓以及箭頭表示隨著時(shí)間的推移所測(cè)量的區(qū)域:刺激前(第I區(qū))、波峰處(第2區(qū))以及靜止時(shí)(第3區(qū))。圖(第4區(qū))顯示在大約第2分鐘時(shí)發(fā)現(xiàn)峰值，以箭頭表示添加BBP的時(shí)間。(14b)對(duì)BBP有反應(yīng)的memAhR的定量RT-PCR分析顯示在第5分鐘時(shí)快速的上升，在第15分鐘時(shí)達(dá)到波峰，繼而在第2小時(shí)之時(shí)逐漸的下降至較低的平臺(tái)水平。誤差條(Error bars)表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation)。*, p < 0.05, t_ 檢驗(yàn)(n=3)。(14c)Western 印跡分析的分析顯示:BBP在第15分鐘時(shí)促進(jìn)AhR上升繼而在第30分鐘時(shí)輕微的下降并在第60分鐘時(shí)再上升。(14d)Western印跡分析的分析顯示:BBP在第30分鐘時(shí)誘導(dǎo)Ga q/11以及GP這兩者的生成。(He)免疫沉淀(IP)分析顯示在BBP刺激之后AhR與G a q/11之間的交互作用，字母C代表對(duì)照。(14f)通過(guò)Western印跡分析所測(cè)量的，由siRNA所造成的AhR的敲除證明:BBP抑制Huh-7細(xì)胞中AhR與G a q/11這兩者的表達(dá)，字母S代表作為陰性對(duì)照的混雜的SiRNA0 [0063]圖15說(shuō)明動(dòng)態(tài)免疫熒光成像的結(jié)果。(15a)說(shuō)明未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞的免疫染色；觀察到AhR以及Ga q/11主要在Huh-7細(xì)胞的核中表達(dá)并且微弱地在細(xì)胞溶質(zhì)中表達(dá)；帶狀比例尺(bar scale):50 μ M。(15b)用BBP (I μ Μ)處理5以及15分鐘的細(xì)胞各自顯示AhR與G a q/11這兩者從核至細(xì)胞溶質(zhì)隔室(cytosolic compartment)的轉(zhuǎn)位。經(jīng)免疫染色的G a q/11在第15分鐘時(shí)特異性地聚集在細(xì)胞膜處。(15c)用AhRsiRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞強(qiáng)烈地降低細(xì)胞溶質(zhì)與核的隔室這兩者中的AhR強(qiáng)度(上區(qū))，而用混雜的siRNA轉(zhuǎn)染不會(huì)改變免疫染色強(qiáng)度(下區(qū))。(15d)BBP在15分鐘之后回復(fù)具有預(yù)轉(zhuǎn)染的AhR siRNA的細(xì)胞中AhR與6%/11這兩者的強(qiáng)度。
[0064]圖16說(shuō)明雙免疫金透射電子顯微鏡分析的結(jié)果。(16a)免疫金染色的G a q/11 (白色箭頭)會(huì)在作為對(duì)照的Huh-7細(xì)胞中的細(xì)胞膜處作為單一的或雙重的或三重的實(shí)體存在。(16b)在第20分鐘時(shí)，經(jīng)BBP (I μ Μ)處理的細(xì)胞顯示免疫金標(biāo)記的AhR粒子(呈6nm的大小，黑色箭頭)與免疫金標(biāo)記的Gaqm粒子(呈20nm的大小，白色箭頭)的交互作用，其形成復(fù)合體，在細(xì)胞膜處作為不同的實(shí)體出現(xiàn):單體的(monomeric)(未顯示)、二聚體的(dimeric)(未顯示)、三聚體的(trimeric)(左邊)以及聚合的(polymeric)(右邊)實(shí)體。(16c)在細(xì)胞膜處所出現(xiàn)的AhR以及Ga q/11的三聚復(fù)合體。CM:細(xì)胞膜，N:核，以及帶狀比例尺:500nm。
[0065]圖17說(shuō)明“拉與推”機(jī)制以及生化過(guò)程。(17a)說(shuō)明在Huh-7細(xì)胞中對(duì)BBP處理有反應(yīng)的Ga q/11信號(hào)級(jí)聯(lián)(signaling cascades)的測(cè)量。Western印跡分析顯示:BBP (I μ Μ)在第30分鐘時(shí)觸發(fā)G a q/11與G β這兩者的生成。經(jīng)活化的G a q/11導(dǎo)致PIP2減少，造成IP3R水平增加。(17b)說(shuō)明對(duì)免疫突光的Fluo-4-標(biāo)記的鈣(immunofIuorescentFluo-4-labled calcium)在Huh_7細(xì)胞中的反應(yīng)性的分析。顯示的是未經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞(左上區(qū))以及Fluo-4-標(biāo)記的鈣(綠色，左下區(qū))。還顯示了在ΒΒΡ(1 μ M)刺激(箭頭)之后在BSS培養(yǎng)基(中上區(qū))以及無(wú)鈣培養(yǎng)基(中下區(qū))中的相對(duì)鈣水平的變化。培養(yǎng)在具有預(yù)處理的IP3R抑制劑2-ΑΡΒ(100μΜ，1小時(shí))的無(wú)鈣培養(yǎng)基中的細(xì)胞(右上區(qū))顯示在鈣密集上的減少(右上區(qū))，它以劑量反應(yīng)方式(dose-response manner)發(fā)生(y=-0.4x+2.5, R2=0.94)(右下區(qū))。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)。(17c) Western印跡分析的結(jié)果指示:用2-APB (30 μ Μ，I小時(shí))預(yù)處理抑制了經(jīng)BBP誘導(dǎo)的C0X-2表達(dá)，字母C表示對(duì)照。(17d)說(shuō)明Western印跡分析的結(jié)果，顯示BBP (I μ M)經(jīng)由AhR/Ca2+/ERK/C0X-2途徑誘導(dǎo)C0X-2的過(guò)度生產(chǎn)。ERKI/2在BBP處理之后第15分鐘時(shí)被磷酸化并在第30分鐘時(shí)被去磷酸化。(17e)說(shuō)明Western印跡分析的結(jié)果，顯示用化學(xué)品Η)98059 (20 μ M，I小時(shí)，Calciochem)預(yù)處理抑制了經(jīng)BBP誘導(dǎo)的C0X-2表達(dá)，字母C表示對(duì)照。(17f)說(shuō)明用ΒΒΡ(1 μ Μ)進(jìn)行處理顯著地抑制了 ARNT水平(隔夜所測(cè)量的)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SD, η=3,且*:Student 1:檢驗(yàn),口<0.01。(17g)說(shuō)明“拉與推”機(jī)制的示意圖，該機(jī)制構(gòu)成經(jīng)由GPCRs-G蛋白信號(hào)傳遞的配體誘導(dǎo)的非基因組AhR信號(hào)傳遞途徑的基礎(chǔ)。
[0066]圖18說(shuō)明LIF對(duì)Nanog表達(dá)的效果。(18a)說(shuō)明LIF促進(jìn)Nanog的表達(dá)。左區(qū)說(shuō)明:根據(jù)hTS細(xì)胞中的流式細(xì)胞分析，Nanog表達(dá)是以負(fù)向劑量依賴的方式而顯著地被抑制。數(shù)據(jù)表示為3次分析的平均值土SD。*p < 0.01 (Student t檢驗(yàn)，n=3)。右區(qū)說(shuō)明當(dāng)hTS細(xì)胞與RA(IOyM)預(yù)孵育過(guò)夜接著用不同水平(B卩，各125、250以及500U/mL)的LIF處理I天時(shí)的相對(duì)Nanog表達(dá)。(18b)說(shuō)明根據(jù)流式細(xì)胞分析，RA誘導(dǎo)(I天孵育，10 μ Μ)在hTS細(xì)胞中刺激Nanog以及0ct4的表達(dá)，但不刺激Cdx2以及Sox2的表達(dá)。
[0067]圖19說(shuō)明在老年的H)大鼠中對(duì)行為改善的評(píng)估。(19a)說(shuō)明在植入后第12周時(shí)對(duì)一系列的腦部切片(30 μ m)上的TH+神經(jīng)元進(jìn)行的免疫組織化學(xué)顯示:大量重新再生的TH-陽(yáng)性神經(jīng)元出現(xiàn)在損傷的黑質(zhì)紋狀體途徑中(左邊部分)。在SNC區(qū)域中，TH-陽(yáng)性神經(jīng)元呈現(xiàn)具有從細(xì)胞體中突起的多重外生(multiple outgrowths)以與宿主組織一起形成神經(jīng)元回路(neuronal circuitries)的特征。在一只大鼠中的再生的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目占相對(duì)的正常側(cè)的28.2%(n=5)。(19b)與正常側(cè)相比，大鼠的損傷的SNC中多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目再生至28.2%。
[0068]圖20: (20a)說(shuō)明通過(guò)RT-PCR測(cè)得的ICM與滋養(yǎng)外胚層(TE)這兩者的特定基因的表達(dá)；(20b)說(shuō)明用FlB-GFP質(zhì)粒構(gòu)建體的DNA混合物轉(zhuǎn)染hTS細(xì)胞以產(chǎn)生超過(guò)95%的成功率；(20c)說(shuō)明經(jīng)RA誘導(dǎo)的eIF4B的生成的時(shí)程；(20d)說(shuō)明使用eIF4B抑制了 c_Src的活化；(20e)說(shuō)明IP分析顯示:活性的c-Src直接結(jié)合至Stat3 (信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白);(20f)說(shuō)明 c-Src siRN A 抑制 Stat3 的表達(dá)；(20g)說(shuō)明 Stat3siRNA 抑制 Nanog 的表達(dá)；以及(20h)說(shuō)明在hTS細(xì)胞中經(jīng)由亞細(xì)胞c-Src mRNA定位的RA-誘導(dǎo)的c-Src/Stat3/Nanog途徑的方案。
[0069]圖21說(shuō)明Ga q/11信號(hào)傳遞途徑的活化:(21a)說(shuō)明通過(guò)Western印跡法，在RA處理(10 μ M)之后Gaqm途徑相關(guān)的組分隨著時(shí)間的表達(dá)；(21b)說(shuō)明在被培養(yǎng)在無(wú)鈣培養(yǎng)基中并且在RA處理之前20分鐘用配于BSS緩沖液中的Fluo4(l μ Μ)預(yù)裝填的hTS細(xì)胞中的實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像顯微鏡分析(real-time live cell imaging microscopy)(Cell-Rsystem, Olympus, Tokyo)。(a) RA-誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣的消耗通過(guò)以SOCE型態(tài)添加CaCl2 (2mM)而被回復(fù)。(b) RA-誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣水平被2-APB (10分鐘)以顯著的劑量依賴的方式抑制(R2=0.8984)。(c)在ER鈣的消耗之后，KCl (60mM)能夠激活L-型鈣離子通道(L-type calcium channels)。(d)在ER 鈣消耗之后，KCl-依賴的L-型鈣離子通道被抑制劑硝苯地平(nifedipine) (5 μ Μ)阻斷。η:被計(jì)數(shù)的總細(xì)胞；(21c)說(shuō)明CaMKII直接與CREBl以及eIF4B交互作用；(21d)說(shuō)明通過(guò)Western印跡法，eIF4B siRNA抑制CaMKI1、鈣依賴磷酸酶以及eIF4B的表達(dá)；(21e)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，KN93 (I μ M，2小時(shí))抑制eIF4B表達(dá)；(21f)說(shuō)明帕金蛋白直接與CaMKII以及MAPT交互作用；(21g)說(shuō)明SNCA直接與MAPT交互作用；(21h)說(shuō)明MAPT與GSK3P以及α-微管蛋白(a-tubulin)交互作用；(21i)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，2-APB抑制鈣依賴磷酸酶、NFATl以及MEF2A的表達(dá)；(21 j)說(shuō)明輸入蛋白與NFATl之間的直接交互作用；(21k)說(shuō)明根據(jù)分離分析(fractionalassay), RA刺激NFATl核轉(zhuǎn)位(nuclear translocation)。核纖層蛋白A/C:核的標(biāo)記以及α-微管蛋白:細(xì)胞質(zhì)的標(biāo)記；(211)說(shuō)明Akt2直接與GSK3i3交互作用；(21m)說(shuō)明在動(dòng)態(tài)變化中使用不同抗體所顯示的，用RA處理4小時(shí)(空白的柱)和24小時(shí)(黑色的柱)的細(xì)胞中GSK30表達(dá)的流式分析(flow analysis)。數(shù)據(jù)顯示平均值土SD,n=3 ； (21η)說(shuō)明流式細(xì)胞分析顯示Akt2siRNA抑制RA-誘導(dǎo)的GSK3 β表達(dá)。
[0070]圖22說(shuō)明轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(transcriptional complex)的形成:(22a)說(shuō)明β -聯(lián)蛋白與LEFl之間(上面)以及LEFl與Pitx2之間的交互作用；(22b)說(shuō)明通過(guò)RA處理(4小時(shí)),LEFl轉(zhuǎn)錄基因Pitx2而不轉(zhuǎn)錄基因Pitx3 ； (22c)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法,MEF2A直接與NFATl、MEF2A、Pitx2、SNCA以及EP300交互作用；(22d)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，RA誘導(dǎo)MEF2A、EP300以及Pitx2隨著時(shí)間的生成；(22e)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，NFATlsiRNA抑制MEF2A的表達(dá)；(22f)說(shuō)明CREBl靶向在MEF2A基因的啟動(dòng)子處；(22g)說(shuō)明MEF2A轉(zhuǎn)錄基因SNCA(上面)、TH(中間)以及MEF2A本身(下面)；(22h)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，MEF2A siRNA 抑制 EP300、Pitx2 以及 MEF2A 的表達(dá)；(22i)說(shuō)明 EP300 靶向在 HDAC6 (上面)以及TH(下面)基因的啟動(dòng)子處；(22j)說(shuō)明通過(guò)Western印跡法，在第4小時(shí)以及第24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)各種不同的分子活性的鑒定?？s寫，IP:免疫沉淀分析；ChIP:染色質(zhì)免疫沉淀分析。
[0071]圖23說(shuō)明在hTS細(xì)胞中RA-誘導(dǎo)的神經(jīng)生成(neurogenesis)的調(diào)節(jié)網(wǎng)路示意圖(上區(qū))。2種mRNA翻譯的機(jī)制:帽蓋依賴的(cap-dependent)(左下)和不依賴帽蓋的(cap-1ndependent)(右下)?；疑木€:時(shí)空信號(hào)傳遞途徑；黑色的線:轉(zhuǎn)錄途徑；雙向的箭頭:分子連接至其它途徑。
[0072]圖24說(shuō)明RA信號(hào)傳遞促進(jìn)Wnt2B/Fzd6/i3-聯(lián)蛋白途徑:(24a)說(shuō)明流式細(xì)胞分析顯示:通過(guò)經(jīng)預(yù)處理的fct2B siRNA的抑制作用過(guò)夜所證明，RA(IOyM)顯著地誘導(dǎo)Wnt2B、Dvl3以及FRATl的活化但是抑制GSK3 β。數(shù)據(jù)顯示平均值土SD ；n=3 ； (24b)說(shuō)明由RART-PCR所造成的增加的Fzd6mRNA表`達(dá)。數(shù)據(jù)顯示平均值土SD ;n=3，*:通過(guò)Student檢驗(yàn)p<0.05 ； (24c)說(shuō)明通過(guò)Western印跡法，RA誘導(dǎo)β -聯(lián)蛋白以及HDAC6的表達(dá)隨著時(shí)間的改變；(24d)說(shuō)明IP分析顯示--與RA過(guò)夜孵育所造成的HDAC6與β -聯(lián)蛋白之間的物理交互作用；(24e)說(shuō)明在過(guò)夜孵育之后,根據(jù)分離測(cè)定(fractionation assay), RA誘導(dǎo)β_聯(lián)蛋白的核/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。核纖層蛋白以及α-微管蛋白分別作為核的以及細(xì)胞質(zhì)的標(biāo)記；(24f)說(shuō)明共焦免疫熒光顯微術(shù)顯示:RA-誘導(dǎo)的β -聯(lián)蛋白以及HDAC6的動(dòng)態(tài)變化顯示β -聯(lián)蛋白在第30分鐘時(shí)的核轉(zhuǎn)位，它被HDAC6siRNA抑制；(24g)說(shuō)明細(xì)狀的β -聯(lián)蛋白在RA處理的第5分鐘出現(xiàn)在突觸區(qū)域中(箭頭)。
[0073]圖25說(shuō)明共焦免疫熒光顯微鏡分析。在對(duì)抗HDAC6的siRNA的存在下，β -聯(lián)蛋白的核定位被阻斷。
[0074]圖26說(shuō)明在細(xì)胞膜處的分子事件:(26a)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，RA誘導(dǎo)Gaq/11> , RXRa以及RARi3隨著時(shí)間的生成。β _肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照；(26b)說(shuō)明實(shí)時(shí)共焦免疫熒光顯微鏡分析，顯示代表性GFP標(biāo)記的RXRa在RA刺激之后的第0、4.5及13分鐘從核周區(qū)域朝向細(xì)胞膜(箭頭)的移動(dòng)。在核中沒(méi)有RXRa是可見的。正常相差(左上)和熒光圖像(右上)。條(Bar)表示30 μ M ; (26c)說(shuō)明相對(duì)定量的GFP標(biāo)記的RXR α在時(shí)程上從核(N)至細(xì)胞膜(M)的強(qiáng)度上的動(dòng)態(tài)移動(dòng)與變化。正常相差以及熒光成像顯示在右上處；(26d)說(shuō)明代表性成像顯示RA在第5分鐘時(shí)所造成的RXR α以及G a q/11在細(xì)胞膜處的共表達(dá)；(26e)說(shuō)明在RA處理20分鐘之后在細(xì)胞膜處所觀察到的雙免疫金標(biāo)記的RXR α (6 μ M ;黑色箭頭)以及G a q/11 (20 μ M ；白色箭頭)。N:核；(26f)說(shuō)明RXR a siRNA抑制RA-誘導(dǎo)的G a q/11與RXR α的交互作用(24小時(shí))；(26g)說(shuō)明RAR β siRNA抑制RA-誘導(dǎo)的與RARii的交互作用以及Gβ與ΡΙ3Κ的交互作用(24小時(shí))。IP:免疫沉淀分析；IgG:陰性對(duì)照；C:陽(yáng)性對(duì)照；(26h)說(shuō)明IP測(cè)定分析顯示:選擇性c-Src抑制劑PPl類似物能夠防止RXRa-RARP異型二聚物(heterodimer)的形成；(26i)說(shuō)明通過(guò)雙免疫金透射電子顯微術(shù)所觀察到的RA-誘導(dǎo)的 金粒子標(biāo)記的RXRa在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的錨定(anchorage)。
[0075]圖27說(shuō)明通過(guò)RT-PCR，RA刺激典型Wnt2B途徑；在hTS細(xì)胞中處理(10 μ M)過(guò)夜之后，RA誘導(dǎo)Wnt2B信號(hào)傳遞途徑的組分的表達(dá)，顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的結(jié)果；在過(guò)夜處理之后，Wnt2B siRNA抑制RA-誘導(dǎo)的Wnt2B途徑的組分。
[0076]圖28說(shuō)明RXRa以及RAR^的局部合成:(28a)說(shuō)明通過(guò)RT-PCR，RA(IOyM)在第15分鐘時(shí)快速地誘導(dǎo)RXRa mRNA與RARP mRNA這兩者的短暫上升。數(shù)據(jù)顯示平均值土 SD, n=3, t檢驗(yàn)*:p < 0.05 ； (28b)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，RA誘導(dǎo)PI3K以及Akt異構(gòu)型(isoforms)隨著時(shí)間的表達(dá)；(28c)說(shuō)明根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)，PI3K抑制劑124005抑制RA-誘導(dǎo)的Akt異構(gòu)型(24小時(shí))。數(shù)據(jù)顯示平均值土SD,n=3 ; (28d)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，Akt3與mTOR交互作用，但是被Akt3siRNA抑制；(28e)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，RA誘導(dǎo)mTOR的暫時(shí)性表達(dá)；(28f)說(shuō)明Akt3siRNA抑制RA-誘導(dǎo)的mTOR的磷酸化；(28g)說(shuō)明mTOR直接與4EBP1交互作用(4小時(shí))；(28h)說(shuō)明通過(guò)Western印跡法，對(duì)使用或未使用mTOR siRNA或4EBPlsiRNA預(yù)孵育的、用RA處理(4小時(shí))的hTS細(xì)胞進(jìn)行mT0R、4EBPl、eIF4E以及eIF4B的表達(dá)分析；(28i)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，eIF4E siRNA抑制RA-誘導(dǎo)的RXRa與Gaqm之間(上面)以及RARi^與Gi3之間(下面)的交互作用(4小時(shí))。
[0077]圖29: (29a)說(shuō)明通過(guò)RT_PCR，PI3K抑制劑在hTS細(xì)胞中過(guò)夜處理之后抑制RA-誘導(dǎo)的Akt異構(gòu)型Aktl、2以及3的表達(dá)；(29b)通過(guò)RT-PCR，Akt2抑制劑抑制β-聯(lián)蛋白mRNA的表達(dá)；(29c)根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)，Akt3siRNA抑制mTOR的表達(dá)。
[0078]圖30說(shuō)明CREBl促進(jìn)TH的轉(zhuǎn)錄:(30a)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，CREBl直接與Aktl以及β -聯(lián)蛋白交互作用；(30b)說(shuō)明AktlsiRNA抑制CREBl的表達(dá)。β -肌動(dòng)蛋白:對(duì)照；(30c)說(shuō)明CREBl靶向在TH基因的啟動(dòng)子處；(30d)說(shuō)明根據(jù)Western印跡法，CREBlsiRNA抑制TH的表達(dá)；(30e)說(shuō)明免疫熒光組織分析顯示在tNSCs植入H)大鼠腦后的第12周在治療的SNC側(cè)中的DA神經(jīng)元(白色箭頭)中TH-FITC(藍(lán)色)以及TH_Cy-3 (紅色)的共表達(dá)(右區(qū))。在正常側(cè)中(左上)以及在治療側(cè)中(左下)的經(jīng)放大的DA神經(jīng)元。在核中發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性CERBl染色；(30f)說(shuō)明直方圖顯示DA神經(jīng)元中所表達(dá)的TH以及CREBl在正常(左邊；n=86)以及治療側(cè)(右邊；n=114)中的相對(duì)平均強(qiáng)度。誤差條:平均值土SD ；η:被計(jì)數(shù)的總細(xì)胞；p < 0.05:統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
[0079]圖31說(shuō)明免疫組織突光分析(immunohistofluoresence analysis):對(duì)照組的SNC中TH(+)以及NeuN (+)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(motor neurons)(箭頭)(左上)。在6_0HDA損傷之后第I周減少的TH(+)(箭頭)(右上)。在損傷后的第6周隨著TH-陽(yáng)性的神經(jīng)末梢的擾亂，在TH(+)神經(jīng)元上明顯的減少(綠色顆粒)，以及各種不同的退化性空腔形成(紅色爆炸性圓)(左下)。在移植之后，在退化性空腔的壁處(紅色爆炸性圓；插圖)的TH(+)神經(jīng)元(箭頭)帶有突出至空腔(右下)中的TH(+)神經(jīng)末梢(綠色)。
[0080]圖32說(shuō)明具有較少免疫反應(yīng)的TH(+)以及GFAP(+)細(xì)胞的體內(nèi)(in vivo)再生:(32a)說(shuō)明在損傷后的第I與第6周時(shí)TH (+)細(xì)胞的數(shù)目分別減少為在損傷的SNC (深灰色)中的48%和13%以及在損傷的紋狀體(淺灰色)中的78%和4%。在移植之后，TH(+)細(xì)胞在損傷的SNC以及紋狀體中分別重新成長(zhǎng)至67%以及73%(右區(qū))。數(shù)據(jù)通過(guò)Tissuequest2.0 軟件(TissueGnostics Gmbh, Vienna, Austria)進(jìn)行分析；(32b)說(shuō)明在損傷的SNC(Tg)中(顯示放大圖(左上，插圖a))與無(wú)損傷側(cè)(右上，插圖b)相比的多巴胺能神經(jīng)元的再生；(32c)說(shuō)明相較于無(wú)損傷側(cè)，在第12周時(shí)tNSCs的移植在損傷的SNC中的TH陽(yáng)性神經(jīng)元(箭頭)上產(chǎn)生78.4±8.3%(平均值土SEM ;n=4)的復(fù)原率；(32d)說(shuō)明在損傷后的第6周時(shí)在損傷的紋狀體中TH-FITC(+)以及GFAP-Cy-3(+)Wilson束(Wilson’spencils)(空白箭頭)的退化(左列)。在植入后的第12周(右列)，數(shù)個(gè)GFAP(+)細(xì)胞(箭頭)出現(xiàn)在重新建立的Wilson束(空白箭頭)的細(xì)纖維(fine fibers)內(nèi)；(32e)說(shuō)明免疫組織熒光成像分析，在由細(xì)胞大小(8-10 μ m的直徑)的位置及其對(duì)應(yīng)的GFAP-Cy-3強(qiáng)度所決定的門(gate)(左邊的散布圖)中的細(xì)胞被計(jì)數(shù)。門(紅色散布圖):被計(jì)數(shù)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(glial cells);黑色散布圖:排除具有異常大小的細(xì)胞；藍(lán)色散布圖:具有異常GFAP強(qiáng)度的細(xì)胞。在紋狀體中，相較于無(wú)損傷側(cè)，在損傷側(cè)中的GFAP(+)細(xì)胞在處理之前是65.5%，而在細(xì)胞治療之后變成93.9%(右邊的區(qū))；(32f)說(shuō)明hTS細(xì)胞植入至SCID小鼠中僅引起輕微免疫反應(yīng)并且未觀察到腫瘤形成(tumorigenesis)。類黏液樣奇異型細(xì)胞(黑色箭頭)，肌纖維(空白箭頭)以及針軌跡(NT)。
[0081]圖33說(shuō)明通過(guò)在慢性H)大鼠中的免疫組織熒光散布圖所測(cè)量的，利用TH-FITC與NeuN-Cy-3之間的決定系數(shù)(coefficient of determination),在細(xì)胞治療之前以及之后SNC中的TH(+)細(xì)胞的鑒定。(33左上)說(shuō)明正常的SNC =R2=0.72 ； (33右上)說(shuō)明通過(guò)
6-0HDA損傷所造成的SNC (I周):R2=0.77 ； (33左下)說(shuō)明通過(guò)6-0HDA損傷所造成的SNC (6周)=R2=0.25 ； (33右下)在tNSCs移植之后的SNC(12周)=R2=0.66。被顯示的結(jié)果代表2只大鼠的平均值。
【具體實(shí)施方式】
[0082]神經(jīng)組織衍生的干細(xì)胞(Neural tissue-derived stem cells)、衍生自多能胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESC)的表型特化的祖細(xì)胞(phenotype-specifiedprogenitor cells)以及衍生自各種不同的經(jīng)轉(zhuǎn)分化的非神經(jīng)干細(xì)胞(transdifferentiated non-neural stem cells)的神經(jīng)細(xì)胞已全部在針對(duì)它們生成神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)(glia)的能力的臨床前研究中得到探討，并且神經(jīng)干細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中的用途已被描述。雖然胚胎干(ES)細(xì)胞已顯示作為細(xì)胞治療劑(cell therapeutics)的可能性(Bjorklund, L.Μ.等人.Proc.Nat.Acad.Sc1.2002, 99, 2344-49)，但使用所述治療是受限的并且與倫理關(guān)懷(ethical concerns)有關(guān)聯(lián)。
[0083]干細(xì)胞具有自我更新(self-renewal)以及生成定向祖細(xì)胞(committedprogenitors)(包括神經(jīng)干細(xì)胞)的能力(Reubinoff B.E.等人，Nat.Biotech.2001, 19，1134-1140)。[0084]此處提供了衍生自滋養(yǎng)層組織的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞。此處進(jìn)一步提供了在細(xì)胞培養(yǎng)中是穩(wěn)健的且存活數(shù)代并且還具有多能性(pluripotency)以及免疫豁免(immuneprivilege)的特性的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞(tNSCs)。在此處所描述的一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種用于從衍生自人類滋養(yǎng)層干(hTS)細(xì)胞的tNSCs誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的方法。此處進(jìn)一步提供了容許經(jīng)移植的tNSCs能存活并且生長(zhǎng)成為多巴胺能神經(jīng)元的方法，以及用于評(píng)估受損的行為的復(fù)原以達(dá)到與目前的治療方案相比具有降低的變異性的結(jié)果的方法。
[0085]此處還提供了衍生自hTS細(xì)胞的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，該hTS細(xì)胞沒(méi)有使用小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞(mouse embryonic feeder cells)進(jìn)行培養(yǎng)，以防止可疑的污染。此處提供了用于有效率地且可再現(xiàn)地生成hTS細(xì)胞衍生的tNSCs的方法，該方法導(dǎo)致產(chǎn)生均勻混合的族群的子集合，可區(qū)別于其它用于從其它來(lái)源的細(xì)胞誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的方法。此處提供了用于將多巴胺能tNSCs以細(xì)胞懸浮液(cell suspension)移植至腦內(nèi)的方法,從而防止與組織移植物有關(guān)聯(lián)的不均勻的生長(zhǎng)。
[0086]此處提供了用誘導(dǎo)藥物來(lái)調(diào)節(jié)干細(xì)胞以分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)該干細(xì)胞中的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該一種或多種蛋白質(zhì)中的一種是Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATU GSK3 β、HDAC6、β -聯(lián)蛋白、Ga q/11、、RXRa、RAR^、GLuRU PI3K、AKtU AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREBl、TH (酪氨酸羥化酶)、PLC- β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、鈣依賴磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、輸入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A*EP300。在一個(gè)實(shí)施方案中，該干細(xì)胞可以是滋養(yǎng)層、胚胎的或經(jīng)誘導(dǎo)的祖干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞是NSC、多巴胺生成細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、單極神經(jīng)元、雙極神經(jīng)元、多極神經(jīng)元、錐體細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞以及前角細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、貝茨細(xì)胞、閏紹細(xì)胞、顆粒細(xì)胞或中等棘細(xì)胞。
[0087]此處還提供了用誘導(dǎo)藥物來(lái)調(diào)節(jié)干細(xì)胞以分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)藥物調(diào)節(jié)該干細(xì)胞中的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該一種或多種蛋白質(zhì)中的一種是Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATU GSK3 β、HDAC6、β -聯(lián)蛋白、Ga q/11、Gβ、RXRa、RARβ、GLuRl、ΡΙ3Κ、AKtU AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨 酸羥化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、鈣依賴磷酸酶、CRMP-2、NFATl、輸入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A或EP300。在一個(gè)實(shí)施方案中，該干細(xì)胞可以是滋養(yǎng)層、胚胎的或經(jīng)誘導(dǎo)的祖干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該具有降低的免疫原性的細(xì)胞不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，或者可以通過(guò)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肥大細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞來(lái)抑制免疫反應(yīng)。
人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞(hTS細(xì)胞)
[0088]人類輸卵管是婦女中受精的部位以及異位妊娠(ectopic pregnancies)的常見部位，其中有數(shù)種生物事件發(fā)生，諸如內(nèi)細(xì)胞群(ICM)與滋養(yǎng)外胚層之間的區(qū)別化以及具有主要的表觀遺傳改變(epigenetic changes)的從全能性(totipotency)轉(zhuǎn)換至多能性。這些觀察提供有關(guān)輸卵管在著床前的階段作為用于獲得囊胚關(guān)聯(lián)性干細(xì)胞(blastocyst-associated stem cells)的棲位儲(chǔ)存處(niche reservoir)的支持。異位妊娠在工業(yè)化國(guó)家中占全部懷孕的1%至2%，并且在發(fā)展中國(guó)家中高更多。鑒于在人類胚胎干細(xì)胞(hES細(xì)胞)以及胎腦組織(fetal brain tissue)的可利用性上的不足,此處描述了來(lái)源于異位妊娠的人類滋養(yǎng)層細(xì)胞(hTS細(xì)胞)作為針對(duì)幾乎不可利用的hES細(xì)胞的替代物以供生成祖細(xì)胞的用途。
[0089]在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)源于異位妊娠的人類滋養(yǎng)層細(xì)胞不涉及人類胚胎的破壞。在另一實(shí)施方案中，來(lái)源于異位妊娠的人類滋養(yǎng)層細(xì)胞不涉及活的人類胚胎的破壞。在另一實(shí)施方案中，該人類滋養(yǎng)層細(xì)胞衍生自與不存活的異位妊娠有關(guān)聯(lián)的滋養(yǎng)層組織。在另一實(shí)施方案中，該異位妊娠不能被挽救。在另一實(shí)施方案中，該異位妊娠將不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生活的人類胚胎。在另一實(shí)施方案中，該異位妊娠威脅母親的生命。在另一實(shí)施方案中，該異位妊娠是輸卵管的(tubal)、腹部的(abdominal)、卵巢的(ovarian)或子宮頸的(cervical)。
[0090]在囊胚發(fā)育期間，ICM本身接觸，或其衍生的可擴(kuò)散的“誘導(dǎo)物(inducer)”會(huì)引起在極性滋養(yǎng)外胚層中的高速率的細(xì)胞增殖(cell proliferation),而導(dǎo)致在整個(gè)囊胚期朝向壁區(qū)域(mural region)的細(xì)胞移動(dòng),并且甚至在ICM與滋養(yǎng)外胚層區(qū)別化之后可能會(huì)持續(xù)。覆蓋ICM的壁滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞能夠保留ICM的“細(xì)胞記憶(cell memory)”。通常地，在著床的起始階段，在ICM對(duì)面的壁細(xì)胞由于來(lái)自子宮內(nèi)膜(uterine endometrium)的機(jī)械性限制而停止分裂。然而，沒(méi)有此類限制存在于輸卵管中，這致使極性滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞持續(xù)分裂而在異位妊娠的停滯的囊胚中形成胚外外胚層(extraembryonic ectoderm,ExE)。在一個(gè)實(shí)施方案中，ExE-衍生的TS細(xì)胞呈增殖狀態(tài)存在至少4天的時(shí)間，這取決于ICM分泌的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF4)與它的受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (Fgfr2)的相互作用。在另一實(shí)施方案中，ExE衍生的TS細(xì)胞呈增殖狀態(tài)存在至少I天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天的時(shí)間。直到臨床介入發(fā)生，這些細(xì)胞過(guò)程可能在著床前的胚胎中產(chǎn)生無(wú)限數(shù)目的hTS細(xì)胞；此類細(xì)胞保留來(lái)自于ICM的細(xì)胞記憶，這通過(guò)ICM相關(guān)基因的表達(dá)而反映出來(lái)。
[0091]此處所描述的一個(gè)方面是在子宮著床之前的hTS細(xì)胞以及絨毛膜細(xì)胞滋養(yǎng)層(chorionic cytotrophoblasts)。在一個(gè)實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞具有內(nèi)細(xì)胞群(ICM) (0ct4、Nanog、Sox2、FGF4)與滋養(yǎng)外胚層(Cdx2、Fgfr_2、Eomes、BMP4)這兩者的特定基因(圖1a)并且表達(dá)全部3種原胚層的組分(圖7)。在另一實(shí)施方案中，所述hTS細(xì)胞表達(dá)hES細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)記，諸如特異性階段胚胎抗原(SSEA)-l、-3與_4(圖1b)以及間質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記(⑶44、⑶90、CK7以及波形蛋白)，而造血干細(xì)胞標(biāo)記(⑶34、⑶45、α 6-整合蛋白、E-鈣黏素以及L-選擇素)沒(méi)有表達(dá)(圖8)。在一個(gè)實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞可依據(jù)誘導(dǎo)而分化成為3種原胚層的各種不同的特定細(xì)胞表型(圖9)。將hTS細(xì)胞皮下移植至雄性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中在植入后的6-8周僅造成組織學(xué)上輕微的嵌合反應(yīng)(圖10)。在一個(gè)實(shí)施方案中，染色體分析顯示hTS細(xì)胞不會(huì)改變核型的型態(tài)(46，XY)(圖11)。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞壽命在培養(yǎng)介于第3代與第7代之間的端粒長(zhǎng)度上沒(méi)有被顯著地縮短(圖1c)。
[0092]此處所提供的一個(gè)方面是使用AffymetrixTM平臺(tái)以詢問(wèn)GeneChip Human GenomeU133plus2.0GeneChip有關(guān)hTS細(xì)胞與PDMS細(xì)胞之間的總體基因比較，來(lái)描述hTS細(xì)胞與胎盤衍生的間質(zhì)干(PDMS)細(xì)胞之間的區(qū)別。在一個(gè)實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞展現(xiàn)出要比在PDMS細(xì)胞中的基因表達(dá)少大約10%、大約15%、大約20%、大約25%、大約30%、大約35%、大約40%、大約45%、大約50%、大約55%、大約60%、大約65%、大約70%或大約75%的基因表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞展現(xiàn)出總數(shù)為2，140個(gè)的基因(倍數(shù)變化> 2倍)，它要比PDMS細(xì)胞所展現(xiàn)的(3，730個(gè)基因)少大約40%(圖1d)。在一個(gè)實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞的基因強(qiáng)度分布展現(xiàn)出與PDMS細(xì)胞中的基因強(qiáng)度分布有區(qū)別的均質(zhì)型(homogenous pattern)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞代表在著床前的階段的細(xì)胞滋養(yǎng)層的特殊群組，從而使得它們具有內(nèi)細(xì)胞群(ICM)和/或滋養(yǎng)外胚層的分子肖像(molecular portraits) ?在另一實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞展現(xiàn)與hES細(xì)胞相似的多能性及自我更新的特性。
LIF的撤除調(diào)控Nanog在hTS細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)
[0093]在人類中，細(xì)胞滋養(yǎng)層是融合細(xì)胞滋養(yǎng)層(syncytiotrophoblasts)的前 體(Benirschke,K.,Kaufmann,P.1n Pathology of the humanplacenta, 39_51Spring-Verlag New York Inc.，1990)。當(dāng)胚胎是?？芭?morula)時(shí)，滋養(yǎng)層特化的區(qū)域被建立，這反映在該區(qū)域的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子的特殊組合以及各種不同的環(huán)境信號(hào)和生長(zhǎng)因子對(duì)它們的影響。
[0094]許多證據(jù)指出早期外胚層以及真實(shí)ES細(xì)胞的原始多能性(naive pluripotency)取決于 3 個(gè)轉(zhuǎn)錄組成體(transcriptional organizers) (0ct4、性別決定區(qū) Y_box(Sox2)以及 Nanog)的作用(Chambers 1.等人，Oncogene, 23:7150 - 7160 (2004) ; Niwa H.Development，134:635 - 646(2007))。ES細(xì)胞經(jīng)由具有不同的信號(hào)傳遞途徑以及轉(zhuǎn)錄因子[包括白血病抑制因子(LIF)、Nanog、Sox2以及八聚物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子3和4(0ct3/4)]的復(fù)雜相互作用來(lái)維持多能性。轉(zhuǎn)錄因子Nanog在維持小鼠以及人類ES細(xì)胞的多能性上扮演關(guān)鍵角色，而LIF與0ct4以及Nanog協(xié)調(diào)地作用，以支持多能性以及自我更新(Cavaleri，F(xiàn).等人.Cellll3, 551-552(2003))ο
[0095]LIF[ 一種白 介素_6型細(xì)胞因子(interleukin_6class cytokine)]會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)以及分化。LIF結(jié)合至白血病抑制因子受體α (LIFR-α)，后者與膜糖蛋白130(GP130)共同受體形成異型二聚物受體復(fù)合體(heterodimeric receptor complex)。LIF的結(jié)合導(dǎo)致janus激酶(JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)信號(hào)傳遞途徑以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的活化。LIF通常被表達(dá)于發(fā)育中的胚胎的滋養(yǎng)外胚層中。LIF被認(rèn)為在維持未經(jīng)分化的狀態(tài)上發(fā)揮作用。從干細(xì)胞培養(yǎng)物中移除LIF通常會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)的干細(xì)胞的分化。LIF也會(huì)影響Nanog(—種已知在干細(xì)胞維持上發(fā)揮重要作用的基因)的表達(dá)。
[0096]多效性細(xì)胞因子一白血病抑制因子(LIF)通常在輸卵管中要比在子宮內(nèi)膜中以更高的濃度表達(dá)，這顯示從壺腹至峽部節(jié)段(isthmic segment)的梯度降低(圖1g)。而在異位妊娠中，LIF水平可能在輸卵管中會(huì)增加2至4倍(W&nggren, K.等人，Mol.Hum.R印rod.2007，13，391-397)。LIF在功能上能整合其它信號(hào)以活化多能轉(zhuǎn)錄因子(例如，0ct4以及Nanog)，以維持小鼠胚胎干(mES)細(xì)胞中的多能性以及自我更新。在撤除LIF時(shí)，細(xì)胞增殖持續(xù)但是尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子Cdx2 (caudal-related homeobox transcriptionfactor Cdx2)被活化，從而在胚胎干(ES)細(xì)胞中引起滋養(yǎng)外胚層分化。
[0097]在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種用來(lái)確定hTS細(xì)胞如何維持多能性以及自我更新的特性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，在hTS細(xì)胞中檢測(cè)到LIF與多能轉(zhuǎn)錄因子[例如，在 Smith，A.G.等人，Nature336, 688-690 (1998) ;Wi I liams, R.L.等人，Nature336, 684-687，(1998) ；Cavaleri, F.等人，Cel1113，551-552 (2003)；Chambers 1.等人，Cell, 2003; 113:643 - 655 ;Boiani, L.Α.等人，Nature Rev.Mol.CellBiol.6, 872-884 (2005)中所描述的因子]的締合。[0098]hTS細(xì)胞是從在妊娠的第5-8周已蒙受輸卵管異位妊娠的婦女體內(nèi)獲得的，并且被視為細(xì)胞滋養(yǎng)層的特殊群體，具有ICM衍生的人類胚胎干(hES)細(xì)胞以及滋養(yǎng)外胚層的特定基因標(biāo)記(例如，在Adjaye，J.等人，Stem Cells, 2005，23，1514-1525中所描述的標(biāo)記)(圖1a)。
[0099]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了一種通過(guò)調(diào)節(jié)所述細(xì)胞對(duì)LIF的暴露來(lái)影響hTS細(xì)胞分化的方法。例如，hTS細(xì)胞被分為3組并且被暴露于不同濃度的LIF。在一個(gè)實(shí)施方案中，LIF的濃度是大約1000、大約750、大約600、大約550、大約525、大約500、大約450、大約400、大約350、大約300、大約250、大約200、大約150、大約125、大約100、大約75、大約50或大約25單位/mL。在另一實(shí)施方案中，LIF的濃度是500、250以及125單位/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，LIF的濃度是500單位/mL。在另一實(shí)施方案中，LIF的濃度是250單位/mL。在另一實(shí)施方案中，LIF的濃度是125單位/mL。
[0100]在一個(gè)實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞暴露于不同濃度的LIF歷時(shí)1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 天。在另一實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞暴露于不同濃度的LIF歷時(shí)3、6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、
108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240 或 252 小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞暴露于不同濃度的LIF大約I至30、大約I至28、大約I至26、大約I至24、大約I至22、大約I至20、大約I至18、大約I至15、大約I至13、大約I至10、大約I至9、大約I至8、大約I至7、大約I至6、大約I至5、大約I至4或大約I至2天。在另一實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞暴露于不同濃度的LIF歷時(shí)3天。
[0101]此處所描述的一個(gè)方面是較低濃度的LIF會(huì)改變某些基因的表達(dá)，這些基因包括但不限于:0ct4、Sox2、Cdx2和Nanog。另一實(shí)施方案通過(guò)RT-PCR證明:LIF的撤除和/或較低濃度的LIF會(huì)抑制0ct4以及Sox2表達(dá)，并且相反地,會(huì)促進(jìn)Cdx2以及Nanog (圖1e)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些現(xiàn)象通過(guò)流式細(xì)胞分析進(jìn)一步得到確認(rèn)，其顯示0ct4以及Sox2的抑制是呈劑量依賴的方式(圖1f)。`
[0102]在另一實(shí)施方案中，0ct4/Cdx2的相對(duì)表達(dá)比例暗示在早期胚胎分化中的細(xì)胞命運(yùn)(cell fate)。在另一實(shí)施方案中，LIF暴露的撤除和/或減少導(dǎo)致0ct4的表達(dá)減少。在另一實(shí)施方案中，LIF暴露的撤除和/或減少以劑量依賴的方式促進(jìn)Cdx2、Nanog以及Sox2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這與定量PCR (qPCR)分析是一致的。
[0103]此處所描述的另一個(gè)方面是，在hTS細(xì)胞中位于壺腹的高0ct4/Cdx2比例朝向峽部節(jié)段的梯度降低(圖1g)與輸卵管中LIF水平的趨勢(shì)是相容的，從而暗示細(xì)胞命運(yùn)選擇趨向hES細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)的Nanog/Cdx2比例的上調(diào)(2倍)進(jìn)一步執(zhí)行細(xì)胞中的多能性。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)的Nanog/CdX2比例的上調(diào)(2倍)維持hTS細(xì)胞中的多能性。在另一實(shí)施方案中，有關(guān)hTS細(xì)胞的S0x2/Cdx2表達(dá)比例不會(huì)改變以維持多能性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Cdx2過(guò)度表達(dá)有利于hTS細(xì)胞維持滋養(yǎng)層的表型。
[0104]此處所描述的一個(gè)實(shí)施方案是一種用以檢測(cè)hTS細(xì)胞中Nanog與Cdx2之間的關(guān)系的方法。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)使用siRNA所造成的Nanog以及Cdx2這兩者的敲除研究分別促進(jìn)Wx2以及Nanog表達(dá)(圖1h),這支持了在hTS細(xì)胞中Nanog與Cdx2之間的相互關(guān)系類似于在ES細(xì)胞中0ct4與Cdx2對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)選擇所具有的相互關(guān)系(Niwa，H.等人，Celll23, 917-929)。在另一實(shí)施方案中，Nanog的過(guò)度表達(dá)與升高的Nanog/Cdx2比例相結(jié)合來(lái)補(bǔ)償降低的Oct4/Cdx2比例并且足以維持在hTS細(xì)胞中決定細(xì)胞分化命運(yùn)的多能
性和/或更新。
[0105]此處所描述的一個(gè)方面顯示:在LIF撤除時(shí)的Nanog的過(guò)度表達(dá)是至少一個(gè)在維持hTS細(xì)胞的多能性上發(fā)揮作用的因素。
視黃酸(RA)以及相關(guān)的途徑
[0106]視黃酸(RA)(—種維生素A的衍生物)在ES細(xì)胞的分化以及胚胎形成(embryogenesis)上發(fā)揮作用。在ES細(xì)胞中，RA通過(guò)結(jié)合至它的核受體并且誘導(dǎo)特定革巴基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮作用，以生成數(shù)種不同的細(xì)胞類型。在一個(gè)實(shí)施方案中，以RA誘導(dǎo)能夠使hTS細(xì)胞衍生的tNSCs維持具有特定圖式形成的穩(wěn)定地未分化的狀態(tài)。
[0107]在一個(gè)實(shí)施方案中，用全反式視黃酸(RA)處理hTS細(xì)胞會(huì)生成適合用于植入到大鼠疾病模型(例如，帕金森氏癥模型)中的神經(jīng)干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，在hTS細(xì)胞中LIF暴露的撤除和/或減少會(huì)調(diào)控Nanog (它負(fù)責(zé)hTS細(xì)胞的多能性以及自我更新的維持)的過(guò)度表達(dá)。此處還描述了允許經(jīng)RA誘導(dǎo)的hTS細(xì)胞分化成為神經(jīng)干細(xì)胞的某些分子途徑，包括在可逆的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)和Wnt信號(hào)傳遞途徑的相互作用(cross-talk)以及觸發(fā)靶基因Pitx2以供神經(jīng)干細(xì)胞形成上發(fā)揮作用的途徑。因此，一個(gè)實(shí)施方案描述RA相關(guān)的途徑的調(diào)節(jié)子用于由hTS細(xì)胞生成神經(jīng)干細(xì)胞的用途。
RA誘導(dǎo)NSC亞型的一致復(fù)合體
[0108]在一個(gè)實(shí)施方案中`，hTS細(xì)胞被誘導(dǎo)以生成神經(jīng)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該hTS細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)劑或用誘導(dǎo)劑進(jìn)行處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)劑包括，但不限于:視黃酸、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblast growth factor)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白(neurotrophins)(例如，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3),和/或它們的組合。額外的示范性誘導(dǎo)劑包括，但不限于:促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,ΕΡ0)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、無(wú)翅型 MMTV整合位點(diǎn)(Wnt)蛋白質(zhì)(例如，fct3a)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a (transforming growth factoralpha, TGF α )、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β (transforming growth factor beta, TGFP )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)(包括T3以及T4型這兩者)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)、甲狀腺釋放激素(thyroid releasinghormone, TRH)、刺猬蛋白(hedgehog proteins)[例如，音猬因子(sonic hedgehog)]、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor, F1DGF)、環(huán) AMP (cyclic AMP)、垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多妝(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、生長(zhǎng)激素(growth hormone,GH)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors, IGFs)(例如,IGF-1)、生長(zhǎng)素釋放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)、》必字L素(prolactin, PRL)、》必字L素釋放妝(prolactin releasing peptide, PRP)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growthfactor, FGF)、雌激素(estrogen)、5_ 輕色胺、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、促性腺素釋放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)、粒細(xì)胞-巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、人類絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)、信息素(pheromones){例如，2_ 仲丁基-4, 5- 二氧喔唑(2-sec-butyl_4, 5-dihydrothiazole)、2，3_ 去氧-西部松小蠹集合信息素(2，3-dehydro-exo-brevicomin)、α與β金合歡烯(alpha andbeta farnesenes)、6-羥基 _6_ 甲基 _3_ 庚酮(6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone)、2-庚酮(2-heptanone)、反 _5_ 庚烯 _2_ 酮(trans-5-hepten-2_one)、反-4-庚烯-2-酮(trans-4-hepten-2-one)、乙酸正戍酯(n-pentyl acetate)、順 _2_ 戍烯-1-基-乙酸酯(cis-2-penten-l-yl-acetate)、2，5_ 二甲基批嗪(2, 5-dimethyIpyrazine)、丙酸十二燒酯(dodecyl propionate)以及(Z) _7_ 十二烯-1-基乙酸酯[(Z) -7-dodecen-l-ylacetate]}，和/或它們的組合。在另一實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)劑是具有天然誘導(dǎo)劑的活性的類似物或變異體。
[0109]作為非限制性實(shí)例，視黃酸被用來(lái)化學(xué)地誘導(dǎo)hTS細(xì)胞。多效性因子全反式視黃酸(RA)經(jīng)由多重途徑而在神經(jīng)分化(neural differentiation)、圖式形成(patterning)以及運(yùn)動(dòng)軸突外生(motor axon outgrowth)上發(fā)揮體內(nèi)功能,所述多重途徑包括,但不限于:ES細(xì)胞中的RA/RARs/RXRs信號(hào)傳遞、Wnt信號(hào)傳遞以及ERK途徑(Maden, M.Nat.Rev.Neuroscience8, 755-765 (2007), Lu J 等人，BMC Cell Biol.2009, 10:57, Wichterle H 等A, Cell.2002; 110:385-397)。在 mES 細(xì)胞(Wichterle H 等人，Cell.2002; 110:385-397)、hES 細(xì)胞(Li，L.等人.Stem Cells22，448-456 (2004))以及成人神經(jīng)生成(Jacobs S 等K , Proc Natl Acad Sci2006, 103(10):3902-7)中，RA 誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶(TH)(多巴胺能神經(jīng)元的特征酶)的表達(dá)以及軸突形成(neurite formation)。
[0110]在一個(gè)實(shí)施方案中 ，描述了一種用于確定經(jīng)RA處理的hTS細(xì)胞的命運(yùn)的方法。在另一實(shí)施方案中，用 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25、30、35、40、
45、50、55、60或65μΜ的RA處理hTS細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，用大約0.5_75、大約1_65、大約1-60、大約1-50、大約1-55、大約1-50、大約1_40、大約1_35、大約1_30、大約1_25、大約1-20、大約1-15、大約1-13、大約1-10、大約2-10、大約5-10或大約8-10 μ M的RA處理hTS細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，用10μ M的RA處理hTS細(xì)胞。
[0111]在一個(gè)實(shí)施方案中，該於5細(xì)胞暴露于狀歷時(shí)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)3、
6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或252小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)大約I至20、大約I至18、大約I至15、大約I至13、大約I至10、大約I至9、大約I至8、大約I至7、大約I至6、大約I至5、大約I至4或大約I至2天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞各自暴露于RA歷時(shí)下列不同的持續(xù)時(shí)間:1、2、3、4、5、6、7或8天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)I天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)2天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)3天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)4天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)5天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)6天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)7天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于RA歷時(shí)8天。
[0112]在一個(gè)實(shí)施方案中，RA誘導(dǎo)hTS細(xì)胞分化成各種不同表型的神經(jīng)細(xì)胞，其包括，但不限于:神經(jīng)膠質(zhì)限制的前體細(xì)胞(GRP)、神經(jīng)元限制的前體細(xì)胞(NRP)、多能性神經(jīng)干(MNS)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)以及未定義的滋養(yǎng)層巨細(xì)胞(TGC)，它們免疫細(xì)胞化學(xué)地表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記巢蛋白(圖2a)。在另一實(shí)施方案中，在I至5天的RA誘導(dǎo)期內(nèi)，在經(jīng)混合的RA-誘導(dǎo)的神經(jīng)祖細(xì)胞的分布上產(chǎn)生相似的比例。在另一實(shí)施方案中，在7天的RA處理期間，細(xì)胞分化變?yōu)槲炊x的滋養(yǎng)層巨細(xì)胞。
[0113]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了衍生自hTS細(xì)胞的經(jīng)RA-誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該 RA 誘導(dǎo)期是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、25、30、35 或 40 天。在另一實(shí)施方案中，該 RA 誘導(dǎo)期是 3、6、12、18、24、30、36、
48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或252 小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是大約1至20、大約1至18、大約1至15、大約1至13、大約1至10、大約1至9、大約1至8、大約1至7、大約1至6、大約1至5、大約1至4或大約1至2天。在一個(gè)實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是大約1天至大約7天。在另一實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是1天。在另一實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是2天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是3天。在另一實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是4天。在一個(gè)實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是5天。在一個(gè)實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是6天。在另一實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是7天。在另一實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是24小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是12小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該RA誘導(dǎo)期是1小時(shí)至24小時(shí)。
[0114]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處描述了表達(dá)至少一種神經(jīng)干細(xì)胞基因和標(biāo)記的tNSC。在另一實(shí)施方案中，該tNSC表達(dá)至少2種、至少3種、至少4種或至少5種神經(jīng)干細(xì)胞基因。在另一實(shí)施方案中，該tNSC表達(dá)至少2種、至少3種、至少4種或至少5種神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記。神經(jīng)干細(xì)胞基因和標(biāo)記的非限制性實(shí)例包括:巢蛋白、神經(jīng)絲、Ngn-3、MAP-2、Neo-D,⑶133以及0ct4(圖2b)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該tNSCs也表達(dá)RA受體基因(其包括，但不限于:RAR^ ,RXRa以及RXR^ )、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白(CRABP)_2、細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBP)-1以及特別地，被發(fā)現(xiàn)不存在于ES細(xì)胞中的RA合成酶RALDH-2以及RALDH-3。
[0115]因此，一個(gè)實(shí)施方案描述表達(dá)的神經(jīng)干細(xì)胞基因和標(biāo)記[包括巢蛋白、神經(jīng)絲、Ngn-3、MAP-2、Neo-D、CD133 和 0ct4、RA 受體基因(諸如 RAR@ ,RXRa 以及 RXR β )、CRABP_2、CRBP-1、RA合成酶RALDH-2和RALDH-3等，和/或它們的調(diào)節(jié)子]用以促進(jìn)tNSCs的分化能力的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，3天與5天RA-誘導(dǎo)的hTS細(xì)胞都以相似的比例維持神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記，包括巢蛋白、GFAP以及神經(jīng)絲蛋白(圖2c)。在另一實(shí)施方案中，這些tNSCs免疫細(xì)胞化學(xué)地表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)以及5-羥色胺(5-HT)(圖2d)，這暗示它們分化成多巴胺能神經(jīng)元以及5-羥色胺能神經(jīng)元的能力。此處所描述的另一實(shí)施方案是將tNSCs分化成多巴胺能神經(jīng)元以及5-羥色胺能神經(jīng)元。
[0116]此處進(jìn)一步提供了由一致地混合的神經(jīng)上皮祖細(xì)胞(neuroepithelialprogenitor cells)[在細(xì)胞培養(yǎng)期間能在遺傳上以及表型上以穩(wěn)定狀態(tài)(steady-state)維持]所構(gòu)成的tNSCs。這種在產(chǎn)物上的一致性對(duì)于任何包含以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療的治療方案(treatment regimen)是一種理想的特性。
就Nanog表達(dá)而言LIF與RA之間的關(guān)聯(lián)性
[0117]在早期胚胎發(fā)育中，tNSCs典型地表達(dá)RALDH-2。此處所描述的一個(gè)實(shí)施方案是一種用以評(píng)估在hTS細(xì)胞中LIF如何影響RA-誘導(dǎo)的神經(jīng)生成的方法。LIF在小鼠ES (mES)細(xì)胞中抑制RA-誘導(dǎo)的神經(jīng)元分化的能力使得移植更為困難(Martin-1biWez R等人，J.Neuron.Res.85，2686-2710(2007) ;Bain G 等人，Dev Bioll68:342_357)。其它報(bào)道主張LIF在ES細(xì)胞分化成神經(jīng)元上的積極作用(Trop印e V, Neuron 2001,30:65-78)。
[0118]在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種用于評(píng)估hTS細(xì)胞中就Nanog表達(dá)而言LIF與RA之間的關(guān)聯(lián)性的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，tNSCs用LIF處理并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)而進(jìn)行Nanog表達(dá)的測(cè)量(圖18a)。在一個(gè)實(shí)施方案中，tNSCs用大約1000、大約750、大約600、大約550、大約525、大約500、大約450、大約400、大約350、大約300、大約250、大約200、大約150、大約125、大約100、大約75、大約50或大約25單位/mL的LIF處理。在另一實(shí)施方案中，tNSCs 用 1-1000、1-500、1-450、1-400、1-350、1-300、1-250、1-200、1-150、1-125、1-100、1-75或1-50單位/mL的LIF處理。在另一實(shí)施方案中，tNSCs用500、250和/或125單位/mL的LIF處理。 [0119]在一個(gè)實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于LIF歷時(shí)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于LIF過(guò)夜。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于LIF歷時(shí)
3、6、12、15、18、22、24、30、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或252小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，hTS細(xì)胞暴露于LIF歷時(shí)大約I至20、大約I至18、大約I至15、大約I至13、大約I至10、大約I至9、大約I至8、大約I至7、大約I至6、大約I至5、大約I至4或大約I至2天。
[0120]在一個(gè)實(shí)施方案中，用RA處理hTS細(xì)胞誘導(dǎo)Nanog過(guò)度表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，LIF以劑量依賴的方式抑制RA-誘導(dǎo)的Nanog。在另一實(shí)施方案中，LIF對(duì)tNSC發(fā)育發(fā)揮抑制作用。
[0121]此處所描述的一個(gè)方面是在ES細(xì)胞的神經(jīng)分化上LIF與RA相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，LIF影響RA對(duì)hTS細(xì)胞中的多能性的效果。結(jié)果顯示:在hTS細(xì)胞中，RA誘導(dǎo)Nanog以及0ct4的過(guò)度表現(xiàn),但不誘導(dǎo)Cdx2以及Sox2的過(guò)度表達(dá)(圖18b)。在腦的峽部區(qū)域中，觀察到Nanog表達(dá)在LIF-誘導(dǎo)的細(xì)胞中為62.5% (圖1f，左區(qū)和右區(qū))，但在RA-誘導(dǎo)的細(xì)胞中僅為26.9%(圖18b)。還觀察到:較高水平的LIF通常抑制RA-誘導(dǎo)的Nanog并且LIF的撤除顯著地增強(qiáng)RA-誘導(dǎo)的Nanog表達(dá)(圖18a)。這些結(jié)果暗示hTS細(xì)胞朝向峽部移動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA通過(guò)Nanog表達(dá)維持細(xì)胞多能性。
[0122]在一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)RA富集的微環(huán)境(RA-enriched microenviroment)中植入tNSCs促進(jìn)體內(nèi)干細(xì)胞的連續(xù)增殖。在另一實(shí)施方案中，tNSCs被植入至腦內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，tNSCs被植入或被注射至海馬(hippocampus)、大腦皮質(zhì)(cerebralcortex)、紋狀體、間隔(septum)、間腦(diencephalon)、中腦(mesencephalon)、后腦(hindbrain)或脊髓基底神經(jīng)節(jié)(spinal cord basal ganglia)內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，tNSCs被植入至腦的紋狀體內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，tNSCs被植入或被注射至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的任何部位內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，tNSCs被植入或被注射至在特定的神經(jīng)退化性障礙中退化的細(xì)胞的神經(jīng)末梢區(qū)域內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，tNSCs被植入或被注射至中腦(midbrain)中的黑質(zhì)致密部?jī)?nèi)。在另一實(shí)施方案中，tNSCs被植入或被注射至前腦(forebrain)中的神經(jīng)末梢區(qū)域內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，tNSCs被植入或被注射至腦室系統(tǒng)(ventricular system)內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，tNSCs被植入或注射至側(cè)腦室(lateralventricle)內(nèi)。在維持tNSCs中的多能性(multipotency)上的G蛋白信號(hào)傳遞
[0123]此處描述的另一個(gè)方面是一種用以研究tNSCs如何維持它們的多能性狀態(tài)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA在大約第15分鐘時(shí)誘導(dǎo)c-Src mRNA表達(dá)波峰(圖3a)。此處所描述的另一實(shí)施方案是基于RA刺激的RXRa、c-Src以及RARP表達(dá)通過(guò)Western印跡分析來(lái)評(píng)估GPCR信號(hào)傳遞途徑(圖3b)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA在30分鐘內(nèi)促進(jìn)G a q/11和
這兩者表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，免疫沉淀(IP)分析法的分析證明:RA誘導(dǎo)RXRa與RARP之間的直接結(jié)合；然而，此種交互作用被c-Src抑制劑PPl類似物阻斷,這表示c-Src參與到RXRa與RARii之間以形成支架蛋白質(zhì)復(fù)合體(圖3c)。
[0124]通過(guò)免疫沉淀(IP)分析(圖3d)，我們獨(dú)立地觀察到RXRa展現(xiàn)出與Gaq/11的結(jié)合交互作用，而RARP顯示與GP的結(jié)合交互作用。這些結(jié)果與GPCR-G蛋白信號(hào)傳遞的“拉與推(pull and push) ” 模型一致(Tsai 等人，“The ubiquitin ligasegp78promotes sarcoma metastasis by targeting KAIIfor degradation.Nat.Med.13，1504-1509，(2007))。
[0125]在一個(gè)實(shí)施方案中，RARs與RXRs的異型二聚物對(duì)(heterodimeric pair)發(fā)揮核中的配體活化的轉(zhuǎn)錄因子(ligand-activated transcription factors)以及內(nèi)源性細(xì)胞表面信號(hào)分子(endogenous cell surface signal molecules)的作用。組成型活化的RXRa破壞受體構(gòu)型并且募集C-Src以與所締合的Gaq/11交互作用和/或活化所締合的Gaq/11。在一種情況下，這種非基因組RA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)助解釋非視黃酸反應(yīng)兀件(retinoic acid-response element, RARE)調(diào)控的基因表達(dá)(Maden, M.，Nat.Rev.Neuroscience8, 755-765(2007))。
[0126]因此，此處提供了用于防止在移植此處所提供的神經(jīng)干細(xì)胞之前以及之后的細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)的策略。一個(gè)實(shí)施方案描述調(diào)節(jié)RA相關(guān)的途徑從而防止和/或減少和/或緩和過(guò)度生長(zhǎng)和/或移植物排斥(gr aft rejection)的試劑的用途。
原癌基因酪氨酸蛋白激酶(Src)以及Nanog
[0127]c-Src維持ES細(xì)胞處于未分化的狀態(tài)(Anner6n C.等人，J BiolChem.279，590-598 (2004)) Janog和Stat3協(xié)同地結(jié)合以活化Stat3依賴的啟動(dòng)子(TorresJ.等人，Nat Cell Biol.10，194-201 (2008))。在一個(gè)實(shí)施方案中，c_Src誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(Stat3)在Tyr705位點(diǎn)的磷酸化,并且此作用被c-Src抑制劑蛋白磷酸酶I (PP-1)類似物阻斷，從而連結(jié)了 C-Src與Stat3分子之間的關(guān)聯(lián)性(圖3f)。在另一實(shí)施方案中，Stat3直接作用于Nanog啟動(dòng)子(圖3g)。在另一實(shí)施方案中，Stat3不直接作用于Nanog啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，RXRa直接作用于Nanog啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，RXRa未直接作用于Nanog啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，RARP直接作用于Nanog啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，RARP不直接作用于Nanog啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，RA在hTS細(xì)胞中誘導(dǎo)c-Src、pStat3(圖3e)以及Nanog(圖le)的過(guò)度表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，RXR α以及RARP這兩者經(jīng)由GPCR-G蛋白信號(hào)傳遞響應(yīng)于RA發(fā)揮轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
[0128]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處描述了一種用以在tNSCs中維持多能性的方法，該方法包括活化c_Src/Stat3/Nanog轉(zhuǎn)錄途徑。在另一實(shí)施方案中，c_Src與Ga q/11的交互作用活化c_Src/Stat3/Nanog途徑。為了進(jìn)一步通過(guò)成像研究證實(shí)RXR α與G a q/11之間的直接交互作用，使用雙免疫金熒光透射電子顯微術(shù)(IEM)。RA誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜(plasma membrane)處小的金粒子標(biāo)記的RXRa (6μΜ)與大的金粒子標(biāo)記的Gaqm (20 μ Μ)之間的結(jié)合交互作用(圖4)。根據(jù)動(dòng)態(tài)共焦免疫熒光顯微術(shù)，經(jīng)免疫染色的RXR α與Gaq/11這兩者主要地呈均質(zhì)特征出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)或核中(圖4)。通過(guò)用RA處理5分鐘，細(xì)胞溶質(zhì)RXR α強(qiáng)度在核周區(qū)域處增加而核RXRa強(qiáng)度降低(圖4，第I列)，這表示在刺激之后的細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)位。在第15分鐘時(shí)，核RXRa強(qiáng)度變得顯著，而細(xì)胞溶質(zhì)RXRa強(qiáng)度降低(圖3a)。
[0129] 在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞核中的活性增加在細(xì)胞中維持穩(wěn)定狀態(tài)。在30分鐘內(nèi)再次觀察到明顯的細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)位。另一方面，Gaq/11表達(dá)的區(qū)隔變化類似于RXRa表達(dá)的區(qū)隔變化(圖4，第2列)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在刺激之后的第30分鐘，在細(xì)胞膜處觀察到Gaqm的明顯聚集。在另一實(shí)施方案中，RA能夠促進(jìn)RXRα與Gaq/11這兩者在hTS細(xì)胞中的組成性合成以及轉(zhuǎn)位。
[0130]因此，此處提供了 RA在細(xì)胞質(zhì)膜處經(jīng)由G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)-G蛋白信號(hào)傳遞而作用于hTS細(xì)胞(這與基因組RA/RXRs/RARs途徑是可區(qū)別的)以供生成tNSCs的用途。如此處所顯示的，RA在使hTS細(xì)胞分化成為tNSCs方面是經(jīng)由Nanog和0ct4，而非Cdx2和Sox2途徑來(lái)發(fā)揮作用的。此處還提供了 RA-誘導(dǎo)的Nanog活化在維持tNSCs中的多能性以及自我更新方面的用途。此處提供了 G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)-G蛋白信號(hào)傳遞的RA活化以及伴隨的RXRa /Ga q/ll/c-SrC/Stat3/Nanog途徑活化在維持tNSCs中的多能性方面的用途。此處提供了 RXRa和RARii的異型二聚物在細(xì)胞質(zhì)膜處作為信號(hào)分子發(fā)揮功能以維持tNSCs中的多能性的用途。此處還提供了 RA通過(guò)Nanog的過(guò)度表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)hTS細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)以維持多能性以及再生的用途。
[0131]此處所描述的tNSCs表達(dá)幫助神經(jīng)生成的視黃醛脫氫酶(RALDH)-2以及RALDH-3。此處所描述的tNSCs中存在RALDH以及不存在⑶33暗示tNSCs在分化成感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(sensorimotor neurons)上要優(yōu)于hES細(xì)胞。因此,此處提供了此處所描述的tNSCs用于神經(jīng)生成和/或再生醫(yī)學(xué)(regenerative medicine)的用途。
[0132]在發(fā)育的紋狀體以及海馬中，增加的Src激酶活性與神經(jīng)元分化以及生長(zhǎng)的尖峰期相一致。然而，RA可以通過(guò)24小時(shí)孵育來(lái)抑制核糖體S6激酶(ribosomal S6kinase)及其下游真核起始因子4B (eukaryotic Initiation factor4B, eIF4B)的磷酸化，以造成許多細(xì)胞類型的生長(zhǎng)停滯(growth arrest)。RA誘導(dǎo)hTS細(xì)胞中的c_Src mRNA的快速瞬時(shí)表達(dá)，在15分鐘時(shí)達(dá)到峰值(圖3a)，繼而在第I小時(shí)生成c-Src蛋白質(zhì)(圖3e)。在一個(gè)實(shí)施方案中，c-Src mRNA含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site)。在另一實(shí)施方案中，RA短暫地產(chǎn)生eIF4B，在第4小時(shí)達(dá)到峰值，但在第24小時(shí)消退(圖20c)。此作用通過(guò)使用eIF4B siRNA而被抑制(圖20d)。排除了 mT0R/eIF4EBPl信號(hào)傳遞[雷帕霉素 / 真核起始因子 4E 結(jié)合蛋白 I (rapamycin/eukaryotic Initiation factor4Ebinding proteinl)的機(jī)械祀標(biāo)]的參與(圖20b)。在另一實(shí)施方案中，RA活化eIF4B以供亞細(xì)胞mRNA定位以生成c-Src。
[0133]活性c-Src通過(guò)Tyr705位點(diǎn)的磷酸化而直接地結(jié)合至Stat3 (信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白)(圖20e)以生成蛋白質(zhì)(圖3e)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此作用通過(guò)使用c-SrcsiRNA而被抑制(圖20f)。在另一實(shí)施方案中，此作用被選擇性c-Src抑制劑PP-1類似物抑制(圖3f)。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析而觀察到Stat3對(duì)Nanog基因啟動(dòng)子的直接作用(圖3g)。在另一實(shí)施方案中，Nanog在4小時(shí)內(nèi)生成(圖3f及20f)，它可通過(guò)使用PPl類似物(圖3f)以及Stat3siRNA(圖20g)而被阻斷。
[0134]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處描述了一種用以維持tNSCs的多能性的方法，其包括使細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)劑以調(diào)節(jié)非基因組eIF4B/c-Src/Stat3/Nanog信號(hào)傳遞途徑所調(diào)控的c-Src亞細(xì)胞mRNA定位(圖20h)。在另一實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)劑是RA。
RA及Wnt信號(hào)傳遞
[0135]此處還提供了一種用以誘導(dǎo)hTS細(xì)胞成為神經(jīng)干細(xì)胞的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括調(diào)節(jié)fct2B/i3_聯(lián)蛋白信號(hào)傳遞途徑。在另一實(shí)施方案中，該方法包括調(diào)節(jié)RARs-Akt信號(hào)傳遞途徑。在另一實(shí)施方案中，該方法包括調(diào)節(jié)Wnt2B/i3-聯(lián)蛋白以及RARs/Akt信號(hào)傳遞途徑。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)用視黃酸(RA)處理來(lái)誘導(dǎo)hTS細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該用以誘導(dǎo)hTS細(xì)胞成為神經(jīng)干細(xì)胞的方法進(jìn)一步包括活化轉(zhuǎn)錄因子Pitx2。在另一實(shí)施方案中，該用以誘導(dǎo)hTS細(xì)胞成為神經(jīng)干細(xì)胞的方法進(jìn)一步包括活化轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)蛋白(netrin) (NTN)。在另一實(shí)施方案中，該用以誘導(dǎo)hTS細(xì)胞成為神經(jīng)干細(xì)胞的方法進(jìn)一步包括活化轉(zhuǎn)錄因子Pitx2以及NTN。在另一實(shí)施方案中，RAR以及RXR作為異型二聚物而存在，該異型二聚物經(jīng)由它的DNA結(jié)合域(DNA-binding domain, DBD)與視黃酸反應(yīng)元件(RARE)DR-5結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，輔阻遏物(corepressors)結(jié)合至RAR并且募集組蛋白脫乙酰酶(HDAC),造成轉(zhuǎn)錄抑制(transcriptional repression)。在另一實(shí)施方案中，用以誘導(dǎo)hTS細(xì)胞成為神經(jīng)干細(xì)胞的方法進(jìn)一步包括活化轉(zhuǎn)錄因子Pitx2和NTN。在另一實(shí)施方案中，向hTS細(xì)胞添加RA并通過(guò)RA與RAR的結(jié)合來(lái)激活轉(zhuǎn)錄。在另一實(shí)施方案中，RAR與RA結(jié)合，接著募集共活化子(coactivators)以及 HAT。
[0136]RA-調(diào)控的Wnt信號(hào)傳遞途徑在成人神經(jīng)生成以及體內(nèi)存活期間是重要的貢獻(xiàn)者。存在于神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境中的fct蛋白質(zhì)在早期胚胎形成中是細(xì)胞行為的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，并且可維持神經(jīng)干細(xì)胞潛力。在成人神經(jīng)生成中，fct蛋白質(zhì)結(jié)合至它們的受體卷曲蛋白(Frizzled)(例如，F(xiàn)zd6)以轉(zhuǎn)`導(dǎo)許多信號(hào)級(jí)聯(lián)(signaling cascades),例如通過(guò)針對(duì)特定的靶基因來(lái)活化β_聯(lián)蛋白/LEF信號(hào)傳遞。
[0137]fct信號(hào)在神經(jīng)發(fā)育(neurodevelopment)期間涉及細(xì)胞周期控制(cell cyclecontrol)以及形態(tài)發(fā)生(morphogenesis)。在它們之中，fct2B可抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)元的分化，并且使用比較性integromics分析(comparative integromics analysis)已經(jīng)提不是有關(guān)NSC的干細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，Wnt2B調(diào)節(jié)卷曲蛋白家族受體6(Fzd6)的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，Wnt2B誘導(dǎo)Fzd6的表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)zd6在Wnt2B的存在下過(guò)度表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA調(diào)節(jié)針對(duì)hTS細(xì)胞中的多巴胺能分化的典型Wnt2B/Fzd6/ β -聯(lián)蛋白信號(hào)傳遞途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA誘導(dǎo)針對(duì)hTS細(xì)胞中的多巴胺能分化的典型Wnt2B/Fzd6/ β -聯(lián)蛋白信號(hào)傳遞途徑。
[0138]此處所提供的一個(gè)實(shí)施方案將典型Wnt途徑描述為誘導(dǎo)抑制性GSK3 0，導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白穩(wěn)定化以供在細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)位。在另一實(shí)施方案中，RA快速地誘導(dǎo)GSK33在Tyr216位點(diǎn)[Akt2的下游效應(yīng)子(effector)]的磷酸化。在另一實(shí)施方案中，RA快速地誘導(dǎo)GSK3 β在Tyr216位點(diǎn)的磷酸化，導(dǎo)致在最初的數(shù)小時(shí)的β _聯(lián)蛋白磷酸化，這發(fā)揮針對(duì)隨后的典型fct途徑的“促發(fā)(priming) ”效應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，這些經(jīng)活化的Fzd6以及Dvl3能夠促進(jìn)c-Jun N-末端激酶(JNK)與細(xì)胞骨架(cytoskeleton)的交互作用或增加細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平，接著在非典型Wnt/Ca2+信號(hào)傳遞途徑中活化用于突觸功能的CaMKII。隨著時(shí)間的推移，發(fā)生從非典型至典型Wnt途徑的轉(zhuǎn)換，這歸因于GSK3 0在Ser9/21位點(diǎn)處的磷酸化。在一個(gè)實(shí)施方案中，G蛋白在起始階段調(diào)節(jié)非典型Wnt2B信號(hào)傳遞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另一實(shí)施方案中，典型fct2B信號(hào)傳遞在早期發(fā)育的神經(jīng)元分化中的后期階段發(fā)生。
HDAC6
[0139]此處還提供了一種用以誘導(dǎo)hTS細(xì)胞成為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，該方法包括調(diào)節(jié)組蛋白脫乙酰酶6 (histone deacetylase6,HDAC6)。組蛋白脫乙酰酶6 (HDAC6)( 一種主要位于細(xì)胞質(zhì)中的酶)調(diào)節(jié)許多生物過(guò)程(biological processes),包括細(xì)胞遷移、免疫突觸形成(immune synapse formation)、病毒感染以及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的降解。例如,HDAC6可使微管蛋白、Hsp90以及皮層蛋白(cortactin)去乙?；?并與其它伙伴蛋白質(zhì)(partnerproteins)形成復(fù)合體。
[0140]HDAC6能運(yùn)輸β -聯(lián)蛋白以供核定位。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞分離分析，HDAC6與β-聯(lián)蛋白交互作用而導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白的核轉(zhuǎn)位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RA誘導(dǎo)新的典型Wnt2B/Fzd6/ β -聯(lián)蛋白信號(hào)傳遞途徑，而允許在hTS細(xì)胞中的β -聯(lián)蛋白的核轉(zhuǎn)位。在核內(nèi)，β_聯(lián)蛋白涉及調(diào)控關(guān)鍵的基因表達(dá)程序，或作為對(duì)接平臺(tái)(dockingplatform)以供各種不同的轉(zhuǎn)錄共活化子(transcriptional co-activators)來(lái)刺激轉(zhuǎn)錄。
HDAC4
[0141]組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)是功能性hTS細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞的一種重要表觀遺傳調(diào)節(jié)子(epigenetic regulator)。HDAC4抑制細(xì)胞周期進(jìn)展并且保護(hù)神經(jīng)元免于細(xì)胞死亡。RARs所造成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)涉及由HDACs[它們通過(guò)核的輔阻遏物(nuclearco-repressors)被募集至RA祀基因]對(duì)染色質(zhì)的修飾，這決定了對(duì)RA的差別反應(yīng)。`
LEF/TCF/Pitx2
[0142]Lef-1以及PITX2通過(guò)募集并且與β -聯(lián)蛋白交互作用來(lái)活化靶基因而在Wnt信號(hào)傳遞途徑中發(fā)揮作用。ΡΙΤΧ2與Lef-1蛋白質(zhì)內(nèi)的2個(gè)位點(diǎn)交互作用。此外，β-聯(lián)蛋白與ΡΙΤΧ2同源域(homeodomain)交互作用，而Lef-1與PITX2C-端尾部交互作用。Lef-1以及β -聯(lián)蛋白經(jīng)由2個(gè)不同的位點(diǎn)同時(shí)地并且獨(dú)立地與ΡΙΤΧ2交互作用，以調(diào)節(jié)ΡΙΤΧ2轉(zhuǎn)錄活性。這些數(shù)據(jù)支持ΡΙΤΧ2經(jīng)由差異的Lef-1異構(gòu)型表達(dá)以及與Lef-1和β-聯(lián)蛋白的交互作用而在細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞分裂(cell division)中的作用。
導(dǎo)蛋白I (NTNl)
[0143]NTNl的分子機(jī)制被認(rèn)為主要涉及軸突導(dǎo)引(axonal guidance)以及對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞遷移的控制。
ffnt/PSl/PI3K/Akt途徑的活化以及RA所造成的GSK3- β的抑制
[0144]由于增殖性祖細(xì)胞的數(shù)目增加及相應(yīng)的經(jīng)分化的神經(jīng)元的減少，增加的fct信號(hào)傳遞擴(kuò)張干細(xì)胞庫(kù)(stem cell pool)并且強(qiáng)化穩(wěn)定化的β_聯(lián)蛋白的表達(dá)而致使產(chǎn)生大的腦(Chenn, A.等人，Science297, 365-369，(2002) )。β -聯(lián)蛋白作為接合蛋白(junctional protein)起雙重作用，并且在典型Wnt信號(hào)傳遞中，表型可能是由于增加的Wnt信號(hào)傳遞(它與NSC自我更新有關(guān)聯(lián))或增加的接合穩(wěn)定性(junctional stability)。
PI3K/Akt信號(hào)傳遞[0145]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處描述了一種用于維持tNSCs的多能性的方法,該方法包括調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)傳遞途徑。G-蛋白β/Y異型二聚物也活化磷酸肌醇-3-激酶的調(diào)節(jié)亞基 5 (Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit5) [PI3K regclass IB(plOl)]，后者導(dǎo)致磷酸肌醇-3-激酶催化Y多肽[PI3K cat class IB (pllO-Y )]調(diào)控的磷脂酰肌醇 4，5_ 二憐酸[phosphatidylinositol4, 5-biphosphate, PtdIns (4, 5) P2]至憐脂酸肌醇 3, 4, 5-三憐酸[phosphatidylinositol3, 4, 5-triphosphate, PtdIns (3, 4, 5) P3]的轉(zhuǎn)換
[3]。PtdIns (3, 4, 5)P3是直接地與3-磷酸肌醇依賴的蛋白激酶-1 (3-phosphoinositidedependent protein kinase-1) [PDK (PDPKl)]以及V_akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物I (V-akt murine thymoma viraloncogene homologl) [AKT (PKB)]結(jié)合的第二信使(secondmessenger)。Η)Κ(Η)ΡΚΙ)磷酸化 AKT (PKB)并且活化 AKT 信號(hào)傳遞[4]。
[0146]PI3K/Akt信號(hào)傳遞在下面的干細(xì)胞系統(tǒng)中調(diào)節(jié)自我更新以及分化能力。從原生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGC)到多能胚胎生殖(embryonic germ,EG)細(xì)胞的衍生在PGC-特異的Pten-缺乏的小鼠(PGC-specific Pten-deficient mice)中得到增強(qiáng)(KimuraT 等人，Developmentl30:1691-1700，(2003))。
[0147]在一個(gè)實(shí)施方案中所顯示的是:利用Akt信號(hào)傳遞的條件活化，PI3K/Akt信號(hào)傳遞在靜息干細(xì)胞的活化上發(fā)揮作用。在另一實(shí)施方案中，PI3K/Akt信號(hào)傳遞在成人表皮中的祖細(xì)胞的增殖上發(fā)揮作用。
[0148]在一個(gè)實(shí)施方案 中，PI3K/Akt信號(hào)傳遞在這些適應(yīng)培養(yǎng)的干細(xì)胞中促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新，而不是定向祖細(xì)胞的生成。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA在hTS細(xì)胞中調(diào)節(jié)Akt3/mT0R信號(hào)傳遞的活化，而引起編碼蛋白質(zhì)RXRa以及RARP的亞細(xì)胞mRNAs的翻譯。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA在hTS細(xì)胞中誘導(dǎo)Akt3/mT0R信號(hào)傳遞的活化，而引起編碼蛋白質(zhì)RXRa以及RARii的亞細(xì)胞mRNAs的翻譯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)劑抑制Akt3/mT0R信號(hào)傳遞的活化。在另一實(shí)施方案中，RXRa/Gaq/11以及RARi3/Gi3信號(hào)傳遞途徑的選擇性移動(dòng)與交互作用被獨(dú)立地啟動(dòng)。
[0149]在另一實(shí)施方案中，RA調(diào)節(jié)有關(guān)細(xì)胞功能的遺傳程序轉(zhuǎn)錄活性，這取決于多效性及細(xì)胞環(huán)境依賴的方式(cellular context-dependent manner);即，產(chǎn)出表型(outputphenotype)是AP-1和/或β -聯(lián)蛋白-LEF/TCF抑制以及RARE活化的效果的組合。
GSK3 3調(diào)節(jié)微管裝配
[0150]hTS細(xì)胞包括主要的GSK3 0功能，在神經(jīng)發(fā)育中GSK3 0的起始活化促進(jìn)神經(jīng)元分化并且隨后的失活促進(jìn)祖細(xì)胞增殖。在靜息細(xì)胞中，GSK3的基礎(chǔ)活性通常是相對(duì)較高的，而將細(xì)胞暴露于引導(dǎo)信號(hào)會(huì)在10分鐘內(nèi)降低其比活性(specific activity)達(dá)30_70%。GSK30對(duì)于其已磷酸化的底物具有強(qiáng)烈的偏好；因此，在典型fct2B信號(hào)傳遞中先前經(jīng)促發(fā)的β-聯(lián)蛋白對(duì)于隨后的抑制性GSK3 0變成適合的。
[0151]在一個(gè)實(shí)施方案中，快速時(shí)空活性的GSK3 0對(duì)局限在軸突生長(zhǎng)核心中的MAPT進(jìn)行磷酸化，而導(dǎo)致促進(jìn)微管裝配、神經(jīng)元極性(neuronal polarity)以及軸突外生的微管蛋白異型二聚物的活化(圖21a以及21b)，這與GSK3 β的活化參與軸突微管裝配的概念是一致的。此外，GSK3 β也能夠調(diào)節(jié)CRMP-2的磷酸化而促使微管裝配，由此CRMP-2優(yōu)先地與微管蛋白異型二聚物結(jié)合，這明顯地不同于MAPT。CRMP-2的突變體以顯性陰性的方式抑制軸突生長(zhǎng)以及分支。[0152]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了一種用以幫助解釋在體內(nèi)GSK-3信號(hào)傳遞是穩(wěn)態(tài)控制(homeostatic control)的重要調(diào)節(jié)物而在發(fā)育的腦中調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細(xì)胞的機(jī)制基礎(chǔ)。在另一實(shí)施方案中，PI3K/Akt途徑的初始的局部活化誘導(dǎo)hTS細(xì)胞中的GSK3 β在Tyr216處的活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，PI3K/Akt途徑的初始的局部活化與通過(guò)從E18大鼠胚胎分離的海馬神經(jīng)元(hippocampal neurons)中的Ser9/21磷酸化所誘導(dǎo)的GSK3 β的失活是有區(qū)別的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在GSK3 0中的不同位點(diǎn)上的磷酸化導(dǎo)致不同的細(xì)胞命運(yùn)，這取決于時(shí)間因素。磷酸化的GSK30通過(guò)促進(jìn)核輸出來(lái)防止鈣依賴磷酸酶誘導(dǎo)的NFATl的DNA結(jié)合。NFAT在促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄(包括在免疫反應(yīng)期間T細(xì)胞中的細(xì)胞因子基因)上發(fā)揮核心作用。這些事實(shí)至少部分地解釋了為何hTS細(xì)胞與tNSCs這兩者具有促進(jìn)H)大鼠中的頡內(nèi)移植(intracranial transplantation)的免疫優(yōu)勢(shì)。
G蛋白與神經(jīng)兀可塑性(Neuronal Plasticity)
[0153]在NSCs中高度的自主性通過(guò)在神經(jīng)生成期間mRNAs子集的選擇性定位以及翻譯而允許針對(duì)引導(dǎo)信號(hào)的快速局部反應(yīng)，其中mTOR典型地在NSCs中經(jīng)由對(duì)mRNA翻譯以及核糖體合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子進(jìn)行磷酸化來(lái)上調(diào)蛋白質(zhì)合成。在hTS細(xì)胞中，活性Akt3/mTOR信號(hào)傳遞觸發(fā)mRNA翻譯以獨(dú)立地合成RXRa以及RARii蛋白質(zhì)，這兩種蛋白質(zhì)分別活化Gaqm以及Gi3信號(hào)傳遞途徑，其中局部CREBl被活化并且發(fā)揮誘導(dǎo)型基因表達(dá)的作用，該基因表達(dá)短暫地祀向TH基因以供轉(zhuǎn)錄，以生成神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(neurotransmitterdopamine)。已顯示:RA促進(jìn)樹突RNA顆粒中的RARa表達(dá)并且活化局部的谷氨酸受體I (glutamate receptorl, GluRl)合成，這意味著穩(wěn)態(tài)的突觸可塑性(homeostaticsynaptic plasticity)。因此，多巴胺D1/D5受體(CREB的上游增強(qiáng)子)的活化會(huì)誘導(dǎo)GluRl嵌入神經(jīng)元中的突觸位點(diǎn)。
[0154]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了一種分子模型以供研究RA信號(hào)相關(guān)的可塑性。 用于多巴胺能神經(jīng)生成的轉(zhuǎn)錄因子
[0155]在一個(gè)實(shí)施方案中，β-聯(lián)蛋白與CREBl在核中的交互作用代表了 TH轉(zhuǎn)錄中的主流。在一個(gè)實(shí)施方案中，活性的β-聯(lián)蛋白結(jié)合至淋巴樣細(xì)胞增強(qiáng)因子1/Τ細(xì)胞因子I (lymphoid enhancer factorl/T cell factorl) (LEFl),而導(dǎo)致 LEFl 從轉(zhuǎn)錄的抑制子轉(zhuǎn)換為活化子。LEFl接著募集并且與PitX2(bicoid相關(guān)因子超家族的成員)交互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，LEFl促進(jìn)Pitx2基因轉(zhuǎn)錄。在另一實(shí)施方案中，LEFl促進(jìn)Pitx3基因轉(zhuǎn)錄。在另一實(shí)施方案中，LEFl促進(jìn)Pitx3和Pitx2這兩者的基因轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，β-聯(lián)蛋白、Pitx2以及LEFl協(xié)同地交互作用以調(diào)節(jié)LEF-1啟動(dòng)子。
[0156]此外，短暫核活性NFATl作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用以生成用于免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子以及TNF- α。然而，因?yàn)榻?jīng)磷酸化的GSK3 β能夠抑制鈣依賴磷酸酶誘導(dǎo)的NFATl在核中的DNA結(jié)合并且促進(jìn)核輸出，此作用不太可能在本情況中發(fā)生。因此，由于此作用能夠被NFATlsiRNA抑制(圖22e)，活性細(xì)胞質(zhì)NFATl將會(huì)交互作用并且活化細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A (myocyte enhancer factor2A,MEF2A)(圖22c以及22d)。特別地，快速誘導(dǎo)型0^81進(jìn)入核內(nèi)并且轉(zhuǎn)錄可生成1^?24蛋白質(zhì)的1^?2么基因(圖22f)。MEF2A可能在基因轉(zhuǎn)錄上以多種方式起作用(圖22g)，包括經(jīng)由自動(dòng)調(diào)節(jié)的自身轉(zhuǎn)錄以生成更多MEF2A、轉(zhuǎn)錄TH基因以供多巴胺能特化(dopaminergic specification)、轉(zhuǎn)錄SNCA基因以供SNCA/MAPT/帕金蛋白復(fù)合體形成，以及與EP300和Pitx2交互作用(它被MEF2A siRNA抑制)(圖 22h)。
[0157]在一個(gè)實(shí)施方案中，活性的EP300靶向HDAC6基因以及TH基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，活性的EP300靶向HDAC6基因。在另一實(shí)施方案中，活性的EP300靶向TH基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，活性的EP300促進(jìn)HDAC6基因以及TH基因的轉(zhuǎn)錄。在另一實(shí)施方案中，活性的EP300抑制HDAC6基因以及TH基因的轉(zhuǎn)錄。在另一實(shí)施方案中，HDAC6運(yùn)輸β -聯(lián)蛋白以供核轉(zhuǎn)位。
[0158]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了所形成的并且指定用于TH基因轉(zhuǎn)錄的執(zhí)行性轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的表征。例如，CREBU ΕΡ300以及MEF2A能夠靶向TH基因的啟動(dòng)子，而β -聯(lián)蛋白、LEFl以及Pitx2在轉(zhuǎn)錄過(guò)程期間作為增強(qiáng)子的共活化子行使功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了用以了解這些基因如何在多巴胺能NSCs中的分化與增殖之間操縱平衡的方法，這對(duì)于評(píng)估疾病機(jī)制(例如，PD)具有意義。
CaMKII的多面性
[0159]在發(fā)育NSCs中，經(jīng)由電壓門控的鈣離子通道(voltage-gated calcium channels)或神經(jīng)遞質(zhì)受體(neurotransmitter receptors)的局部鈣流入(local calcium influx)導(dǎo)致CaMKII的活化，而向前傳送數(shù)種信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)興奮-轉(zhuǎn)錄偶合(excitation-transcription coupling),時(shí)空CaMKII 在hTS細(xì)胞中經(jīng)由活化的 eIF4B觸發(fā)c-SrcmRNA定位以合成c_Src蛋白質(zhì),導(dǎo)致Nanog的活化以供自我更新以及增殖。在另一實(shí)施方案中，CaMKII觸發(fā)局部CREBl的活化,而導(dǎo)致回向運(yùn)輸(retrograde trafficking)至核內(nèi)以靶向基因MEF2A以供轉(zhuǎn)錄。MEF2A不僅在神經(jīng)元分化以及增殖上，而且在骨骼肌以及心肌發(fā)育上調(diào)控細(xì)胞功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，CaMKII活化MAPT來(lái)調(diào)控帕金蛋白蛋白質(zhì)，并且MAPT轉(zhuǎn)而活化用于 微管裝配的微管蛋白異型二聚物(圖22a以及22j)。這些結(jié)果暗示:早期時(shí)空CaMKII信號(hào)對(duì)于微管蛋白的活化以在早期發(fā)育的NSCs中促進(jìn)微管裝配、神經(jīng)元遷移以及神經(jīng)元極化(neuronal polarization)是足夠的,這確保與腦內(nèi)的紋狀體革巴標(biāo)(striatal targets)的適當(dāng)連接性。
[0160]L型鈣離子通道以另一種方式來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣以供體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這涉及成人NSCs中的興奮-神經(jīng)生成(excitation-neurogenesis)。升高的氯化鉀(KCl)水平導(dǎo)致膜去極化(membrane depolarization),而導(dǎo)致鈣經(jīng)由L-型電壓敏感的鈣離子通道的流入,這足以經(jīng)由神經(jīng)元中的ER以及粒線體之間的相互作用來(lái)誘導(dǎo)粒線體功能異常(mitochondrialdysfunction)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA調(diào)節(jié)與L-型鈣離子通道有關(guān)聯(lián)的細(xì)胞內(nèi)ER鈣。
[0161]CaMKII { 鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴的蛋白激酶 II [calmodulin (CaM)-dependentprotein kinase II]} (L型Ca2+通道的下游效應(yīng)子)響應(yīng)于短暫的低幅度鈣離子峰(transient 1w-amplitude calcium spikes)展現(xiàn)出針對(duì)Ca2+/鈣調(diào)蛋白的較低親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA調(diào)節(jié)CaMKII的時(shí)空活化。在另一實(shí)施方案中，RA誘導(dǎo)CaMKII的時(shí)空活化。在另一實(shí)施方案中，RA抑制CaMKII的時(shí)空活化。
[0162]根據(jù)IP分析，CaMKII直接地磷酸化并活化CREBl (圖21c)，這與CaMKII在興奮-轉(zhuǎn)錄偶合上局部地將L-型鈣離子通道活性編碼為針對(duì)核CREB的信號(hào)的先前研究是一致的。因?yàn)檩S突含有各種不同的局部地編碼特定蛋白質(zhì)合成的mRNA，包括在發(fā)育的神經(jīng)元中的CaMKI1、鈣依賴磷酸酶以及CREBl，這顯示外來(lái)的RA觸發(fā)的mRNA翻譯機(jī)制發(fā)生在它們身上，因?yàn)樗鼈兡鼙徽婧似鹗家蜃?B(EIF4B) siRNA抑制(圖21d)。因此，此局部的CREBl能夠回向運(yùn)輸以供在核中負(fù)責(zé)末梢軸突的信號(hào)的特定轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這些結(jié)果顯示了基于細(xì)胞外信號(hào)的快速誘導(dǎo)型基因轉(zhuǎn)錄。
[0163]這些結(jié)果首次探究的是:Ga q/11信號(hào)衍生的CaMKII興奮涉及tNSCs的自我更新的維持。同時(shí)，這些結(jié)果顯示軸突行為(axonal behaviors)在早期神經(jīng)生成中的重要性。SNCA與磷脂膜(phospholipid membranes)交互作用并且在神經(jīng)退化性障礙(包括F1D以及阿爾茲海默癥)的致病機(jī)制(pathogenesis)上發(fā)揮重要作用。 鈣依賴磷酸酶/NFATl信號(hào)傳遞
[0164]在一個(gè)實(shí)施方案中，RA調(diào)節(jié)鈣依賴磷酸酶的生成。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA誘導(dǎo)鈣依賴磷酸酶的生成。在另一實(shí)施方案中，ER鈣與鈣依賴磷酸酶/NFATl信號(hào)傳遞相關(guān)聯(lián)，這與先前的研究是一致的。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞分離分析，RA誘導(dǎo)NFATl與輸入蛋白[核質(zhì)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nucleocytoplasmic transporter)]的短暫交互作用，導(dǎo)致NFATl核轉(zhuǎn)位。這種NFATl的短暫效應(yīng)被認(rèn)為是細(xì)胞由此辨別持續(xù)的以及短暫的鈣信號(hào)的一種機(jī)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA-誘導(dǎo)的鈣依賴磷酸酶/NFATl信號(hào)傳遞涉及到早期神經(jīng)生成。
在初始神經(jīng)生成時(shí)的細(xì)胞重建(Cellular Remodeling)
[0165]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了一種用于在hTS細(xì)胞向tNSCs轉(zhuǎn)變期間誘導(dǎo)分子過(guò)程的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分子過(guò)程由RA來(lái)誘導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)分子級(jí)聯(lián)(molecular cascade):第4小時(shí)(早期)以及第24小時(shí)(晚期)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子事件發(fā)生于2個(gè)時(shí)期內(nèi)。在特定的實(shí)施方案中，一個(gè)時(shí)期包括在形態(tài)發(fā)生中的時(shí)空反應(yīng)(例如，圖23 ;早期；灰線)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，一個(gè)時(shí)期包括在細(xì)胞分化以及增殖中的基因轉(zhuǎn)錄(例如，圖23 ;晚期；黑線)。
[0166]在一個(gè)實(shí)施方案中，表征了早期神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生中的機(jī)制。一旦干細(xì)胞感測(cè)到外來(lái)的引導(dǎo)信號(hào)，各種不同的特定亞細(xì)胞mRNA定位快速地啟動(dòng)，而作為反應(yīng)在核中轉(zhuǎn)錄過(guò)程的極遠(yuǎn)處局部地制造特定蛋白質(zhì)。經(jīng)由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用以及“感覺經(jīng)驗(yàn)(sensoryexperience) ",這些局部蛋白質(zhì)聚集在亞細(xì)胞區(qū)域處以在早期發(fā)育的NSCs中啟動(dòng)生長(zhǎng)錐(growth cone)形成。不對(duì)稱分裂(asymmetric division)伴隨著基因轉(zhuǎn)錄而開始。例如，β -聯(lián)蛋白的存在在RA處理5分鐘之后于突觸膜(synaptic membrane)處是可見的(圖23g)，并且局部活化的CREBl移動(dòng)回到核內(nèi)以靶向基因MEF2A以供轉(zhuǎn)錄。
[0167]在一個(gè)實(shí)施方案中，一系列的分子過(guò)程協(xié)同地發(fā)生以調(diào)節(jié)粒線體功能(mitochondrial function)、膜的脂質(zhì)代謝(lipid metabolism of membrane)、軸突生長(zhǎng)(axonal growth)、神經(jīng)兀遷移與可塑性(neuronal migration and plasticity)以及微管裝配，這些分子過(guò)程包括，但不限于:RXRa、RAR@、β -聯(lián)蛋白、Akt、CREB1、mTOR、CaMKI1、鈣依賴磷酸酶、c-Src、GSK3 0、SNCA以及MAPT。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)MEF2A、EP300以及CREBl所造成的在TH基因上的轉(zhuǎn)錄代表誘導(dǎo)型基因表達(dá)，其從染色體區(qū)域誘導(dǎo)染色質(zhì)環(huán)(chromatin looping),以促進(jìn)之后的基因轉(zhuǎn)錄。在另一實(shí)施方案中，RA-誘導(dǎo)的G蛋白信號(hào)傳遞的組分在神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生上發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且在活化TH基因處的轉(zhuǎn)錄中也是不可或缺的部分。
[0168]此處描述了分化與增殖之間的平衡以在體外維持呈穩(wěn)定狀態(tài)的tNSCs。在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)分化是通過(guò)調(diào)節(jié)RA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)控制的。在進(jìn)一步應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)或藥物發(fā)現(xiàn)之前，通過(guò)對(duì)這些調(diào)節(jié)機(jī)制的了解，能夠在體外更有效地進(jìn)行hTS細(xì)胞的操作。tNSCs具有免疫豁免
[0169]此處提供的一個(gè)實(shí)施方案描述了一種使用至少一種tNSC治療神經(jīng)障礙的方法，其中該細(xì)胞是經(jīng)免疫豁免的。在另一實(shí)施方案中，該tNSC不會(huì)引起免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該tNSC不會(huì)引起來(lái)自于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)(miciOglia)、NK細(xì)胞或肥大細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該tNSC抑制免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，該tNSC具有降低的免疫原性。在另一實(shí)施方案中，該tNSC不會(huì)導(dǎo)致腫瘤形成。在另一實(shí)施方案中，該tNSC被設(shè)計(jì)為經(jīng)免疫豁免的。在此處所提供的另一實(shí)施方案中描述了一種使用tNSC細(xì)胞的族群來(lái)治療神經(jīng)障礙的方法，其中所述細(xì)胞是經(jīng)免疫豁免的。在另一實(shí)施方案中，干細(xì)胞或它們的衍生物作為細(xì)胞治療的應(yīng)用得益于了解它們的免疫原性以幫助確定免疫抑制劑(immunosuppression agents)植入后的應(yīng)用。
[0170]此處所描述的另一個(gè)方面是一種用以檢測(cè)以及比較在hTS細(xì)胞、tNSCs以及hES細(xì)胞中的免疫相關(guān)基因以及標(biāo)記的表達(dá)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)流式細(xì)胞分析來(lái)檢測(cè)表達(dá)。
[0171]在hTS細(xì)胞、tNSCs以及hES細(xì)胞中的免疫相關(guān)基因以及標(biāo)記的實(shí)例包括，但不限于:HLA-ABC、HLA-DR、CD14、CD44、CD73、CD33、CD34、CD45、CD105 以及 CD133。在另一實(shí)施方案中，HLA-ABC在hTS細(xì)胞以及tNSCs中的表達(dá)在tNSCs中要比在hES細(xì)胞中更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，在全部3種干細(xì)胞中觀察到HLA-DR的陰性表達(dá)(圖2e)。在另一實(shí)施方案中，HLA-ABC在hTS細(xì)胞(99.4%)以及tNSCs (99.7%)中的表達(dá)在tNSCs中要比在hES細(xì)胞中(12.9%)高得多(圖2e)。在另一實(shí)施方案中，在hTS細(xì)胞、tNSCs以及hES細(xì)胞中未觀察到⑶14和⑶44表達(dá)上的差異。在另一實(shí)施方案中，與hES細(xì)胞中的陰性表達(dá)水平相比，高水平的⑶73在hTS細(xì)胞以及tNSCs中表達(dá)(圖2f)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該tNSCs具有間質(zhì)干細(xì)胞的特性，其有利于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。
[0172]在另一實(shí)施方案中，CD33(它在細(xì)胞外部分處含有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)并且是跨膜受體)在hTS以及hES細(xì)胞中表達(dá)但 在tNSCs中沒(méi)有表達(dá)(圖2f)。在另一實(shí)施方案中，在tNSCs中的⑶33的不存在有利于細(xì)胞治療，因?yàn)樗c免疫防御(immune defense)有關(guān)。因此，此處提供了具有低水平的⑶33表達(dá)并且因而具有低免疫原性的tNSCs。
[0173]在一個(gè)實(shí)施方案中，在間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記⑶105的表達(dá)上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它們之間在強(qiáng)度上的差異。在另一實(shí)施方案中，與hTS細(xì)胞以及hES細(xì)胞相比，在tNSCs中發(fā)現(xiàn)了癌癥干細(xì)胞標(biāo)記⑶133 (cancer stem cell marker⑶133)的低水平表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，與hTS細(xì)胞(93.6%)以及hES細(xì)胞(98.8%)相比，在tNSCs中發(fā)現(xiàn)了癌癥干細(xì)胞標(biāo)記CD133的低水平表達(dá)(11.8%)(圖2h)。因此，此處提供了具有低水平的⑶133表達(dá)并且因而具有低致腫瘤性(tumorigenicity)的 tNSCs。
[0174]此處進(jìn)一步提供了⑶133+tNSCs的選擇性族群，它們可用于移植以及組織再生(tissue regeneration)以供干細(xì)胞治療。此處還提供了具有免疫豁免狀態(tài)的tNSCs,它們對(duì)于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療而言是可行的候選者。
[0175]在一個(gè)實(shí)施方案中，RA誘導(dǎo)免疫相關(guān)的標(biāo)記的表達(dá)上的改變，例如，具有⑶34(+)的細(xì)胞增加但具有CD133(+)的細(xì)胞減少。在另一實(shí)施方案中，RA誘導(dǎo)CD34(+)hES細(xì)胞分化成為平滑肌祖細(xì)胞(smooth muscle progenitor cells)。在另一實(shí)施方案中，以⑶34(+)免疫選擇的移植物來(lái)進(jìn)行tNSCs的自體移植(autologous transplantation)在具有高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma)的兒童中是可行的。
植入后分化與增殖
[0176]在神經(jīng)生成上，RA與視黃酸反應(yīng)元件(RARE)之間的關(guān)聯(lián)是已知的(Maden，M.等人，Nat.Rev.Neuroscience.8，755-765，(2007))，然而對(duì)非RARE作用的存在知之甚少。在一個(gè)實(shí)施方案中，RA經(jīng)由G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)信號(hào)傳遞的“拉與推”機(jī)制誘導(dǎo)RXRa /RARi3/c-Src復(fù)合體的活化。在另一實(shí)施方案中，在2小時(shí)內(nèi)，RXRa通過(guò)與G a q/11的交互作用最先被活化，繼而是c-Src以及之后的RARP的活化，從而形成復(fù)合體(圖3a以及3b)。在它們之中，c-Src隨后經(jīng)由Stat3誘導(dǎo)Nanog過(guò)度表達(dá)以維持那些hTS細(xì)胞衍生的NSCs的多能性和自我更新。
[0177]這種信號(hào)傳遞途徑暗示-M沒(méi)有必要進(jìn)入細(xì)胞來(lái)觸發(fā)典型RA/RXR/RAR/RARE途徑，替代地，RA經(jīng)由GPCR信號(hào)傳遞來(lái)活化G蛋白Gaqm，這與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signaltransduction)的概念是相容的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了用于控制RA-調(diào)控的NSCs的多能性以及自我更新的調(diào)節(jié)，以及在移植之前與之后操控hTS細(xì)胞和/或神經(jīng)干細(xì)胞的方法。在另一實(shí)施方案中，Wnt以及RA在近端啟動(dòng)子中分別經(jīng)由非典型的RARE以及Lef/轉(zhuǎn)錄因子(Tcf)-反應(yīng)元件(LRE)而影響尾型同源框I (Cdxl)。
[0178]在一個(gè)實(shí)施方案中，RA經(jīng)由典型RA/RARE信號(hào)傳遞途徑誘導(dǎo)hTS細(xì)胞分化成為多巴胺能NSCs以維持干細(xì)胞性質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，是非RARE信號(hào)傳遞途徑經(jīng)由Wnt/β-聯(lián)蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)的活化而生成功能性多巴胺能NSCs。在另一實(shí)施方案中，非RARE信號(hào)傳遞的損害造成多巴胺生成的功能異常或缺失，而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化性變化(progressive degenerative change)。因此,在另一實(shí)施方案中，此處提供了一種經(jīng)由活化非RARE信號(hào)傳遞途徑而分化為多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)干細(xì)胞。
[0179]RA在誘導(dǎo)RAR-β表達(dá)之前于第`6小時(shí)活化蛋白激酶C(PKC)途徑。RA在第2分鐘時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)二?；视?diacylglycerol,DG)的短暫的1.3倍增加以及在5分鐘之內(nèi)的PKC 的 Y 同工酶(gamma isozyme) (PKC- y)的轉(zhuǎn)位(Kurie J.Μ.等人，Biochim BiophysActa.1993，1179(2): 203-7)。這些發(fā)現(xiàn)顯示:PKC途徑活化是RA調(diào)控的人類TC分化中的早期步驟，并且PKC-Y會(huì)加強(qiáng)RA對(duì)RAR轉(zhuǎn)錄活化的效果。因此，此處提供了用以控制hTS細(xì)胞分化的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，PKC信號(hào)傳遞途徑的調(diào)節(jié)控制hTS細(xì)胞分化。
[0180]骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)與LIF—起來(lái)支持未分化的mES細(xì)胞的擴(kuò)充。BMP4誘導(dǎo)hES細(xì)胞的滋養(yǎng)層分化(Qi X等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2004; 101:6027 - 6032)。Id蛋白質(zhì)的BMP誘導(dǎo)與STAT3合作來(lái)抑制分化并且維持胚胎干細(xì)胞自我更新(Ying，Q.L.等人，Cell.2003; 115:281-292)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)與LIF結(jié)合來(lái)作用以維持自我更新并保持多譜系分化、嵌合體聚落形成(chimera colonization)以及種系傳遞(germlinetransmission)性質(zhì)(Xu RH 等人，Nat Biotechnol.2002; 20:1261-1264)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了一種通過(guò)調(diào)節(jié)PKC和/或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)來(lái)誘導(dǎo)此處所描述的tNSCs的多巴胺能分化的方法。
疾病的治療
[0181]此處提供了一種用于治療障礙的方法，其中該方法包括將神經(jīng)元的純族群或特定的神經(jīng)干細(xì)胞族群的復(fù)合體移植至患者，其中該患者是有此需要的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該患者被診斷為患有神經(jīng)疾病。在另一實(shí)施方案中，該患者被診斷為患有神經(jīng)精神障礙(neuropsychiatric disorder)。在另一實(shí)施方案中，該患者被診斷為患有神經(jīng)退化性障礙。在另一實(shí)施方案中，該神經(jīng)元的純族群包含多巴胺能神經(jīng)元。
[0182]此處所描述的任何方法可以用來(lái)治療疾病(disease)或障礙(disorder)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該疾病是神經(jīng)疾病。在另一實(shí)施方案中，該疾病是神經(jīng)退化疾病或障礙。神經(jīng)障礙的非限制性實(shí)例包括:帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、路易氏體癥、脊髓性肌萎縮、多系統(tǒng)萎縮、癡呆、精神分裂癥、麻痹、多發(fā)性硬化癥、脊髓損傷、腦損傷(例如，中風(fēng))、腦神經(jīng)障礙、周邊感覺神經(jīng)病變、癲癇、朊病毒障礙、克雅氏病、阿爾珀斯病、小腦/脊髓小腦退化、巴滕病、皮質(zhì)基底核退化、貝爾氏麻痹、格林-巴利綜合征、皮克病 以及自閉癥。
[0183]因此，此處所描述的tNSCs適合用于治療神經(jīng)退化性障礙，包括但不限于:帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏癥、脊髓損傷、青光眼(glaucoma)等。
[0184]此外，tNSCs也表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺。因此，一個(gè)實(shí)施方案描述tNSCs在治療神經(jīng)精神障礙中的用途。神經(jīng)精神障礙的非限制性實(shí)例包括:憂郁(d印ression)、精神分裂癥、癡呆、自閉癥、注意力缺陷伴多動(dòng)障礙(attention deficit hyperactivity disorder)以及躁郁癥(bipolar disorder)。
[0185]此處所描述的任何方法可以用來(lái)改善或改進(jìn)神經(jīng)疾病或障礙的癥狀。與神經(jīng)疾病或障礙有關(guān)的癥狀的非限制性實(shí)例包括:震顫、步態(tài)障礙、不良性步態(tài)、癡呆、過(guò)度腫脹(水腫)、肌無(wú)力、下肢萎縮、運(yùn)動(dòng)障礙(舞蹈病)、肌肉僵直、物理運(yùn)動(dòng)的減慢(運(yùn)動(dòng)遲緩)、物理運(yùn)動(dòng)的缺失(運(yùn)動(dòng)失能癥)、健忘、認(rèn)知(智能)損傷、辨識(shí)的缺失(失識(shí)癥)、受損的功能(諸如決策與計(jì)劃)、單側(cè)面麻痹、感覺缺失、麻木、刺痛感、四肢的疼痛感覺異常、虛弱、腦神經(jīng)麻痹、語(yǔ)言障礙、眼球運(yùn)動(dòng)、視野缺損、失明、出血、分泌物、近端肌萎縮、運(yùn)動(dòng)困難癥、四肢肌肉張力的異常、肌強(qiáng)直減少、動(dòng)作失調(diào)、在手指-手指測(cè)試或手指-鼻測(cè)試中錯(cuò)誤的指示、辨距不良、霍-斯二氏現(xiàn)象、不完全的或完全的全身性麻痹、視神經(jīng)炎、視物顯多癥、眼球運(yùn)動(dòng)障礙(諸如眼球震顫)、痙攣性麻痹、痛苦的強(qiáng)直發(fā)作、萊爾米特綜合征、共濟(jì)失調(diào)、語(yǔ)言困難、膀胱直腸障礙、起立性低血壓、運(yùn)動(dòng)功能的減退、尿床、貧乏的言語(yǔ)表達(dá)、不充足的睡眠型態(tài)、睡眠障礙、食欲障礙、體重改變、精神運(yùn)動(dòng)性激動(dòng)或遲滯、減少的活力、無(wú)價(jià)值的感受或過(guò)度或不適當(dāng)?shù)膬?nèi)疚、思考或全神貫注困難、反復(fù)的死亡意圖或者自殺的意念或企圖、害怕、焦慮、興奮增盛、沉思的或強(qiáng)迫性沉思、過(guò)度擔(dān)心身體健康、恐慌發(fā)作以及恐懼癥。
[0186]此處描述了具有下列某些所需特性的tNSCs:首先，該tNSCs是由具有表型一致性、穩(wěn)定的基因表達(dá)以及多能特性的異質(zhì)性亞型(heterogeneous subtypes)所組成的混合的細(xì)胞族群；其次，它們含有實(shí)質(zhì)上加強(qiáng)多巴胺能神經(jīng)生成的神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞(gliaprogenitor cells)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞；第三，它們具有用于“挽救”功能異常的多巴胺能神經(jīng)元的內(nèi)在能力以及免疫豁免的性質(zhì)；最后，來(lái)自宿主組織上的不同的神經(jīng)前體的神經(jīng)滋養(yǎng)效果將會(huì)促進(jìn)結(jié)構(gòu)修復(fù)(structural repair)。
[0187]在一些實(shí)施方案中，此處提供了具有允許在移植治療中適當(dāng)操作的下列某些所需特性的tNSCs:1)該獨(dú)特的tNSCs在品質(zhì)上的一致性以及充足的細(xì)胞來(lái)源方面被RA簡(jiǎn)單且有效地誘導(dǎo)；2)經(jīng)移植的tNSCs在損傷的黑質(zhì)紋狀體途徑(nigrostriatal pathway)中功能性地新生成多巴胺能神經(jīng)元，它在植入后可以存活至少18周；3)感覺運(yùn)動(dòng)損傷(sensorimotor impairments)早在植入后的第3周就得到顯著地改善；4)該tNSCs具有免疫豁免，促進(jìn)干細(xì)胞治療；5)如此處所描述的對(duì)細(xì)胞增殖的分子機(jī)制的操控允許發(fā)展用于在移植之后預(yù)防腫瘤形成的策略；6)該tNSCs經(jīng)由數(shù)個(gè)細(xì)胞傳代能夠在培養(yǎng)中生長(zhǎng)；以及7)該tNSCs能夠在無(wú)小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0188]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了一種用于治療急性以及慢性疾病的方法，其中該方法包括植入hTS細(xì)胞衍生的tNSCs。在一個(gè)實(shí)施方案中，該tNSCs被植入到患有神經(jīng)障礙的患者的腦內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，該tNSCs被植入到患有神經(jīng)障礙的患者的紋狀體內(nèi)。
[0189]此處所描述的一個(gè)方面是一種用于治療神經(jīng)疾病的方法，其中該方法包括tNSCs的位點(diǎn)特異性整合(site-specific integration)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該tNSCs衍生自hTS細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，與hES細(xì)胞治療相比，腫瘤形成的可能性是較低的。
通過(guò)多巴胺能神經(jīng)元的再生來(lái)治療神經(jīng)退化疾病
[0190]此處提供了用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的方法，其中此處所描述的神經(jīng)元祖細(xì)胞作為細(xì)胞懸浮液進(jìn)行移植，從而產(chǎn)生與組織塊的移植物相比更均質(zhì)的神經(jīng)再支配(reinnervation)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如此處所描述的多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)降低運(yùn)動(dòng)失調(diào)(dyskinesias)的風(fēng)險(xiǎn)并且增加臨床上有益的效果的可能性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是人類。在另一實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是大鼠、小鼠、豬、犬、猴、猩猩或人猿。
[0191]tNSCs的移植在黑質(zhì)紋狀體途徑中誘導(dǎo)新生成的多巴胺能神經(jīng)元并且實(shí)質(zhì)上改善了帕金森氏癥大鼠中的行為 障礙。這些結(jié)果提供的證據(jù)證明了 hTS細(xì)胞是適合在臨床應(yīng)用中使用以治療神經(jīng)退化疾病的人類多能干細(xì)胞。
[0192]進(jìn)行第一實(shí)驗(yàn)以檢測(cè):1)用RA處理不同持續(xù)時(shí)間的tNSCs是否會(huì)影響改善H)大鼠中的行為缺陷(behavioral deficits)的效力；以及2)如此植入的tNSCs在腦中能存活多久。根據(jù)阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)分析，將GFP標(biāo)記的tNSCs (1.5X IO6)移植到損傷的紋狀體的2個(gè)部位內(nèi)從第3周直到第12周顯著地改善行為缺陷(圖5a)。接受5天RA-誘導(dǎo)的tNSCs的H)大鼠在植入后6周的開始時(shí)顯著地改善，然而，此效果在第12周后消失而與對(duì)照組相似。此原因可以被解釋為大多數(shù)的神經(jīng)遺傳命運(yùn)限制的GRP (Gmz)在誘導(dǎo)超過(guò)5天
之后處于向未定義的滋養(yǎng)層巨細(xì)胞分化的脊(ridge)處。如有行為改善，大鼠在第18周時(shí)處死以檢測(cè)那些GFP標(biāo)記的tNSCs的活力。腦部切片以免疫組織化學(xué)方式顯示了在黑質(zhì)紋狀體途徑中大量新生成的多巴胺能神經(jīng)元，它們具有從細(xì)胞體中突起的多重外生長(zhǎng)，再支配周圍的腦區(qū)域(圖5b)。然而，在接受5天RA-誘導(dǎo)的tNSCs (圖5c)以及對(duì)照H)組(圖5d)的大鼠中，未觀察到此現(xiàn)象。在第18周，免疫熒光顯微術(shù)證明GFP標(biāo)記的tNSCs仍然存在于損傷的區(qū)域中，且呈散布的或斑點(diǎn)模式分布在注射部位。未發(fā)現(xiàn)畸胎瘤形成(teratomaformation),也未使用免疫抑制劑。
[0193]為了避免來(lái)自多巴胺能過(guò)度生長(zhǎng)以及不均勻且不一致的神經(jīng)再支配的不利影響，第二實(shí)驗(yàn)試圖將較少的tNSCs (I X IO6)通過(guò)注射在一個(gè)部位上來(lái)移植至“老年”H)大鼠(η=16 ;體重630-490gm)的損傷的紋狀體內(nèi)。行為評(píng)估在植入后每3周進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:在阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)測(cè)試中，從植入后的第3周至第12周對(duì)側(cè)的旋轉(zhuǎn)得到顯著改善(圖6a)。為了評(píng)估細(xì)胞治療對(duì)姿勢(shì)不平衡(postural imbalance)以及步態(tài)障礙(PI⑶)(特征為運(yùn)動(dòng)失能癥、僵硬以及步伐與平衡障礙)的效果，進(jìn)行數(shù)種測(cè)試(諸如步行速度、步伐長(zhǎng)度、跨步長(zhǎng)度以及支撐的基礎(chǔ))。受影響的前肢在杠上的抓握時(shí)間顯著地縮短了 3周并且在“杠測(cè)試(bar test) ”中于第12周結(jié)束時(shí)持續(xù)改善(圖6b)，這表明前肢的抓取力量得到非?？焖俚母纳?。步伐長(zhǎng)度(圖6c)、跨步長(zhǎng)度(圖6d)、步行速度(圖6e)以及支撐的基礎(chǔ)(圖6f)的測(cè)量顯示tNSCs的移植從第3周早期至第12周在功能上顯著地改善感覺運(yùn)動(dòng)障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，該tNSCs在再生醫(yī)學(xué)上是合適的候選物，以用于在神經(jīng)退化疾病(例如，帕金森氏癥)患者中以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療。在第12周結(jié)束時(shí)，處死大鼠并且對(duì)腦部切片進(jìn)行酪氨酸羥化酶(TH)免疫染色。實(shí)驗(yàn)顯示在黑質(zhì)紋狀體途徑中出現(xiàn)的新的多巴胺能神經(jīng)元的再生(圖19)。新生成的多巴胺神經(jīng)元使用密度測(cè)定法(densitometry)進(jìn)行評(píng)估，其顯示28.2%的復(fù)原。在一個(gè)實(shí)施方案中，在神經(jīng)退化疾病患者的治療中，該tNSCs是hES細(xì)胞以及胎兒中腦組織(fetal mesencephalic tissue)這兩者的備選替代物。
[0194]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處提供了一種hTS細(xì)胞，它是除了 hES細(xì)胞之外的人類多能干細(xì)胞，但在早期胚胎形成中具有多能性以及自我更新的相似特性。在體內(nèi)，經(jīng)移植的tNSCs在損傷的黑質(zhì)紋狀體途徑中功能性地新生多巴胺能神經(jīng)元，它們?cè)谥踩牒竽茉趓o大鼠中存活至少18周。根據(jù)在年輕以及老年ro大鼠這兩者中進(jìn)行的一組行為評(píng)估，感覺運(yùn)動(dòng)障礙早在植入后的第3周就得到顯著的改善。將hTS細(xì)胞衍生的NSCs移植至腦的神經(jīng)毒素-神經(jīng)切除的紋狀體(neurotoxin-denervated striatum)中能夠使缺失的多巴胺能神經(jīng)元再生，并改善患有H)的大鼠中的主要行為缺陷。
[0195]在一個(gè)實(shí)施方案中，黑質(zhì)紋狀體途徑中的DA神經(jīng)元再生。在另一實(shí)施方案中，植入的tNSCs增加紋狀體中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，RA誘導(dǎo)GRAP以及GFAP-陽(yáng)性的祖細(xì)胞的表達(dá)，這產(chǎn)生遍及CNS的神經(jīng)元以及少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocytes)。
阿爾茲海默癥的治療
[0196]此處提供了用于治療阿爾茲海默癥的方法，其中該方法包括將神經(jīng)元祖細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物的腦中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是人類。在另一實(shí)施方案中，該人類是經(jīng)診斷患有阿爾茲海默癥或處于發(fā)展阿爾茲海默癥的風(fēng)險(xiǎn)中的患者，例如，具有該疾病的家族史或已被鑒定為具有關(guān)于`該疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子的人。在另一實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是豬、犬、猴、猩猩或人猿。在另一實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是小鼠。在另一實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是大鼠。在另一實(shí)施方案中，該大鼠或小鼠展現(xiàn)阿爾茲海默癥的癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)元祖細(xì)胞被移植到該疾病的非人類動(dòng)物模型(例如，其中AD7C-NTP過(guò)度表達(dá)的小鼠模型、阿爾茲海默癥大鼠模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型等等)中。
[0197]在一個(gè)實(shí)施方案中，用誘導(dǎo)劑處理hTS細(xì)胞以提供具有生物標(biāo)記(biomarker)特征的神經(jīng)元細(xì)胞族群。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)劑是RA。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)分子機(jī)制或信號(hào)傳遞途徑以維持多能性。在另一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)分子機(jī)制或信號(hào)傳遞途徑以預(yù)防在移植之后的腫瘤形成。
[0198]在另一實(shí)施方案中，該tNSCs被移植或嵌入到哺乳動(dòng)物的腦中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該神經(jīng)元祖細(xì)胞作為細(xì)胞懸浮液進(jìn)行移植，從而產(chǎn)生更均質(zhì)的神經(jīng)再支配。在另一實(shí)施方案中，該神經(jīng)元祖細(xì)胞被注射到所述哺乳動(dòng)物的腦內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，衍生自hTS細(xì)胞的tNSCs被嵌入到腦的腦室下區(qū)(subventricular zone)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是人類。
[0199]在一個(gè)實(shí)施方案中，如此處所描述的神經(jīng)元的誘導(dǎo)減少腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)并且增加臨床上有益的效果的可能性。在另一實(shí)施方案中，tNSCs的接受者顯示與阿爾茲海默癥有關(guān)的癥狀得到改善。在另一實(shí)施方案中，腦中的神經(jīng)元之間的連接得到增加并且加強(qiáng)。 精神分裂癥的治療
[0200]此處提供了用于治療精神分裂癥的方法，其中該方法包括將神經(jīng)元祖細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物的腦中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是人類。在另一實(shí)施方案中，該人類是經(jīng)診斷患有精神分裂癥或處于發(fā)展精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)中的患者，例如，具有該疾病的家族史或已被鑒定為具有關(guān)于該疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子的人。在另一實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是小鼠。在另一實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是大鼠。在另一實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物是豬、犬、猴、猩猩或人猿。在另一實(shí)施方案中，該大鼠或小鼠展現(xiàn)精神分裂癥的癥狀。 [0201]在一個(gè)實(shí)施方案中，該神經(jīng)元祖細(xì)胞被移植到該疾病的非人類動(dòng)物模型(例如，精神分裂癥大鼠模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型等等)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，模型小鼠具有改變的神經(jīng)元系統(tǒng)的正常生理學(xué)調(diào)節(jié)。在另一實(shí)施方案中，該模型動(dòng)物或組織可用于篩選在細(xì)胞內(nèi)水平上發(fā)揮作用的潛在的治療劑和/或治療性方案。
[0202]在一個(gè)實(shí)施方案中，用誘導(dǎo)劑處理hTS細(xì)胞以提供具有生物標(biāo)記特征的神經(jīng)元細(xì)胞族群。在特定的實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)劑是RA。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)分子機(jī)制或信號(hào)傳遞途徑以維持多能性。在另一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)分子機(jī)制或信號(hào)傳遞途徑以預(yù)防在移植之后的腫瘤形成。
[0203]在另一實(shí)施方案中，tNSCs被移植或嵌入到哺乳動(dòng)物的腦中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該神經(jīng)元祖細(xì)胞作為細(xì)胞懸浮液進(jìn)行移植，從而產(chǎn)生更均質(zhì)的神經(jīng)再支配。在另一實(shí)施方案中，神經(jīng)元祖細(xì)胞被注射到所述哺乳動(dòng)物的腦內(nèi)。
[0204]在一個(gè)實(shí)施方案中，如此處所描述的神經(jīng)元的誘導(dǎo)減少腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)并且增加臨床上有益的效果的可能性。在另一實(shí)施方案中，tNSCs的接受者顯示與精神分裂癥有關(guān)的癥狀得到改善。
給藥(Dosing)及施用(Administration)
[0205]此處所描述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞制劑的施用模式包括，但不限于:全身性靜脈注射(systemic intravenous injection)以及直接注射到預(yù)期的活性位點(diǎn)。該制劑可通過(guò)任何便利的途徑[例如，通過(guò)輸注(infusion)或濃注(bolus injection)]來(lái)施用，并且可與其它生物活性劑(biologically active agents) 一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用是全身性定位施用(systemic localized administration)。
[0206]在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)干細(xì)胞制劑或組合物被配制為適用于靜脈內(nèi)施用至哺乳動(dòng)物(包括人類)的藥物組合物(pharmaceutical composition)。在一些實(shí)施方案中,用于靜脈內(nèi)施用的組合物是在無(wú)菌等滲水性緩沖液(sterile isotonic aqueous buffer)中的溶液。在必要時(shí)，該組合物也包含局部麻醉劑(local anesthetic)以減輕注射部位處的任何疼痛。當(dāng)該組合物通過(guò)輸注施用時(shí)，它可使用含有無(wú)菌藥學(xué)級(jí)水或鹽水(saline)的輸液瓶(infusion bottle)進(jìn)行分配。當(dāng)該組合物通過(guò)注射施用時(shí)，可提供用于注射的無(wú)菌水或鹽水的安瓿(ampoule)以使得所述成分在施用之前被混合。
[0207]在一個(gè)實(shí)施方案中，適合的藥物組合物包含治療有效量的祖干細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體(carrier)或賦形劑(excipient)。此載體包括,但不限于:鹽水、緩沖鹽水(buffered saline)、右旋糖(dextrose)、水及其組合。
[0208]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處所描述的分離的tNSCs通過(guò)適合用于將細(xì)胞靶向至特定組織的遞送系統(tǒng)而被遞送到靶部位(例如，腦、脊髓或任何其它神經(jīng)損傷和/或退化的部位)。例如，所述細(xì)胞被囊封在輸送載體(delivery vehicle)中，其允許所述細(xì)胞在祀部位處緩慢地釋出。該輸送載體經(jīng)修飾使得其特異性地靶向至特定的組織。靶向遞送系統(tǒng)的表面以各種不同的方式進(jìn)行修飾。在脂質(zhì)體靶向的遞送系統(tǒng)的情況下，脂質(zhì)基團(tuán)被并入到該脂質(zhì)體的脂雙層(lipid bilayer)中，以維持祀向配體與脂質(zhì)體雙層(liposomal bilayer)穩(wěn)定締合。
[0209]在另一個(gè)實(shí)例中，使用膠體分散系統(tǒng)(colloidal dispersion system)。膠體分散系統(tǒng)包括大分子復(fù)合體(macromolecule complexes)、納米膠囊(nanocapsules)、微球體(microspheres)、珠粒(beads)以及以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的系統(tǒng),包括水包油乳液(oil-1n-wateremulsions)、微胞(micelles)、混合的微胞(mixed micelles)以及脂質(zhì)體。
[0210]此處所描述的tNSCs的施用任選地通過(guò)下列方式對(duì)個(gè)體進(jìn)行定制:(I)增加或減少注射的細(xì)胞數(shù)量；(2)改變注射的數(shù)量；(3)改變所述細(xì)胞的遞送方法；或(4)改變細(xì)胞的來(lái)源，例如通過(guò)基因工程細(xì)胞或來(lái)自體外細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0211]tNSC制劑以有效促進(jìn)細(xì)胞植入接受者中的量來(lái)使用。在醫(yī)師的裁量下，調(diào)整施用以滿足最佳的效力以及藥理給藥。
篩選的方法
[0212]此處提供了篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與所述化合物接觸。在另一實(shí)施方案中，該方法包括使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞與所述化合物接觸。在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性改變。在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平改變。在另一實(shí)施方案中，該方法包括檢測(cè)所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性改變。
[0213]此處所提供的一個(gè)實(shí)施方案描述了一種針對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞中的改變的能力來(lái)篩選化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與所述化合物接觸。在另一實(shí)施方案中，該方法包括使經(jīng)分離的神經(jīng)祖干細(xì)胞與所述化合物接觸。在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)對(duì)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)。在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)對(duì)所述神經(jīng)干細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)。
[0214]此處還提供了一種針對(duì)細(xì)胞毒性(cellular toxicity)或細(xì)胞的調(diào)節(jié)來(lái)篩選化合物的方法，該方法包括使本發(fā)明的經(jīng)分化的細(xì)胞與化合物接觸。在另一實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括確定該細(xì)胞中任何起因于與該化合物接觸的表型或代謝改變，以及將該變化與細(xì)胞毒性或任何其它細(xì)胞功能或生物化學(xué)上的改變進(jìn)行關(guān)聯(lián)。在另一實(shí)施方案中，促進(jìn)了對(duì)分化的藥劑(pharmaceuticals)、毒素或潛在調(diào)節(jié)子的篩選。可以向培養(yǎng)基添加這些物質(zhì)(例如，藥劑、毒素或潛在調(diào)節(jié)子)。
[0215]此處所提供的一個(gè)實(shí)施方案描述了一種篩選增殖因子(proliferationfactors)、分化因子(differentiation factors)以及藥劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞被用來(lái)篩選影響人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)中的特性的因子[諸如小分子藥物、肽(peptides)、多核苷酸(polynucleotides)等]或條件(諸如培養(yǎng)條件或操作)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此系統(tǒng)具有不會(huì)被由測(cè)試化合物所造成的飼養(yǎng)細(xì)胞的干擾而引起的次級(jí)效應(yīng)(secondary effect)所復(fù)雜化的優(yōu)點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，測(cè)試了影響生長(zhǎng)的物質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，從該培養(yǎng)物中撤除條件培養(yǎng)基(conditioned medium)并用較單純的培養(yǎng)基予以取代。在另一實(shí)施方案中，接著用不同的可溶性因子的混合物(cocktails)(它們是用于取代該條件培養(yǎng)基的組分的候選物)處理不同的孔。若經(jīng)處理的細(xì)胞被維持并且以滿意的方式增殖(最佳地與在條件培養(yǎng)基中一樣)，則每種混合物的效力得以確定?？梢酝ㄟ^(guò)依據(jù)測(cè)試操作程序來(lái)處理細(xì)胞，并且接著確定經(jīng)處理的細(xì)胞是否發(fā)展特定譜系的經(jīng)分化的細(xì)胞的功能性或表型特性，來(lái)測(cè)試潛在的分化因子或條件。
[0216]在一個(gè)實(shí)施方案中，該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞被用來(lái)篩選細(xì)胞分化的潛在調(diào)節(jié)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞分化是神經(jīng)分化。例如，在一個(gè)用于篩選細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)子的分析中，該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞可在無(wú)血清、低密度條件(根據(jù)情況需要，在LIF的存在或缺少下、在調(diào)節(jié)子的存在下，以及在RA的存在或缺少下)下培養(yǎng)，并且可檢測(cè)對(duì)分化的效果。在另一實(shí)施方案中，此處所描述的篩選方法可用來(lái)研究與細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的條件以及篩選有關(guān)該條件的潛在治療劑或矯正藥物或調(diào)節(jié)子。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將正常的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育與具有該條件的細(xì)胞的發(fā)育相比較。
[0217]在一個(gè)實(shí)施方案中，基因以及蛋白質(zhì)表達(dá)可在從人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞獲得的不同細(xì)胞族群之間進(jìn)行比較，并且被用來(lái)鑒定和表征在分化過(guò)程中上調(diào)或下調(diào)的因子，并且生成受影響的基因的核苷酸拷貝(nucleotide copies)。
[0218]在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物也可在藥物研究中用于測(cè)試藥學(xué)化合物(pharmaceutical compounds)。候選藥學(xué)化合物的活性的評(píng)估通常涉及將本發(fā)明的經(jīng)分化的細(xì)胞與該候選化合物組合，確定任何所產(chǎn)生的改變，并且接著將該化合物的效果與觀察到的改變進(jìn)行關(guān)聯(lián)。在另一實(shí)施方案中，完成了篩選，例如，因?yàn)樵摶衔锉辉O(shè)計(jì)成對(duì)某些細(xì)胞類型具有藥理作用(pharmacological effect),或因?yàn)楸辉O(shè)計(jì)為在別處具有效果的化合物具有非預(yù)期的副作用。在另一實(shí)施方案中，兩種或多種藥物組合地(通過(guò)同時(shí)地或`依序地與細(xì)胞組合)進(jìn)行測(cè)試，以檢測(cè)可能的藥物-藥物交互作用效應(yīng)(interaction effects)。在另一實(shí)施方案中，最初針對(duì)潛在的毒性篩選化合物。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)對(duì)細(xì)胞活力(cell viability)、存活、形態(tài)學(xué)(morphology),對(duì)某些標(biāo)記、受體或酶的表達(dá)或釋放，對(duì)DNA合成或修復(fù)的作用來(lái)確定細(xì)胞毒性。
[0219]本文中的術(shù)語(yǔ)“治療(treating) ”、“治療(treatment) ”用于指獲得所需的藥理和/或生理效果。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體(例如，疑似患有神經(jīng)退化性障礙和/或在遺傳上有神經(jīng)退化性障礙患病傾向的個(gè)體)用此處所描述的tNSCs制劑進(jìn)行預(yù)防性治療，并且該預(yù)防性治療完全地或部分地預(yù)防神經(jīng)退化性障礙或者它的征兆或癥狀。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體接受治療性治療(例如，當(dāng)個(gè)體患有神經(jīng)退化性障礙時(shí))，該治療性治療造成對(duì)于障礙的部分或完全治愈(cure)，和/或逆轉(zhuǎn)可歸因于該障礙的副作用，和/或穩(wěn)定該障礙，和/或延緩該障礙的進(jìn)展，和/或造成該障礙的消退。
[0220]將tNSCs施用(例如，移植)至有治療需要的區(qū)域是通過(guò)，例如并且不受限地，手術(shù)期間的局部輸注、通過(guò)注射、通過(guò)導(dǎo)管(catheter)的方式,或通過(guò)植入物(implant)的方式來(lái)完成的，所述植入物是多孔性(porous)、非孔性(non-porous)或凝膠狀材料,包括膜，諸如硅膠膜(silastic membranes)或纖維。
[0221]將組合物“移植(transplanting) ”至哺乳動(dòng)物中意指通過(guò)本領(lǐng)域所建立的任何方法來(lái)將該組合物導(dǎo)入到該哺乳動(dòng)物的體內(nèi)。被導(dǎo)入的組合物是“移植物(transplant)”，并且該哺乳動(dòng)物是“接受者(recipient)”。該移植物以及該接受者可以是同源的(syngeneic)、同種異體的(allogeneic)或異種的(xenogeneic)。此外,該移植可以是自體移植。
[0222]“有效量(effective amount) ”是足以達(dá)到預(yù)期目的的治療劑的量。例如，用于增加hTS細(xì)胞或tNSCs數(shù)目的因子的有效量是足以在體內(nèi)或在體外(視情況而定)導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目增加的量。用于治療或改善神經(jīng)退化疾病或病況的組合物的有效量是足以減少或消除神經(jīng)退化疾病或病況的癥狀的組合物的量。給定的治療劑的有效量將會(huì)隨著諸如試劑的性質(zhì)、施用的途徑、要接受治療劑的動(dòng)物的大小與物種以及施用的目的等因素而變化。
[0223]在一個(gè)實(shí)施方案中，此處進(jìn)一步提供了遺傳修飾的tNSCs。操控改變了細(xì)胞的各種不同的性質(zhì)，例如，使它更適應(yīng)于或抵抗特定環(huán)境條件，和/或誘導(dǎo)由其生成一種或多種特定物質(zhì)，所述物質(zhì)可以例如改善細(xì)胞的活力?？梢赃M(jìn)行此類遺傳改變以使該細(xì)胞更適合在移植中使用，例如，以避免接受者對(duì)該細(xì)胞的排斥(有關(guān)基因治療操作程序的綜述，參見 Anderson, Science, 256:808 ；Mulligan, Science, 926 ；Miller, Nature, 357:455 ；VanBrunt, Biotechnology, 6 (10): 1149 ；以及 Yu 等人,Gene Therapy, 1:13)。
[0224]“載體(vector) ”意指重組DNA或RNA構(gòu)建體，諸如質(zhì)粒(plasmid)、卩遼菌體(phage)、重組病毒，或者其它的載體，當(dāng)導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中會(huì)產(chǎn)生對(duì)此處所描述的祖細(xì)胞的修飾。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并且包括那些在真核和/或原核細(xì)胞中可復(fù)制的表達(dá)載體和維持游離型(episomal)的表達(dá)載體或整合至宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的表達(dá)載體。
[0225]載體的構(gòu)建使用此 處所描述的技術(shù)來(lái)完成，例如，如在Sambrook等人，1989中所描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的質(zhì)粒或DNA片段以希望生成質(zhì)粒的形式進(jìn)行切割、裁剪以及再連接。若需要，使用任何適合的方法執(zhí)行用于確認(rèn)所構(gòu)建的質(zhì)粒中的正確序列的分析。用于構(gòu)建表達(dá)載體、制備體外轉(zhuǎn)錄物、將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中以及執(zhí)行有關(guān)評(píng)估基因表達(dá)及功能的分析的適合方法是已知的?；虺尸F(xiàn)、擴(kuò)增和/或表達(dá)直接在樣品中進(jìn)行測(cè)量，例如，通過(guò)傳統(tǒng)的Southern印跡法(Southern blotting)、用以定量mRNA的轉(zhuǎn)錄的Northern 印跡法(Northern blotting)、斑點(diǎn)印跡法(dot blotting) (DNA 或 RNA 分析)或原位雜交法(in situ hybridization)(使用可以此處所提供的序列為基礎(chǔ)的適當(dāng)標(biāo)記的探針)。
[0226]如此處所用的，諸如“轉(zhuǎn)染(transfection) ”、“轉(zhuǎn)化(transformation) ”等術(shù)語(yǔ)意指將核酸以功能形式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或生物體。此類術(shù)語(yǔ)包括各種不同的將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的方法，包括用 CaP04 轉(zhuǎn)染、電穿孔(electroporation)、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(viral Iransductionhi^轉(zhuǎn)染(Iipofection)、使用脂質(zhì)體和/或其它輸送載體遞送。
[0227]通過(guò)親和力技術(shù)(affinity techniques)或通過(guò)細(xì)胞分選(cell sorting)[諸如突光活化細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting)]對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，其中它們用適合的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，諸如偶聯(lián)至例如反義核酸分子或免疫球蛋白或其一部分上的熒光團(tuán)(f Iuorophore),或者內(nèi)生性突光蛋白質(zhì)(intrinsically fluorescent protein),諸如綠色突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)或它的變異體。如此處所用的，“分選(sorting)”意指第一細(xì)胞類型與第二細(xì)胞類型的至少部分物理分離。
[0228]如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“大約(about)”意指±15%。例如，術(shù)語(yǔ)“大約10”包括8.5至 11.5。
實(shí)施例
材料
[0229]抗體。用于免疫印跡法(immunoblot)以及免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocytochemistry):第一抗體:SSEA-1、-2、_3、CD90 以及巢蛋白(Chemicon)。神經(jīng)絲以及 GFAP (BioGenex)。Nanog、0ct4、Cdx2 以及 Sox2 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ?Ga q/11(C-19, sc-392)、GP (T-20, sc-378) ,RXRa ,RAR^、c_Src、pStat3、Stat3、PPl 類似物以及 β 肌動(dòng)蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) > TH(Sigma-AldrichSt.Louis, MO and Temcoula, CA)以及 5-輕色胺(Sigma-Aldrich St.Louis, MO)。[0230]第二抗體:[0231]siRNAs:Nanog siRNA 以及 Cdx2siRNA (Sigma-Aldrich St.Louis, MO)。[0232]用于流式細(xì)胞術(shù)的第一抗體:HLA-ABC、CD9、CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CK7、波形蛋白、6-整合蛋白、E-1丐黏素、L-選擇素、Nanog、0ct4、Cdx2以及Sox2購(gòu)自于BDBiosciences, San Jose, CA, USA ;HLA_DR、CD33、CD44 以及 CD105 來(lái)自于 eBioscience, SanDiego, CA, USA ；CD133 來(lái)自于 Miltenyi Biotec, Germany?[0233]為了進(jìn)行TH-2以及5-羥色胺免疫染色，細(xì)胞用PBS洗滌之后在4 °C下于0.1M PBS中孵育過(guò)夜。在室溫下與封閉溶液(50mL0.1MPBS、0.05g疊氮鈉、1%馬血清以及10%Triton X-100)孵育I小時(shí)之后，再次洗滌細(xì)胞。細(xì)胞與第一抗體，即TH-2 (1:200, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)以及 5-輕色胺(1:100, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)孵育2小時(shí)并且用PBS洗滌。通過(guò)與帶有FITC或PE的抗小鼠IgG(Sigma-Aldrich, St.Louis，MO)孵育I小時(shí)，用PBS徹底地洗滌細(xì)胞并且進(jìn)行免疫熒光分析。
實(shí)施例1:分離、分化以及細(xì)胞培養(yǎng)[0234]胚胎絨毛膜絨毛(Embryonic chorionic villous)經(jīng)由腹腔鏡手術(shù)(laparoscopic surgery)從婦女體內(nèi)的早期異位妊娠(孕齡:6_8周)的輸卵管獲得，由人體研究及倫理委員會(huì)的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(Institutional Review Boardon Human Subjects Research and Ethics Committees)所批準(zhǔn)。組織在無(wú)血清的α -MEM(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)中被絞碎并且用0.025%胰蛋白酶/EDTA(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)胰蛋白酶化 15 分鐘，通過(guò)添加含有 10%FBS 的 a -MEM終止該消化。重復(fù)此操作程序數(shù)次。在離心之后，收集細(xì)胞并且在37°C下于5%C02中用含有 20%FBS(JRH, Biosciences, San Jose, CA)和 1% 青霉素-鏈霉素的 a-MEM 培養(yǎng)。在培養(yǎng)2代之后通過(guò)商業(yè)試劑盒(Dako，Carpinteria，CA)測(cè)量，培養(yǎng)基中的hCG表達(dá)變得無(wú)法檢測(cè)。[0235]細(xì)胞分化:hTS細(xì)胞在37°C下于5%C02中被培養(yǎng)于含有20%FBS、1%青霉素-鏈霉素和 10yg/mL bFGF 的條件 a-MEM(CytoLab Ltd, Rehovot, Israel)中。培養(yǎng)基每 3 天更換。在5代之后，使用經(jīng)過(guò)改良的已公開的操作程序啟動(dòng)向各種不同的特化表型的分化。關(guān)于在Transwell板(Corning, New York, NY)中的細(xì)胞培養(yǎng),上層小室涂覆有500 μ L的4:1比例的含有PureCol的膠原蛋白凝膠(Inamed Biomaterials, Fremont, CA)以及條件L-DMEM(Gibco1Grand Island, NY)(使用 IM NaHCO3 調(diào)整至 ρΗ7.4)。細(xì)胞(4X IO5)培養(yǎng)于上層小室上的條件L-DMEM(ImL)中。下層小室含有條件H-DMEM(3mL)。初步的實(shí)驗(yàn)顯示:在這兩個(gè)小室中的葡萄糖水平可能在4小時(shí)內(nèi)達(dá)到平衡狀態(tài)。
[0236]亞表型的細(xì)胞分化:細(xì)胞在37°C下于5%C02中被培養(yǎng)于含有20%FBS、1%青霉素-鏈霉素和 10 μ g/mL bFGF 的條件 a -MEM(CytoLab Ltd, Rehovot, Israel)中。一般而言，培養(yǎng)基每3天更新。在培養(yǎng)5代之后，通過(guò)如圖12的表中所示的各種不同的策略進(jìn)行向各種不同的特定細(xì)胞表型的分化。對(duì)于成骨分化(osteogenic differentiation),使用菌素紅 S 試驗(yàn)(Alizarin red S assay) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)來(lái)分析細(xì)胞化學(xué)礦物基質(zhì)(cytochemical mineral matrix)以檢測(cè)鈣礦物質(zhì)含量。為了鑒定鈣沉積物,將細(xì)胞固定并且在黑暗中與2%硝酸銀溶液(w/v)孵育10分鐘，接著用去離子水徹底地洗滌并暴露于亮光下15分鐘。使用商業(yè)試劑盒(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)以von Kossa染色處理細(xì)胞，以檢測(cè)堿性磷酸酶活性。在酸性pH水平下使用阿爾新藍(lán)染色(Alcian blue staining)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)來(lái)確認(rèn)成軟骨分化(Chondrogenic differentiation)。對(duì)于成肌分化(myogenic differentiation),細(xì)胞與配于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的3%過(guò)氧化氫孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶酶活性。非特異性位點(diǎn)用含有10%人血清和0.l%Triton X-100的PBS封閉60分鐘并且用封閉緩沖液洗滌5分鐘。細(xì)胞在含有骨豁肌肌球蛋白重鏈特異性單克隆抗體(skeletal muscle myosin heavy chain-specificmonoclonal antibody)的封閉緩沖液(Vector Laboratories, Burlingame, CA)中孵育 I小時(shí)，接著使用VectaStain ABC試劑盒(Vector Laboratories)進(jìn)行染色。對(duì)于脂肪生成性分化，用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞，并且在含有1%1 丐的4%低聚甲醒(paraformaldehyde)中固定60分鐘，接著以70%乙醇洗滌。在暴露于2%油紅O試劑(Oil red O reagent)(Sigma-Aldrich, St.L ouis，MO) 5分鐘之后，用70%乙醇繼而通過(guò)水漂洗來(lái)移除過(guò)度的染色。油紅O染劑用作細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的指示劑。神經(jīng)干細(xì)胞用配于乙醇中的ΙΟμΜ全反式視黃酸(all-trans retinoic acid) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)來(lái)誘導(dǎo)。
實(shí)施例2:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0237]為了進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，hTS細(xì)胞如先前所述用全反式視黃酸(ΙΟμΜ)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)誘導(dǎo)過(guò)夜，繼而在FlB-GFP的DNA混合物中共轉(zhuǎn)染(Myers)。簡(jiǎn)言之，在4°C下將DNA混合物緩慢地添加到含有DOTAP (30 μ L)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)和 70 μ L HBSS 緩沖液[含有 NaCl (867g配于 80mLH20 中)]的 DOTAP (100 μ L)溶液加 2mL HEPES 溶液(1M, ρΗ7.4，Gibco)中，歷時(shí)15分鐘。在用PBS洗滌之后，細(xì)胞與DNA混合物充分地混合。在孵育過(guò)夜之后，通過(guò)培養(yǎng)2-3周直到集落形成為止經(jīng)G418選擇(400 μ g/mL, Roche Applied Science)而獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株。合并和裂解G418-抗性細(xì)胞并且通過(guò)使用單克隆抗GFP抗體(Stratagene, LaJolla, CA)的Western印跡法(Western blotting)進(jìn)行分析以定量表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)染子的百分比。通過(guò)傳代培養(yǎng)(subcultures),經(jīng)轉(zhuǎn)染的hTS細(xì)胞用甲醇固定(10分鐘)以通過(guò)免疫突光法(immunofluorescence)來(lái)檢測(cè)GFP的表達(dá)。轉(zhuǎn)染率獲得超過(guò)95%的效力。
實(shí)施例3 =RT-PCR及定量PCR(qPCR)[0238]為了進(jìn)行RT-PCR，使用TRIZOL試劑(Invitrogen)提取來(lái)自于IO5-1O6個(gè)細(xì)胞的總 RNA，并且使用 Ready-To-Go RT-PCR Beads 試劑盒(Ready-To-Go RT-PCR Beads kit)(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)來(lái)測(cè)定 mRNA 表達(dá)。簡(jiǎn)言之，反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上解析并且用溴化乙錠(ethidium bromide)來(lái)顯影。β-肌動(dòng)蛋白或β-2微球蛋白(β-2microglobulin)用作陽(yáng)性對(duì)照。全部實(shí)驗(yàn)執(zhí)行3個(gè)重復(fù)。關(guān)于qPCR,基因表達(dá)用 iQ5 實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)系統(tǒng)(iQ5Real-Time PCR Detection System) (Bio-RadLaboratories)進(jìn)行測(cè)量并且用 Bio-Rad iQ5 光學(xué)系統(tǒng)軟件 2.0 版(Bio-Rad iQ50pticalSystem Software, version2.0) (Bio-Rad Laboratories)進(jìn)行分析。相對(duì)mRNA 水平使用比較Ct法(comparative Ct method) (Bio-Rad,使用手冊(cè))進(jìn)行計(jì)算并且表示為相對(duì)于生物對(duì)照的比例。全部引物對(duì)經(jīng)確認(rèn)在一個(gè)循環(huán)內(nèi)大約使產(chǎn)物的量加倍并且產(chǎn)生預(yù)期大小的單一產(chǎn)物。
實(shí)施例4:ffestern印跡法
[0239] 將細(xì)胞接種至具有無(wú)血清培養(yǎng)基的IOcm皿中過(guò)夜，并且用或不用RA(IOyM)處理如所指示的多個(gè)時(shí)間間隔。在刺激之后，細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌兩次并且用RIPA裂解緩沖液(RIPA lysis buffer) (Minipore)裂解。蛋白質(zhì)濃度通過(guò)BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(BCAprotein assay kit) (Thermo)來(lái)測(cè)定。等量(30 μ g)的蛋白質(zhì)通過(guò) 8%SDS_PAGE 來(lái)解析，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并且在室溫下用5%脫脂奶粉封閉I小時(shí)。在封閉之后，該膜在4°C下與第一抗體孵育4小時(shí)。細(xì)胞用PBST洗滌3次，接著在室溫下與HRP偶聯(lián)的第二抗體孵育I小時(shí)。在用PBST緩沖液洗滌6次之后，該膜與化學(xué)發(fā)光底物(chemiluminescentsubstrate) (GE Healthcare)孵育I分鐘。特定的條帶使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(enhancedchemi luminescence kit, ECL) (Amersham)來(lái)顯影。
實(shí)施例5: Southern印跡法
[0240]hTS細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度如先前所述在第3代和第7代通過(guò)Southern免疫印跡分析進(jìn)行測(cè)量(Tsai)。簡(jiǎn)言之,將片段轉(zhuǎn)移到Hybond N+尼龍膜(Hybond N+nylon membranes)(Amersham Biosciences)并且在 65 °C 下與使用 Ready-To-Go 標(biāo)記珠粒(Ready-To-Golabeling beads) (Amersham Biosciences)以 a-32P_dCTP 標(biāo)記的 TTAGGG 重復(fù)序列的探針雜交。末端限制片段通過(guò)與互補(bǔ)于端粒重復(fù)序列的標(biāo)記的寡核苷酸雜交進(jìn)行顯影。TRF的大小分布與DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。
實(shí)施例6:末端限制片段(TRF)Southern印跡法
[0241]自細(xì)胞啟動(dòng)它的癌變以后，它的端粒將會(huì)變得非常短。端粒長(zhǎng)度在hTS細(xì)胞的培養(yǎng)中于第3以及第7代進(jìn)行測(cè)量。簡(jiǎn)言之，將片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜(AmershamBiosciences)并且在 65°C下與使用 Ready-To-Go 標(biāo)記珠粒(Amersham Biosciences)以a -[32P]-dCTP標(biāo)記的TTAGGG重復(fù)序列的探針雜交。末端限制片段通過(guò)與互補(bǔ)于端粒重復(fù)序列的標(biāo)記的寡核苷酸雜交進(jìn)行顯影。末端限制片段的大小分布與DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。關(guān)于電子顯微術(shù)，hTS細(xì)胞衍生的葡萄樣細(xì)胞群(hTS cell-derived grape-like cellmass)通過(guò)透射電子顯微術(shù)(JEM-2000EXII，JEOL，Tokyo，Japan)進(jìn)行檢測(cè)以鑒定細(xì)胞的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。
[0242]0ct4、Sox2、NANOG、fgfr2、FGF4、BMP4、Cdx2 以及內(nèi)源性對(duì)照 β -肌動(dòng)蛋白(ACTB)在hTS以及用500單位LIF(Chemicon，Temecula, CA)處理的hTS細(xì)胞中的差異性基因表達(dá)通過(guò)使用突光素(fluorescein)作為用于標(biāo)準(zhǔn)化孔間光學(xué)偏差(well_to_welloptical variation)的內(nèi)部被動(dòng)參考染料(internal passive reference dye)的 IQ5 實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)進(jìn)行測(cè)量。在含有 12.5yL 的 2X SYBR Greensupermix(Bio-Rad)、0.5 μ L的10 μ M的各個(gè)引物以及0.5 μ L的cDNA樣品并與無(wú)菌水混合的25 μ L總體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)開始于95°C，3分鐘；接著是60個(gè)由95°C下變性(denaturation) 30s、6CTC下退火(annealing) 30s、72°C下延伸(extension) 15s 所構(gòu)成的 3步擴(kuò)增循環(huán)。在最終解離階段，運(yùn)行以生成用于確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的解鏈曲線(meltingcurve) ο 通過(guò) Bio-Rad IQ5 光學(xué)系統(tǒng)軟件 2.0 版(Bio-Rad IQ5optical system softwareversion2.0) (Bio-Rad)監(jiān)測(cè)并分析實(shí)時(shí)qPCR。相對(duì)mRNA水平使用比較Ct法(Bio-Rad使用手冊(cè))進(jìn)行計(jì)算并且表示為相對(duì)于生物對(duì)照的比例。ACTB轉(zhuǎn)錄物水平經(jīng)確認(rèn)與總RNA量非常相關(guān)，因而始終用于標(biāo)準(zhǔn)化。全部使用的引物對(duì)經(jīng)確認(rèn)在一個(gè)循環(huán)內(nèi)大約使產(chǎn)物的量加倍并且產(chǎn)生預(yù)期大小的單一產(chǎn)物。0ct4、Sox2、NAN0G、fgfr2、FGF4、BMP4、Cdx2以及內(nèi)源性對(duì)照肌動(dòng)蛋白(ACTB)的引物序列示于所附的數(shù)據(jù)表3中。
【權(quán)利要求】
1.一種經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞衍生自從滋養(yǎng)層組織中所得到的干細(xì)胞。
2.—種經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞,其中所述神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct_4、神經(jīng)絲、Ngn3、Neo-D, MAP-2、CD133、RARP、RXRa、RXRβ、CRABP-2、CRBP-K RALDH-2 或RALDH-3中的一種或多種的轉(zhuǎn)錄物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有正常的核型。
5.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有一種或多種免疫豁免的特性。
6.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其中所述一種或多種免疫豁免的特性包括不存在CD33表達(dá)和/或⑶133表達(dá)。
7.—種使權(quán)利要求1或2的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的方法，該方法包括:將所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞施用至哺乳動(dòng)物的腦中，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述神經(jīng)元是多巴胺能神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元或GABA能(Y -氨基丁酸)神經(jīng)元。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，用誘導(dǎo)藥物預(yù)誘導(dǎo)所述祖細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中該誘導(dǎo)期為至少I天。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，未用誘導(dǎo)藥物預(yù)誘導(dǎo)所述祖細(xì)`胞。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，所述哺乳動(dòng)物的所述腦被損害或蒙受神經(jīng)元缺失。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述損害是針對(duì)多巴胺能神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元、GABA能(Y -氨基丁酸)神經(jīng)元的。
14.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述神經(jīng)元缺失是針對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的。
15.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)胞用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。
16.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述干細(xì)胞在被施用至所述個(gè)體的腦中之后，會(huì)移轉(zhuǎn)至該個(gè)體的腦的黑質(zhì)致密部(SNc)區(qū)域。
17.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述施用改善所述哺乳動(dòng)物中的感覺運(yùn)動(dòng)功能。
18.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述施用導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物的僵硬、運(yùn)動(dòng)失能癥或平衡障礙的減輕。
19.一種使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化成多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括:將所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞施用至哺乳動(dòng)物的腦中，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神經(jīng)絲、NgN3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARP ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一種或多種的轉(zhuǎn)錄物，其中所述哺乳動(dòng)物的所述腦被損害或已蒙受神經(jīng)元缺失，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞中的一種或多種分化成多巴胺能神經(jīng)J Li ο
20.一種使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化成多巴胺能神經(jīng)元的方法，該方法包括:將所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞施用至哺乳動(dòng)物的腦中，其中所述分離的神經(jīng)干細(xì)胞衍生自滋養(yǎng)層組織，其中所述哺乳動(dòng)物的所述腦被損害或已蒙受神經(jīng)元缺失，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞中的一種或多種分化成多巴胺能神經(jīng)元。
21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述施用改善所述哺乳動(dòng)物中的感覺運(yùn)動(dòng)功倉(cāng)泛。
22.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述施用導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物的僵硬、運(yùn)動(dòng)失能癥或平衡障礙的減輕。
23.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中在所述施用之前，用誘導(dǎo)藥物預(yù)誘導(dǎo)所述祖細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中該誘導(dǎo)期為至少I天。
25.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中在所述施用之前，未用誘導(dǎo)藥物預(yù)誘導(dǎo)所述祖細(xì)胞。
26.一種使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包括:調(diào)節(jié)Cdx2、似11(^、巢蛋白、神經(jīng)絲、呢11-3、獻(xiàn)?-2、他0-0、0)133、0(^4、狀1^ ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 基因的活性。
27.一種使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包括:調(diào)節(jié)Cdx2、似11(^、巢蛋白、0(^4、神經(jīng)絲、呢11-3、獻(xiàn)?-2、他0-0、0)133、狀1^ ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2 或 RALDH-3 轉(zhuǎn)錄物的水平。
28.一種使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包括:調(diào)節(jié)Cdx2、似11(^、巢蛋白、0(^4、神經(jīng)絲、呢11-3、獻(xiàn)?-2、恥0-0、0)133、狀1^ ,RXRa、RXRP、CRABP_2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3蛋白質(zhì)的水平或活性。
29.—種篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法，其包括: a.使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及 b.檢測(cè)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性的改變。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞相比，所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的所述活性降低。
31.如權(quán)利要求29或30所述的方法，其中與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞相比，所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中的至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的所述活性增加。
32.如權(quán)利要求29至31所述的方法，其中所述疾病是神經(jīng)退化性障礙。
33.如權(quán)利要求29至32所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、路易氏體癥、脊髓性肌萎縮、多系統(tǒng)萎縮、癡呆、精神分裂癥、麻痹、多發(fā)性硬化癥、脊髓損傷、腦損傷(例如，中風(fēng))、腦神經(jīng)障礙、周邊感覺神經(jīng)病變、癲癇、朊病毒障礙、克雅氏病、阿爾珀斯病、小腦/脊髓小腦退化、巴滕病、皮質(zhì)基底核退化、貝爾氏麻痹、格林-巴利綜合征、皮克病和自閉癥。
34.一種篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法，其包括: a.使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及 b.檢測(cè)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平的改變。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞相比，所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的所述水平降低。
36.如權(quán)利要求34或35所述的方法，其中與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞相比，所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的所述水平增加。
37.如權(quán)利要求34至36所述的方法，其中所述疾病是神經(jīng)退化性障礙。
38.如權(quán)利要求34至37所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、路易氏體癥、脊髓性肌萎縮、多系統(tǒng)萎縮、癡呆、精神分裂癥、麻痹、多發(fā)性硬化癥、脊髓損傷、腦損傷(例如，中風(fēng))、腦神經(jīng)障礙、周邊感覺神經(jīng)病變、癲癇、朊病毒障礙、克雅氏病、阿爾珀斯病、小腦/脊髓小腦退化、巴滕病、皮質(zhì)基底核退化、貝爾氏麻痹、格林-巴利綜合征、皮克病和自閉癥。
39.一種針對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞中的改變的能力篩選化合物的方法，其包括: a.使經(jīng)分離的人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及 b.檢測(cè)對(duì)所述人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)。
40.一種針對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞中的改變的能力篩選化合物的方法，其包括: a.使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及 b.檢測(cè)對(duì)所述神經(jīng)干細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)。
41.一種篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法，其包括: a.使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及 b.檢測(cè)所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性的改變。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞相比，所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的所述活性降低。
43.如權(quán)利要求41或42所述的方法，其中與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞相比，所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種基因、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的活性增加。
44.如權(quán)利要求41至43所述的方法，其中所述疾病是神經(jīng)退化性障礙。
45.如權(quán)利要求41至44所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、路易氏體癥、脊髓性肌萎縮、多系統(tǒng)萎縮、癡呆、精神分裂癥、麻痹、多發(fā)性硬化癥、脊髓損傷、腦損傷(例如，中風(fēng))、腦神經(jīng)障礙、周邊感覺神經(jīng)病變、癲癇、朊病毒障礙、克雅氏病、阿爾珀斯病、小腦/脊髓小腦退化、巴滕病、皮質(zhì)基底核退化、貝爾氏麻痹、格林-巴利綜合征、皮克病和自閉癥。
46.一種篩選用于治療或預(yù)防疾病的化合物的方法，其包括: a.使經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞與所述化合物接觸；以及 b.檢測(cè)所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平的改變。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞相比，所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的所述水平降低。
48.如權(quán)利要求46或47所述的方法，其中與未接觸所述化合物的可比較的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞相比，所述神經(jīng)干細(xì)胞中至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的所述水平增加。
49.如權(quán)利要求46至48所述的方法，其中所述疾病是神經(jīng)退化性障礙。
50.如權(quán)利要求46至49所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、路易氏體癥、脊髓性肌萎縮、多系統(tǒng)萎縮、癡呆、精神分裂癥、麻痹、多發(fā)性硬化癥、脊髓損傷、腦損傷(例如，中風(fēng))、腦神經(jīng)障礙、周邊感覺神經(jīng)病變、癲癇、朊病毒障礙、克雅氏病、阿爾珀斯病、小腦/脊髓小腦退化、巴滕病、皮質(zhì)基底核退化、貝爾氏麻痹、格林-巴利綜合征、皮克病和自閉癥。
51.一種用于治療有需要的哺乳動(dòng)物中的神經(jīng)障礙的方法，其包括將至少一種神經(jīng)干細(xì)胞施用至所述哺乳動(dòng)物，其中該細(xì)胞是經(jīng)免疫豁免的。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠、豬、犬、猴、猩猩或人猿。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
54.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述有需要的哺乳動(dòng)物具有一種或多種與神經(jīng)障礙有關(guān)的癥狀。
55.如權(quán)利要求54所述的方法,其中所述一種或多種癥狀選自于由下列所構(gòu)成的群組:僵硬、平衡障礙、震顫、步態(tài)障礙、不良性步態(tài)、癡呆、過(guò)度腫脹(水腫)、肌無(wú)力、下肢萎縮、運(yùn)動(dòng)障礙(舞蹈病)、肌肉僵直、物理運(yùn)動(dòng)的減慢(運(yùn)動(dòng)遲緩)、物理運(yùn)動(dòng)的缺失(運(yùn)動(dòng)失能癥)、健忘、認(rèn)知(智能)損傷、辨識(shí)的缺失(失識(shí)癥)、受損的功能諸如決策與計(jì)劃、單側(cè)面麻痹、感覺缺失、麻木、刺痛感、四肢的疼痛感覺異常、虛弱、腦神經(jīng)麻痹、語(yǔ)言障礙、眼球運(yùn)動(dòng)、視野缺損、失明、出血、分泌物、近端肌萎縮、運(yùn)動(dòng)困難癥、四肢肌肉張力的異常、肌強(qiáng)直減少、動(dòng)作失調(diào)、在手指-手指測(cè)試或手指-鼻測(cè)試中錯(cuò)誤的指示、辨距不良、霍-斯二氏現(xiàn)象、不完全的或完全的全身性麻痹、視神經(jīng)炎、視物顯多癥、眼球運(yùn)動(dòng)障礙如眼球震顫、痙攣性麻痹、痛苦的強(qiáng)直發(fā)作、萊爾米特綜合征、共濟(jì)失調(diào)、語(yǔ)言困難、膀胱直腸障礙、起立性低血壓、運(yùn)動(dòng)功能的減退、尿床、貧乏的言語(yǔ)表達(dá)、不充足的睡眠型態(tài)、睡眠障礙、食欲障礙、體重改變、精神運(yùn)動(dòng)性激動(dòng)或遲滯、減少的活力、無(wú)價(jià)值的感受或過(guò)度或不適當(dāng)?shù)膬?nèi)疚、思考或全神貫注困難、反復(fù)的死亡意圖或者自殺的意念或企圖、害怕、焦慮、興奮增盛、沉思的或強(qiáng)迫性沉思、過(guò)度擔(dān)心身體健康、恐慌發(fā)作以及恐懼癥。`
56.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述神經(jīng)障礙是帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、路易氏體癥、脊髓性肌萎縮、多系統(tǒng)萎縮、癡呆、精神分裂癥、麻痹、多發(fā)性硬化癥、脊髓損傷、腦損傷(例如，中風(fēng))、腦神經(jīng)障礙、周邊感覺神經(jīng)病變、癲癇、朊病毒障礙、克雅氏病、阿爾珀斯病、小腦/脊髓小腦退化、巴滕病、皮質(zhì)基底核退化、貝爾氏麻痹、格林-巴利綜合征、皮克病和自閉癥。
57.如權(quán)利要求51所述的方法，其中該神經(jīng)干細(xì)胞衍生自滋養(yǎng)層組織。
58.如權(quán)利要求51所述的方法，其中該經(jīng)免疫豁免的細(xì)胞具有低水平的CD33表達(dá)。
59.如權(quán)利要求51所述的方法，其中該經(jīng)免疫豁免的細(xì)胞具有低水平的CD133表達(dá)。
60.如權(quán)利要求51所述的方法,其中該神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)Cdx2、Nanog、巢蛋白、0ct_4、神經(jīng)絲、NgN3、Neo-D, MAP-2、CD133、RAR^、RXRa、RXRβ、CRABP-2、CRBP-K RALDH-2 或RALDH-3中的一種或多種的轉(zhuǎn)錄物。
61.如權(quán)利要求51所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括將所述一種或多種神經(jīng)干細(xì)胞施用到哺乳動(dòng)物的腦中，其中該細(xì)胞分化成神經(jīng)元。
62.如權(quán)利要求51所述的方法，所述施用包括注射或植入。
63.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述神經(jīng)元是多巴胺能神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元或者GABA能(Y -氨基丁酸)神經(jīng)元。
64.如權(quán)利要求56所述的方法，其中在所述施用之前，用誘導(dǎo)藥物進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)所述祖細(xì)胞。
65.如權(quán)利要求56所述的方法，其中該神經(jīng)祖干細(xì)胞不會(huì)引起免疫反應(yīng)。
66.如權(quán)利要求56所述的方法，其中該神經(jīng)祖干細(xì)胞不會(huì)形成腫瘤。
67.一種誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞的方法，其包括: a.使該干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸； b.在該干細(xì)胞中用誘導(dǎo)藥物來(lái)調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3P、HDAC6、β _ 聯(lián)蛋白、G a q/11、G β ,RXRa、RARP ,GLuRUPI3K、AKtl、AKt2、AKt3、mT0R、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羥化酶)、ΡΙΧ_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、鈣依賴磷酸酶、CRMP-2、NFATl、輸入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A 或 EP300 ；以及 c.誘導(dǎo)或促進(jìn)該干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。
70.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
71.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該干細(xì)胞是內(nèi)胚層、中胚層、外胚層或間質(zhì)干細(xì)胞。
72.如權(quán)利要求67所述的方法，`其中該干細(xì)胞來(lái)自于小鼠、大鼠、人類、黑猩猩、大猩猩、犬、豬、山羊、海豚或牛。
73.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該干細(xì)胞來(lái)自于人類。
74.如權(quán)利要求67所述的方法，其中該干細(xì)胞是人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞。
75.如權(quán)利要求第67所述的方法，其中該具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞具有與下列細(xì)胞相似的表型:神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、多巴胺生成細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、單極神經(jīng)元、雙極神經(jīng)元、多極神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元、GABA能(Y-氨基丁酸)神經(jīng)元、錐體細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞以及前角細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、貝茨細(xì)胞、閏紹細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、GRP細(xì)胞、NRP細(xì)胞、麗S細(xì)胞、AST細(xì)胞或TGC細(xì)胞或中等棘細(xì)胞。
76.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述誘導(dǎo)藥物包括:視黃酸、煙酰胺或β-巰基乙醇、維生素Β12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羥基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤或胰島素。
77.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括:增加該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的活性。
78.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括:增加該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的表達(dá)。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中增加表達(dá)包括:增加編碼該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的mRNA的量，或增加由mRNA翻譯而來(lái)的該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的量。
80.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括:降低該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的活性。
81.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括:減少該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的表達(dá)。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中減少表達(dá)包括:減少編碼該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的mRNA的量，或減少由mRNA翻譯而來(lái)的該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的量。
83.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述神經(jīng)元特性包括:多巴胺、谷氨酸NMDA受體的亞基、突觸蛋白1、α -鈣通道標(biāo)記、GAP-43、電壓依賴的K+通道、電壓依賴的Ca+通道或電壓依賴的Na+通道的表達(dá)。
84.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)是Wnt2B。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被活化。
86.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被去活化。
87.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被活化，并接著被去活化。
88.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被去活化，并接著被活化。
89.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。
90.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B促進(jìn)或誘導(dǎo)多巴胺表達(dá)。
91.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)是GSK33。
92.如權(quán)利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被活化。
93.如權(quán)利要求91所述的方法，其中所述GSK30被去活化。
94.如權(quán)利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被活化，并接著被去活化。
95.如權(quán)利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被去活化，并接著被活化。
96.如權(quán)利要求91所述的方法，其中所述GSK30促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。
97.如權(quán)利要求91所述的方法，其中所述GSK30調(diào)節(jié)微管裝配。
98.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)是CREBl。
99.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述CREBl被活化。
100.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述CREBl被去活化。
101.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述CREBl被活化，并接著被去活化。
102.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述CREBl被去活化，并接著被活化。
103.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述CREBl促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。
104.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述CREBl促進(jìn)或誘導(dǎo)多巴胺表達(dá)。
105.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)是CaMKII。
106.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被活化。
107.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被去活化。
108.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被活化，并接著被去活化。
109.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被去活化并接著被活化。
110.如權(quán)利要求105所述的方法，其中所述CaMKII促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。
111.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該CaMKII調(diào)節(jié)微管裝配。
112.如權(quán)利要求67至75所述的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)是MAPT。
113.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述MAPT被活化。
114.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述MAPT被去活化。
115.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述MAPT被活化并接著被去活化。
116.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述MAPT被去活化并接著被活化。
117.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述MAPT促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。
118.如權(quán)利要求112所述的方法，其中所述MAPT調(diào)節(jié)微管裝配。
119.一種誘導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞的方法，其包括: a.使該干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸； b.在該干細(xì)胞中用誘導(dǎo)藥物來(lái)調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3P、HDAC6、β -聯(lián)蛋白、G a q/11、G β ,RXRa、RARP ,GLuRUPI3K、AKtl、AKt2、AKt3、mT0R、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羥化酶)、ΡΙΧ_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、鈣依賴磷酸酶、CRMP-2、NFATl、輸入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A 或 EP300 ；以及 c.誘導(dǎo)或促進(jìn)該干細(xì)胞分化成具有降低的免疫原性的細(xì)胞。
120.如權(quán)利要求119所述的方法，其中該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞。
121.如權(quán)利要求119所述的方法，其中該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。
122.如權(quán)利要求119所述的方法，其中該干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
123.如權(quán)利要求119所述的方法，其中該干細(xì)胞是內(nèi)胚層、中胚層、外胚層或間質(zhì)干細(xì)胞。
124.如權(quán)利要求119所述的方法，其中該具有降低的免疫原性的細(xì)胞具有與下列細(xì)胞相似的表型:神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、多`巴胺生成細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、單極神經(jīng)元、雙極神經(jīng)元、多極神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元、GABA能(Y -氨基丁酸)神經(jīng)元、錐體細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞以及前角細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、貝茨細(xì)胞、閏紹細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、GRP細(xì)胞、NRP細(xì)胞、麗S細(xì)胞、AST細(xì)胞或TGC細(xì)胞，或中等棘細(xì)胞。
125.如權(quán)利要求119所述的方法，其中該干細(xì)胞來(lái)自于小鼠、大鼠、人類、黑猩猩、大猩猩、犬、豬、山羊、海豚或牛。
126.如權(quán)利要求119所述的方法，其中該干細(xì)胞來(lái)自于人類。
127.如權(quán)利要求119所述的方法，其中該干細(xì)胞是人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞。
128.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中該具有降低的免疫原性的細(xì)胞不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或可以抑制免疫反應(yīng)。
129.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中該具有降低的免疫原性的細(xì)胞不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或可以抑制免疫反應(yīng)。
130.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中該具有降低的免疫原性的細(xì)胞不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，或者可以通過(guò)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肥大細(xì)胞或NK細(xì)胞來(lái)抑制免疫反應(yīng)。
131.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中所述誘導(dǎo)藥物包括:視黃酸、煙酰胺或β-巰基乙醇、維生素B12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羥基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤或胰島素。
132.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括:增加該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的活性。
133.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括:增加該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的表達(dá)。
134.如權(quán)利要求133所述的方法，其中增加表達(dá)包括:增加編碼該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的mRNA的量，或增加由mRNA翻譯而來(lái)的該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的量。
135.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括:降低該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的活性。
136.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括:減少該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的表達(dá)。
137.如權(quán)利要求136所述的方法，其中減少表達(dá)包括:減少編碼該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的mRNA的量，或減少由mRNA翻譯而來(lái)的該一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種的量。
138.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括:誘導(dǎo)或促進(jìn)該干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞，其中所述神經(jīng)元特性包括:多巴胺、谷氨酸NMDA受體的亞基、突觸蛋白1、α -鈣離子通道標(biāo)記、GAP-43、電壓依賴的K+通道、電壓依賴的Ca+通道或電壓依賴的Na+通道的表達(dá)。
139.如權(quán)利要求119至127所述的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)是NFAT。
140.如權(quán)利要求139所述的方法，其中所述NFAT被活化。
141.如權(quán)利要求139所述的方法，其中所述NFAT被去活化。
142.如權(quán)利要求139所述的方法，其中所述NFAT被活化并接著被去活化。
143.如權(quán)利要求139所述的方法，其中所述NFAT被去活化并接著被活化。
144.如權(quán)利要求139所述的方法，其中所述NFAT促進(jìn)該干細(xì)胞的分化或增殖。
145.如權(quán)利要求139所述的方法，其中所述NFAT調(diào)節(jié)微管裝配。
146.一種誘導(dǎo)或促進(jìn)人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成tNSC(滋養(yǎng)層神經(jīng)干細(xì)胞)的方法，其包括: a.使該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸； b.在該干細(xì)胞中用誘導(dǎo)藥物來(lái)調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRATl、GSK3P、HDAC6、β _ 聯(lián)蛋白、G a q/11、G β ,RXRa、RARP ,GLuRUPI3K、AKtl、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羥化酶)、ΡΙΧ_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、鈣依賴磷酸酶、CRMP-2、NFATl、輸入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A 或 EP300 ；以及 c.誘導(dǎo)或促進(jìn)該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成tNSC。
147.如權(quán)利要求146所述的方法，其中該誘導(dǎo)藥物包括:視黃酸、煙酰胺或β-巰基乙醇、維生素Β12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羥基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤或胰島素。
148.如權(quán)利要求146所述的方法，其中該tNSC具有降低的免疫原性。
149.如權(quán)利要求146所述的方法，其中該tNSC不會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，或可以抑制免疫細(xì)胞所引起的免疫反應(yīng)。
150.如權(quán)利要求148所述的方法，其中該免疫細(xì)胞是T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肥大細(xì)胞或NK細(xì)胞。
151.一種誘導(dǎo)或促進(jìn)人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成具有與神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、多巴胺生成細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、單極神經(jīng)元、雙極神經(jīng)元、多極神經(jīng)元、谷氨酰胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元、GABA能(Y-氨基丁酸)神經(jīng)元、錐體細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞以及前角細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、貝茨細(xì)胞、閏紹細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、GRP細(xì)胞、NRP細(xì)胞、MNS細(xì)胞、AST細(xì)胞或TGC細(xì)胞或中等棘細(xì)胞相似的表型的細(xì)胞的方法，其包括: a.使該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞與誘導(dǎo)藥物接觸； b.在該干細(xì)胞中用誘導(dǎo)藥物來(lái)調(diào)節(jié)一種或多種蛋白質(zhì)，其中該一種或多種蛋白質(zhì)包括:Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT l、GSK3P、HDAC6、β -聯(lián)蛋白、G a q/11、G β ,RXRa、RARP ,GLuRUPI3K、AKtl、AKt2、AKt3、mT0R、EIF4EBP、CREBl、TH(酪氨酸羥化酶)、ΡΙΧ_β、PIP2、CaMKI1、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、鈣依賴磷酸酶、CRMP-2、NFATl、輸入蛋白、LEFl、Pitx2、MEF2A 或 EP300 ；以及 c.誘導(dǎo)或促進(jìn)該人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、多巴胺生成細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元、單極神經(jīng)元、雙極神經(jīng)元、多極神經(jīng)元、錐體細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞以及前角細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、貝茨細(xì)胞、閏紹細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、GRP細(xì)胞、NRP細(xì)胞、MNS細(xì)胞、AST細(xì)胞或TGC細(xì)胞，或中等棘細(xì)胞。
152.—種通過(guò)使哺乳動(dòng)物干細(xì)胞與LIF接觸而維持其增殖能力的方法。
153.如權(quán)利要求152所述的方法，其中該LIF的濃度介于1-1000U/ML之間。
154.如權(quán)利要求152所述的方法，其中該LIF的濃度是大約125至大約250U/ML。
155.如權(quán)利要求152所述的方法，其中該LIF的濃度是大約125至大約500U/ML。
156.如權(quán)利要求152所述的方法，其中該LIF的濃度是大約125至大約1000U/ML。
157.如權(quán)利要求152至156所述的方法，其中該干細(xì)胞是滋養(yǎng)層、胚胎或經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
158.如權(quán)利要求152至156所述的方法，其中該干細(xì)胞是人類、小鼠、大鼠、人類、黑猩猩、大猩猩、犬、豬、山羊、海豚或牛干細(xì)胞。
159.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)高水平的HLA-ABC(MHC-1)。
160.如權(quán)利要求159所述的方法，其中所述水平高于人類胚胎干細(xì)胞所表達(dá)的水平。
161.如權(quán)利要求159所述的方法，其中所述水平與人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞所表達(dá)的水平相似。
162.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)低水平的⑶33。
163.如權(quán)利要求162所述的方法，其中所述水平低于人類胚胎干細(xì)胞所表達(dá)的水平。
164.如權(quán)利要求162所述的方法，其中所述水平低于人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞所表達(dá)的水平。
165.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞不表達(dá)⑶33。
166.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述分離的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)低水平的⑶133。
167.如權(quán)利要求164所述的方法，其中所述水平低于人類胚胎干細(xì)胞所表達(dá)的水平。
168.如權(quán)利要求164所述的方法，其中所述水平低于人類滋養(yǎng)層干細(xì)胞所表達(dá)的水平。
169.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)低水平的⑶34。
170.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞在施用至受體哺乳動(dòng)物中之后不會(huì)形成畸胎瘤。
171.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，其中所述經(jīng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞在施用至受體人類中之后不會(huì)形成畸胎瘤。
172.如權(quán)利要求51所述的方法，其中該經(jīng)免疫豁免的細(xì)胞表達(dá)CD34。
173.—種抑制腫瘤細(xì)胞的方法，其包括: a.使該腫瘤細(xì)胞與化合物接觸； b.調(diào)節(jié)該腫瘤細(xì)胞中的AhR;以及 c.通過(guò)該調(diào)節(jié)來(lái)抑制該腫瘤細(xì)胞。
174.—種減少腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括: a.使該腫瘤細(xì)胞與治療劑接觸； b.調(diào)節(jié)該腫瘤細(xì)胞中的AhR;以及 c.通過(guò)該調(diào)節(jié)來(lái)減少在該腫瘤細(xì)胞中的生長(zhǎng)。
175.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中調(diào)節(jié)AhR包括:抑制所述細(xì)胞中的AhR蛋白質(zhì)活性。
176.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中調(diào)節(jié)AhR包括:抑制所述細(xì)胞中的AhR基因表達(dá)。
177.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中該腫瘤細(xì)胞被殺死。
178.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中該腫瘤是肺、乳腺、結(jié)腸、腦、骨、肝、前列腺、胃、食道、皮膚或白血病腫瘤。
179.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中該腫瘤是實(shí)體或液態(tài)腫瘤。
180.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中AhR用AhR促效劑進(jìn)行調(diào)節(jié)。
181.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中AhR用AhR拮抗劑進(jìn)行調(diào)節(jié)。
182.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中AhR用具有抗雌激素活性的化合物進(jìn)行調(diào)節(jié)。
183.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中AhR用具有抗雄激素活性的化合物進(jìn)行調(diào)節(jié)。
184.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中該腫瘤細(xì)胞存在于哺乳動(dòng)物中。
185.如權(quán)利要求173或174所述的方法，其中該腫瘤細(xì)胞存在于人類中。
【文檔編號(hào)】A61K35/12GK103561751SQ201180065283
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月15日
【發(fā)明者】李昭男, 李東穎, 李育達(dá), 蔡英美 申請(qǐng)人:李昭男, 李東穎, 李育達(dá), 蔡英美