專利名稱：細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用肽衍生物作為細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化的方法，特別是它們在抗腫瘤非細(xì)胞毒性療法中的應(yīng)用。
已知在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中分化能力的缺乏會導(dǎo)致無法控制的腫瘤生長。
尋找特異性與非特異性的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑因此是新穎的抗腫瘤非細(xì)胞毒性療法之一。
“細(xì)胞分化的誘導(dǎo)”一般是不同物質(zhì)恢復(fù)(或驅(qū)動)下列因各種原因而喪失或降低的功能的能力經(jīng)過正常的細(xì)胞周期、其中生物活性重要物質(zhì)的合成等。
作用機(jī)理不與一種特定細(xì)胞功能有關(guān)并且能夠由若干參數(shù)導(dǎo)致其分化的物質(zhì)或化合物可以歸屬于非特異性分化誘導(dǎo)劑。
通過給以類視黃醇或α-2-干擾素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的方法是已知的(Cancer Res.，40，2245-3350，1980)。
細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑聚反式視黃酸(PTRA)被用作延長急性前髓細(xì)胞性白血病的誘導(dǎo)或緩解后療法之后的緩解的成分。受視黃酸衍生物影響的細(xì)胞分化引起腫瘤細(xì)胞生長的穩(wěn)定化(Abelev G.I.Differentiationand tumor phenotype in cells of leukoses and lymphomas，TheClinical Oncohematology(ed.M.A.Volkova)，Moscow，theMeditsina publishers，2001，Chapter 11，pages 116-123)。
α-干擾素制備物在治療黑瘤中作為免疫治療劑的應(yīng)用也與腫瘤細(xì)胞分化的誘導(dǎo)有關(guān)，其中粘連能力得到增強(qiáng)，抗原屬性發(fā)生改變。干擾素療法導(dǎo)致腫瘤生長進(jìn)展減少，以及防止轉(zhuǎn)移的形成和比率(AtzpodienJ.，Kirchner H.Cancer，Cytokines and cytotoxic cellsinterleukin-2 in the immunotherapy of human neoplasms. Klin.Wochenschr，1990，v.68，pp.1-7)。
由于細(xì)胞毒性化學(xué)療法而導(dǎo)致造血細(xì)胞分化損傷的制備物最近已被引入到臨床實(shí)踐中。這些制備物是從骨髓制備的不同細(xì)胞因子，例如血液激素類粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和其他。它們在治療不同人腫瘤中的應(yīng)用導(dǎo)致骨髓細(xì)胞的成熟加速，防止化療制備物的血液學(xué)細(xì)胞毒性(Crawford j.，Ozer H.，Stoller R.etal.Phase II of clinical investigation of GM-CSF by the patientsof SCLC with the dose-intensive the chemotherapy.The New EnglandJournal of Medicine.1991，v.325，No.3，pp.164-170)。
因而，腫瘤細(xì)胞分化的誘導(dǎo)是化療制備物的贅生物生長穩(wěn)定化、增加免疫療法效果和糾正血液學(xué)毒性的主導(dǎo)機(jī)理之一。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通式(I)肽衍生物
是細(xì)胞分化的有力誘導(dǎo)劑，可用作癌癥疾病非細(xì)胞毒性療法的成分，特別是黑瘤和造血組織增殖，以及血液糾正劑。
式(I)化合物
在國際申請PCT/RU98/00215中被公開為具備抗氧化、抗氣喘、抗低氧、抗炎、抗病毒、抗菌、脂質(zhì)調(diào)節(jié)、抗轉(zhuǎn)移以及其他治療效果。環(huán)狀天冬氨酰-組胺和乙酰-天冬氨酰-組胺結(jié)構(gòu)的化合物公開在下列著作中Kvamme，E.；Reichelt，K.L.；Edminson，P.D.；et al.N-substitutedpeptides in brain.Fed.Eur.Biochem.Society Meet.，[Proc.]，1975，41，127-136。
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細(xì)胞分化的方法，包含有效量通式(I)化合物
或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的給藥， 其中R1是被官能團(tuán)取代的C1-C3烴原子團(tuán)，取代基選自氨基、C1-C5酰氨基或羧基，羧基可選地被醚化，氨基可選地被酰基取代基取代；或者同時被氨基和羧基取代的C1-C3烴原子團(tuán)，氨基可選地被?；〈〈?，羧基可選地包括在C5-C6元環(huán)狀酰亞胺中，該酰亞胺包括N-末端氨基或-CONH-基團(tuán)的-NH-基團(tuán)；或者被5-6元不飽和雜環(huán)基團(tuán)取代的C1-C3烴原子團(tuán)，烴原子團(tuán)可以同時包含可選被?；〈〈陌被?；或者 R1是飽和的雜環(huán)基團(tuán)； R2是氫原子或官能團(tuán)，選自可以被醚化的羧基； R3是5-6元飽和或不飽和環(huán)狀或雜環(huán)基團(tuán)，或者氨基或羧基，羧基可選地被醚化； n＝0-4，m＝1-4，k＝0-1。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，包含有效量4-[N-(2-咪唑-4-基)乙基)氨甲?；鵠丁酸(Dicarbamine)作為活性成分的給藥。
優(yōu)選用在本發(fā)明中的通式(I)化合物是下示通式(I)化合物


更優(yōu)選用在本發(fā)明中的通式(I)化合物是這樣的通式(I)化合物，其中R1＝NH2CH2-、HOOC-CH2-、CH3CONH-CH2-、CH3OCO-CH2-、
n＝0-4；k＝0-1 R2＝H，COOH，COOCH3；
最優(yōu)選用在本發(fā)明中的化合物是4-[N-(2-咪唑-4-基)乙基)氨甲?；鵠丁酸(Dicarbamine)。
在優(yōu)選的發(fā)明實(shí)施方式中，將通式(I)肽衍生物在0.5-5.0mg/kg體重單一劑量下長期給藥。
在另一種優(yōu)選的發(fā)明實(shí)施方式中，將通式(I)肽衍生物與化療聯(lián)合給藥。
優(yōu)選的發(fā)明實(shí)施方式還是細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其中為了使惡性腫瘤生長穩(wěn)定，特別是黑瘤或造血組織增殖，當(dāng)化療的能力已經(jīng)耗盡時，將通式(I)肽衍生物在0.5-5.0mg/kg體重單一劑量下給藥至少15天。
將通式(I)肽衍生物與免疫治療劑干擾素聯(lián)合給藥導(dǎo)致其關(guān)于惡性腫瘤細(xì)胞的功效增強(qiáng)，特別是黑瘤。
另一種優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方式是細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，其中為了增強(qiáng)黑瘤免疫療法的功效，將通式(I)肽衍生物在0.5-5.0mg/kg體重劑量下給藥不少于15天，并且一起給以干擾素。
優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方式還是誘導(dǎo)細(xì)胞分化的方法，其中為了降低血液學(xué)毒性，在化療過程開始之前、化療期間和化療過程與下一細(xì)胞毒性療法過程之間，將通式(I)肽衍生物在0.5-5.0mg/kg體重單一劑量下每日給藥。
下面提供實(shí)施例，闡述優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方式。
實(shí)施例1通式(I)肽衍生物對黑瘤M-6細(xì)胞分化的活性 研究是針對體重20-22克的10-12周齡無胸腺(裸)雌性Balb/C小鼠進(jìn)行的(由隸屬于N.N.Blokhin of the Russian Academy ofMedical Sciences(RAMS)的Russian Cancer Research Center(RCRC)繁殖)。預(yù)先從原始臨床材料獲得人黑瘤株，從RAMS RCRC的腫瘤株庫取得，移植給無胸腺“裸”鼠。將腫瘤用含有活性臺盼藍(lán)染劑的Versen溶液分解，皮下接種給小鼠，每只小鼠1.6百萬個細(xì)胞。
每日利用金屬探針將Dicarbamine對小鼠胃內(nèi)給藥，劑量為1.0mg/kg，開始于腫瘤接種前4天，之后達(dá)10-11天(給藥過程多達(dá)15天)。在最后一次給藥后12、24和48小時內(nèi)，將小鼠用乙醚麻醉處死。
在實(shí)驗(yàn)中用到4組小鼠 第1組-對照，沒有Dicarbamine給藥。按照與接受Dicarbamine的組相同的期限處死小鼠。
第2組-將Dicarbamine給藥，在給藥終止后12小時內(nèi)處死小鼠。
第3組-將Dicarbamine給藥，在給藥終止后24小時內(nèi)處死小鼠。
第4組-將Dicarbamine給藥，在給藥終止后48小時內(nèi)處死小鼠。
測定四種形態(tài)學(xué)參數(shù)，即含有色素的細(xì)胞數(shù)、具有細(xì)胞凋亡跡象(分化的能力)的細(xì)胞數(shù)、有絲分裂(增殖活動)的數(shù)量和壞死面積，以監(jiān)測對照組和Dicarbamine組動物M-6黑瘤的分化和增殖程度。這些參數(shù)是動態(tài)測定的，利用作為整體跡象的一般腫瘤生長形態(tài)圖加以校正。為此，從小鼠中取出腫瘤，置于福爾馬林中，進(jìn)行組織學(xué)加工，用于光學(xué)顯微鏡檢查。所得數(shù)據(jù)如表1所示。
表1 M-6黑瘤的形態(tài)學(xué)參數(shù)(光學(xué)顯微鏡檢查)參數(shù)(％)Dicarbamine撤除后所經(jīng)過的時間12小時24小時48小時壞死面積對照1-22-33-5Dicarbamine給藥后6-77-98-10有絲分裂對照3-53-53-5Dicarbamine給藥后3-53-53-5編程性細(xì)胞死亡對照0.1-0.20.1-0.20.1-0.2Dicarbamine給藥后0.1-0.20.2-0.30.2-0.3含有色素的細(xì)胞對照1-21-22-3Dicarbamine給藥后2-32-43-5 所進(jìn)行的研究允許發(fā)明人確定，接種給裸鼠的人黑瘤在第9天形成由多形核白細(xì)胞組成的腫瘤，生長在連續(xù)的視野中，具有顯著的基質(zhì)發(fā)育。統(tǒng)計腫瘤中的小壞死部位，與12和24小時的處死期限(分別為1-2％和2-3％)相比，這些部位在48小時后有輕微增加(至多為切片面積的3-5％)。在全部生長階段期間，在腫瘤中觀察到3-5％的有絲分裂。細(xì)胞凋亡有輕微表現(xiàn)。很少見到含有色素的細(xì)胞，它們的數(shù)量在第一天不超過1-2％，僅在生長48小鼠后增加至2-3％。因而，在此期間黑素生成的強(qiáng)度是顯著的。所得特征可以得出結(jié)論，黑瘤是一種迅速生長的腫瘤，實(shí)際上喪失了在細(xì)胞凋亡程度基礎(chǔ)上、更是在黑素生成的基本功能能力基礎(chǔ)上的分化能力。
通過計數(shù)腫瘤切片中含有黑素的細(xì)胞數(shù)，在黑素生成強(qiáng)度的基礎(chǔ)上評估Dicarbamine對黑瘤細(xì)胞分化的效果。為此，切除小鼠中的腫瘤，置于戊二醛中，進(jìn)行組織學(xué)加工，用于電子顯微鏡檢查。按照下列方程，計算所制備的切片中反映細(xì)胞分化程度的黑素生成強(qiáng)度指數(shù)(MGII) MGII＝NCM×NM 其中NCM是含有黑素體的細(xì)胞數(shù)； NM是每細(xì)胞中黑素體的平均數(shù)。
利用這種指數(shù)進(jìn)行黑素生成分析，如表2所示。
表2 Dicarbamine給藥后黑瘤細(xì)胞中的黑素生成強(qiáng)度對比(電子顯微鏡檢查)參數(shù)(絕對值)Dicarbamine撤除后所經(jīng)過的時間12小時24小時48小時含有黑素體的細(xì)胞數(shù)(每500個細(xì)胞)對照135.0144.0159.0Dicarbamine給藥后175.0210.0227.0每細(xì)胞中黑素體的平均數(shù)對照19.021.026.0Dicarbamine給藥后28.035.042.0MGII對照5.16.08.2Dicarbamine給藥后9.814.719.0 *從腫瘤接種后第9天開始 電子顯微鏡檢查試驗(yàn)顯示，與對照相比，包含黑素體的腫瘤細(xì)胞數(shù)和每一細(xì)胞中的黑素體數(shù)由于Dicarbamine的效果而增加。不同觀察期的MGII指數(shù)如下增加12小時-1.9倍，24小時-2.4倍，48小時-2.3倍。
因而，在Dicarbamine的15天給藥過程后，M-6黑瘤腫瘤細(xì)胞分化程度平均增加2.2倍，這得到黑素生成強(qiáng)度(MGII指數(shù))、包含黑素體的細(xì)胞數(shù)增加(1.3倍)和黑素體數(shù)增加(1.3倍)的支持。
實(shí)施例2Dicarbamine對所接種的人黑瘤細(xì)胞的黑素合成功能的效果 按照較高的單一劑量4.5mg/kg向如實(shí)施例1所述皮下接種人黑瘤的小鼠每日p.o.給以Dicarbamine達(dá)3周，從腫瘤移植術(shù)之時開始。
在腫瘤抑制術(shù)后3周內(nèi)處死動物。處死時的腫瘤體積平均為150mm3。處死后，切除小鼠腫瘤，用Versen溶液分解，分離細(xì)胞部分，在光學(xué)顯微鏡檢查期間計算Goryaev腔中含有色素的細(xì)胞數(shù)。
所進(jìn)行的研究顯示，含有黑素的細(xì)胞的對照平均數(shù)為39.14±8.72，試驗(yàn)組為108.42±11.91，也就是說合成黑素的細(xì)胞數(shù)顯著(p＜0.01)增加3倍。
因而，在使用不同劑量Dicarbamine所進(jìn)行的系列試驗(yàn)中，在黑素生成強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，獲得統(tǒng)計學(xué)上顯著的增強(qiáng)人黑瘤細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用的效果。
數(shù)據(jù)列在表3中。
表3 由Dicarbamine誘導(dǎo)的人黑瘤細(xì)胞黑素生成強(qiáng)度腫瘤編號對照腫瘤編號試驗(yàn) 含有黑素的細(xì)胞數(shù) 含有黑素的細(xì)胞數(shù)13219523521113293954424110546513063661067547111平均39.14平均108.42*標(biāo)準(zhǔn)偏差8.72標(biāo)準(zhǔn)偏差11.91 *p＜0.01 實(shí)施例3Dicarbamine對所接種的人黑瘤Me1-6生長動力學(xué)的效果 研究是針對體重20-22克的10-12周齡無胸腺(裸)雌性Balb/C小鼠進(jìn)行的(由隸屬于RAMS的RCRC繁殖)。預(yù)先從原始臨床材料獲得人黑瘤株Me1-6，從RAMS RCRC的腫瘤株庫取得，移植給無胸腺“裸”鼠。
向兩組小鼠每日p.o.給以單一劑量1.5mg/kg和4.5mg/kg的Dicarbamine達(dá)3周，從腫瘤發(fā)育之時開始從腫瘤移植術(shù)后第15天至36天)。
在移植術(shù)后第18、25、33、39、46和53天進(jìn)行腫瘤的測量。在腫瘤生長動力學(xué)的基礎(chǔ)上評估8周Dicarbamine的效果，按照下式計算腫瘤體積“V” V＝π*L*s*h(mm3) 其中L是長度的mm數(shù)，s是寬度的mm數(shù)，h是高度的mm數(shù)。
然后計算腫瘤體積之間的比例Vt/Vt-1，以百分比表示，按照Student法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以計算統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異。所得數(shù)據(jù)如表4所示。
所得數(shù)據(jù)顯示，與對照相比，最大腫瘤質(zhì)量增益延遲了7天。與對照組相比，接受單一劑量4.5mg/kg Dicarbamine的小鼠組移植術(shù)后第25天相當(dāng)于45mg/kg Dicarbamine給藥10天，此時見到腫瘤生長速率有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異。這組的平均腫瘤體積增加了166.0±93.0％，而對照組中該參數(shù)為329.0±88.9％(p＜0.015)。
實(shí)施例4Dicarbamine與化療的組合對接種移植給無胸腺小鼠的人M-6黑瘤生長的效果 按照實(shí)施例3所述技術(shù)進(jìn)行研究。將Dicarbamine按照單一劑量4.5mg/kg每日p.o.給藥3周，從腫瘤出現(xiàn)之時開始(從第15天至第36天)。在聯(lián)合治療組中，也將Dicarbamine按照單一劑量4.5mg/kg每日給藥3周(第15天至第36天)，聯(lián)合由抗腫瘤細(xì)胞抑制劑順鉑6mg/kgi.v.(第25天)和Aranoza 40mg/kgi.p.(第27天)的單一給藥。細(xì)胞抑制療法開始于平均腫瘤體積為200±62mm3之時。在移植術(shù)后第18、25、33、39、46和53天，測量腫瘤體積，計算Vt/Vt-1值，以百分比表示。所得數(shù)據(jù)如表5所示。
表5 抗腫瘤細(xì)胞抑制劑與Dicarbamine的化療組合對人M-6黑瘤生長動力學(xué)的效果小鼠組別治療方案腫瘤接種后不同天數(shù)的M±m(xù)(％)劑量(mg/kg)單次/療程給藥天數(shù)25天33天39天46天53天對照生理鹽水p.o.15-36329.0±88.9132.9±57.321.9±2.610.5±8.13.8±10.3順鉑Aranoza6mg/kg i.v.25413.0±276.0177.0±46.062.04±30.121.2±18.718.2±12.740mg/kg i.p.27Dicarbamine4.5/94.5mg/kgp.o.15-36166.0±93.0**276.0±104.039.8±27.319.6±17.54.2±22.5Dicarbamine順鉑Aranoza4.5/94.5mg/kgp.o.*15-36182.0±60.0**191.0±71.024.5±17.428.7±9.88.0±30.66mg/kg i.v.2540mg/kg i.p.27 *-每日；**-p＜0.05 從所列數(shù)據(jù)可以看出，Dicarbamine在所用給藥途徑中在最初階段延緩腫瘤生長，第25天的腫瘤質(zhì)量增益為166.0±93.0％，比對照組的增益329.0±88.9％減少了。因而，再現(xiàn)了Dicarbamine對黑瘤生長的效果結(jié)果(見實(shí)施例3)。Aranoza與順鉑的聯(lián)合化療在所示制度中似乎是無效的，也就是說腫瘤增益在此期限高于對照值(413.0±276.0％)。這證實(shí)了所用Me1-6人黑瘤株對給定化療方案不存在敏感性。向該無效的化療方案引入Dicarbamine導(dǎo)致腫瘤質(zhì)量增益在第25天有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性(p＜0.05)減少，為182.0±60.0％，這證實(shí)了它在沒有化療效果存在下的情況下的功效。
實(shí)施例5當(dāng)干擾素給藥時通式(I)肽衍生物對黑瘤細(xì)胞增殖能力的效果 研究了Dicarbamine以及α-干擾素(Introne，IN)對黑瘤細(xì)胞增殖能力的效果。應(yīng)當(dāng)注意，Dicarbamine本身能夠延緩黑瘤細(xì)胞的增殖活動，而不改變它們的存活。
研究是針對在組織培養(yǎng)物中以單層方式生長的兩種連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的，即鼠B-16黑瘤細(xì)胞和人M-5黑瘤細(xì)胞。IN的給藥濃度為70-700IU/ml。將Dicarbamine(D)轉(zhuǎn)移至儲備溶液中(1.000μM)，通過0.22μM孔徑濾器除菌，然后稀釋至0.01和1.0μM濃度。
在初始細(xì)胞增殖速率(IRCP)的基礎(chǔ)上評估制備物對細(xì)胞的效果。該指數(shù)(IRCP)通常被稱為集落速率生長，是這樣測定的，計數(shù)“試驗(yàn)”皿(含有制備物)和“對照”皿(沒有制備物)中感染后前幾天期間微集落中的細(xì)胞數(shù)，分析其中的50個集落。每一“點(diǎn)”包括不少于三個含有生長中的細(xì)胞集落的Petri皿，其中加入特定濃度的研究用制備物。按照下式計算集落的生長速率(％) (試驗(yàn)皿中細(xì)胞數(shù)/集落(平均值)-1)/(對照皿中細(xì)胞數(shù)/集落-1)×100％ 計算每“點(diǎn)”的微集落中的細(xì)胞數(shù)。根據(jù)“試驗(yàn)”皿與“對照”皿之間所生長的集落數(shù)之比測定細(xì)胞存活率，借助細(xì)胞存活率判斷制備物在選定濃度范圍內(nèi)的毒性。試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。
表6 Dicarbamine和α-干擾素對鼠B-16黑瘤和人M-5黑瘤細(xì)胞增殖活動的效果制備物IN濃度IU/ml與制備物接觸下列期限時的初始細(xì)胞增殖速率(相對于對照而言的％細(xì)胞/集落)48小時72小時96小時無D0.01μM D1.0μM D無D0.01μM D1.0μM D無D0.01μM D1.0μM DM-5的對照100.084.269.0100.073.650.0100.070.249.1IN7.0111.379.154.794.849.136.973.046.933.370.053.740.530.751.934.924.548.831.723.9B-16的對照100.052.944.6100.061.043.6---IN70.0---50.2-26.1---700.038.024.921.529.822.016.0 從上表可以看到，在M-5黑瘤的對照中，IRCP指數(shù)保持在100％的水平達(dá)96小時。
在加入7.0IU/mlα-干擾素的M-5細(xì)胞樣本中，IRCP指數(shù)在48小時增加至111.3％，在76和96小時僅分別減慢至94.8和73.0％。當(dāng)加入70IU/mlα-干擾素時，IRCP指數(shù)在48小時減慢至53.7％，在72小時減慢至51.9％，在96小時減慢至48.8％。也就是說，70IU/mlα-干擾素的最大抑制效果達(dá)到50％IRCP。
當(dāng)加入0.01μM Dicarbamine時，IRCP指數(shù)在48小時減慢至82.4％，在72小時減慢至73.6％，在96小時減慢至70.2％，當(dāng)加入1μMDicarbamine時，IRCP指數(shù)在48小時減慢至69.0％，在72小時減慢至50.0％。
因而，Dicarbamine的最大抑制效果也達(dá)到IRCP的50％，這是在1.0μM制備物濃度下獲得的。
在B-16黑瘤試驗(yàn)中，當(dāng)加入70IU/mlα-干擾素時，IRCP指數(shù)在72小時減慢至50.0％，當(dāng)加入兩種所示濃度的Dicarbamine時，IRCP指數(shù)在48小時分別減慢至52.9和44.6％，在72小時分別減慢至61.0和44.6％。僅當(dāng)加入700IU/mlα-干擾素時，IRCP指數(shù)才顯著減少至38.0和29.8％。。
因而，所進(jìn)行的試驗(yàn)顯示，α-干擾素和Dicarbamine抑制M-5黑瘤和B-16黑瘤細(xì)胞生長的水平為40.0-50.0％，這是分化誘導(dǎo)劑所特有的。僅在α-干擾素濃度增加100倍的情況下才獲得更強(qiáng)的對IRCP指數(shù)的效果。
向M-5細(xì)胞聯(lián)合加入70.0IU/mlα-干擾素和Dicarbamine顯示，在所有情況下IRCP指數(shù)在所記錄的期限分別降低至30.7-24.0-31.0％。當(dāng)聯(lián)合使用700IU/mlα-干擾素和兩種濃度Dicarbamine時，獲得最強(qiáng)的對B-16黑瘤的效果IRCP指數(shù)在48小時分別降低至24.9和29.8％，在72小時分別降低至22.0和16.0％。
因而，Dicarbamine類似于α-干擾素減緩鼠B-16黑瘤和人M-5黑瘤細(xì)胞增殖，不顯示毒性(根據(jù)存活指數(shù))。正如所給出的實(shí)施例所示，Dicarbamine的效果是分化誘導(dǎo)劑所特有的，與已知分化誘導(dǎo)劑α-干擾素的組合對黑瘤細(xì)胞具有加和特征。這種效果導(dǎo)致腫瘤生長抑制作用的強(qiáng)化，是提高黑瘤免疫療法功效的象征。
5.2肽衍生物對黑瘤細(xì)胞增殖能力的效果 研究是針對在組織培養(yǎng)物中以單層方式生長的鼠B-16黑瘤的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的。選擇α-干擾素作為對比制備物，給藥濃度為70IU/ml。
將供試化合物轉(zhuǎn)移至儲備溶液中(1,000μM)，通過0.22μm孔徑濾器除菌，然后稀釋至100μM濃度。
在初始細(xì)胞增殖速率(IRCP)的基礎(chǔ)上評估化合物對細(xì)胞的效果。該指數(shù)是這樣測定的，計數(shù)“試驗(yàn)”皿(含有制備物)和“對照”皿(沒有制備物)中感染后前幾天期間微集落中的細(xì)胞數(shù)，分析其中的50個集落。
按照下式計算集落的生長速率(％) (試驗(yàn)皿中細(xì)胞數(shù)/集落(平均值)-1)/(對照皿中細(xì)胞數(shù)/集落-1)×100％ 計算每“點(diǎn)”的微集落中的細(xì)胞數(shù)。根據(jù)“試驗(yàn)”皿與“對照”皿之間所生長的集落數(shù)之比測定B-16細(xì)胞存活率，借助細(xì)胞存活率判斷毒性。試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。
表7 100μM肽衍生物和70IU/ml α-干擾素對鼠B-16黑瘤細(xì)胞增殖活動的效果化合物與制備物接觸下列期限時的初始細(xì)胞增殖速率(相對于對照而言的％細(xì)胞/集落)48小時72小時對照2.52＝100％3.49＝100％干擾素29.6+2.327.4±2.1Dicarbamine30.8±2.828.2±2.2126.6±2.726.6±2.8225.5±1.925.5±1.7335.6+2.935.6±2.9438.3±3.538.3+3.5532.4±2.632.4±2.3629.3±2.729.3+2.2738.8+2.738.8±2.8821.4±1.516.9±0.9927.1±1.717.2±1.31035.9±3.623.1±1.61121.5±1.920.7±1.81228.7+2.120.3±1.91344.9±4.018.9±1.41433.8±3.519.9±1.81539.7+2.529.8+2.31641.3±4.028.9+2.51739.7+2.126.6±2.11842±339±31921±141±52044+342+42142±428±2 與對照的差異是顯著的(p＜0.01)。
表7所列數(shù)據(jù)顯示，肽衍生物抑制B-16黑瘤細(xì)胞集落生長的水平為50.0-70.0％，這是分化誘導(dǎo)劑所特有的。
實(shí)施例6在Dicarbamine給藥后不同期限腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布 試驗(yàn)是針對所接種的B-16黑瘤進(jìn)行的。在制備物給藥后不同期限D(zhuǎn)NA含量的基礎(chǔ)上研究Dicarbamine對腫瘤細(xì)胞分布的效果。從腫瘤接種后第6天開始?xì)v時10天，每日向小鼠胃內(nèi)給以0.5mg/kgDicarbamine。在接種后第10、12、16和18天，也就是分別在Dicarbamine給藥后第5和7天以及在Dicarbamine 10-天給藥終止后第2和4天，處死動物，用于隨后的腫瘤材料研究。
試驗(yàn)結(jié)果顯示，Dicarbamine導(dǎo)致分裂間期腫瘤細(xì)胞比例(IIG1)的顯著增加(≈25％)。在恒定的增殖中細(xì)胞比例(≈30％)中，注意到IIG2細(xì)胞比例有所增加(12-14％)。因此，正常基質(zhì)細(xì)胞(IG1)在樣本中的比例代償性降低。所述變化在5-10次Dicarbamine給藥后最突出。
Dicarbamine的過程給藥導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞群的動態(tài)重排。注意到合成周期(S-相)細(xì)胞的抑制作用伴有準(zhǔn)備增殖的細(xì)胞或增殖中細(xì)胞(G2相)的比例的代償性降低。同時發(fā)生腫瘤細(xì)胞在固定相G1中的蓄積。
通過降低增殖活動水平，Dicarbamine促進(jìn)細(xì)胞在固定(非增殖)細(xì)胞周期中的蓄積。它能夠延緩腫瘤生長，促進(jìn)細(xì)胞向更加分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。
實(shí)施例7Dicarbamine關(guān)于環(huán)磷酰胺及其與順鉑和卡鉑組合的血液學(xué)毒性的功效 針對第一代雄性小鼠雜交體F1(CBA×C57BI)研究Dicarbamine的血液矯正效果。
7.1使用4組動物研究Dicarbamine對環(huán)磷酰胺(CPH)血液學(xué)毒性的效果 第1組-每日0.5mg/kg Dicarbamine，開始于CPH給藥前5天直至200mg/kg CPH單一給藥后5天； 第2組-200mg/kg CPH單一給藥； 第3組-完整的對照； 第4組-每日0.5mg/kg Dicarbamine，歷時10天。所得數(shù)據(jù)如表8所示。
表8 在環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺與Dicarbamine作用下小鼠外周血中的總白細(xì)胞數(shù)組 環(huán)磷酰胺給藥后不同天數(shù)的總白細(xì)胞數(shù)(以千個/mm3計)3 571013172112.80±0.22 7,96±1.1013.38±1.5411.88±1.9213.30+1.4812.40±1.7612.90±2.6021.06±0.44 4.38±0.7710.50±3.026.44±0.6012.20±3.0212.20±1.8011.86±1.32316.50±8.20 16.10±3.2014.80±3.3015.80±1.9014.90±2.7016.90±4.7014.70±2.80415.70±4.30 15.30±7.8017.30±5.1015.70±3.8012.50±3.5217.80±4.7016.30±3.90 所得數(shù)據(jù)顯示，Dicarbamine與CPH的聯(lián)合使用減少后者的血液毒性效果，加速恢復(fù)血液參數(shù)。
7.2在研究Dicarbamine對CPH與鉑衍生物組合的血液毒性作用的效果時，每日將Dicarbamine向小鼠胃內(nèi)給藥20天，單一劑量為0.5mg/kg。在從開始Dicarbamine給藥過程第5天，將細(xì)胞抑制性制備物腹膜內(nèi)給藥一次。細(xì)胞抑制性制備物的劑量如表10和11所示。
研究Dicarbamine當(dāng)聯(lián)合CPH和順鉑或卡鉑給藥對小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的效果的結(jié)果分別如表9和10所示。
表9 Dicarbamine對環(huán)磷酰胺與順鉑組合的血液毒性的效果細(xì)胞抑制性制備物Cdtistaticpreparation劑量(mg/kg)細(xì)胞抑制性制備物給藥后不同天數(shù)的總白細(xì)胞數(shù)(以千個/mm3計)死亡期限(天)035721DicarbamineCPH順鉑200811.30±2.302.32±0.496.60±0.9010.40±1.5412.30±1.568；16CPH順鉑200811.30±2.301.20±0.334.32±0.776.24±1.1510.80±1.023；4；7DicarbamineCPH順鉑100411.30±2.304.14±0.6011.40±1.1014.90±1.3211.80±1.32noCPH順鉑100411.3±2.32.65±0.664.74±0.668.05±0.8812.0±1.4DicarbamineCPH順鉑50211.30±2.306,70±1.1517.00±5.1714.50±2.0012.40±0.99noCPH順鉑5021.30±2.304.04±0.777.62±0.998.72±1.1513.10±1.54no 所列數(shù)據(jù)顯示，在第5天，在接受最大劑量細(xì)胞抑制性制備物以及Dicarbamine的小鼠組中，白細(xì)胞數(shù)已經(jīng)達(dá)到比生理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的下限，在第7天，實(shí)際上恢復(fù)至原始水平。僅就試驗(yàn)的21天而言，沒有觀察到Dicarbamine恢復(fù)。在接受最大劑量細(xì)胞抑制性制備物而無Dicarbamine的小鼠中，注意到在試驗(yàn)的第3、4和7天有動物死亡。在接受最大劑量細(xì)胞抑制性制備物以及Dicarbamine的動物中，注意到僅在第8和16天有被延遲了的死亡。
表10 Dicarbamine對環(huán)磷酰胺與卡鉑組合的血液毒性的效果細(xì)胞抑制性制備物Cytostaticpreparation劑量(mg/kg)細(xì)胞抑制性制備物給藥后不同天數(shù)的總白細(xì)胞數(shù)(以千個/mm3計)死亡期限(天)035721DicarbamineCPH順鉑2003011.50±2.803.10±0.7012.80±1.3715.30±1.2612.30±0.8910CPH順鉑2003011.30±2.301.18±0.494.60±0.607.54±0.7712.60±1.283DicarbamineCPH順鉑1001511.50±2.804.04±0.4410.40±1.5914.80±1.7611.80±1.34noCPH順鉑1001511.30±2.302.74±0.496.48±0.6010.50±1.3813.20±1.50noDicarbamineCPH順鉑507.511.30±2.306.60±0.7710.90±1.2111.20±1.2010.90±1.28noCPH順鉑50211.50±2.803.94±1.048.72±1.9810.80±2.4011.20+0.99no 所列數(shù)據(jù)(表10)顯示，在使用Dicarbamine以及致死劑量卡鉑和環(huán)磷烷的情況下，外周血中的白細(xì)胞數(shù)和動物死亡的期限與表9所列數(shù)據(jù)相似。
因而，當(dāng)使用致死劑量的細(xì)胞抑制性制備物時，Dicarbamine在全部所研究的過程中抑制白細(xì)胞減少癥的形成，它加速恢復(fù)總白細(xì)胞數(shù)，延遲小鼠死亡的期限。
7.3在研究通式(I)肽衍生物對CPH與卡鉑組合的血液學(xué)毒性作用的效果時，將化合物每日向小鼠胃內(nèi)給藥10天，劑量為0.5mg/kg。在供試化合物給藥開始后第5天，向小鼠腹膜內(nèi)注射200mg/kg CPH和單一劑量15mg/kg卡鉑。然后，繼續(xù)5天供試化合物的給藥。
在供試化合物開始給藥之前，從小鼠尾巴抽取血液，計算總白細(xì)胞數(shù)。在環(huán)磷酰胺與卡鉑給藥后第3、5和7天，也樅小鼠尾巴抽取血液，計算總白細(xì)胞數(shù)。每組包括15只動物。
作為對照組，小鼠僅接受細(xì)胞抑制性制備物。
表11所列數(shù)據(jù)顯示通式(I)肽衍生物抑制白細(xì)胞減少癥的形成，加速恢復(fù)總白細(xì)胞數(shù)。
表11 通式(I)肽衍生物對環(huán)磷酰胺與卡鉑組合的血液學(xué)毒性作用的效果化合物編號在細(xì)胞抑制性制備物給藥后不同天數(shù)的外周血中總白細(xì)胞數(shù)(以千個/mm3計)0 357113,3±3,5 3.3±1.0*10.0±1.3*11.6±2.5*213.8±3.5 3.18±0.82*9.1±0.5*11.9±2.5*315.5±3.2 4.18±2.019.2±1.917.5±1.7*415.3±2.7 3.02±0.839.62±3.8416.1±0.15512.1±1.4 2.1±1.0410.5±2.0815.26±1.23614.2+1.1 3.04+1.6114.56+2.6525.68+3.1*713.7±1.1 3.14±0.6213.7±0.5716.58+2.9812.9+2.5 3.98±0.7810.8±0.5716.16±0.85913.2±3.0 5.04+0.20*8.64±1.9719.38+1.81012.9±1.9 5.18±1.97*19.76±3.22*21.82±3.74*1114.8±2.3 3.32±1.310.28±1.3517.56+2.61212.8±0.8 3.56±0.1220.66±3.7*17.4+2.81314,9±0,6 2.66±0.2125.7±4.1*32.1±4.87*1413.8±0.5 2.66±0.2316.24+2.328.9±3.65*1512.7±0.7 3.76±0.1426.4±5.8*27.6±4.12*1612.6±0.6 3.9±0.2315.44±1.324.9±4.31*1713.4±0.8 3.36±0.2717.6±3.126.1±3.97*CPH+C16.1±3.5 1.14±0.554.31±1.38.3±0.58 *顯著性p≤0.05 7.4Dicarbamine對細(xì)胞分化的效果得到在環(huán)磷酰胺與Dicarbamine組合的影響下與單獨(dú)給以Dicarbamine相比小鼠外周血微分?jǐn)?shù)研究的支持。
使用兩組小鼠。第一組給以Dicarbamine，在CPH給藥之前5天的劑量為0.5mg/kg，在CPH給藥之后5天的劑量為200mg/kg。第二組小鼠給以單獨(dú)的CPH，劑量為200mg/kg。研究結(jié)果如表12和13所示。
表12和13所列數(shù)據(jù)顯示，由于成熟形式的爆發(fā)而發(fā)生回收外周血，這確認(rèn)了Dicarbamine的分化效果。尤其在第3和5天根據(jù)外周血數(shù)和骨髓細(xì)胞構(gòu)成見到這一點(diǎn)(表12和13)。在Dicarbamine組中，外周血缺乏髓細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞，在沒有Dicarbamine的組中，存在這些構(gòu)成要素(表12)。
實(shí)施例8受肽衍生物影響，皮下接種的小鼠Friend成紅細(xì)胞增多(FEB)的速率和尺寸的減少 研究是針對雄性小鼠雜交體100BDF1進(jìn)行的，將動物分組，每組10只小鼠。使用直系DBA2小鼠用于體內(nèi)繼代移植FEB。
從隸屬于RAMS N.N.Blokhin的GU RCRC腫瘤株庫獲得Friend成紅細(xì)胞增多株，使用3-8代皮下接種物腹膜內(nèi)繼代移植兩次。使用1×106個細(xì)胞的0.3ml 1999培養(yǎng)基懸液進(jìn)行Thr接種。
利用探針，將供試化合物的溶液每日向小鼠胃內(nèi)給藥，從腫瘤接種后第3天至第7天。
在腫瘤生長抑制率(TGI，％)和平均壽命(ALS)的基礎(chǔ)上評估治療功效。借助普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)T/C(％)測定壽命的增加，它是試驗(yàn)組與對照組ALS之比。在平均腫瘤體積變化動力學(xué)的基礎(chǔ)上計算腫瘤生長速率Vt/V1。
關(guān)于肽衍生物對腫瘤大小和腫瘤生長速率的效果的研究數(shù)據(jù)分別如表14和15所示。
所得結(jié)果顯示，肽衍生物導(dǎo)致皮下接種的FEB的生長抑制，直至療法終止后19天。所述效果開始于在單一劑量1.5mg/kg化合物給藥終止后不久，直至第13天仍保持顯著水平(p＜0.05)。腫瘤生長速率在撤除化合物后一周期間變得穩(wěn)定。
從所進(jìn)行的研究可以確定，通式(I)化合物對FEB皮下結(jié)節(jié)的形成具備抑制效果。從所得數(shù)據(jù)可以認(rèn)為供試化合物可用于人造血組織增殖的治療。
實(shí)施例9Dicarbamine和2α-干擾素(Reaferon)對Friend成紅細(xì)胞增多腫瘤細(xì)胞的效果 經(jīng)由脾細(xì)胞皮下接種給DBA2雌性小鼠，研究Friend成紅細(xì)胞增多。
進(jìn)行4組試驗(yàn)。
第1組-沒有治療的對照動物，給以生理鹽水； 第2組-每日s.c.給以100千IU/kg Reaferon，從接種后第3天至第7天； 第3組-p.o.給以單一劑量4.5mg/kg Dicarbamine，從接種后第3天至第7天； 第4組-按照相似的方案同時給以Dicarbamine和Reaferon。
在治療終止或生理鹽水給藥終止后第3、7和14天處死動物，獲取光學(xué)顯微鏡檢查用材料，在第7和14天獲取電子顯微鏡檢查用材料。
就組織學(xué)檢查而言，將腫瘤塊固定在10％中性福爾馬林中，包埋到石蠟中；將所得切片用蘇木精-曙紅染色，利用高碘酸Schiff反應(yīng)檢查糖原(多糖)含量，根據(jù)Brachet檢查RNA含量，還檢查脂質(zhì)和鐵。在Polivar光學(xué)顯微鏡(Austria)中進(jìn)行切片的觀察和照相。
就電子顯微鏡檢查而言，將腫瘤塊固定在2.5％戊二醛溶液和1％四氧化鋨中，包埋到EPON-812中。在LKB-III ultratome(Sweden)上制備semi-thick和ultra-sick切片。將所得semi-sick切片用甲苯胺藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡中進(jìn)行觀察。將ultra-sick切片另外用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色；在JEOL 1200 EX-II電子顯微鏡(Japan)中進(jìn)行切片的觀察和照相。
在電子顯微鏡檢查期間計算不同類型細(xì)胞(胚細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒性白細(xì)胞)的分化百分比，用于定量評估。
在組織學(xué)檢查期間評估細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞凋亡百分比以及壞死面積。
組織學(xué)檢查 第1組沒有治療的對照動物 組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞是大的、多形的，它們的核是明亮的，細(xì)胞質(zhì)是適度發(fā)育的。細(xì)胞大小偶爾有波動，統(tǒng)計個別較小的細(xì)胞，但是大細(xì)胞代表了細(xì)胞的主體。
腫瘤細(xì)胞連續(xù)向外生長。在個別腫瘤中，統(tǒng)計包圍腫瘤細(xì)胞保留區(qū)域的壞死部位。壞死面積沒有超過切片表面的10-15％。
在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，RNA的Brachet反應(yīng)明顯突出，很少微弱或不存在(在個別小細(xì)胞中)。
高碘酸Schiff反應(yīng)具有擴(kuò)散特性，與鐵的反應(yīng)僅在個別細(xì)胞中呈陽性。
在大細(xì)胞中的腫瘤中，統(tǒng)計有絲分裂(多達(dá)1-1.5％)和具有細(xì)胞凋亡跡象的細(xì)胞(多達(dá)0.5％)。
隨著腫瘤生長，壞死面積增加至切片表面的20-30％，有絲分裂的數(shù)量增加(多達(dá)1.5-2％)，細(xì)胞凋亡活動沒有變化。大型多形細(xì)胞的數(shù)量在所有期限下都顯著占優(yōu)勢。
第2組Reaferon給藥 腫瘤具有通常的組織結(jié)構(gòu)。正如對照組，在大型多形細(xì)胞中見到較小的具有深染色核的細(xì)胞。
第14天，壞死面積為切片表面的40-50％，有絲分裂活動為0.5-1％，第7天，細(xì)胞凋亡增加至1-2％，但是第14天降低至1-1.5％。
第3組Dicarbamine給藥 注意到具有深染色核的小腫瘤細(xì)胞數(shù)量有所增加。大型多形細(xì)胞數(shù)量顯著占優(yōu)勢。與第1組圖形相比，壞死面積沒有顯著變化。有絲分裂活動也停留在對照圖形的限度內(nèi)。在第3和7天，細(xì)胞凋亡的比率顯著降低(第7天降至0.1＝0.5％)。
第4組Dicarbamine與Reaferon的同時給藥 與第2組的變化相比，壞死面積和有絲分裂活動沒有顯示顯著的變化。第3天，細(xì)胞凋亡降低至0.2-0.5％，在第7和14天為0.5％(同對照)。
胚型大型多形細(xì)胞在腫瘤中顯著占優(yōu)勢。
電子顯微鏡檢查 第1組沒有治療的對照動物 在電子顯微鏡檢查期間，在腫瘤中主要見到胚型大型多形低分化細(xì)胞。這些細(xì)胞中的核為圓形或者略微不規(guī)則的形狀，偶爾有不平坦的表面。在其中通常見到染色質(zhì)的擴(kuò)散分布，注意到僅有一些生成位于邊緣的異染色質(zhì)。核通常占據(jù)細(xì)胞質(zhì)的大部分，其中核糖體、單線粒體、偶爾還有略微粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)占優(yōu)勢。胚細(xì)胞占全部腫瘤群的90-95％。
除了胚細(xì)胞以外，還統(tǒng)計不同成熟程度的淋巴細(xì)胞，即成淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(大、中、小)。這些細(xì)胞中的核是圓形的、卵形的，經(jīng)常具有不平坦的表面，它們包含大量蓄積方式的異染色質(zhì)，統(tǒng)計核仁。細(xì)胞質(zhì)是適度發(fā)育的，它包含大量核糖體；幾乎沒有其他細(xì)胞器，偶爾統(tǒng)計有密集的顆粒。
粒性白細(xì)胞具有嗜中性白細(xì)胞的小顆粒特征，嗜曙紅細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中不太常見。細(xì)胞中的核是有節(jié)段的或者具有深的凹陷。偶爾能夠見到在細(xì)胞質(zhì)中具有顆粒的細(xì)胞、不規(guī)則的核和伸出的胞質(zhì)膜(單核細(xì)胞)。在腫瘤中統(tǒng)計到自由移動的紅細(xì)胞。
腫瘤中主要是大型胚細(xì)胞占優(yōu)勢(多達(dá)90-95％)。據(jù)統(tǒng)計淋巴樣細(xì)胞在4-8％范圍內(nèi)，粒細(xì)胞占1-2％。
在移入后隨著腫瘤生長，注意到不同細(xì)胞類型之間的比例沒有顯著變化。
第2組Reaferon給藥 不同類型腫瘤細(xì)胞的一般超微結(jié)構(gòu)得以保留。
大型胚細(xì)胞的數(shù)量沒有降低，淋巴樣細(xì)胞占到4-8％，粒性白細(xì)胞占到1-2％。在腫瘤中存在個別的紅細(xì)胞。
第3組Dicarbamine給藥 不同類型腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)仍然跟以前一樣。它們的數(shù)量比例變化和分化水平多少有所升高。大型胚型細(xì)胞的數(shù)量降低至70-80％，淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞的數(shù)量分別增加至18-25％和2-5％。在腫瘤中存在個別的紅細(xì)胞。
在處置終止后第7天統(tǒng)計最常見的變化。
第4組Reaferon和Dicarbamine給藥 不同類型腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)實(shí)際上相當(dāng)于上述(見第1組)。
大型胚型細(xì)胞的數(shù)量在70-80％范圍內(nèi)波動。淋巴細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到18-25％，白細(xì)胞的數(shù)量停留在2-5％的水平。在其他細(xì)胞中統(tǒng)計有紅細(xì)胞。
如同前面幾組，所見到的變化在第7天最突出。
因而，每日向Friend成紅細(xì)胞增多小鼠口服給以4.5mg/kgDicarbamine 5天確實(shí)導(dǎo)致不成熟腫瘤細(xì)胞主要向形成粒細(xì)胞以及紅細(xì)胞樣譜系細(xì)胞方向分化。
與對照動物的腫瘤相比，當(dāng)使用Dicarbamine時，不成熟腫瘤細(xì)胞的數(shù)量從90-95％降低至70-80％，也就是降低了15-20％，淋巴細(xì)胞的數(shù)量從4-8增加至18-25％，也就是增加了4倍。
粒細(xì)胞譜系細(xì)胞的數(shù)量也有不太顯著的增加(從1-2％至約2-5％)。
應(yīng)當(dāng)注意到，在處置終止后第7天見到最常見的變化。在處置終止后第14天，這些變化變得穩(wěn)定。
100千IU/kg Reaferon皮下給藥5天導(dǎo)致腫瘤壞死面積增加在處置終止后第7天從對照組的15-20％至試驗(yàn)組的40-50％，在第14天從20-30％至40-50％)。有絲分裂的比率多少有所減少(從1.5-2％至0.5-1％)，具有細(xì)胞凋亡跡象的細(xì)胞的數(shù)量有所增加(在處置終止后第7天從0.5％至1-2％)。腫瘤細(xì)胞的分化實(shí)際上沒有變化。
在Dicarbamine和Reaferon在相同劑量和相同期限下同時給藥中，見到每種制備物效果的總和。觀察到單獨(dú)Dicarbamine所特有的增強(qiáng)不成熟胚細(xì)胞分化的效果，以及在給以單獨(dú)Reaferon所見到的壞死面積增加和有絲分裂數(shù)量減少。
因而，已經(jīng)確認(rèn)，Dicarbamine能夠增強(qiáng)Friend成紅細(xì)胞增多的不成熟腫瘤造血細(xì)胞向不同方向的分化，特別是形成淋巴樣和髓樣譜系腫瘤細(xì)胞。
Dicarbamine對細(xì)胞分化的效果代表了它的一般性質(zhì)，正如前面在黑瘤研究實(shí)施例中所觀察到的。
實(shí)施例10Dicarbamine在化療期間關(guān)于卵巢癌患者骨髓與外周血造血細(xì)胞的保護(hù)效果的電子顯微鏡檢查 在以前涉及Dicarbamine對骨髓作用機(jī)理的研究中，發(fā)現(xiàn)所給定的制備物在試驗(yàn)條件下通過減少正常造血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，保護(hù)動物骨髓免于環(huán)磷酰胺的不利細(xì)胞毒性效果。
針對10名III-IV期卵巢癌患者的骨髓穿刺活組織檢查樣本和外周血也獲得相似的數(shù)據(jù)。
將患者分為相等的兩組第I組-患者接受單獨(dú)的化療，第II組-患者接受化療以及Dicarbamine給藥。
第I和II組患者在療法第一天接受600mg/m2環(huán)磷酰胺和400mg/m2卡鉑；重復(fù)該療程，間隔3-4周。一名患者的化療過程平均包括6個沒有Dicarbamine的療程和5.7個伴有Dicarbamine的療程。
第II組患者接受化療以及Dicarbamine，按照單一劑量100mg給藥，開始于第一療程前5天，然后直至相同劑量下一療程的開始。在兩個療程之間使用Dicarbamine的持續(xù)時間平均為24.5天。平均總劑量為2.5克。
在化療開始之前和伴有或沒有Dicarbamine的療程結(jié)束時采集患者的穿刺活組織檢查用骨髓和電子顯微鏡檢查用外周血。
將新鮮的骨髓穿刺活組織檢查樣本放置在載物板上，用攪拌桿攪拌多次，直至獲得小的密集的片段。將后者固定在2.5％戊二醛溶液中，另外固定在1％四氧化鋨溶液中；用pH7.4磷酸鹽緩沖液洗滌后，在遞增濃度的醇中脫水，包埋到環(huán)氧樹脂EPON-812的混合物中。在LKB-IIIultratome(Sweden)上制備semi-thick和ultra-sick切片。將semi-sick切片用亞甲基或甲苯胺藍(lán)染色，使ultra-sick切片與乙酸雙氧鈾與檸檬酸鉛的水溶液對比。
將包含肝素的外周血在3,000rpm下離心1小時。然后在表面上倒上2.5％戊二醛溶液，成膜10-15分鐘，除去膜，然后如上所述進(jìn)行處理。
在光學(xué)顯微鏡Polivar(Austria)中觀察薄切片，在電子顯微鏡JEOL-1200-CX-11(Japan)中觀察半薄切片。
1、在化療和Dicarbamine給藥開始之前的對照研究-第I和II組患者 在骨髓穿刺活組織檢查中見到不同成熟程度和分化方向的造血細(xì)胞，一部分細(xì)胞具有空泡形成和營養(yǎng)不良的跡象。
存在大型的未分化胚細(xì)胞，具有狹窄的細(xì)胞質(zhì)邊緣，主要包含核糖體。在這些細(xì)胞中，具有擴(kuò)散性染色質(zhì)和個別核仁的圓形-卵形核占據(jù)細(xì)胞質(zhì)的主要部分。
一部分細(xì)胞以不同的類型和分化程度向白細(xì)胞的粒細(xì)胞譜系分化。
見到具有圓形-卵形核的前髓細(xì)胞與髓細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中的擴(kuò)散性染色質(zhì)包含不同量的特殊顆粒。紅細(xì)胞和更成熟的粒細(xì)胞經(jīng)常位于這些細(xì)胞周圍。
經(jīng)常見到更加分化的粒細(xì)胞，即帶狀嗜中性白細(xì)胞和節(jié)段性嗜中性白細(xì)胞。在它們的細(xì)胞質(zhì)中存在嗜中性白細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞所特有的不同類型特殊顆粒。
不同分化程度(小、中、大-成淋巴細(xì)胞的)淋巴樣細(xì)胞排列在粒細(xì)胞中。
統(tǒng)計有多種成熟紅細(xì)胞，經(jīng)常具有不同的形狀，以及正成紅細(xì)胞，包含核和血小板。
2、環(huán)磷烷和卡鉑化療后的骨髓-第I組 在不同類型的保守性造血細(xì)胞(粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、正常紅細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板)中，在化療過程之后采集的骨髓穿刺活組織檢查樣本中統(tǒng)計有營養(yǎng)不良和低度成熟的跡象。
在胚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有核糖體，它經(jīng)常形成空泡。核是大的，具有擴(kuò)散的染色質(zhì)或異染色質(zhì)的蓄積，偶爾有不規(guī)則的形狀，具有向內(nèi)突出的部位。
前髓細(xì)胞和髓細(xì)胞中特殊顆粒的數(shù)量是不顯著的，細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常具有突出的營養(yǎng)不良性改變。
在帶型和節(jié)段型的保守性粒細(xì)胞中，也觀察到營養(yǎng)不良性改變和不顯著量的特殊顆粒。這些顆粒也經(jīng)常發(fā)生營養(yǎng)不良性改變和形成空泡。
保守性正成紅細(xì)胞經(jīng)常是不規(guī)則形狀的，具有細(xì)胞質(zhì)的過程和設(shè)計。
應(yīng)當(dāng)注意到，在穿刺骨髓活組織檢查樣本中，尤其在粒細(xì)胞中，統(tǒng)計有具有細(xì)胞凋亡跡象的細(xì)胞。在這類細(xì)胞中，注意到異染色質(zhì)的著邊、核與細(xì)胞質(zhì)片段化的跡象核細(xì)胞凋亡體的生成。
3、環(huán)磷烷和卡鉑化療以及Dicarbamine給藥之后的骨髓-第II組 在經(jīng)歷化療以及Dicarbamine給藥的患者的穿刺骨髓活組織檢查中，統(tǒng)計不同分化程度與類型的造血細(xì)胞(粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、正成紅細(xì)胞)。
胚型細(xì)胞是大的，它們含有圓形的核，具有擴(kuò)散性染色質(zhì)和個別的核仁，它們的細(xì)胞質(zhì)是狹窄的，在其中見到核糖體、個別的線粒體和偶爾的單一原始密集顆粒。
存在很多前髓細(xì)胞和髓細(xì)胞，包含圓形或卵形的核，具有擴(kuò)散性或凝聚性染色質(zhì)；它們的細(xì)胞質(zhì)包含相當(dāng)大量的特殊顆粒，既有原始的(黑暗者)，也有不太成熟的(更加成熟者)。
還經(jīng)常統(tǒng)計有帶狀和節(jié)段狀白細(xì)胞。它們具有凹陷的(豌豆樣)或有節(jié)段的核，在它們的細(xì)胞質(zhì)中有豐富的主要為嗜中性白細(xì)胞類型的特殊顆粒，不太常見具有結(jié)晶樣結(jié)構(gòu)的嗜曙紅細(xì)胞類型。
細(xì)胞質(zhì)中，不同分化程度的淋巴細(xì)胞包含線粒體、粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)、偶爾有單一顆粒形式的單一包涵物。
粒細(xì)胞類型的細(xì)胞、淋巴細(xì)胞經(jīng)常構(gòu)成致密的蓄積。
與紅細(xì)胞一起，統(tǒng)計有不同分化程度和相對普通形狀的正成紅細(xì)胞。
極少統(tǒng)計有具有細(xì)胞凋亡跡象的細(xì)胞。
在研究外周血造血細(xì)胞時，見到與以前關(guān)于骨髓要素所述相同的組成規(guī)律。
在聯(lián)合化療(環(huán)磷酰胺+卡鉑)之前與之后和化療以及Dicarbamine給藥期間對卵巢癌患者所進(jìn)行的骨髓與外周血造血細(xì)胞的對比電子顯微鏡檢查確立了免于所用制備物細(xì)胞毒性影響的保護(hù)效果機(jī)理。
研究顯示，用在本項(xiàng)工作中的化療制備物對粒細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和紅細(xì)胞樣譜系的不同造血細(xì)胞類型發(fā)揮突出的細(xì)胞毒性效果。
這種細(xì)胞毒性效果以細(xì)胞質(zhì)營養(yǎng)不良性改變和在骨髓細(xì)胞(和分別外周血)中發(fā)育的特殊顆粒死亡的形式表示。
所述障礙尤其涉及早期分化節(jié)段的粒細(xì)胞，在更低程度上還涉及淋巴樣細(xì)胞，也就是胚細(xì)胞、前髓細(xì)胞、髓細(xì)胞、成淋巴細(xì)胞的生成，它們牽涉紅細(xì)胞樣譜系，以及導(dǎo)致造血細(xì)胞的功能性分化形式的不充分蓄積。
進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，在粒細(xì)胞譜系要素中，遺傳性編程性細(xì)胞死亡、即細(xì)胞凋亡增強(qiáng)了。
營養(yǎng)不良變化和細(xì)胞凋亡一般導(dǎo)致白細(xì)胞減少、中性白細(xì)胞減少、血小板減少和其他造血狀態(tài)障礙的形成和有限的化療能力。
基于所進(jìn)行的研究，確認(rèn)Dicarbamine保護(hù)骨髓(分別和外周血)造血細(xì)胞免于所用化療制備物的細(xì)胞毒性效果，促進(jìn)年輕形式向成熟細(xì)胞要素的分化，和減少細(xì)胞凋亡事件。
作為所發(fā)現(xiàn)的Dicarbamine效果的結(jié)果，在化療期間的患者的骨髓中，發(fā)生年輕(胚)型造血細(xì)胞的蓄積，尤其重要的是，它們向功能性形式的分化增強(qiáng)了。
因而，在化療條件下，刺激骨髓造血細(xì)胞、尤其是粒細(xì)胞譜系細(xì)胞的分化，和防止細(xì)胞凋亡的生長，是Dicarbamine的保護(hù)效果機(jī)理。
實(shí)施例11Dicarbamine關(guān)于減少卵巢癌化療血液學(xué)毒性的功效 在13名III-IV期卵巢癌患者中研究Dicarbamine的效果，他們按照下列方案經(jīng)歷77個化療過程400mg/m2卡鉑i.v.逐滴一次+600mg/m2環(huán)磷烷i.v.逐滴一次；在28天中重復(fù)這些過程。每日飯后口服給以100mg Dicarbamine，開始于第一過程之前5天，然后持續(xù)三周。給藥的持續(xù)時間為26天，療程劑量為2600mg。在第二化療過程之前5天再次給以Dicarbamine，給藥持續(xù)21天。在兩個化療過程期間Dicarbamine攝取的總持續(xù)時間為52天。
在接受77個Dicarbamine化療過程的13名患者中評估血液學(xué)毒性(白細(xì)胞減少、中性白細(xì)胞減少、血小板減少)，與一組7名接受25-27個沒有Dicarbamine的化療過程的患者(對照)進(jìn)行對比。
在進(jìn)行化療(對照)之前和之后多次動態(tài)評估造血參數(shù)，以及在試驗(yàn)組中在Dicarbamine給藥之前和之后動態(tài)評估這些參數(shù)。下面列出按照所示方案接受有或沒有Dicarbamine的化療的個別患者的造血參數(shù)。
8.1患者接受沒有Dicarbamine的化療 51歲女性，診斷III期卵巢癌；按照治療方案她接受第一化療過程600mg/m2環(huán)磷烷和400mg/m2卡鉑一次。
完整的血液分析，化療過程1參數(shù)，測量單位化療過程1開始之前化療過程1之后5天化療過程1之后2周化療過程1之后3周白細(xì)胞109/l4.53.82.22.0嗜中性白細(xì)胞109/l2.92.40.90.8血小板168160154150 由于中性白細(xì)胞減少，第二治療過程推遲7天。
按照如下治療方案，第二化療過程600mg/m2環(huán)磷烷+400mg/m2卡鉑一次，沒有Dicarbamine。
完整的血液分析，化療過程2參數(shù)，測量單位化療過程2開始之前化療過程2之后5天化療過程2之后2周化療過程2之后3周白細(xì)胞109/l3.53.32.02.1嗜中性白細(xì)胞109/l2.22.00.80.9血小板178170154150 由于中性白細(xì)胞減少，第三過程推遲。
63歲女性，診斷IV期卵巢癌，轉(zhuǎn)移至右腹股溝淋巴結(jié)，腹水；按照如下治療方案她接受第一化療過程600mg/m2環(huán)磷烷+400mg/m2卡鉑一次，沒有Dicarbamine。
完整的血液分析，化療過程1參數(shù)，測量單位CT過程1開始之前CT過程1之后5天CT過程1之后2周CT過程1之后3周白細(xì)胞109/l5.03.92.12.0嗜中性白細(xì)胞109/l3.21.70.91.0血小板160150151152 由于白細(xì)胞減少和中性白細(xì)胞減少，第二治療過程推遲4天。
按照如下治療方案，進(jìn)行第二化療過程600mg/m2環(huán)磷烷+400mg/m2卡鉑一次，沒有Dicarbamine。
完整的血液分析，化療過程2參數(shù)，測量單位CT過程2開始之前CT過程2之后5天CT過程2之后2周CT過程2之后3周白細(xì)胞109/l3.7 2.9 2.0 2.2嗜中性白細(xì)胞109/l2.2 1.8 0.9 0.9血小板166 160 140 155 由于中性白細(xì)胞減少，第三過程推遲。
8.2患者接受化療以及Dicarbamine 51歲女性，診斷III期卵巢癌；按照如下治療方案她接受第一化療過程600mg/m2環(huán)磷烷和400mg/m2卡鉑，在治療第1天。每日給以100mg Dicarbamine，開始于化療過程1之前5天，然后持續(xù)21天。過程2之前的Dicarbamine療法周期為26天。
完整的血液分析，化療與Dicarbamine過程1參數(shù)，測量單位開始 Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程2之后第0天第5天第21天第33天白細(xì)胞109/l5.95.54.74.0嗜中性白細(xì)胞109/l4.24.03.32.9血小板170164160158 按照如下治療方案，如期進(jìn)行化療過程2600mg/m2環(huán)磷烷和400mg/m2卡鉑一次，在進(jìn)行第一化療過程之后28天+Dicarbamine。在過程2之前5天給以100mg Dicarbamine，然后每日給藥持續(xù)21天。Dicarbamine攝取的總持續(xù)時間(2個化療過程)為52天。
完整的血液分析，化療過程2參數(shù)，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程3之后CT過程1之后第28天第33天第54天第61天白細(xì)胞109/l4.95.04.24.2嗜中性白細(xì)胞109/l3.23.33.13.0血小板180170160160 如期給以第三CT過程。
75歲女性，診斷III期卵巢癌；按照如下治療方案她接受化療與Dicarbamine600mg/m2環(huán)磷烷和400mg/m2卡鉑，在治療第1天。每日給以100mg Dicarbamine，開始于CT過程1之前5天，然后持續(xù)21天。過程2之前的Dicarbamine療法周期為26天。
完整的血液分析，化療與Dicarbamine過程1參數(shù)，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程2之后第0天第5天第21天第33天白細(xì)胞109/l7.47.26.65.2嗜中性白細(xì)胞109/l5.75.05.23.8血小板174165162167 按照如下治療方案，如期進(jìn)行化療過程2600mg/m2環(huán)磷烷和400mg/m2卡鉑一次，在進(jìn)行第一化療過程之后28天+Dicarbamine。在過程2之前5天給以100mg Dicarbamine，然后每日給藥持續(xù)21天。Dicarbamine攝取的總持續(xù)時間(2個化療過程)為52天。
完整的血液分析，化療過程2參數(shù)，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程3之后CT過程1之后第28天第33天第54天第61天白細(xì)胞109/l7.88.27.67.2嗜中性白細(xì)胞109/l5.26.06.25.8血小板165160162157 按期給以第三CT過程。
65歲女性，診斷IV期卵巢癌；按照如下治療方案她接受化療與Dicarbamine600mg/m2環(huán)磷烷和400mg/m2卡鉑，在治療第1天。每日給以100mg Dicarbamine，開始于CT過程1之前5天，然后持續(xù)21天。過程2之前的Dicarbamine療法周期為26天。
完整的血液分析，化療與Dicarbamine過程1參數(shù)，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程2之后第0天第5天第21天第33天白細(xì)胞109/l6.65.95.55.0嗜中性白細(xì)胞109/l5.04.24.43.4血小板170172166164 按照如下治療方案，如期進(jìn)行化療過程2600mg/m2環(huán)磷烷和400mg/m2卡鉑一次，在進(jìn)行第一化療過程之后28天+Dicarbamine。在過程2之前5天給以100mg Dicarbamine，然后每日給藥持續(xù)21天。Dicarbamine攝取的總持續(xù)時間(2個化療過程)為52天。
完整的血液分析，化療過程2參數(shù)，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程3之后CT過程1之后第28天第33天第54天第61天白細(xì)胞109/l5.65.85.75.5嗜中性白細(xì)胞109/l3.03.23.43.2血小板170170176165 按期給以第三CT過程。
8.3接受化療和接受或不接受Dicarbamine的患者血液學(xué)毒性的對比數(shù)據(jù)，如表16和17所示 表16 接受化療沒有Dicarbamine的患者具有血液學(xué)毒性的人數(shù)(％)毒性類型CT過程數(shù)根據(jù)WHO的血液學(xué)毒性程度 0I II III IVIII+IV白細(xì)胞減少26 3 11.5％519.2％ 12 46.1％ 5 19.2％ 1 3.8％623.07％中性白細(xì)胞減少26 7 26.9％0 8 30.7％ 6 23.07％ 5 19.2％1142.3％血小板減少25 10 40.0％312.0％ 7 28.0％ 4 16.0％ 1 4.0％520.0％ 表17 接受化療與Dicarbamine的患者具有血液學(xué)毒性的人數(shù)(％)毒性類型CT過程數(shù)根據(jù)WHO的血液學(xué)毒性程度0IIIIIIIVIII+IV白細(xì)胞減少77100％67.7％1823.3％4355.8％1012.9％01012.9％中性白細(xì)胞減少67100％2131.3％1217.9％2334.3％57.4％68.9％1116.4％血小板減少76100％2735.5％3242.1％1013.1％67.8％11.3％79.1％ 所得數(shù)據(jù)顯示，沒有使用Dicarbamine達(dá)到有限的III-IV階段血液學(xué)毒性(表16)，白細(xì)胞減少為23.0％，中性白細(xì)胞減少為42.3％，血小板減少為20.0％。
在接受Dicarbamine的患者組中，白細(xì)胞減少、中性白細(xì)胞減少和血小板減少的發(fā)生率顯著降低(表17)。血液學(xué)毒性中，白細(xì)胞減少降低至12.9％，即1.8倍，中性白細(xì)胞減少降低2.6倍，血小板減少降低2.2倍。因而，Dicarbamine的使用導(dǎo)致所列種類血液學(xué)毒性都有減少。
下列數(shù)據(jù)支持這樣的事實(shí)，Dicarbamine的給藥沒有降低細(xì)胞抑制劑療法的功效，而是相反在一定程度上增強(qiáng)所達(dá)到的效果。
按照上述方案，在兩個有或沒有Dicarbamine的化療過程之后評估患者的治療功效。功效是按照公認(rèn)的參數(shù)評估的CR-完全消退；PR-部分消退；SB-穩(wěn)定化；和Progr.-進(jìn)展。
所得數(shù)據(jù)列在表18中。
表18 按照方案環(huán)磷烷+卡鉑與Dicarbamine治療患者的功效患者組患者人數(shù)CRPRSBProgr.化療6100.0％233.3％116.6％233.5％116.6％化療+Dicarbamine15100.0％426.6％746.6％213.5％213.3％ 所列數(shù)據(jù)顯示，在接受沒有Dicarbamine的化療的患者組中，腫瘤生長控制率(CR+PR)達(dá)到49.9％。在接受化療與Dicarbamine的患者組中，治療功效為73.2％。
因而，在治療接受化療的患者時使用Dicarbamine，導(dǎo)致主要種類血液學(xué)毒性的減少，而不降低治療功效。
上列試驗(yàn)與臨床數(shù)據(jù)明顯證實(shí)通式(I)肽衍生物作為非特異性分化誘導(dǎo)劑的功效，當(dāng)使用肽衍生物以及骨髓抑制劑時，化療減少中性白細(xì)胞減少的程度和數(shù)量，單獨(dú)使用導(dǎo)致鼠造血組織增殖和分化中鼠與人黑瘤的生長穩(wěn)定化，包括沒有化療功效存在的情況。
通式(I)肽衍生物對腫瘤生長的效果顯示與腫瘤細(xì)胞增殖活動延遲和分化程度升高有關(guān)，特別是黑瘤細(xì)胞的黑素合成能力和Friend成紅細(xì)胞增多前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。
臨床研究揭示了通式(I)肽衍生物在采用不同聯(lián)合化療方案治療癌癥患者時顯著降低血液學(xué)毒性的性質(zhì)。因而，當(dāng)利用鉑制備物(環(huán)磷烷)以及肽衍生物治療患有卵巢癌的患者時，有限的中性白細(xì)胞減少和血小板減少的程度降低了2-3倍。與此同時，治療功效沒有降低。
表4 Dicarbamine對裸鼠M-6人黑瘤生長的效果 表4 Dicarbamine對裸鼠M-6人黑瘤生長的效果接種后天數(shù)對照n＝7Dicarbamine 1.5mg/kgn＝10 Dicarbamine 4.5mg/kgn＝10M+m*M+mM+mV％ V％p**V％P18天66.2+2.8100 21.8+12.810091.9+54.410025天266.0+69.4329.0+88.9 77.5+46.4302.0+186.00.82266.0+198.0166.0+93.00.01533天582.0+127.4132.9+57.3 342.0+142.0428.0+313.10.11852.0+495.0276.0+104.00.01139天701.0+123.521.9+12.6 435.0+187.023.2+22.10.921129.0+600.039.8+27.30.16946天778.0+148.410.5+8.1 662.0+417.023.9+31.00.451354.0+735.019.6+17.50.27653天821.0+221.83.8+10.3 783.0+423.018.6+54.00.431550.0+780.04.2+22.50.538 *平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差 **顯著性計算是僅對腫瘤體積變化百分比數(shù)據(jù)而進(jìn)行的。
表12 在環(huán)磷酰胺與Dicarbamine組合的影響下，小鼠外周血白細(xì)胞組成的動力學(xué)所生成的要素第1組環(huán)磷酰胺給藥后天數(shù)35710131721髓細(xì)胞000,4/54±O,40000年輕的001,4/188±1480.4/48±3000帶狀3.2/89±164.6/370±134.8/660±2235.7/620±2602.2/293±1461.6/198±1502.7/286±214有節(jié)段的10.4/290±21017.6/1400±31.4/4200±96027/3200±45024/3190+44019.6/2430±54518.8/2444±585嗜曙紅細(xì)胞1.2/34±151.2/95.5±44001.2/290±732.6/322±931.4/182±72單核細(xì)胞6.2/172±627.2/570±175.4/724±745.2/690±1304.6/612±2195.4/60±1504.0/520±143淋巴細(xì)胞75.6/2120±31069.4/5520±56.2/7530±125065.4/7780±45067.8/9017±58070.8/8780±54573.8/9594±585第2組髓細(xì)胞00.6/26±500000年輕的0.4/4±11.6/70±240.6/63±12O.4/26±5000帶狀1.2/13±34.2/184±483.6/378±413.2/206±712.2/26811341.6/195±671.4/167±67有節(jié)段的5.2/55±0.616/700±24035.2/3700±70523.7/1494±39018.2/2220±47020.2/2460±3719.6/2330±714嗜曙紅細(xì)胞0.4/4±10.4/17±501.0/64±351.4/170±1341.4/170±791.6/190±130單核細(xì)胞4.649±17.56.4/280±484.8/504±1155.4/350±1603.8/464±1344.4/537±1344.6/547±65淋巴細(xì)胞88.2/935±2371/3110±21755.8/6860±75065.8/4240±70875.0/9150±40271.6/8740±60471.6/8520±785 表格列舉％/絕對量，以mm3表示 表13 在環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺與Dicarbamine組合的影響下，鼠骨髓的細(xì)胞構(gòu)成組No環(huán)磷酰胺給藥后的天數(shù)35710131721114.5±3.4321.55±1.9232.35±3.5733.8±3.8532.6±5.2228.25±3.0230.4±2.7528.2±1.6513.05±2.7525.22±2.7527.9±2.7530.15±6.625.0±3.1626.55±4.53 *細(xì)胞數(shù)，以百萬個表示 表14 肽衍生物對Friend成紅細(xì)胞增多小鼠腫瘤大小的效果化合物每日給以單一劑量(mg/kg)達(dá)5天在療法終止后不同天數(shù)的平均腫瘤體積腫瘤生長抑制率％81319對照342[139÷545]706[457÷961]777[199÷1355]11.5157[73÷241]284[197÷371]318[136÷500]5460*6321.5130[68÷192]367[105÷629]367[105÷629]624857對照**249[150÷348]678[373÷983]645[385÷905]---31.5**77[52÷102]219[104÷334]368[193÷543]69*68*43Dicarbamine1.596[37÷155]150[87÷213]290[103÷477]6178*554.5**129[67÷191]300[130÷470]485[1354÷835]625838 注*與對照的差異是顯著的，p＜0.05 **第二次試驗(yàn) 表15 肽衍生物對Friend成紅細(xì)胞增多小鼠腫瘤生長速率的效果化合物每日給以單一劑量(mg/kg)達(dá)5天在腫瘤接種后不同天數(shù)的相對腫瘤體積以及每日Dicarbamine攝取Vt/V1腫瘤生長抑制率％81319對照-1,02,02.311.51.01.82.05460**6321.51.02.82.8624857對照***1.51.02.722.59---31.5***1.02.84.7869**68**43Dicarbamine1.51.01.563.06178**5545***1.02.33.76625838 注*p＜0.05 **第二次試驗(yàn)
權(quán)利要求
1、誘導(dǎo)包括人類在內(nèi)的哺乳動物細(xì)胞分化的方法，該方法包含有效量下列通式肽衍生物
或其藥學(xué)上可接受的鹽的給藥，
其中R1是被官能團(tuán)取代的C1-C3烴原子團(tuán)，取代基選自氨基、C1-C5酰氨基或羧基，羧基可選地被醚化，氨基可選地被?；〈〈?；或者同時被氨基和羧基取代的C1-C3烴原子團(tuán)，氨基可選地被?；〈〈?，羧基可選地包括在C5-C6元環(huán)狀酰亞胺中，該酰亞胺包括N-末端氨基或-CONH-基團(tuán)的-NH-基團(tuán)；或者被5-6元不飽和雜環(huán)基團(tuán)取代的C1-C3烴原子團(tuán)，烴原子團(tuán)可以同時包含可選被?；〈〈陌被换蛘?br> R1是飽和的雜環(huán)基團(tuán)；
R2是氫原子或官能團(tuán)，選自可以被醚化的羧基；
R3是5-6元飽和或不飽和環(huán)狀或雜環(huán)基團(tuán)，或者氨基或羧基，羧基可選地被醚化；
n＝0-4，m＝1-4，k＝0-1。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的通式(I)肽衍生物是按照0.5-5.0mg/kg的劑量每日口服給藥的。
3、根據(jù)權(quán)利要求1和2任意一項(xiàng)的方法，其中如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的通式(I)肽衍生物是與化療過程聯(lián)合給藥的。
4、根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的方法，其中為了使惡性腫瘤的生長穩(wěn)定，將如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的通式(I)肽衍生物給藥至少15天。
5、根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)的方法，其中為了增強(qiáng)惡性腫瘤免疫療法的功效，將如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的通式(I)肽衍生物與干擾素一起給藥。
6、根據(jù)權(quán)利要求4和5任意一項(xiàng)的方法，其中該惡性腫瘤是黑瘤或造血組織增殖。
7、根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的方法，其中為了降低血液學(xué)毒性，將如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的通式(I)肽衍生物在開始化療過程之前5天給藥直至其終止。
8、根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)的方法，其中R1＝NH2CH2-、HOOC-CH2-、CH3CONH-CH2-、CH3OCO-CH2-、
n＝0-4；k＝0-1
R2＝H，COOH，COOCH3；
NH2，COOH，-COOCH3，m＝1-4.。
9、根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)的方法，其中該肽衍生物是4-[N-(2-咪唑-4-基)乙基)氨甲?；鵠丁酸。
10、下列通式肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，
其中R1是被官能團(tuán)取代的C1-C3烴原子團(tuán)，取代基選自氨基、C1-C5酰氨基或羧基，羧基可選地被醚化，氨基可選地被?；〈〈?；或者同時被氨基和羧基取代的C1-C3烴原子團(tuán)，氨基可選地被?；〈〈然蛇x地包括在C5-C6元環(huán)狀酰亞胺中，該酰亞胺包括N-末端氨基或-CONH-基團(tuán)的-NH-基團(tuán)；或者被5-6元不飽和雜環(huán)基團(tuán)取代的C1-C3烴原子團(tuán)，烴原子團(tuán)可以同時包含可選被?；〈〈陌被?；或者
R1是飽和的雜環(huán)基團(tuán)；
R2是氫原子或官能團(tuán)，選自可以被醚化的羧基；
R3是5-6元飽和或不飽和環(huán)狀或雜環(huán)基團(tuán)，或者氨基或羧基，羧基可選地被醚化；
n＝0-4，m＝1-4，k＝0-1；
用于制造誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞分化的藥物。
11、如權(quán)利要求10所指定的通式(I)肽衍生物的用途，與化療過程聯(lián)合用于減少血液學(xué)毒性。
12、如權(quán)利要求10所指定的通式(I)肽衍生物的用途，用于使惡性腫瘤的生長穩(wěn)定。
13、如權(quán)利要求10所指定的通式(I)肽衍生物的用途，與干擾素聯(lián)合用于增強(qiáng)免疫療法的功效。
14、根據(jù)權(quán)利要求10-13任意一項(xiàng)的用途，其中R1＝NH2CH2-、HOOC-CH2-、CH3CONH-CH2、CH3OCO-CH2-、
n＝0-4；k＝0-1
R2＝H，COOH，COOCH3；
NH2，COOH，-COOCH3，m＝1-4.。
15、根據(jù)權(quán)利要求10-14任意一項(xiàng)的用途，其中該肽衍生物是4-[N-(2-咪唑-4-基)乙基)氨甲?；鵠丁酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方法，該方法注射具有下列通式(I)的肽衍生物，用作分化誘導(dǎo)因子。所述肽衍生物用于治療腫瘤學(xué)疾病，特別是用于使黑瘤生長穩(wěn)定，增加黑瘤免疫療法的效率，減少化療的血液學(xué)毒性。還公開了所述肽衍生物的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/4045GK1649612SQ0380949
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月28日
發(fā)明者弗拉迪米爾·葉夫根尼耶維奇·涅博利辛, 維拉·安德列芙娜·戈?duì)柌贾Z娃, 伊萬·德米特耶維奇·特里斯查林, 納坦·坦弗列維奇·賴赫林, 奧古斯特·米哈伊洛維奇·加林, 馬克·鮑里索維奇·貝奇科夫, 伊蓮娜·米哈伊洛芙娜·特里斯查林娜, 加利娜·亞歷山德羅芙娜·熱爾圖金娜 申請人:弗拉迪米爾·葉夫根尼耶維奇·涅博利辛