專利名稱：細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞的分化轉(zhuǎn)換方法。更具體而言，涉及通過(guò)改變已最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境而使細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的方法。本發(fā)明進(jìn)而涉及利用上述方法得到的分化細(xì)胞。
背景技術(shù)：
在實(shí)現(xiàn)再生醫(yī)療或細(xì)胞醫(yī)療中，在任何領(lǐng)域，確保以成為其基底為目的的細(xì)胞的供給源都是必要、不可缺少的課題，目前為止，已開(kāi)發(fā)出利用干細(xì)胞、成熟細(xì)胞的方法等各種方法。
現(xiàn)在，在該領(lǐng)域作為主流使用的以胚性干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、間葉系干細(xì)胞(MSC)為代表的多能性干細(xì)胞，具有多能性的優(yōu)點(diǎn)，但相反，在多能性的基礎(chǔ)上，有包括難以控制等很多問(wèn)題。
另一方面，近年來(lái)，除了多能性肝細(xì)胞以外，有報(bào)道已決定某種程度分化方向的細(xì)胞(組織干細(xì)胞、未分化的組織細(xì)胞等)的分化轉(zhuǎn)換技術(shù)。
直到目前，已報(bào)道的分化轉(zhuǎn)換技術(shù)的代表性方法是利用DNA的甲基化劑、還有脫甲基化劑的方法。該技術(shù)是利用DNA具有如下所述的性質(zhì)的技術(shù)，所述的性質(zhì)是通過(guò)甲基化/脫甲基化而向核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的DNA的結(jié)合能發(fā)生變化，來(lái)調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄。即，該技術(shù)通過(guò)使甲基化劑/脫甲基化劑直接作用于細(xì)胞中的DNA而人為地改變轉(zhuǎn)錄因子向DNA的結(jié)合能，來(lái)強(qiáng)制性地引起細(xì)胞分化誘導(dǎo)。
福田等將該技術(shù)用于間葉系干細(xì)胞，向間葉系干細(xì)胞添加脫甲基化劑的5-氮雜胞苷，成功地從間葉系干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)系獲得心肌細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)、Vol.19，No.12，(8月號(hào))2001)。進(jìn)而，利用該方法，除了心肌細(xì)胞以外，還報(bào)道了向以成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞為代表的各種細(xì)胞分化。
但是，目前，該技術(shù)在產(chǎn)生DNA的甲基化/脫甲基化而使細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換本身是成功了，但不能控制分化的方向性，在使用這些試劑使其發(fā)生分化的情況下，隨即決定向何種細(xì)胞分化，所以，此時(shí)的實(shí)際情況是從眾多已隨機(jī)變化的細(xì)胞中分離必要的細(xì)胞使用。為此，為了得到目的細(xì)胞，不僅費(fèi)力，還有細(xì)胞發(fā)生預(yù)料以外的變異的危險(xiǎn)性，在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用或在產(chǎn)業(yè)方面的利用有很大風(fēng)險(xiǎn)。
另外，作為分化轉(zhuǎn)換的例子，在特開(kāi)2003-304878號(hào)公報(bào)中記載了使哺乳類胎兒性肝細(xì)胞或肝前體細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的技術(shù)。該技術(shù)不使用如上所述的分化轉(zhuǎn)換劑，通過(guò)在尼克酰胺的存在下培養(yǎng)或?qū)牖?，誘導(dǎo)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞，但最終還是利用胎兒性細(xì)胞或前體細(xì)胞等未分化的細(xì)胞的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以解決消除上述以往技術(shù)的問(wèn)題點(diǎn)作為課題。即，本發(fā)明以提供不使用DNA的甲基化劑/脫甲基化劑而使成熟細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的方法作為解決的課題。
本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果實(shí)際證明了通過(guò)改變具有第1性質(zhì)的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，可以向具有與上述第1性質(zhì)不同的第2性質(zhì)的最終分化的成熟細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)而完成的發(fā)明。
即，本發(fā)明提供一種方法，是通過(guò)改變具有第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，使其向具有與上述第1分化表現(xiàn)型不同的第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的方法，其特征在于，將培養(yǎng)條件，從適合培養(yǎng)具有上述第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，改變?yōu)檫m合培養(yǎng)具有上述第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件。
培養(yǎng)條件的變化優(yōu)選為培養(yǎng)基的變化。
優(yōu)選不使用DNA的甲基化劑和脫甲基化劑而進(jìn)行分化轉(zhuǎn)換。
具有第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞優(yōu)選為成骨細(xì)胞，具有第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞優(yōu)選為神經(jīng)細(xì)胞。在這種情況下，優(yōu)選通過(guò)將培養(yǎng)基從含有β-甘油磷酸(glycerophosphate)、抗壞血酸以及Glutamax的培養(yǎng)基，換為含有bFGF、FGF-8、EGF以及BDNF的培養(yǎng)基，進(jìn)行分化轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明的另外一個(gè)側(cè)面是提供利用上述方法得到的具有規(guī)定的分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞。


圖1表示利用本發(fā)明的方法從成骨細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的細(xì)胞的樣子。
圖2表示利用本發(fā)明的方法分化轉(zhuǎn)換的神經(jīng)細(xì)胞的免疫染色的結(jié)果。
圖3表示利用本發(fā)明的方法使成骨細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞重新向成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的細(xì)胞的樣子。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明的方法的特征在于，是通過(guò)改變具有第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件而使其向具有與第1分化表現(xiàn)型不同的第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的方法，使培養(yǎng)條件，從適合培養(yǎng)具有上述第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，改變?yōu)檫m合培養(yǎng)具有上述第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件。
本說(shuō)明書(shū)中的分化轉(zhuǎn)換是指，具有某種分化表現(xiàn)型的已分化的成熟細(xì)胞失去其分化表現(xiàn)型，變化成具有其它的分化表現(xiàn)型的已分化的成熟細(xì)胞。
作為與分化轉(zhuǎn)換相關(guān)的以往技術(shù)，甲基化劑/脫甲基化劑法的優(yōu)點(diǎn)在于，可以通過(guò)直接作用于已決定分化方向的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系，在促進(jìn)細(xì)胞分化的程序化的因子作用下，由1種試劑誘導(dǎo)各種細(xì)胞。另一方面，利用該方法不能決定分化的方向性，為了得到目的的細(xì)胞，需要從已隨機(jī)分化的細(xì)胞中篩選/分離目的細(xì)胞的操作。
另一方面，本發(fā)明的方法不是在分化轉(zhuǎn)換劑的作用下對(duì)哺乳類所有的細(xì)胞強(qiáng)制性地促進(jìn)再程序化，而是通過(guò)使細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境與目的細(xì)胞一致，實(shí)現(xiàn)分化轉(zhuǎn)換。該作用可能是通過(guò)將細(xì)胞移到適當(dāng)?shù)纳h(huán)境的培養(yǎng)基，細(xì)胞本來(lái)具有的基因在細(xì)胞的周圍環(huán)境的作用下引起產(chǎn)生的。因而，與一起使用分化轉(zhuǎn)換劑強(qiáng)制性地使細(xì)胞分化的分化轉(zhuǎn)換不同，利用細(xì)胞本來(lái)具有的對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的對(duì)應(yīng)能力，所以利用該手段，可以使所有的哺乳類細(xì)胞向目的細(xì)胞分化。另外，由于難以產(chǎn)生脫甲基化劑之類的隨機(jī)分化，所以將成熟細(xì)胞作為再生醫(yī)療或細(xì)胞醫(yī)療等中的穩(wěn)定的細(xì)胞供給源利用成為可能。
另外，對(duì)于已發(fā)生分化的細(xì)胞，通過(guò)使細(xì)胞恢復(fù)到分化前的條件下，可以重新誘導(dǎo)分化前的細(xì)胞，所以可以根據(jù)目的，隨意地控制細(xì)胞的分化。
進(jìn)而，本發(fā)明可以使其正確地向目的細(xì)胞分化，所以不需要以往技術(shù)中在利用分化轉(zhuǎn)換劑時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞分離操作，只以簡(jiǎn)便的培養(yǎng)基的交換操作即可實(shí)現(xiàn)分化轉(zhuǎn)換操作。因而，本發(fā)明的方法容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，從產(chǎn)業(yè)角度也可以看出是出色的方法。
另一方面，在上述特開(kāi)2003-304878號(hào)公報(bào)的方法中，雖然不利用分化轉(zhuǎn)換劑，但是只限定于未分化肝細(xì)胞的技術(shù)。就本發(fā)明而言，只要是哺乳類細(xì)胞，可以不選擇生物種類、細(xì)胞種類而實(shí)施。進(jìn)而，在特開(kāi)2003-304878號(hào)公報(bào)中，使用的是基因?qū)?，在本發(fā)明中不需要基因?qū)搿?br> 另外，對(duì)于上述的以往技術(shù)，作為與分化轉(zhuǎn)換相關(guān)的技術(shù)已被報(bào)道，但這些報(bào)道大多作為細(xì)胞的供給源，利用干細(xì)胞或前體細(xì)胞等未分化的細(xì)胞，從該角度來(lái)看，與作為使已最終分化的成熟細(xì)胞分化為其它細(xì)胞的技術(shù)的本發(fā)明不同。本發(fā)明即使不使用未分化的細(xì)胞，也可以誘導(dǎo)其它細(xì)胞，在臨床的現(xiàn)場(chǎng)，在原本使用干細(xì)胞等未分化細(xì)胞的情況下，可以利用能夠簡(jiǎn)便采取且最終分化的成熟細(xì)胞來(lái)代替干細(xì)胞，即使從臨床上的細(xì)胞選擇的范圍寬的角度來(lái)看，與以往的技術(shù)相比，也是很大的優(yōu)點(diǎn)。
在本說(shuō)明書(shū)中的實(shí)施例中使用的MC3T3-E1是在全世界中被認(rèn)知且廣泛使用的具有代表性的成骨細(xì)胞株。在針對(duì)該細(xì)胞使用本發(fā)明的方法時(shí)，其形態(tài)向神經(jīng)細(xì)胞樣變化，從表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物的神經(jīng)絲(Neurofilament)和GFAP可以證明利用本發(fā)明的方法，成骨細(xì)胞已向神經(jīng)細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換。
另外，在將神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基換成成骨細(xì)胞培養(yǎng)基之后，從神經(jīng)細(xì)胞向成骨細(xì)胞變化可以證明根據(jù)培養(yǎng)基的條件，這些分化轉(zhuǎn)換向相反方向也可以隨意地發(fā)生。
從生物的細(xì)胞本身在任何細(xì)胞中都保有全部的遺傳信息可知對(duì)于本實(shí)施例，通常停止表達(dá)的成骨細(xì)胞所具有的神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)的基因，在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中含有的因子的影響下表達(dá)，進(jìn)行從成骨細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化。另外，在將已分化成為神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞的培養(yǎng)條件從神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基變更為成骨細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)產(chǎn)生的向成骨細(xì)胞的分化，也可以說(shuō)是由于同樣的原因產(chǎn)生的。
如上所述，本發(fā)明是，利用全部細(xì)胞本身具有的遺傳信息，通過(guò)使細(xì)胞的生育環(huán)境成為與目的細(xì)胞對(duì)應(yīng)的環(huán)境來(lái)實(shí)現(xiàn)分化轉(zhuǎn)換的技術(shù)。
即，從全部的細(xì)胞保有全部的遺傳信息可知，本發(fā)明的分化轉(zhuǎn)換技術(shù)不限定于成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，也可以用于全部的哺乳類細(xì)胞。
對(duì)本發(fā)明使用的細(xì)胞的種類沒(méi)有特別限定，但可以優(yōu)選使用包括人或非人哺乳類動(dòng)物的任意的哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞。作為非哺乳類動(dòng)物，例如可以舉出小鼠以及以外的嚙齒類、牛、馬、豬、山羊、羊、狗、貓等，但不限定于這些。本發(fā)明使用的細(xì)胞特別優(yōu)選人來(lái)源細(xì)胞。在本發(fā)明中，需要分化轉(zhuǎn)換的細(xì)胞可以從外胚層、中胚層、內(nèi)胚層、神經(jīng)嵴或外胚膜來(lái)源的組織取得。
對(duì)于本發(fā)明的方法，通過(guò)將細(xì)胞的培養(yǎng)條件，從適合培養(yǎng)具有第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，變化為適合培養(yǎng)具有第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，進(jìn)行分化轉(zhuǎn)換。適合培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件是指例如培養(yǎng)基的組成適合該細(xì)胞的培養(yǎng)。
本發(fā)明中可以作為起始材料使用或制作的細(xì)胞的種類、用于其培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成的具體例子如下所示，但本發(fā)明不被它們所限定。
(1)成骨細(xì)胞可以在含有地塞米松(dexamethasone)、抗壞血酸鹽、間葉干細(xì)胞補(bǔ)充劑(MCGS)(Mesenchymal Stem Cell Supplement)、L-谷氨酰胺、β-甘油磷酸(glycerophosphate)等的培養(yǎng)基中分化轉(zhuǎn)換。作為成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基的組成例，可以舉出加入了FBS(終濃度10％)、5～10mM的β-甘油磷酸、50μg/ml的抗壞血酸、1×Glutamax的αMEM培養(yǎng)基等。
(2)神經(jīng)細(xì)胞通?？梢栽诤幸朁S酸或維生素A之類的retinoid化合物以及根據(jù)需要的腦來(lái)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(PDGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、neurotrophin(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)(NT)-3、neurotrophin(NT)-4、或sonichedgehog(Shh)之類的神經(jīng)生長(zhǎng)因子或neurotrophin等的培養(yǎng)基中分化轉(zhuǎn)換。作為神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基的組成例，可以舉出加入了FBS(終濃度10％)、100ng/ml的bFGF、10ng/ml的FGF-8、10ng/ml的EGF、10ng/ml的BDNF的αMEM培養(yǎng)基等。
(3)軟骨細(xì)胞通?？梢栽诤械厝姿?、抗壞血酸鹽、丙酮酸鈉、脯氨酸、L-谷氨酰胺、鐵傳遞蛋白(transferrin)、胰島素(insulin)、TGF-β等的培養(yǎng)基中分化轉(zhuǎn)換。
(4)脂肪細(xì)胞通常可以在含有胰島素、L-谷氨酰胺、地塞米松、消炎痛(indomethacin)等的培養(yǎng)基中分化轉(zhuǎn)換。
(5)肝細(xì)胞通?？梢栽诤幸葝u素、地塞米松、抗壞血酸、FGF-4、FGF、HGF等的培養(yǎng)基中分化轉(zhuǎn)換。
在本發(fā)明中，細(xì)胞的培養(yǎng)可以使用上述優(yōu)選的培養(yǎng)基，在通常的哺乳類細(xì)胞的培養(yǎng)條件(例如，從室溫到37℃的溫度；5％CO2孵箱(incubator)內(nèi)等)下進(jìn)行。對(duì)培養(yǎng)的形態(tài)沒(méi)有特別限定，例如可以靜置培養(yǎng)進(jìn)行。
是否利用本發(fā)明的方法進(jìn)行了分化轉(zhuǎn)換，可以將在目的細(xì)胞中有無(wú)特異標(biāo)記物的表達(dá)作為指標(biāo)進(jìn)行判斷。標(biāo)記物的表達(dá)可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生化學(xué)或免疫化學(xué)方法檢測(cè)。例如，可以使用酶結(jié)合免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、免疫熒光測(cè)定法(IFA)、免疫電泳、免疫層析測(cè)定法或免疫組織化學(xué)染色法等免疫化學(xué)方法，但不被它們所限定。在這些方法中，使用與各種目的細(xì)胞的抗原選擇性結(jié)合的標(biāo)記物特異的多克隆抗體或單克隆抗體或其片斷。各種特異的針對(duì)標(biāo)記物的抗體有市售，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以適當(dāng)取得。
或者，目的細(xì)胞中特異標(biāo)記物的表達(dá)也可以利用RT-PCR、轉(zhuǎn)錄界在性擴(kuò)增(TMA)、逆轉(zhuǎn)錄酶連接酶(ligase)連鎖反應(yīng)(RT-PCR)、或者雜交分析等分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。
或者，也可以利用對(duì)已分化的細(xì)胞的代謝產(chǎn)物或者細(xì)胞的試劑代謝、色素的染色性等性質(zhì)，通過(guò)茜素紅(Alizarine Red)染色、阿爾新藍(lán)(alcianblue)染色、油紅(Oil-Red)-O染色、Von Kossa染色、靛青綠(indocyaninegreen)染色等組織染色方法特異性地檢測(cè)出。
作為神經(jīng)細(xì)胞特異的標(biāo)記物的具體例子，可以舉出神經(jīng)絲、GFAP(膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白)(Glial fibrillary acidic protein)、nestin、神經(jīng)特異微管蛋白(tubulin)、神經(jīng)特異烯醇化酶(enolase)等。
作為成骨細(xì)胞特異的標(biāo)記物，可以舉出Collagen type I(I型膠原)、骨橋蛋白(osteopontin)、骨鈣素(osteocalcin)、MGP(基質(zhì)Gla蛋白)(matrixGla protein)、ALP(堿性磷酸酶)(Alkaline phosphatase)、Cbfal(核心結(jié)合因子a1)(Core binding factor alpha 1)等。另外，作為特異的染色法，可以舉出茜素紅染色、Von Kossa染色等。
作為軟骨細(xì)胞特異的標(biāo)記物，可以舉出Collagen type II(II型膠原)、硫酸軟骨蛋白多聚糖(Chondroitin sulfate-proteoglycan)、COMP(軟骨低聚物基質(zhì)蛋白)(cartilage oligomeric matrix protein)、Aggrecan、SOX9(SRY-related HMG box9)等。另外，作為特異的染色法，可以舉出阿爾新藍(lán)染色等。
作為脂肪細(xì)胞特異的標(biāo)記物，可以舉出PPARγ(過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ)(Peroxisome Proliferator Activated Receptor-gamma)等。另外作為特異的染色法，可以舉出油紅-O染色等。
作為肝細(xì)胞特異的標(biāo)記物，可以舉出白蛋白(Albumin)、細(xì)胞色素P450等。另外，作為特異的染色法，可以舉出靛青綠染色等。
進(jìn)而，向目的細(xì)胞的分化轉(zhuǎn)換也可以使用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確認(rèn)。例如，神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞直徑的3倍以上的軸索突起或軸索突起樣突起的表達(dá)來(lái)確認(rèn)。
利用本發(fā)明的分化轉(zhuǎn)換法在體外(in vitro)進(jìn)行，通過(guò)將由此得到的成熟細(xì)胞或其產(chǎn)生的組織或器官移植到身體，可以使組織或器官再生。
利用以下實(shí)施例進(jìn)一步具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不被實(shí)施例所限定。
實(shí)施例
(1)方法在加入了FBS(終濃度10％)、5～10mM的β-甘油磷酸、50μg/ml的抗壞血酸、1×Glutamax的αMEM培養(yǎng)基(以下，成骨細(xì)胞培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞建立株(MC3T3/E1)，直至變?yōu)閬唴R合(subconfluent)。
用DMEM培養(yǎng)基清洗在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞之后，將已培養(yǎng)的MC3T3/E1的培養(yǎng)條件，從利用成骨細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)變更為加入了FBS(終濃度10％)、100ng/ml的bFGF、10ng/ml的FGF-8、10ng/ml的EGF、10nm/ml的BDNF的αMEM培養(yǎng)基(以下，神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基)，利用通過(guò)鏡檢的形態(tài)觀察、通過(guò)免疫染色的蛋白質(zhì)表達(dá)分析來(lái)經(jīng)時(shí)檢測(cè)改變培養(yǎng)基而產(chǎn)生的細(xì)胞的變化。
(2)結(jié)果在將用成骨細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的MC3T3/E1細(xì)胞移至神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基后，經(jīng)過(guò)6～12小時(shí)之后，從成骨細(xì)胞特有的鋪路石狀形態(tài)，變?yōu)榧?xì)胞突起長(zhǎng)的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)(圖1)。對(duì)變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞樣的細(xì)胞，使用對(duì)作為神經(jīng)細(xì)胞特異標(biāo)記物蛋白質(zhì)的神經(jīng)纖維、GFAP(膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白)的抗體，進(jìn)行免疫染色，結(jié)果，神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞被染色(圖2)。以上結(jié)果表明，該細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞。
進(jìn)而，在將成骨細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞移至成骨細(xì)胞培養(yǎng)基之后，神經(jīng)細(xì)胞分化為鋪路石狀的成骨細(xì)胞(圖3)。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明是使成熟細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換為其它細(xì)胞的技術(shù)，作為再生醫(yī)療、細(xì)胞療法等中的細(xì)胞供給源，作為可以利用成熟細(xì)胞的技術(shù)是有用的。通過(guò)使用本發(fā)明，在醫(yī)療的現(xiàn)場(chǎng)，在以往使用干細(xì)胞的場(chǎng)合下，變得不一定需要使用干細(xì)胞，例如不需要從骨髓、臍帶血、末梢血、胎盤(pán)、脂肪組織等取出或篩選干細(xì)胞，保存后利用的操作，與干細(xì)胞相比，可以從采取更簡(jiǎn)便的已最終分化的成熟細(xì)胞誘導(dǎo)需要的細(xì)胞，所以在再生醫(yī)療、細(xì)胞醫(yī)療等現(xiàn)場(chǎng)成為了非常有用的技術(shù)。
另外，在本發(fā)明中不使用脫甲基化劑等分化轉(zhuǎn)換劑，所以本發(fā)明的方法是癌化的風(fēng)險(xiǎn)小、安全性高的方法。另外，本發(fā)明的方法由于隨機(jī)分化少，所以安全性高，從操作工序只是改變培養(yǎng)基這樣的簡(jiǎn)便性等理由出發(fā)，容易進(jìn)行在臨床方面的利用或自動(dòng)化等向產(chǎn)業(yè)方面的導(dǎo)入。
權(quán)利要求
1.一種方法，是通過(guò)改變具有第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，使其向具有與所述第1分化表現(xiàn)型不同的第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的方法，其中，將培養(yǎng)條件，從適合培養(yǎng)具有所述第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，改變?yōu)檫m合培養(yǎng)具有所述第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，培養(yǎng)條件的變化為培養(yǎng)基的變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，不使用DNA的甲基化劑和脫甲基化劑而進(jìn)行分化轉(zhuǎn)換。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，具有第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞為成骨細(xì)胞，具有第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，將培養(yǎng)基，從含有β-甘油磷酸(glycerophosphate)、抗壞血酸以及Glutamax的培養(yǎng)基，換為含有bFGF、FGF-8、EGF以及BDNF的培養(yǎng)基。
6.利用權(quán)利要求1～5中任意一項(xiàng)所述的方法得到的具有規(guī)定的分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種不使用DNA的甲基化劑/脫甲基化劑而使成熟細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的方法。該方法是通過(guò)改變具有第1分化表現(xiàn)型的已最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，向具有與所述第1分化表現(xiàn)型不同的第2分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞分化轉(zhuǎn)換的方法，其特征在于，將培養(yǎng)條件，從適合培養(yǎng)具有所述第1分化表現(xiàn)型的最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件，改變?yōu)檫m合培養(yǎng)具有所述第2分化表現(xiàn)型的已最終分化的成熟細(xì)胞的培養(yǎng)條件。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1965075SQ20058001131
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者里村一人 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立醫(yī)藥, 里村一人