專(zhuān)利名稱(chēng)：用來(lái)自分化細(xì)胞的供體核克隆豬的方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及將來(lái)自分化的豬細(xì)胞的細(xì)胞核移植入與供體核相同物種的去核的哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的克隆方法。核得到程序重排以指導(dǎo)克隆胚的發(fā)育，然后將克隆胚轉(zhuǎn)移到雌性受體中產(chǎn)生胎兒和子代，或?qū)⑵溆糜诋a(chǎn)生培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(CICM)。克隆胚也可用于與受精胚結(jié)合產(chǎn)生嵌合胚、胎兒和/或子代。
2.發(fā)明背景已有報(bào)道使用有蹄動(dòng)物的內(nèi)細(xì)胞群(ICM)細(xì)胞進(jìn)行核移植。例如，Collas等在Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)中公開(kāi)了通過(guò)將裂解的供體細(xì)胞顯微注射入去核的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行牛ICMs的核移植。Collas等公開(kāi)了將胚在體外培養(yǎng)七天產(chǎn)生的十五個(gè)胚細(xì)胞轉(zhuǎn)移入牛受體時(shí)使其中四頭懷孕及兩頭生產(chǎn)。并且，Keefer等在Biol.Reprod.，50935-939(1994)中公開(kāi)了在核轉(zhuǎn)移方法中將牛的ICM細(xì)胞作為供體核產(chǎn)生的胚細(xì)胞移植入牛的受體時(shí)，產(chǎn)生了一些可存活的子代。并且，Sims等在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)906143-6147(1993)中公開(kāi)了通過(guò)將在體外短期培養(yǎng)的牛ICM細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移入去核的成熟卵母細(xì)胞可生產(chǎn)小牛。
也有報(bào)道稱(chēng)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)的胎盤(pán)細(xì)胞的核后可產(chǎn)生能存活的小羊(Campbell等，自然，38064-68(1996))。更進(jìn)一步地，核轉(zhuǎn)移中牛多能胚細(xì)胞的使用和嵌合胎兒的產(chǎn)生已有報(bào)道(stice等，Biol.Reprod，54100-110(1996)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994))。Collas等證明肉芽腫細(xì)胞(成體細(xì)胞)可用于牛克隆方法中以產(chǎn)生胚。但是，未能證明其發(fā)育可超過(guò)早期胚階段(胚泡階段)。并且，肉芽腫細(xì)胞不易培養(yǎng)并僅能從雌性獲得。Collas等未嘗試在培養(yǎng)中繁殖肉芽腫細(xì)胞或試圖遺傳修飾那些細(xì)胞。Wilmut等(自然，365810-813(1997))從胎兒成纖維細(xì)胞產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移綿羊子代，從成體綿羊細(xì)胞也產(chǎn)生一個(gè)子代。
克隆豬細(xì)胞與其它物種的細(xì)胞相比更為困難。
此現(xiàn)象可由下表進(jìn)行說(shuō)明
在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因豬的領(lǐng)域中也存在問(wèn)題。通過(guò)現(xiàn)有方法，將異源DNA引入在胎兒中分化成各種細(xì)胞類(lèi)型并最終發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的早期胚或胚細(xì)胞系。但是，產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物需要許多早期胚，因此該方法是非常低效的。并且，沒(méi)有在花費(fèi)時(shí)間和經(jīng)費(fèi)將胚放入代理雌性體內(nèi)之前篩選轉(zhuǎn)基因胚的簡(jiǎn)單及有效的方法。此外，基因?qū)ぐ屑夹g(shù)不易于用早期胚轉(zhuǎn)基因技術(shù)完成。
小鼠中的胚胎干細(xì)胞使研究人員能夠篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并進(jìn)行基因?qū)ぐ小＿@導(dǎo)致與其它轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比將更多地使用遺傳工程。但是，必需將胚胎干細(xì)胞系和其它胚細(xì)胞系維持在未分化狀態(tài)，這需要飼養(yǎng)層和/或在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子。即使采取了這些預(yù)防措施，這些細(xì)胞仍會(huì)經(jīng)常發(fā)生自發(fā)分化并且不能通過(guò)現(xiàn)有可獲得的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因子代。并且，一些胚細(xì)胞系必須以不利于基因?qū)ぐ蟹椒ǖ姆绞竭M(jìn)行繁殖。
從早先預(yù)移植的小鼠胚中體外獲得胚胎干(ES)細(xì)胞系的方法為大家所熟知。(見(jiàn)，例如Evans等，自然，29154-156(1981)；Martin，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，787634-7638(1981))。假如由于成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層(Evans等，Id.)或分化抑制源(Smith等，生物學(xué)進(jìn)展，1211-9(1987))存在的話，能使ES細(xì)胞以未分化狀態(tài)傳代。
以前已報(bào)道ES細(xì)胞具有許多應(yīng)用。例如，已報(bào)道ES細(xì)胞可用作分化的體外模型，特別可用于研究早期發(fā)育調(diào)節(jié)中涉及的基因。當(dāng)將小鼠ES細(xì)胞引入預(yù)移植的小鼠胚時(shí)可產(chǎn)生種系嵌合體，從而證明了它們的多能性(Bradley等，自然，309255-256(1984))。
由于ES細(xì)胞的可將其基因組傳遞到下一代的能力，它們具有通過(guò)使用帶有或不帶有所需的遺傳修飾的ES細(xì)胞進(jìn)行家畜動(dòng)物種系操作的潛在用途。并且，在家畜動(dòng)物如有蹄動(dòng)物中，來(lái)自如預(yù)移植家畜胚的核可促進(jìn)去核卵母細(xì)胞的發(fā)育(Smith等，Biol.Reprod.，401027-1035(1989)；和Keefer等，Biol.Reprod.，50935-939(1994))。相反，據(jù)報(bào)道來(lái)自小鼠超過(guò)8細(xì)胞階段的胚的核在轉(zhuǎn)移后并不促進(jìn)去核卵母細(xì)胞的發(fā)育(Cheong等，Biol.Reprod.，48958(1993))。因此，來(lái)自家畜動(dòng)物的ES細(xì)胞是非常所需的，因?yàn)樗鼈兛商峁┙?jīng)遺傳操作的全能性供體核的潛在來(lái)源或用于核轉(zhuǎn)移方法。
一些研究小組已報(bào)道了稱(chēng)為多能性胚細(xì)胞系的分離。例如，Notarianni等在J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260(1991)中報(bào)道了來(lái)自豬和綿羊胚泡的認(rèn)為是穩(wěn)定的全能性細(xì)胞系的建立，該細(xì)胞系表現(xiàn)出一些與從綿羊胚泡中免疫外科分離出的內(nèi)細(xì)胞群的初級(jí)培養(yǎng)物的細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)特性。同時(shí)，Notarianni等也在J.Reprod.Fert.Suppl.，4151-56(1990)中公開(kāi)了來(lái)自豬胚泡的推定是全能性胚細(xì)胞系的培養(yǎng)物的維持和分化。Gerfen等在動(dòng)物生物技術(shù)，6(1)1-14(1995)中公開(kāi)了從豬胚泡中分離胚細(xì)胞系。這些細(xì)胞可在不使用條件培養(yǎng)基的小鼠胚的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層中穩(wěn)定維持，并且據(jù)報(bào)道在培養(yǎng)過(guò)程中分化成幾種不同的細(xì)胞類(lèi)型。
并且，Saito等在Roux’s Arch.Dev.Biol.，201134-141(1992)中報(bào)道培養(yǎng)的牛胚胎干細(xì)胞樣的細(xì)胞可存活三代，但在第四次傳代后死亡。Handyside等在Roux’s Arch.Dev.Biol.，196185-190(1987)中公開(kāi)了在分離來(lái)自小鼠ICMs的小鼠ES細(xì)胞系的條件下培養(yǎng)免疫外科分離的綿羊胚的內(nèi)細(xì)胞群。Handyside等報(bào)道在這樣的條件下，綿羊ICMs附著、擴(kuò)散并發(fā)育出ES細(xì)胞樣和內(nèi)胚層細(xì)胞樣細(xì)胞的區(qū)域，但在進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)后僅有內(nèi)胚層樣的細(xì)胞明顯可見(jiàn)。
近來(lái)，Cherny等在Theriogenology，41175(1994)中報(bào)道了來(lái)自稱(chēng)為多能性牛原生殖細(xì)胞的細(xì)胞系可在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中維持。這些細(xì)胞，在培養(yǎng)約7天后，產(chǎn)生堿性磷酸酶(AP)染色為陽(yáng)性的ES樣的集落，表現(xiàn)出形成胚狀體的能力，并自發(fā)分化成至少兩種不同的細(xì)胞類(lèi)型。據(jù)報(bào)道這些細(xì)胞還表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，這確信是專(zhuān)門(mén)由ES細(xì)胞表達(dá)的同源異型框基因的模式。
并且，近來(lái)Campbell等在自然，38064-68(1996)中報(bào)道了將來(lái)自在促進(jìn)小鼠中ES細(xì)胞系分離的條件下培養(yǎng)的9天齡綿羊胚的培養(yǎng)的胎盤(pán)(ED)細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)移之后，可產(chǎn)生存活的小羊。作者得出結(jié)論來(lái)自9天齡綿羊胚的ED細(xì)胞在經(jīng)過(guò)核轉(zhuǎn)移后是全能性的，并且這種全能性可在培養(yǎng)過(guò)程中得到維持。
Van Stekelenburg-Hamers等在Mol.Reprod.Dev.，40444-454(1995)中報(bào)道了來(lái)自牛胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的稱(chēng)為永久細(xì)胞系的分離和特性描述。作者在不同的條件下分離并培養(yǎng)來(lái)自8或9天齡的牛胚泡的ICM以測(cè)定哪一種滋養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基在促進(jìn)牛ICM細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)中最為有效。他們得出結(jié)論培養(yǎng)的ICM細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)可通過(guò)使用STO(小鼠成纖維細(xì)胞)滋養(yǎng)細(xì)胞(代替牛的子宮內(nèi)皮細(xì)胞)和使用補(bǔ)充以活性碳解吸的血清(而不是標(biāo)準(zhǔn)血清)的培養(yǎng)基得到增強(qiáng)。然而，Van Stekelenburg等報(bào)道了他們的細(xì)胞系更類(lèi)似于上皮細(xì)胞而不是多能性ICM細(xì)胞。
Smith等于1994年10月27日公開(kāi)的WO 94/24274、Evans等于1990年4月5日公開(kāi)的WO 90/03432和Wheeler等于1994年11月24日公開(kāi)的WO 94/26889報(bào)道了認(rèn)為可用于獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物干細(xì)胞的分離、篩選和繁殖。Evans等也報(bào)道了來(lái)自豬和牛物種的認(rèn)為對(duì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是有用的稱(chēng)為多能性干細(xì)胞的衍生。并且，Wheeler等于1994年11月24日公開(kāi)的WO 94/26884也公開(kāi)了認(rèn)為對(duì)制備嵌合的和轉(zhuǎn)基因有蹄動(dòng)物有用的胚胎干細(xì)胞。
因此，基于前面所述的內(nèi)容，可明顯看出許多小組由于ES細(xì)胞系在克隆或轉(zhuǎn)基因胚的產(chǎn)生中和核移植中的潛在應(yīng)用，已嘗試產(chǎn)生ES細(xì)胞系。
因此，盡管已在文獻(xiàn)中有所報(bào)道，仍然需要使用培養(yǎng)的分化細(xì)胞作為供體核克隆豬的改進(jìn)方法。
發(fā)明目的和概述發(fā)明的目的是提供使用培養(yǎng)的分化細(xì)胞作為供體核來(lái)產(chǎn)生克隆豬的新的和改進(jìn)的方法。
本發(fā)明的更具體的目的是提供包括將分化的豬細(xì)胞核移植入去核的豬卵母細(xì)胞的克隆豬的新方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供繁殖具有被證實(shí)的遺傳優(yōu)勢(shì)或其它所需性狀的成體豬的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬(即NT單位、胎兒、子代)的改進(jìn)方法。本發(fā)明還提供遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的豬，包括通過(guò)所說(shuō)的方法制備的豬。
本發(fā)明的更具體的目的是提供通過(guò)在將分化的細(xì)胞或細(xì)胞核用于形成NT單位之前在分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾目的DNA序列以產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的方法。本發(fā)明還提供通過(guò)所說(shuō)的方法制備的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的豬。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生豬CICM細(xì)胞的新方法，包括將分化的豬細(xì)胞核移植入去核的豬卵母細(xì)胞中，然后用獲得的NT單位產(chǎn)生CICM細(xì)胞。本發(fā)明還提供用所說(shuō)的方法產(chǎn)生的豬CICM細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將所說(shuō)的的豬CICM細(xì)胞用于治療或診斷。
本發(fā)明的具體目的是將所說(shuō)的的豬CICM細(xì)胞用于任何其中細(xì)胞、組織或器官的移植在治療或診斷中有益的疾病的治療或診斷。CICM細(xì)胞可在相同物種中使用或者跨物種使用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將來(lái)自豬的NT單位、胎兒或子代的細(xì)胞或組織用于任何其中細(xì)胞、組織或器官的移植在治療或診斷中有益的疾病的治療或診斷。這些疾病和損傷包括帕金森綜合癥、亨廷頓氏舞蹈癥、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、肌肉萎縮、糖尿病、肝病、心臟病、軟骨替換、燒傷、血管疾病、尿道疾病及免疫缺陷的治療、骨髓移植、癌癥等疾病。組織可在相同物種中使用或者跨物種使用。
本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是將來(lái)自豬的NT單位、胎兒或子代的細(xì)胞或組織，或根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的豬CICM細(xì)胞用于產(chǎn)生分化的細(xì)胞、組織或器官。
本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是將來(lái)自豬的NT單位、胎兒或子代的細(xì)胞或組織，或根據(jù)本發(fā)明在體外產(chǎn)生的豬CICM細(xì)胞用于研究細(xì)胞分化和用于分析目的，如進(jìn)行藥物研究。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是用由來(lái)自豬的NT單位、胎兒或子代的所說(shuō)的組織產(chǎn)生的細(xì)胞、組織或器官，或豬的CICM細(xì)胞來(lái)提供移植治療的改進(jìn)方法。這些治療包括對(duì)例如以下疾病和損傷的治療帕金森綜合癥、亨廷頓氏舞蹈癥、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、肌肉萎縮、糖尿病、肝病、心臟病、軟骨替換、燒傷、血管疾病、尿道疾病及免疫缺陷的治療、骨髓移植、癌癥等疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在用分化的細(xì)胞或細(xì)胞核形成NT單位之前通過(guò)在分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾目的DNA序列來(lái)提供來(lái)自豬的NT單位、胎兒或子代、或豬的CICM細(xì)胞的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因組織。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將來(lái)自豬的NT單位、胎兒或子代、或來(lái)自根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的豬CICM細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因或遺傳工程組織用于基因治療，特別是用于所說(shuō)的疾病和損傷的治療和/或預(yù)防。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將來(lái)自豬的NT單位、胎兒或子代的組織，或根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的豬CICM細(xì)胞，來(lái)自豬的NT單位、胎兒或子代、或來(lái)自根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的豬CICM細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因或遺傳工程組織用作核移植的核供體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因或遺傳工程的豬子代生產(chǎn)藥理學(xué)上重要的蛋白。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供克隆豬(例如胚、胎兒、子代)的方法。該方法包括
(i)在適于核轉(zhuǎn)移(NT)單位形成的條件下，將所需的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的豬卵母細(xì)胞中；(ii)活化所獲得的核轉(zhuǎn)移單位；及(iii)將所說(shuō)的培養(yǎng)的NT單位轉(zhuǎn)移到宿主豬中從而使NT單位發(fā)育成胎兒。
可選擇地，將活化的核轉(zhuǎn)移單位培養(yǎng)至大于2細(xì)胞的發(fā)育階段。
胎兒的細(xì)胞、組織和/或器官有利于用于細(xì)胞、組織和/或器官移植的領(lǐng)域，或用于所需的基因型的產(chǎn)生。
本發(fā)明還包括克隆遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的方法，其中在將分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的卵母細(xì)胞之前，在分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾目的DNA序列。通過(guò)所說(shuō)的方法產(chǎn)生的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬有利于用于細(xì)胞、組織和/或器官移植的領(lǐng)域、所需的基因型的產(chǎn)生和藥用蛋白的產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供根據(jù)所說(shuō)的方法獲得的豬和那些豬的子代。
在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生豬CICM細(xì)胞的方法。該方法包括(i)在適于核轉(zhuǎn)移(NT)單位形成的條件下，將所需的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的豬卵母細(xì)胞中；(ii)活化所獲得的核轉(zhuǎn)移單位；及(iii)培養(yǎng)從所說(shuō)的培養(yǎng)的NT單位獲得的細(xì)胞以獲得豬的CICM細(xì)胞。
可選擇地，將活化的核轉(zhuǎn)移單位培養(yǎng)至大于2細(xì)胞的發(fā)育階段。
豬的CICM細(xì)胞有利于用于細(xì)胞、組織和/或器官移植的領(lǐng)域。
基于本發(fā)明的所說(shuō)的和其它目的，優(yōu)點(diǎn)和特征在下文將是非常明顯的，通過(guò)參考下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳述和所附的權(quán)利要求可更清楚地理解本發(fā)明的性質(zhì)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供通過(guò)核轉(zhuǎn)移或核移植克隆豬的改進(jìn)方法。在本主題的申請(qǐng)中，核轉(zhuǎn)移或核移植或NT可交換使用。
根據(jù)本發(fā)明，將來(lái)自分化的豬細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞中。核得到程序重排以指導(dǎo)克隆胚的發(fā)育，然后將克隆胚轉(zhuǎn)移到受體雌性體內(nèi)以產(chǎn)生胎兒和子代，或用于產(chǎn)生CICM細(xì)胞?？寺∨咭部膳c受精胚結(jié)合產(chǎn)生嵌合胚、胎兒和/或子代。
現(xiàn)有技術(shù)的方法已在克隆方法中使用胚細(xì)胞類(lèi)型。這包括Campbell等(自然，38064-68，1996)和Stice等(Biol.Reprod.，54100-110，1996)的工作。在這些研究中，胚細(xì)胞系來(lái)自妊娠少于10天的胚。在這兩個(gè)研究中，細(xì)胞在飼養(yǎng)層上維持以防止用于克隆方法的供體細(xì)胞的明顯的分化。本發(fā)明使用分化的細(xì)胞來(lái)自綿羊的成體細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞被認(rèn)為已用于產(chǎn)生綿羊子代(Wilmut等，1997)。然而研究已表明，豬的克隆比克隆羊更為困難。事實(shí)上，在研究的哺乳動(dòng)物中，羊的克隆看來(lái)是最容易的，而豬的克隆看來(lái)是最困難的。根據(jù)本發(fā)明用分化的細(xì)胞類(lèi)型對(duì)豬的成功克隆是完全出乎意料的。
因此，根據(jù)本發(fā)明，豬的優(yōu)良基因型的增加是可能的。這使帶有確定的遺傳優(yōu)勢(shì)或其它的優(yōu)良性狀的成體豬得到增加。遺傳進(jìn)展可在豬中加速。通過(guò)本發(fā)明，可能有數(shù)十億的胎兒或成體豬的細(xì)胞得到收獲并用于克隆方法中。這可能導(dǎo)致在短期內(nèi)產(chǎn)生許多完全相同的子代。
已有推測(cè)Wilmut等的方法可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生殖(見(jiàn)，MacQuitty，Nature Biotech.，15294(1997))。但是，沒(méi)有理由可推測(cè)，例如，來(lái)自成體細(xì)胞的已轉(zhuǎn)染了外源DNA的核能在核轉(zhuǎn)移的過(guò)程中存活?？紤]到這一點(diǎn)，可知體外的操作可改變小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞的特性從而使它們產(chǎn)生形成可存活的嵌合胚的能力。因此，在本發(fā)明之前，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的克隆是不可預(yù)測(cè)的。
本發(fā)明還可通過(guò)對(duì)能克隆繁殖的細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行操作來(lái)簡(jiǎn)化轉(zhuǎn)基因方法。這排除了將細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)的需要，因此，包括隨機(jī)整合和基因?qū)ぐ械倪z傳修飾更易于完成。此方法還通過(guò)將核轉(zhuǎn)移與在體外修飾和篩選這些細(xì)胞的能力相結(jié)合變得比以前的轉(zhuǎn)基因胚技術(shù)更有效。根據(jù)本發(fā)明，這些細(xì)胞能在無(wú)細(xì)胞因子、條件培養(yǎng)基和/或飼養(yǎng)層時(shí)克隆繁殖，進(jìn)一步簡(jiǎn)化并有利于轉(zhuǎn)基因方法。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于克隆方法時(shí)，可產(chǎn)生能發(fā)育成胎兒和子代的轉(zhuǎn)基因豬胚。并且，這些轉(zhuǎn)基因的克隆胚可用于產(chǎn)生CICM細(xì)胞系或其它胚細(xì)胞系。因此，本發(fā)明排除了為有利于遺傳工程技術(shù)在體外衍生和維持未分化的細(xì)胞系的需要。
本發(fā)明還可用于產(chǎn)生能用在例如細(xì)胞、組織和器官移植中的克隆豬的胎兒、子代或CICM細(xì)胞。通過(guò)取出來(lái)自豬的胎兒或成體的細(xì)胞并將其用于克隆方法中，多種的細(xì)胞、組織和可能的器官由于通過(guò)器官形成發(fā)育可從克隆的胎兒中獲得。同樣，也可從克隆的子代中分離細(xì)胞、組織和器官。此方法可提供包括細(xì)胞和基因治療在內(nèi)的許多醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)治療的“材料”的來(lái)源。如果將細(xì)胞轉(zhuǎn)移回它們所來(lái)源的動(dòng)物中，免疫排斥就得到避免。并且，由于許多細(xì)胞類(lèi)型可從這些克隆中分離，其它方法學(xué)如生血嵌合狀態(tài)可用于在同物種動(dòng)物間及物種之間避免免疫排斥。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供克隆豬的方法。一般地，豬將通過(guò)包括以下步驟的核轉(zhuǎn)移方法產(chǎn)生(i)獲得用作供體核來(lái)源的所需的分化的豬細(xì)胞；(ii)獲得來(lái)自豬的卵母細(xì)胞；(iii)去除所說(shuō)的卵母細(xì)胞的核；(iv)將所需的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入去核的卵母細(xì)胞，例如通過(guò)融合或注射，形成NT單位；(v)活化所獲得的NT單位；及(vi)將所說(shuō)的培養(yǎng)的NT單位轉(zhuǎn)移入宿主豬中從而使NT單位發(fā)育成胎兒。
可選擇地，將活化的核轉(zhuǎn)移單位培養(yǎng)至大于2細(xì)胞的發(fā)育階段。
本發(fā)明還包括克隆遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的方法，其中在將分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的卵母細(xì)胞之前，在分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾目的DNA序列。
本發(fā)明還提供根據(jù)所說(shuō)的方法獲得的豬，和那些豬的子代。
除了上面所述的用途之外，根據(jù)本發(fā)明所述的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬還可用于產(chǎn)生所需的蛋白，如在藥理學(xué)上重要的蛋白。然后可從轉(zhuǎn)基因豬的乳汁或其它體液或組織中分離所需的蛋白。或者，外源DNA序列可將農(nóng)業(yè)上有用的性狀傳遞到轉(zhuǎn)基因豬中，如疾病抗性、減少身體脂肪、增加瘦肉產(chǎn)量、改善飼料轉(zhuǎn)化或改變子代中的性比。
本發(fā)明進(jìn)一步提供細(xì)胞、組織和器官移植領(lǐng)域中的NT胎兒和NT和嵌合子代的使用。
在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生豬CICM細(xì)胞的方法。該方法包括(i)在適于核轉(zhuǎn)移單位形成的條件下，將所需的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的豬卵母細(xì)胞中；(ii)活化所獲得的核轉(zhuǎn)移單位；及(iii)培養(yǎng)從所說(shuō)的培養(yǎng)的NT單位獲得的細(xì)胞以得到豬的CICM細(xì)胞。
可選擇地，將活化的核轉(zhuǎn)移單位培養(yǎng)至大于2細(xì)胞的發(fā)育階段。
豬的CICM細(xì)胞有利于用于細(xì)胞、組織和器官移植的領(lǐng)域，或用于胎兒或子代，包括轉(zhuǎn)基因胎兒或子代的產(chǎn)生。
如這里所用到的，胎兒是在子宮中成形后胎生動(dòng)物的未出生的幼小個(gè)體。在豬中，胎兒階段發(fā)生在懷孕后30天直到出生。哺乳動(dòng)物是從出生直到死亡的成體。
優(yōu)選地，將NT單位培養(yǎng)到至少2到400個(gè)細(xì)胞大小，優(yōu)選地為4到128個(gè)細(xì)胞，并且最優(yōu)選地是到至少約50個(gè)細(xì)胞大小。
核轉(zhuǎn)移技術(shù)或核移植技術(shù)在文獻(xiàn)中有描述并在發(fā)明背景中引用的許多參考文獻(xiàn)中也有描述。特別見(jiàn)Campbell等，Theriogenology，43181(1995)；Collas等，Mol.Report.Dev.，38264-267(1994)；Keefer等，Biol.Reprod.，50935-939(1994)；Sims等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，906143-6147(1993)；WO 94/26884；WO 94/24274和WO 90/03432，在這里將它們完全引用作為參考。并且，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)為4,944,384和5,057,420的專(zhuān)利也描述了牛的核移植的方法。
分化的是指具有與周?chē)慕Y(jié)構(gòu)或原始的細(xì)胞不同的特點(diǎn)或功能的細(xì)胞。分化的豬細(xì)胞是那些經(jīng)過(guò)了早期胚胎階段的細(xì)胞。更具體地，分化的細(xì)胞是那些來(lái)自至少已經(jīng)過(guò)胎盤(pán)階段(牛胚胎發(fā)生的第10天)的細(xì)胞。分化的細(xì)胞可來(lái)自外胚層、中胚層或內(nèi)胚層。
豬細(xì)胞可通過(guò)大家熟知的方法獲得。在本發(fā)明中有用的豬細(xì)胞包括，例如上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核的細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和其它肌肉細(xì)胞等。并且，用于核轉(zhuǎn)移的豬細(xì)胞可從不同器官如皮膚、肺、胰臟、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟、尿道和其它泌尿器官等獲得。這些僅是適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞的例子。適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞，即在本發(fā)明中有用的細(xì)胞可從身體的任何細(xì)胞或器官中獲得。這包括所有的體細(xì)胞或生殖細(xì)胞。
成纖維細(xì)胞是所需的細(xì)胞類(lèi)型，因?yàn)樗鼈兛纱罅康貜陌l(fā)育的胎兒和成體豬獲得。成纖維細(xì)胞有一定程度的分化，因此以前認(rèn)為它們是用于克隆方法中的較差細(xì)胞類(lèi)型。但重要地是，這些細(xì)胞能在體外以快速的倍增時(shí)間輕易繁殖并能夠克隆繁殖以用于基因?qū)ぐ械姆椒ㄖ?。本發(fā)明是新穎的也是因?yàn)槭褂昧朔只募?xì)胞類(lèi)型。本發(fā)明是有優(yōu)點(diǎn)的因?yàn)榧?xì)胞易于在體外繁殖、遺傳修飾和篩選。
分離卵母細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域所熟知?；旧?，這包括從豬的卵巢或生殖道中分離卵母細(xì)胞。易于獲得的豬卵母細(xì)胞的來(lái)源是屠宰場(chǎng)材料。
為使如遺傳工程、核轉(zhuǎn)移和克隆的技術(shù)成功使用，一般卵母細(xì)胞在用作核轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞之前，及在它們可由精子細(xì)胞受精以發(fā)育成胚之前必須在體外成熟。此過(guò)程一般需要從豬的卵巢如在屠宰場(chǎng)獲得的豬卵巢收集未成熟的(前期I)卵母細(xì)胞，并使其在受精或去核之前在成熟培養(yǎng)基中成熟直至卵母細(xì)胞到達(dá)中期II階段，這一般發(fā)生在吸取豬卵母細(xì)胞約35-45小時(shí)后。為達(dá)到本發(fā)明的目的，這一時(shí)間段稱(chēng)為“成熟期”。如這里所用到的，為了計(jì)算時(shí)間段，“吸取”是指從卵巢濾泡中吸取未成熟的卵母細(xì)胞。
并且，在體外已成熟的中期II階段的卵母細(xì)胞已成功地用于核轉(zhuǎn)移技術(shù)中。例如，成熟的中期II卵母細(xì)胞已從動(dòng)情期開(kāi)始后或注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)或類(lèi)似的激素后35到48小時(shí)的非超排卵或超排卵的母牛或小母牛中外科收集。在豬中可使用相似的方法。
已有報(bào)道稱(chēng)去核和核轉(zhuǎn)移中的卵母細(xì)胞的成熟階段對(duì)NT方法的成功是重要的。(見(jiàn)例如，Prather等，分化，48，1-8，1991)。一般地，成功的哺乳動(dòng)物胚克隆方法用中期II階段的卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞是因?yàn)榇_信在這一階段的卵母細(xì)胞能夠或足以得到“活化”以像處理受精的精子一樣處理引入的核。在家畜中，卵母細(xì)胞活化期一般是約16-52小時(shí)，優(yōu)選地是在吸取后約35-45小時(shí)。
例如，可將未成熟的卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)基(MAT-見(jiàn)實(shí)施例中的表)中洗滌。然后將卵母細(xì)胞置于1到2毫升MAT中并在db-cAMP和激素的存在下培養(yǎng)22小時(shí)。再次洗滌卵母細(xì)胞，然后在無(wú)激素的MAT中再培養(yǎng)18小時(shí)。
在大約為30到50小時(shí)，并優(yōu)選地為約40小時(shí)的成熟期之后，將卵母細(xì)胞去核。將卵母細(xì)胞去核前優(yōu)選地將其在去除丘細(xì)胞之前移出并置于每毫升含有1毫克透明質(zhì)酸酶的HECM(Seshagiri和Bavister，1989)中。這可通過(guò)用內(nèi)徑非常細(xì)的移液管重復(fù)吸取或通過(guò)短暫的旋渦離心(約3分鐘)來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后篩選剝離的卵母細(xì)胞的極體，再將通過(guò)測(cè)定極體的存在選出的中期II卵母細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移。然后去核。
去核可通過(guò)已知的方法來(lái)進(jìn)行，如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)為4,994,384的專(zhuān)利中所描述的方法，在這里引用作為參考。例如，可將中期II的卵母細(xì)胞置于選擇性地每毫升含有7.5微克細(xì)胞松弛素B(CB)和0.15M蔗糖的HECM中立即去核，或者可將其在39℃及5％CO2的條件下置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，例如胚培養(yǎng)基如NCSU 23(見(jiàn)實(shí)施例中的表)中，然后晚一些去核，優(yōu)選地不超過(guò)24小時(shí)后，并且更優(yōu)選地立即去核。
可用微量移液管去除極體和周?chē)?xì)胞質(zhì)來(lái)顯微外科地完成去核。篩選鑒定出那些已成功去核的卵母細(xì)胞。此篩選過(guò)程可通過(guò)用每毫升1微克的Hoechst 33342染料將卵母細(xì)胞在NCSU中染色20分鐘，然后在紫外光照射下觀察卵母細(xì)胞少于10秒來(lái)進(jìn)行。然后可將已成功去核的卵母細(xì)胞置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，例如HECM和0.15M蔗糖中。
在本發(fā)明中，受體卵母細(xì)胞優(yōu)選地在開(kāi)始在體外成熟后的約30小時(shí)到約50小時(shí)的某一個(gè)時(shí)間進(jìn)行去核，更優(yōu)選地是在開(kāi)始在體外成熟后的約38小時(shí)到約42小時(shí)的某一個(gè)時(shí)間，并且最優(yōu)選地是在開(kāi)始在體外成熟后的約40小時(shí)進(jìn)行去核。
然后將單個(gè)豬細(xì)胞轉(zhuǎn)移入用于產(chǎn)生NT單位的去核卵母細(xì)胞的卵周隙。豬細(xì)胞和去核的卵母細(xì)胞將根據(jù)本領(lǐng)域所知的方法用于產(chǎn)生NT單位。例如，細(xì)胞可通過(guò)電融合進(jìn)行融合。電融合是通過(guò)提供足以使質(zhì)膜發(fā)生瞬時(shí)破裂的電脈沖來(lái)完成的。這種質(zhì)膜的破裂是非常短暫的因?yàn)槟?huì)很快重建。因此，如果誘導(dǎo)兩個(gè)相鄰的膜破裂并與脂雙層混合重建，將在兩個(gè)細(xì)胞之間打開(kāi)較小的通道。由于這種小開(kāi)口的熱力學(xué)不穩(wěn)定性，它將擴(kuò)大至兩個(gè)細(xì)胞變成一個(gè)?？蓞⒖糚rather等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)為4,997,384的專(zhuān)利(在這里完全引用作為參考)對(duì)此方法作進(jìn)一步的討論。可使用多種電融合培養(yǎng)基包括例如蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸鹽緩沖溶液。融合也可用仙臺(tái)病毒作為融合劑來(lái)完成(Graham，WisterInot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。優(yōu)選的融合培養(yǎng)基是0.28M甘露醇、10μM CaCl2、100μM MgSO4和10μM組氨酸，pH7.0。
并且，在某些情況下(例如用較小的供體核時(shí))將核直接注射到卵母細(xì)胞中比用電融合來(lái)進(jìn)行融合可能更為優(yōu)選。此技術(shù)在Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)中公開(kāi)，在這里完全引用作為參考。
在引入融合室之前，優(yōu)選地將NT單位逐漸暴露于融合培養(yǎng)基，在含有HECM與融合培養(yǎng)基的比例為2∶1、1∶2和0∶1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)三次。優(yōu)選地，豬細(xì)胞和卵母細(xì)胞通過(guò)外加90-120V的電脈沖約30微秒，在卵母細(xì)胞成熟開(kāi)始后約44小時(shí)在500μm的室中進(jìn)行融合。融合后，將獲得的融合NT單位在融合培養(yǎng)基中維持5分鐘，然后將其置于HECM中10分鐘，再置于加入7.5mg/ml CB的NCSU 23中直至活化。典型地，活化將在不久后發(fā)生，典型地在少于24小時(shí)后發(fā)生，并且優(yōu)選地在4-9小時(shí)后發(fā)生。
NT單位可通過(guò)已知的方法進(jìn)行活化。這些方法包括，例如，在亞生理溫度培養(yǎng)NT單位，實(shí)質(zhì)上通過(guò)應(yīng)用冷的，或?qū)嶋H上較涼的溫度冷擊NT單位。最方便地可通過(guò)在室溫培養(yǎng)NT單位達(dá)到此目的，室溫相對(duì)于胚所正常暴露的生理溫度條件是較冷的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在含有0.28M甘露醇、10μM CaCl2、100μM MgSO4和10mM組氨酸，pH7.0的活化培養(yǎng)基中外加30V的電脈沖30微秒使豬的NT單位在500μm的室中活化。1小時(shí)后再外加15V的電脈沖30微秒。在兩次脈沖之間將NT單位在39℃和5％ CO2的條件下維持在含有CB的NCSU 23中。
或者，活化可通過(guò)應(yīng)用已知的活化劑完成。例如，在受精期間通過(guò)精子進(jìn)入卵母細(xì)胞或精子細(xì)胞中所含的活化因子能活化NT單位。并且，如電或化學(xué)休克、鈣離子載體和蛋白激酶抑制劑的處理可用于在融合后活化NT胚。
優(yōu)選地，在活化之后將NT單位在加入CB的NCSU 23中培養(yǎng)3到4小時(shí)，然后在不含CB的NCSU 23中培養(yǎng)?？蓪T單位在活化后任何時(shí)候轉(zhuǎn)移到受體雌性中。
或者，可將活化的NT單位在適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至CICM細(xì)胞和細(xì)胞集落傳代。適于胚的培養(yǎng)和成熟的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域所熟知。已知的培養(yǎng)基的例子包括Ham’s F-10+10％胎牛血清、組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、臺(tái)羅德-清蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽(TALP)、Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、Eagle’s和Whitten’s培養(yǎng)基。用于卵母細(xì)胞的收集和成熟的最普通的培養(yǎng)基之一是TCM-199，再補(bǔ)充1％到20％的血清，包括胎牛血清、新生小牛血清、動(dòng)情的母牛血清、小羊、豬或公牛血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括帶有Earl鹽、10％胎牛血清、0.2mM丙酮酸鈉和50μg/ml硫酸慶大霉素的TCM-199。更優(yōu)選地，所用的培養(yǎng)基是NCSU 23，并且將NT單位在活化2到5天后培養(yǎng)于新鮮的NCSU 23和5％到10％的胎牛血清中。所說(shuō)的的任何培養(yǎng)也可包括與多種細(xì)胞類(lèi)型如肉芽腫細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、BRL細(xì)胞和子宮細(xì)胞及STO細(xì)胞的共培養(yǎng)。
另一種維持培養(yǎng)基在Rosenkrans等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)為5,096,822的專(zhuān)利中有所描述，在這里引用作為參考。這種胚培養(yǎng)基，稱(chēng)為CR1，含有促進(jìn)胚所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
典型地，將NT單位在加入5％到10％ FCS的NCSN 23中培養(yǎng)至NT單位達(dá)到適于轉(zhuǎn)移到受體雌性中的大小，或適于獲得可用于產(chǎn)生CICM細(xì)胞或細(xì)胞集落的大小。優(yōu)選地，這些NT單位將培養(yǎng)至至少約2到400個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選地約4到128個(gè)細(xì)胞，并且最優(yōu)選地至少約50個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)程在適當(dāng)?shù)臈l件，即約38.5℃和5％ CO2下進(jìn)行，典型地約每2-5天更換一次培養(yǎng)基以利于生長(zhǎng)，優(yōu)選地約每3天更換一次。
本發(fā)明中胚轉(zhuǎn)移和處理受體動(dòng)物的方法是用于胚轉(zhuǎn)移工業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。同步轉(zhuǎn)移對(duì)于本發(fā)明的成功是重要的，即NT胚的階段與受體雌性的動(dòng)情周期相一致。此優(yōu)點(diǎn)和如何維持受體在Wall等的“離心以觀察前核和核的豬卵細(xì)胞的發(fā)育”，Biol.Reprod.，32645-651(1985)中討論，其內(nèi)容在這里引用作為參考。
本發(fā)明還可用于克隆遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬。如上面所解釋的，本發(fā)明具有優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因方法可通過(guò)對(duì)能克隆繁殖的分化的細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行操作加以簡(jiǎn)化。特別地，用作供體核的分化細(xì)胞帶有插入、去除或修飾的所需的DNA序列。然后將那些遺傳改變的、分化的細(xì)胞用于去核卵母細(xì)胞的核移植。
任何已知的用來(lái)插入、去除或修飾來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所需的DNA序列的方法都可用于改變欲用作核供體的分化的細(xì)胞。這些方法可去除所有或部分的DNA序列，并且DNA序列可以是異源的。所包括的技術(shù)有同源重組，可在細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)特定位點(diǎn)插入、去除或修飾DNA的一個(gè)或多個(gè)序列。
本發(fā)明因此可用于提供帶有所需的基因型的成體豬。帶有確定的遺傳優(yōu)勢(shì)或其它所需的性狀的成體豬的增加是特別有用的，包括轉(zhuǎn)基因或遺傳工程動(dòng)物，和嵌合動(dòng)物。因此，本發(fā)明可產(chǎn)生單種性別的子代，也可產(chǎn)生肉產(chǎn)量增加、具有復(fù)現(xiàn)的性狀和疾病抗性的豬。并且，來(lái)自NT胎兒，包括轉(zhuǎn)基因和/或嵌合胎兒的細(xì)胞和組織可用于治療如下所述的與使用CICM細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的多種疾病的細(xì)胞、組織和器官移植。因此，轉(zhuǎn)基因豬具有作為包括疾病、細(xì)胞和器官的異種移植和生產(chǎn)藥用蛋白的模型的用途。
為產(chǎn)生CICM細(xì)胞和細(xì)胞系，在獲得理想大小的NT單位之后，手工操作從區(qū)域中去除細(xì)胞，然后使用。此過(guò)程優(yōu)選地通過(guò)以下步驟進(jìn)行取含有NT單位的細(xì)胞團(tuán)，該NT單位典型地包含至少約50個(gè)細(xì)胞，洗滌這些細(xì)胞，并將細(xì)胞平板接種于飼養(yǎng)層上，例如擴(kuò)散的成纖維細(xì)胞。典型地，用于獲得干細(xì)胞或細(xì)胞集落的細(xì)胞可從培養(yǎng)的優(yōu)選地有至少50個(gè)細(xì)胞大小的NT單位的最靠?jī)?nèi)部分得到。但是，較少或較大數(shù)目細(xì)胞的NT單位或來(lái)自NT單位的其它部分的細(xì)胞也可用于獲得ES細(xì)胞和細(xì)胞集落。將細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基，例如，補(bǔ)充以10％ FCS和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的α-MEM中的飼養(yǎng)層里。為了有利于生長(zhǎng)每當(dāng)需要時(shí)可更換培養(yǎng)基，例如大約每2-3天更換一次。
此培養(yǎng)方法導(dǎo)致CICM細(xì)胞或細(xì)胞系的形成。當(dāng)需要時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員可改變培養(yǎng)條件以利于特定的CICM細(xì)胞的生長(zhǎng)。并且，可根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的CICM細(xì)胞。即，所說(shuō)的方法可用于產(chǎn)生引入了一個(gè)或多個(gè)所需的DNA序列的NT單位，或者產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源DNA序列的全部或部分已去除或修飾的NT單位。然后那些遺傳工程或轉(zhuǎn)基因NT單位可用于產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞。
獲得的CICM細(xì)胞和細(xì)胞系具有許多治療和診斷用途。最特別地，這些CICM細(xì)胞可用于細(xì)胞移植治療。
考慮到這一點(diǎn)，已知小鼠的胚胎干(ES)細(xì)胞能分化成幾乎任何細(xì)胞類(lèi)型，例如造血干細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的豬的CICM細(xì)胞應(yīng)具有相似的分化能力。本發(fā)明所述的CICM細(xì)胞可經(jīng)誘導(dǎo)而分化，以根據(jù)已知方法得到所需的細(xì)胞類(lèi)型。例如，通過(guò)在分化培養(yǎng)基中和在供細(xì)胞分化的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞，可誘導(dǎo)試驗(yàn)的豬CICM細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、尿道細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。導(dǎo)致CICM細(xì)胞分化的培養(yǎng)基和方法為本領(lǐng)域所知，稱(chēng)為適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。
例如，Palacios等在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)927530-7537(1995)中教授了通過(guò)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行如下誘導(dǎo)從胚細(xì)胞系中產(chǎn)生造血干細(xì)胞，該誘導(dǎo)方法包括首先將這些細(xì)胞的聚集體培養(yǎng)在缺乏視黃酸的懸浮培養(yǎng)基中，然后再培養(yǎng)于含有視黃酸的相同培養(yǎng)基中，再將細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)移到使細(xì)胞附著的基質(zhì)上。
并且，Pedersen，J.Reprod.Fertil.Dev.，6543-552(1994)是參考了大量文章的綜述文章，所參考的文章公開(kāi)了胚胎干細(xì)胞在體外分化產(chǎn)生多種分化的細(xì)胞類(lèi)型包括造血干細(xì)胞、肌肉、心肌、神經(jīng)細(xì)胞等的方法。
并且，Bain等在生物學(xué)進(jìn)展，168342-357(1995)中教授了使胚胎干細(xì)胞在體外分化產(chǎn)生具有神經(jīng)元特性的神經(jīng)細(xì)胞的方法。這些參考文獻(xiàn)是已報(bào)道的從胚或干細(xì)胞中獲得分化細(xì)胞的方法的范例。這些參考文獻(xiàn)特別是其中所公開(kāi)的涉及使胚胎干細(xì)胞分化的方法的內(nèi)容在這里完全引用作為參考。
因此，使用已知的方法和培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員可培養(yǎng)本主題的CICM細(xì)胞，包括遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的CICM細(xì)胞，以獲得所需的分化細(xì)胞類(lèi)型，例如神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞等。
本主題的CICM細(xì)胞可用于獲得任何所需的分化細(xì)胞類(lèi)型。這些分化細(xì)胞的治療用途是前所未有的。例如，造血干細(xì)胞可用在需要骨髓移植的醫(yī)學(xué)治療中。此方法可用來(lái)治療多種疾病，例如晚期癌癥如卵巢癌和白血病，及調(diào)和免疫系統(tǒng)的疾病如艾滋病。造血干細(xì)胞是可獲得的，例如可通過(guò)將癌癥或艾滋病病人的成熟體細(xì)胞如上皮細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合，獲得如上所述的CICM細(xì)胞，并在利于分化的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，直至獲得造血干細(xì)胞。這樣的造血干細(xì)胞可用在包括癌癥和艾滋病的疾病的治療中。
本發(fā)明可用于替換有缺陷的基因，例如有缺陷的免疫系統(tǒng)基因，或用于引入可導(dǎo)致對(duì)治療有益的蛋白如生長(zhǎng)因子、淋巴因子、細(xì)胞因子、酶等的表達(dá)的基因。
可引入本主題的CICM細(xì)胞的DNA序列包括，例如，那些編碼表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)因子、胰島素樣的生長(zhǎng)因子(I和II)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4/5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、AFT-1、細(xì)胞因子(白介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子(α和β)等)、治療用的酶等的DNA序列。
本發(fā)明包括在人類(lèi)疾病的治療中使用豬細(xì)胞。因此，豬的CICM細(xì)胞、NT胎兒和NT及嵌合的子代(轉(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因的)可用于應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞、組織或器官移植的人類(lèi)病癥的治療。一般地，根據(jù)本發(fā)明所述的CICM細(xì)胞、胎兒和子代可在相同物種內(nèi)使用(自體的、同源的或同種異體移植)或跨物種使用(異種移植)。例如，來(lái)自豬的NT胎兒的腦細(xì)胞可用于治療帕金森綜合癥。
并且，本主題的CICM細(xì)胞也可用作分化，特別是與早期發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的研究的體外模型。并且，用本主題的CICM細(xì)胞分化出的細(xì)胞、組織和器官也可用于藥物研究中。
并且，本主題的CICM細(xì)胞可用作產(chǎn)生其它CICM細(xì)胞和細(xì)胞集落的核供體。
為了更清楚地描述本發(fā)明，提供了下面的實(shí)施例。實(shí)施例用于豬克隆的材料和方法修飾的NCSU 37培養(yǎng)基(mNCSU 37)<
使用18mohm，RO，DI水。pH應(yīng)為7.4，檢查摩爾滲透壓濃度并記錄。通過(guò)真空過(guò)濾(0.22μm)消毒，在瓶上標(biāo)注日期和縮寫(xiě)。貯存于4℃并在10日內(nèi)使用。
修飾的TL-Hepes-PVA培
pH至7.4，檢查摩爾滲透壓濃度并記錄。通過(guò)真空過(guò)濾(0.22μm)消毒，在瓶上標(biāo)注日期和縮寫(xiě)。貯存于4℃并在10日內(nèi)使用。
NCSU 23培養(yǎng)基使用18mohm，RO，DI水。pH應(yīng)為7.4，檢查摩爾滲透壓濃度并記錄。通過(guò)真空過(guò)濾(0.22μm)消毒，在瓶上標(biāo)注日期和縮寫(xiě)。貯存于4℃并在10日內(nèi)使用。注意BSA的類(lèi)型是重要的。優(yōu)選地使用Sigma公司貨號(hào)為#A-7906的BSA。并且，青霉素G/鏈霉素是可任選的。培養(yǎng)基的制備成熟培養(yǎng)基(MAT)18.0ml mNCSU 372.0ml豬的濾
泡液(pFF)7.0μl稀釋的β-巰基乙醇(將10μl β-巰基乙醇稀釋到990μl mNCSU37中；終濃度為50μM)0.002g半胱氨酸(終濃度為0.6mM)20μl EGF原液(來(lái)自10ng/μl EGF原液的表皮生長(zhǎng)因子)經(jīng)0.22μm過(guò)濾至10ml的培養(yǎng)管。標(biāo)注日期和縮寫(xiě)，在CO2培養(yǎng)箱中平衡。豬濾泡液的制備從前青春期的小母豬的3-6mm濾泡中收集濾泡液并使卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞沉降5-10分鐘。吸取pFF并移到15ml的圓錐形管中。在Sorvall離心機(jī)上于4℃以3000rpm離心30分鐘。取出管，收集沉淀上方的pFF，使其匯集并用0.8μm的過(guò)濾器過(guò)濾，然后用0.45μm的過(guò)濾器(Sterivex公司)過(guò)濾。分裝至1.5ml的無(wú)菌微量離心管中并凍存于-20℃直至使用。表皮生長(zhǎng)因子原液(EGF)100μg EGF含0.1％ BSA的10ml mNCSU 37混合均勻。分裝至25μl，凍存于-20℃。用于MAT的馬絨毛膜促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素原液(PMSG/hCG)ECG(PMSG 6000；Intervet Inc.，Millsboro；DE 19966)加3ml dH2O將6000 IU稀釋到2000 IU/ml。hCG(Chorulon；IntervetInc.)加5ml dH2O將10,000 IU稀釋到2000 IU/ml?；旌?ml PMSG和1mlhCG以獲得1000 IU/ml的每種激素。制備50μl的分裝液并凍存于-20℃。同樣凍存剩余的PMSG和hCG原液。db-cAMP的100mM原液25mg db-cAMP(于-20℃貯存于干燥器中)0.509ml dH2O混合均勻。制備50μl的分裝液并凍存于-20℃。融合培養(yǎng)基0.28M甘露醇10μM CaCl2100μM MgSO410mM組氨酸調(diào)節(jié)pH至7.0活化培養(yǎng)基0.28M甘露醇100μM CaCl2100μM MgSO410mM組氨酸調(diào)節(jié)pH至7.0抗生素/抗真菌劑(Ab/Am)100 U/l青霉素，100μg/l鏈霉素和0.25μg/l兩性霉素B，(Gibco#15240-062)在每升鹽溶液中加入10ml等分試樣。在每ml精液中加入10μl等分試樣。卵丘復(fù)合體(OCC)的收集將卵巢于25℃轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室并立即用含有抗生素/抗真菌劑(10ml/L；Gibco #600-5240g)的0.9％鹽溶液洗滌。3-6mm之間的濾泡用18g的針和50ml連于真空系統(tǒng)(GEML牛系統(tǒng))的Falcon管吸取。管裝滿(mǎn)后，使OCC沉降5-10分鐘。吸取濾泡液(pFF)并貯存下來(lái)在需要時(shí)用于培養(yǎng)系統(tǒng)(見(jiàn)下面的pFF制備方法)。OCC的洗滌將OCCs重懸于20ml Hepes-PVA中并使其沉降；重復(fù)2次。最后一次洗滌后，將OCCs移至帶有格子的碟中并選出用于培養(yǎng)的OCC。選出的OCCs在Hepes-PVA的60mm碟中洗滌兩次。所有的吸取和卵母細(xì)胞的回收均在室溫(約25℃)下進(jìn)行。體外成熟(IVM)50個(gè)OCCs在MAT中洗滌3次之后，將其移至4孔Nunc板中(內(nèi)區(qū)室含有1-2ml MAT或mNCSI 37)的0.5ml MAT中。在每孔OCC中加入5μl 100mM的db-cAMP(在水中)。在含有激素的情況下培養(yǎng)22小時(shí)。用不含激素的新鮮MAT洗滌3次并將其移至新鮮MAT的0.5ml孔，大約50個(gè)卵母細(xì)胞/孔。在39℃、5.0％ CO2氣氛中培養(yǎng)22小時(shí)，在MAT中總共培養(yǎng)約40小時(shí)。豬胚的和成熟的成纖維細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)物的分離豬成纖維細(xì)胞的初級(jí)培養(yǎng)物從受精后30到114天，優(yōu)選地為35天的豬胎兒獲得。無(wú)菌地去除頭、肝臟、心臟和消化道，將胎兒絞碎并于37℃在預(yù)熱的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％ EDTA；GIBCO，GrandIsland，NY)中溫育30分鐘。將成纖維細(xì)胞平板接種于組織培養(yǎng)皿中并在含有α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MD)并補(bǔ)充以10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青霉素(100 IU/ml)和鏈霉素(50μl/ml)的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(FGM)中培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞于37℃及含有5％ CO2的潮濕空氣中生長(zhǎng)并維持。
從豬的肺和皮膚中分離成熟的成纖維細(xì)胞。將絞碎的肺組織于10℃在胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％ EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中溫育過(guò)夜。過(guò)夜后的組織及任何分離的細(xì)胞于37℃在預(yù)熱的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％ EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中溫育1小時(shí)并經(jīng)3次連續(xù)洗滌和胰蛋白酶溫育(1小時(shí))進(jìn)行加工。將成纖維細(xì)胞平板接種于組織培養(yǎng)皿中并在補(bǔ)充以10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青霉素(100 IU/ml)和鏈霉素(50μl/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MD)中培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞可在發(fā)育中的任何時(shí)候進(jìn)行分離，從約后胎盤(pán)期到動(dòng)物的成體生活期(豬受精后9到10天至5歲或更長(zhǎng)時(shí)間)均可。制備用于核轉(zhuǎn)移的成纖維細(xì)胞可用作供體核的胎兒成纖維細(xì)胞的實(shí)施例為1.在任何單細(xì)胞階段不同步的或血清饑餓的或休眠的增殖成纖維細(xì)胞可作為核的供體。來(lái)自所說(shuō)的培養(yǎng)物的細(xì)胞用胰蛋白酶EDTA處理10分鐘并在100％的胎牛血清中洗滌3次。然后將單細(xì)胞的成纖維細(xì)胞置于HbT培養(yǎng)基(Bavister等，1983)的顯微操作液滴中。此過(guò)程在將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去核的豬卵母細(xì)胞之前的10到30分鐘完成。優(yōu)選地，將具有CMV啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白基因的增殖轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞(第9代)用于產(chǎn)生NT單位。
2.通過(guò)第二種方法，使成纖維細(xì)胞同步于細(xì)胞周期的G1或GO期。使成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)。然后將FGM中的胎牛血清濃度連續(xù)4天依次減半(第0天＝10％，第1天＝5％，第2天＝2.5％，第3天＝1.25％，第4天＝0.625％)。在第5天細(xì)胞用胰蛋白酶EDTA處理10分鐘并在100％的胎牛血清中洗滌3次。然后將單細(xì)胞的成纖維細(xì)胞置于HbT培養(yǎng)基的顯微操作液滴中。此過(guò)程在將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去核的豬卵母細(xì)胞之前的15分鐘內(nèi)完成。去除丘細(xì)胞在成熟期后，即從約30到50小時(shí)，并優(yōu)選地為約40小時(shí)，將卵母細(xì)胞去核。在去核前優(yōu)選地將卵母細(xì)胞在去除丘細(xì)胞之前移出并置于每毫升含有1毫克透明質(zhì)酸酶的HECM(Seshagiri和Bavister，1989)中。這可通過(guò)用內(nèi)徑非常細(xì)的移液管反復(fù)吸取或通過(guò)短暫的旋渦離心(約3分鐘)來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后篩選剝離的卵母細(xì)胞的極體，再將通過(guò)測(cè)定極體的存在選出的中期II卵母細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移。然后去核。成纖維細(xì)胞的去核、轉(zhuǎn)移及融合不含丘的豬卵母細(xì)胞在成熟后約40小時(shí)(hpm)用成斜角的微量移液管去核。此方法在以前已由Prather等，1989描述，該內(nèi)容在這里引用作為參考。卵母細(xì)胞在HECM HEPES和加入0.15M蔗糖的7.5mg/ml CB中去核。去核在卵母細(xì)胞在加入Hoechst 33342(3μg/ml；Sigma)的NCSU23培養(yǎng)基中溫育超過(guò)20分鐘后得到證實(shí)。然后用HECM加入0.15M蔗糖和CB(7.5mg/ml)的HEPES中的成斜角的微量移液管將單獨(dú)的供體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)置于受體卵母細(xì)胞的卵周隙。通過(guò)電融合技術(shù)將豬卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與供體核(NT單位)融合在一起。將NT單位在增加量的融合培養(yǎng)基中(HECM HEPES與融合培養(yǎng)基的比例為2∶1，1∶2和0∶1)洗滌3次。融合室含有兩條平行的直徑為200μm的線，之間的距離為500μm。用手工操作使每個(gè)NT單位排成一線從而使將要融合的膜與兩條線平行。將一個(gè)100V 30微秒的融合脈沖外加于電融合室中的NT單位。這發(fā)生在44到45hpm。NT單位在融合培養(yǎng)基中溫育5分鐘，然后在HECM HEPES中溫育10分鐘。將NT單位放回加入CB的NCSU 23培養(yǎng)基中直至47到49hpm?；罨梢栽诨罨?7到49小時(shí)使用的活化方法的實(shí)施例為1.單活化脈沖 從加入CB的NCSU 23中取出NT單位并在活化培養(yǎng)基中洗滌3次。平衡之后，將NT單位置于如融合步驟中所述的裝滿(mǎn)活化培養(yǎng)基的融合室(500μm距離)中。外加30V 30微秒的脈沖。然后立即將NT單位在HECM HEPES中洗滌3次并在NCSU 23中再培養(yǎng)(39℃，5％CO2)2小時(shí)直至胚轉(zhuǎn)移或體外培養(yǎng)(39℃，5％ CO2于NCSU 23中)。如果經(jīng)培養(yǎng)，將NT單位在培養(yǎng)的第二天置于加入5％胎牛血清的新鮮NCSU 23中。表1中的結(jié)果表明可用此方法活化卵母細(xì)胞并表明卵母細(xì)胞具有發(fā)育能力。
2.雙活化脈沖 從加入CB的NCSU 23中取出NT單位并在活化培養(yǎng)基中洗滌3次。平衡之后，將NT單位置于如融合步驟中所述的裝滿(mǎn)活化培養(yǎng)基的融合室(500μm距離)中。外加30V 30微秒的脈沖。然后立即將NT單位在HECM HEPES中洗滌3次，放回加入CB的NCSU 23中，并于39℃，5％ CO2在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至1小時(shí)后的下一次電脈沖。1小時(shí)后重復(fù)此次活化培養(yǎng)基平衡步驟并使用15V 30微秒的脈沖。然后立即將NT單位在HECM HEPES中洗滌3次，放回加入CB的NCSU 23中，并于39℃，5％ CO2在此培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2到6小時(shí)。然后用上面1.中描述的相同方法培養(yǎng)NT單位。表1中的結(jié)果表明可用此方法活化卵母細(xì)胞并表明卵母細(xì)胞具有發(fā)育能力。核轉(zhuǎn)移胚的情況是相同的。通過(guò)雙脈沖活化方法產(chǎn)生了4胚泡階段的NT單位。
3.精子因子 由Stice和Robl(Mol.Reprod.Dev.，25272-280(1990))在哺乳動(dòng)物精子中首次描述(其內(nèi)容在這里引用作為參考)，該因子在卵母細(xì)胞中引起活化。從豬的精子細(xì)胞中分離精子因子及顯微注射的方法在Fissore等(Mol.Reprod.Dev.，46176-189(1997))中描述，其內(nèi)容在這里引用作為參考。從加入CB的NCSU 23中取出NT單位并將其置于所說(shuō)的的顯微操作板以進(jìn)行去核和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移。使用裝滿(mǎn)精子因子的顯微注射針(1μm開(kāi)口)將因子傳送到NT單位的細(xì)胞質(zhì)中之后，卵母細(xì)胞得到活化。顯微注射后，將NT胚在HECM HEPES中洗滌3次并保持于加入CB的NCSU 23中2到6小時(shí)，然后置于NCSU 23中直至胚轉(zhuǎn)移。表1.使用不同的活化方法時(shí)活化的卵母細(xì)胞和NT單位的發(fā)育。<
胚轉(zhuǎn)移豬的胚(單細(xì)胞胚)轉(zhuǎn)移方法為大家所熟知(見(jiàn)，例如，Pinkert等，1993，其內(nèi)容在這里引用作為參考)。簡(jiǎn)言之，將20到30個(gè)NT單位同時(shí)轉(zhuǎn)移到生育或未生育過(guò)的小母豬的輸卵管中。懷孕超過(guò)29天后，受體小母豬可產(chǎn)生核轉(zhuǎn)移胎兒(轉(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因的)?；蛘?，使胎兒進(jìn)入分娩期(懷孕114天)產(chǎn)生克隆豬的子代。
權(quán)利要求
1.一種克隆豬的方法，包括(i)在適于核轉(zhuǎn)移(NT)單位形成的條件下，將所需的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的豬卵母細(xì)胞中；(ii)活化獲得的核轉(zhuǎn)移單位；及(iii)將所說(shuō)的培養(yǎng)的NT單位轉(zhuǎn)移到宿主哺乳動(dòng)物中從而使NT單位發(fā)育成胎兒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使胎兒發(fā)育成子代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所說(shuō)的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾所需的DNA，從而導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳改變的NT單位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使胎兒發(fā)育成子代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括培養(yǎng)所說(shuō)的活化的核轉(zhuǎn)移單位直至大于2細(xì)胞的發(fā)育階段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核來(lái)自中胚層。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核來(lái)自外胚層。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核來(lái)自?xún)?nèi)胚層。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核是成纖維細(xì)胞或細(xì)胞核。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核是成熟的細(xì)胞或細(xì)胞核。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核是胚或胎兒細(xì)胞或細(xì)胞核。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中去核的卵母細(xì)胞在去核之前成熟。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中融合的核轉(zhuǎn)移單位通過(guò)接受兩次電脈沖活化。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中融合的核轉(zhuǎn)移單位通過(guò)接受一次電脈沖活化。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中融合的核轉(zhuǎn)移單位通過(guò)暴露于至少一種來(lái)自精子細(xì)胞的活化因子而活化。
16.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中顯微注射用于插入異源DNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中電穿孔用于插入異源DNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法獲得的胎兒。
19.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法獲得的子代。
20.根據(jù)權(quán)利要求19獲得的子代的子代。
21.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因胎兒。
22.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因子代。
23.根據(jù)權(quán)利要求22獲得的子代的子代。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使克隆的NT單位與受精胚結(jié)合以產(chǎn)生嵌合胚。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使胎兒發(fā)育成子代。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法獲得的胎兒。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法獲得的子代。
28.根據(jù)權(quán)利要求27獲得的哺乳動(dòng)物的子代。
29.一種產(chǎn)生CICM細(xì)胞系的方法，包括(i)在適于核轉(zhuǎn)移(NT)單位形成的條件下，將所需的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的豬卵母細(xì)胞中；(ii)活化獲得的核轉(zhuǎn)移單位；及(iii)培養(yǎng)從所說(shuō)的培養(yǎng)的NT單位獲得的細(xì)胞以得到豬的CICM細(xì)胞系。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，該方法包括培養(yǎng)所說(shuō)的活化的核轉(zhuǎn)移單位直至大于2細(xì)胞的發(fā)育階段。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法獲得的CICM細(xì)胞系。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中在所說(shuō)的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾所需的DNA，從而導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳改變的NT單位。
33.根據(jù)權(quán)利要求32獲得的CICM細(xì)胞系。
34.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中獲得的CICM細(xì)胞系經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)生分化。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法獲得的分化細(xì)胞。
36.一種治療方法，包括給需要細(xì)胞移植治療的病人接種權(quán)利要求35所述的異種分化細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞移植治療用來(lái)治療選自以下的疾病或病癥帕金森綜合癥、亨廷頓氏舞蹈癥、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌肉萎縮、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、艾滋病和癌癥。
38.一種治療方法，包括給需要細(xì)胞移植治療的病人從接種權(quán)利要求18所述的從胎兒獲得的異種細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞移植治療用來(lái)治療選自以下的疾病或病癥帕金森綜合癥、亨廷頓氏舞蹈癥、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌肉萎縮、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、艾滋病和癌癥。
40.一種治療方法，包括給需要細(xì)胞移植治療的病人接種從權(quán)利要求19所述的子代獲得的異種細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞移植治療用來(lái)治療選自以下的疾病或病癥帕金森綜合癥、亨廷頓氏舞蹈癥、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌肉萎縮、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、艾滋病和癌癥。
42.一種治療方法，包括給需要細(xì)胞移植治療的病人接種從權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因胎兒獲得的異種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞移植治療用來(lái)治療選自以下的疾病或病癥帕金森綜合癥、亨廷頓氏舞蹈癥、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌肉萎縮、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、艾滋病和癌癥。
44.一種治療方法，包括給需要細(xì)胞移植治療的病人接種從權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因子代獲得的異種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞移植治療用來(lái)治療選自以下的疾病或病癥帕金森綜合癥、亨廷頓氏舞蹈癥、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌肉萎縮、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、艾滋病和癌癥。
46.一種產(chǎn)生藥物活性蛋白的方法，包括分離由權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因子代表達(dá)的藥物活性蛋白。
47.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使克隆的NT單位與受精胚結(jié)合以產(chǎn)生嵌合體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使嵌合的CICM細(xì)胞系發(fā)育成嵌合胚。
49.根據(jù)權(quán)利要求48獲得的嵌合胚。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使嵌合胚發(fā)育成嵌合胎兒。
51.根據(jù)權(quán)利要求50獲得的嵌合胎兒。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使嵌合胎兒發(fā)育成嵌合子代。
53.根據(jù)權(quán)利要求52獲得的嵌合子代。
54.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中在所說(shuō)的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾所需的DNA，從而導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳改變的NT單位。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使嵌合的CICM細(xì)胞系發(fā)育成嵌合胚。
56.根據(jù)權(quán)利要求55獲得的嵌合胚。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使嵌合胚發(fā)育成嵌合胎兒。
58.根據(jù)權(quán)利要求57獲得的嵌合胎兒。
59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使嵌合胎兒發(fā)育成嵌合子代。
60.根據(jù)權(quán)利要求59獲得的嵌合子代。
61.一種克隆豬的方法，包括(i)在適于核轉(zhuǎn)移(NT)單位形成的條件下，將所需的分化的豬細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的豬卵母細(xì)胞中；(ii)活化獲得的核轉(zhuǎn)移單位；及(iii)將所說(shuō)的培養(yǎng)的NT單位轉(zhuǎn)移到宿主哺乳動(dòng)物中從而使NT單位發(fā)育成胎兒。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，該方法包括培養(yǎng)所說(shuō)的活化的核轉(zhuǎn)移單位直至大于2細(xì)胞的發(fā)育階段。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，該方法進(jìn)一步包括使胎兒發(fā)育成子代。
64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法獲得的胎兒。
65.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法獲得的子代。
66.一種用作器官異種移植的器官，該器官?gòu)臋?quán)利要求19所述的子代獲得。
67.一種用作器官異種移植的器官，該器官?gòu)臋?quán)利要求22所述的子代獲得。
68.一種用作器官異種移植的器官，該器官?gòu)臋?quán)利要求27所述的子代獲得。
69.一種用作器官異種移植的器官，該器官?gòu)臋?quán)利要求60所述的子代獲得。
70.一種用作器官異種移植的器官，該器官?gòu)臋?quán)利要求65所述的子代獲得。
71.根據(jù)權(quán)利要求19所述的子代，其中包含在農(nóng)業(yè)上有用的性狀。
72.根據(jù)權(quán)利要求22所述的子代，其中包含在農(nóng)業(yè)上有用的性狀。
73.根據(jù)權(quán)利要求27所述的子代，其中包含在農(nóng)業(yè)上有用的性狀。
74.根據(jù)權(quán)利要求60所述的子代，其中包含在農(nóng)業(yè)上有用的性狀。
75.根據(jù)權(quán)利要求65所述的子代，其中包含在農(nóng)業(yè)上有用的性狀。
76.一種轉(zhuǎn)基因豬。
77.一種用作器官異種移植的器官，該器官?gòu)臋?quán)利要求76所述的子代獲得。
78.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中藥物活性蛋白質(zhì)從轉(zhuǎn)基因子代的乳汁中分離。
全文摘要
本發(fā)明提供包括將作為供體的分化的豬細(xì)胞的核移植入去核的卵母細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移的改進(jìn)方法。獲得的核轉(zhuǎn)移單位通過(guò)產(chǎn)生胎兒和子代在增加基因型和轉(zhuǎn)基因基因型方面是有用的。通過(guò)本方法有利于遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的胚、胎兒和子代的產(chǎn)生,因?yàn)楣w核的分化細(xì)胞來(lái)源能進(jìn)行遺傳修飾并能克隆繁殖。
文檔編號(hào)A61P21/00GK1265600SQ98807956
公開(kāi)日2000年9月6日 申請(qǐng)日期1998年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月3日
發(fā)明者S·L·斯迪司, J·M·羅伯爾, J·斯比里, P·格路克 申請(qǐng)人:馬薩諸塞大學(xué)，馬薩諸塞州高等教育公立研究所