專利名稱：流感病毒基質(zhì)2蛋白的胞外域、其表達(dá)系統(tǒng)和應(yīng)用的制作方法
流感病毒基質(zhì)2蛋白的胞外域、其表達(dá)系統(tǒng)和應(yīng)用
背景技術(shù)：
流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族的負(fù)義RNA成員，引起人和動(dòng)物疾病。流感病毒感染常見且可為流行性或季節(jié)性。盡管流感病毒感染不常引起感染個(gè)體的死亡，但發(fā)病率嚴(yán)重。因此，流感病毒流行可導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失。此外，流感病毒感染對(duì)某些個(gè)體群可能更危險(xiǎn)，如心臟病患者、C.A.R.A.患者或年長(zhǎng)者。流感病毒以復(fù)發(fā)方式引起疾病，這是由于許多復(fù)雜的因素，包括:1)水鳥和水禽中存在不同亞型流感A病毒的已建立儲(chǔ)器；2)禽流感病毒與其他動(dòng)物如豬的流感病毒重組的能力，該過程稱為‘抗原轉(zhuǎn)移’ ；3)由于缺乏病毒RNA聚合酶的校對(duì)活性而在病毒基因產(chǎn)物中積累的突變，該過程稱為‘抗原漂移’(Tollis，M.和L.Di Trani, Vet.J.164:202-215(2002))?？乖D(zhuǎn)移、抗原漂移和禽流感病毒感染其他宿主如豬和人的能力產(chǎn)生導(dǎo)致人嚴(yán)重疾病的新病毒。這些重配和突變事件組合引起病毒兩種表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)中良好表征的抗原可變性，其為所述病毒提供逃逸先前感染或接種疫苗誘導(dǎo)所產(chǎn)生的免疫響應(yīng)(尤其是中和抗體)的機(jī)制。(Palese，P.和J.F.Young, Science 215:1468-1474; Gorman, 0.T.,等，Curr.Top.Microbiol.1mmunol176:75-97;和 Yewdel 1，J.W.，等，Nature 279:246-248)。為了預(yù)測(cè)可能對(duì)人類健康具有全球影響的特定流感亞型，必須依賴監(jiān)督程序生產(chǎn)流感疫苗。生產(chǎn)亞型匹配疫苗(由滅活的或‘裂解的’病毒顆粒組成)的時(shí)間一般最少需要6-8個(gè)月。面對(duì)病毒亞型引起的嚴(yán)重流感病毒流行時(shí)，這種時(shí)間延遲可能導(dǎo)致全國(guó)或全球傳播，發(fā)病率和死亡率極高。因此，非常需要對(duì)不同亞型流感病毒有效的流感疫苗。流感病毒包含單鏈RNA的8個(gè)區(qū)段-形成該病毒的遺傳指令。其表面覆蓋有一層兩種不同糖蛋白:一種由血凝素(HA)分子構(gòu)成，另一種由神經(jīng)氨酸酶(NA)構(gòu)成。病毒衣殼由病毒核糖核酸和若干所謂的“內(nèi)部”蛋白(聚合酶(PB1、PB2和PA)、基質(zhì)蛋白(Ml)和核蛋白(NP))構(gòu)成。由于傳統(tǒng)上已證實(shí)針對(duì)HA和NA的抗體在對(duì)抗感染方面最有效，很多研究都集中在這些分子的結(jié)構(gòu)、功能和遺傳變異方面。不同于HA和NA，跨膜病毒M2蛋白(M2e)的外部結(jié)構(gòu)域高度保守且針對(duì)該表位的抗體在小鼠中具有保護(hù)性(Treanor, J.J.，等，J.Virol.64:1375-1377 (1990) ; Frace, A.M.,等，Vaccine 17:2237-2244(1999) ;ffanli, L.,等，Immunol.Lett.93:131-136 (2004);和Fan，J.，等，Vaccine 22:2293-3003(2004))。所述M2蛋白是A型流感病毒的整合膜蛋白，在病毒感染細(xì)胞的質(zhì)膜上表達(dá)。由于病毒中該蛋白豐度低，所以針對(duì)該表位的抗體應(yīng)答的保護(hù)機(jī)制不是通過病毒中和介導(dǎo)，而是通過抗體依賴性、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。(Jegerlehner, A.,等，J.1mmunol.172:5598-5605 (2004))。開發(fā)誘導(dǎo)免疫響應(yīng)疫苗的主要障礙是選擇合適的遞送形式。單獨(dú)使用或一起使用的DNA質(zhì)粒疫苗和病毒載體， 以及重組蛋白或肽是合理的疫苗遞送形式，但是，各種形式有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，DNA疫苗容易生產(chǎn)且給予安全，但效力不足，尤其是臨床試驗(yàn)中，需要給予大(毫克)劑量。Liu, M.A.J.1ntern.Med.253:402-410 (2003)。使用病毒載體遞送疫苗已引發(fā)關(guān)注，通常涉及安全性和對(duì)載體的預(yù)存免疫性。因此，非常需要開發(fā)安全有效的新流感疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種含編碼多肽的編碼區(qū)域的分離多核苷酸，其中所述多肽包含至少5種流感病毒基質(zhì)2蛋白(M2)胞外域肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的下述氨基酸序列的任何5種或更多:⑴SEQ ID NO:1 (M2e#l_C) ; (ii).SEQ ID N0:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQID N0:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii) SEQ ID NO:7(M2e#l_S);(viii)SEQID N0:8(M2e#2_S) ; (ix)SEQ ID NO: 9 (M2e#3_S) ; (x) SEQ ID NO: 10 (M2e#4_S) ; (xi)SEQ IDN0:ll(M2e#5_S);和(xii)SEQ ID NO:12(M2e#6_S)。還提供含編碼多肽的編碼區(qū)域的分離多核苷酸，其中所述多肽包含相對(duì)彼此以任何順序排列的下述M2胞外域肽的任何3種或更多:(i)SEQ ID N0:l(M2e#l_C) ; (ii)SEQ ID N0:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQ ID NO:4(M2e#4_C);(v)SEQID N0:5(M2e#5_C);(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C);(vii)SEQID NO:7(M2e#l_S);(viii)SEQID N0:8(M2e#2_S) ; (ix)SEQ ID NO: 9 (M2e#3_S) ; (x) SEQ ID NO: 10 (M2e#4_S) ; (xi)SEQ IDN0:ll(M2e#5_S);和(xii) SEQ ID NO: 12 (M2e#6_S).在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含編碼多肽的編碼區(qū)域，所述多肽含相對(duì)彼此以任何順序排列的下述6種M2胞外域肽:(i)SEQ ID N0:l(M2e#l_C);(ii)SEQ ID NO:2(M2e#2_C);(iii)SEQ ID NO:3(M2e#3_C);(iv)SEQID N0:4(M2e#4_C);(v)SEQ ID NO:5(M2e#5_C);和(vi)SEQ ID NO:6(M2e#6_C)或(i)SEQ ID N0:7(M2e#l-S);(ii)SEQ ID NO:8 (M2e#2_S);(iii)SEQID NO:9(M2e#3_S);(iv)SEQID N0:10(M2e#4_S) ; (v) SEQ ID NO: 11 (M2e#5_S);和(vi)SEQ ID NO: 12 (M2e#6_S)的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸編碼多肽，所述多肽含相對(duì)彼此以任何順序排列的6種M2胞外域肽，在至少兩種M2胞外域肽之間插有至少一種接頭肽，且任選地在至少兩種M2胞外域肽之間插有表位。所述表位可為T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明針對(duì)含編碼多肽的多核苷酸的載體,所述多肽含多拷貝的M2胞外域肽。所述載體可為病毒載體，如痘苗病毒載體，如改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)。本發(fā)明載體還可表達(dá)其他多肽，如流感病毒蛋白或其片段。所述其他多肽可選自下組:血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)I蛋白(Ml)、基質(zhì)2蛋白(M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亞基(PA)、RNA聚合酶PBl亞基(PBl)、RNA聚合酶PB2亞基(PB2)、或其兩種或更多組合。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明是含所述載體和所述多核苷酸所編碼分離多肽的宿主細(xì)胞。還包括含所述多核苷酸、所述載體如MVA、所述宿主細(xì)胞或所述多核苷酸以及藥學(xué)上可接受運(yùn)載體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗組合物還包括其他流感疫苗組合物。其他流感疫苗可包括表達(dá)流感病毒或其片段的MVA。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明包括誘導(dǎo)需要的對(duì)象中針對(duì)流感病毒的免疫響應(yīng)的方法，所述方法包括同時(shí)或以任何順序給予所述對(duì)象有效量的所述多核苷酸、所述載體、所述宿主細(xì)胞、所述多肽或所述組合物，或其任何組合。還提供治療、預(yù)防、或減少需要的對(duì)象中流感病毒感染的癥狀或有關(guān)流感病毒感染的病癥的方法，所述方法包括同時(shí)或以任何順序給予所述對(duì)象有效量的所述多核苷酸、所述載體、所述宿主細(xì)胞、所述多肽或所述組合物，或其任何組合。本發(fā)明還涉及減弱或改善需要的對(duì)象中流感病毒感染引起的癥狀或有關(guān)流感病毒感染的病癥的方法，所述方法包括同時(shí)或以任何順序給予所述對(duì)象有效量的所述多核苷酸、所述載體、所述宿主細(xì)胞、所述多肽或所述組合物，或其任何組合。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明包括為需要的對(duì)象針對(duì)流感病毒感染進(jìn)行疫苗接種的方法，所述方法包括同時(shí)或以任何順序給予所述對(duì)象有效量的所述多核苷酸、所述載體、所述宿主細(xì)胞、所述多肽或所述組合物，或其任何組合。本文所用的鑒定序列如下:SEQ ID NO:1:具有半胱氨酸的M2胞外域#1的氨基酸序列(M2e#l_C)SEQ ID NO: 2:具有半胱氨酸的M2胞外域#2的氨基酸序列(M2e#2_C)SEQ ID NO: 3:具有半胱氨酸的M2胞外域#3的氨基酸序列(M2e#3_C)SEQ ID NO:4:具有半胱氨酸的M2胞外域#4的氨基酸序列(M2e#4_C)SEQ ID NO: 5:具有半胱氨酸的M2胞外域#5的氨基酸序列(M2e#5_C)SEQ ID N0:6:具有半胱氨酸的M2胞外域#6的氨基酸序列(M2e#6_C)SEQ ID N0:7:具有絲氨酸取代的M2胞外域#1的氨基酸序列(M2e#l_S)SEQ ID N0:8:具有絲氨酸取代的M2胞外域#2的氨基酸序列(M2e#2_S)SEQ ID N0:9:具有絲氨酸取代的M2胞外域#3的氨基酸序列(M2e#3_S)SEQ ID NO: 10 :具有絲氨酸取代的M2胞外域#4的氨基酸序列(M2e#4_S)SEQ ID NO: 11:具有絲氨酸取代的M2胞外域#5的氨基酸序列(M2e#5_S)SEQ ID NO: 12:具有絲氨酸取代的M2胞外域#6的氨基酸序列(M2e#6_S)SEQ ID NO: 13:編碼流感病毒 A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的基質(zhì) 2 (M2)蛋白的核酸序列SEQ ID NO: 14:流感病毒 A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的基質(zhì) 2 (M2)蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO: 15:編碼METR_C多肽的核酸序列SEQ ID N0:16:METR_C多肽的氨基酸序列SEQ ID NO: 17:編碼METR_S多肽的核酸序列SEQ ID NO: 18:METR_S多肽的氨基酸序列SEQ ID NO: 19:編碼NP共有序列的核酸序列SEQ ID NO:20:NP共有序列的氨基酸序列SEQ ID NO:21-25:接頭肽SEQ ID NO:26-27: T 細(xì)胞表位SEQ ID NO:28:人工序列SEQ ID NO:29-30:啟動(dòng)子SEQ ID NO:31:轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)SEQ ID NO:32-50:引物SEQ ID N0:51:編碼流感病毒A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的HA蛋白的核酸序列SEQ ID NO: 52:編碼流感病毒A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的HA蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:53:編碼流感病毒A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的M2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的核酸序列SEQ ID N0:54:流感病毒A/Puerto Rico/8/34(HlNl)的M2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的
氨基酸序列SEQ ID NO:55:METR_C多肽的氨基酸序列SEQ ID N0:56:METR_S多肽的氨基酸序列附圖簡(jiǎn)要說明

圖1是重組載體vEMOll的示意載體圖?？s寫如下:術(shù)語“AmpR”代表用于在細(xì)菌中選擇的氨芐青霉素抗性基因；術(shù)語“側(cè)接(Flank) I/側(cè)接2Del III”代表與MVA基因組中缺失位點(diǎn)III的側(cè)接區(qū)域同源的序列；術(shù)語“Ps”表示強(qiáng)合成啟動(dòng)子；BsdR表示編碼殺稻瘟菌素抗性的基因；術(shù)語“GFP”表示編碼綠色熒光蛋白的基因；術(shù)語“FIDel 3rpt”代表側(cè)接IDel III的后部重復(fù)；術(shù)語“LacZ”表示用于檢測(cè)細(xì)菌的大腸桿菌(E.coli)Lac Z基因。圖2顯不含流感病毒A基因的重組載體的不意載體圖:(A) vEM47編碼NP共有序列；(B)vEM57編碼M2胞外域串聯(lián)重復(fù)(METR_C)肽；(C) vEM58編碼M2胞外域串聯(lián)重復(fù)-絲氨酸取代的(METR_S)肽；(D)vEM61編碼流感病毒A/Puerto Rico/8/34的全長(zhǎng)基質(zhì)2結(jié)構(gòu)域(Pr8M2) ; (E) vEM62編碼源自流感病毒A/Puerto Rico/8/34的基質(zhì)2結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域(Pr8M2e-TML);和(F) vEM65 編碼流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 的血凝素蛋白(Pr8HA)。圖3 顯示各 種 MVAtor 的 PCR 產(chǎn)物:⑷ MVAtor-NP 共有(mEMIO);⑶ MVAtor_METR_C(mEM18);(C)MVAtor-METR_S(mEM19);以及(D)MVAtor_Pr8M2(mEM22)，MVAtor_Pr8M2e_TML(mEM23)和 MVAtor_Pr8HA(mEM17)。圖4顯示示例性PCR片段的示意圖?？s寫如下:術(shù)語“側(cè)接lDel3”表示插入位點(diǎn)缺失3的側(cè)接序列I ;術(shù)語“Ps”表示痘苗病毒強(qiáng)合成啟動(dòng)子；術(shù)語“flu基因”表示編碼感興趣基因的基因，即分別為HA、NP、M2e、M2e_TML和METR;和術(shù)語“側(cè)接2Del3”代表缺失3的側(cè)接序列2。圖5代表以下各種MVAtor表達(dá)的流感病毒蛋白的Western印跡分析:MVAtor_NP共有(mEMIO)、MVAtor-METR_C(mEM18)和 MVAtor_METR_S (mEM19)。圖6代表用MVAtor-Pr8HA (MVAtor_Pr8)感染的CEF細(xì)胞、模擬感染的CEF細(xì)胞和用MVAtor(MVAtor)感染的CEF細(xì)胞的血球吸附試驗(yàn)(HAD)。圖7代表用于檢測(cè)CEF細(xì)胞中Pr8M2的免疫試驗(yàn):(A)用MVAtor_Pr8M2感染的細(xì)胞；和(B)用MVAtor-Pr8M2e_TML感染的細(xì)胞。圖8代表用以下表達(dá)流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的體重變化百分比:Pr8M2(灰色，大實(shí)心圓)、Pr8M2e-TML(黑色，星號(hào))、METR_C(灰色，小空心圓)、METR_S (灰色，實(shí)心菱形)、NP共有(黑色，實(shí)心三角)、MVAtor (黑色，大空心圓)，和PBS (黑色，小實(shí)心圓)。圖9表示免疫小鼠中的病毒負(fù)荷。獲取每組四個(gè)小鼠中每個(gè)的肺重量以表示50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/肺重量。圖10表示來自用MVA疫苗免疫的小鼠的血清的ELISA，使用小鼠IgG抗_M2e抗體(14C2)。本實(shí)驗(yàn)中使用的M2e肽(M2e#l (第4行)、M2e#4 (第3行)、M2e#5 (第2行)和M2e#6 (第I行))不于表I。圖11顯示鼻內(nèi)(IN)遞送(圖11A)和肌肉內(nèi)(IM)遞送(圖11B)的MVA疫苗免疫小鼠的體重減少。圖12代表鼻內(nèi)遞送(左柱)和肌肉內(nèi)遞送(右柱)的MVA疫苗免疫小鼠的病毒負(fù)荷。圖13表示用表達(dá)流感病毒蛋白的MVAtor免疫后小鼠的體重變化百分比:HA(灰色，實(shí)心方塊)、NP (灰色，實(shí)心三角)、M2 (灰色，實(shí)心菱形)，和M2+NP (灰色，星號(hào))以及對(duì)照=MVAtor (黑色，實(shí)心菱形)和非致死的HlNl PR8 (黑色，實(shí)心圓)。圖 14 的 ELISA 結(jié)果顯示免疫有 ld21 MVA、2d21 MVA、ld21 MVA+NP、2d21 MVA+NP、ld21 MVA-M2eA+MVA-NP、2d21 MVA_M2eA+MVA_NP、ld21 非致死 HlNl PR8 和 2d21 非致死 HlNlPR8MVA的小鼠的抗-NP (IgG抗-NP)免疫響應(yīng)，使用第42天血清(攻擊前)。圖15表示HlNl PR8病毒攻擊后第2天(左柱)和第4天(右柱)，免疫有MVA、MVA-HA、MVA-NP、MVA-M2eA、MVA-M2e+NP和A/PR/8/34的小鼠的病毒負(fù)荷。獲取各小鼠中每個(gè)的肺重量以表示50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/肺重量。圖16A表示用表達(dá)流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的體重變化百分比:MVA-PR8HA (黑色，小實(shí)心菱形)，MVA-PR8-M2+NP (黑色，實(shí)心方形)，和MVA-PR8-C+NP (灰色，大實(shí)心菱形)以及對(duì)照:PBS (黑色，三角)。圖16B代表用表達(dá)表9所示全部流感病毒蛋白以及陰性對(duì)照的MVAtor免疫后的體重變化百分比。圖 17 的 ELISA 結(jié)果顯示免疫有 ConsNP, PR9M2+ConsNP、PR8M2e_TML+ConsNP、METR-C+ConsNP和METR-S+ConsNP的小鼠抗-NP (IgG抗-NP)免疫響應(yīng)，使用第42天血清(攻擊前)。 圖 18 的 ELISA 結(jié)果顯示免疫有 M2、M2-TML、METR-C, METR-S, M2+NP、M2-TML+NP、METR-C+NP和METR-S+NP的小鼠抗-M2 (IgG抗_M2e肽)免疫響應(yīng)，使用第42天血清(攻擊前)。圖19表示用HlNl PR8病毒攻擊3天后鼻內(nèi)(左柱)或肌肉內(nèi)(右柱)免疫有PBS (IN)、MVAtor, NP、M2、M2e_TML、METR-C, METR-S, HA 和亞致死性 PR8 (IN)的小鼠肺中的病毒負(fù)荷。獲取每只小鼠的肺重量以表示50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/肺重量。圖20A表示用表達(dá)流感病毒蛋白的MVAtor免疫后的體重變化百分比:M1+NP+METR-C (黑色，實(shí)心方塊)、M1+NP+M2 (灰色，空心三角)、M2+NP (灰色，X)、Ml (黑色，星號(hào))和M1+NP(灰色，實(shí)心圓)以及對(duì)照=Flulaval (黑色，實(shí)心菱形)、MVAtor (黑色，小實(shí)心方塊)和PBS (黑色，實(shí)心三角)。圖20B顯示用表達(dá)流感病毒蛋白的MVAtor免疫的小鼠的存活數(shù)據(jù)百分比:M1+NP+METR-C (灰色，實(shí)心方塊)、M1+NP+M2 (灰色，空心三角)、M2+NP (灰色，X)、Ml (黑色，星號(hào))和M1+NP(灰色，實(shí)心圓)以及對(duì)照=Flulaval (黑色，空心菱形)、MVAtor (黑色，實(shí)心方塊)和PBS (黑色，實(shí)心菱形)。圖 21 的 ELISA 結(jié)果顯示免疫有 PBS, MVAtor, Ml+NP+METRC, M1+NP+M2, M2+NP, Ml, Ml+NP和Flulaval的小鼠抗-NP (左半邊)和抗M2 (右半邊)免疫響應(yīng)，使用第39天血清(攻擊前)。水平線表示組平均值。未就Ml治療組評(píng)估IgG抗-M2水平。圖 22k 的 ELISA 結(jié)果顯示免疫有 PBS、MVAtor、Ml+NP+METRC、Ml+M2+NP、M2+NP、Ml、M1+NP和Flulaval的小鼠抗-Ml免疫響應(yīng)，使用第39天血清(攻擊前)。水平線表示組平均值。圖 22B 的 ELISA 結(jié)果顯示免疫有 MVAtor、M1+M2+NP、M2+NP、Ml 和 M1+NP 的小鼠抗-MVA免疫響應(yīng),使用第21天(初免后)(左半邊)和第39天(攻擊前)(右半邊)血清。水平線表示組平均值。圖23表示用sHlNl A/Mx/4108/09病毒攻擊后第2天(左柱)或第4天(右柱)，用PBS、MVAtor、Ml+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、Ml、M1+NP、和 Flulaval 免疫的小鼠肺的病毒負(fù)荷。圖24表示用sHlNl A/Mx/4108/09病毒攻擊后第2天(左柱)或第4天(右柱)，用PBS、MVAtor、Ml+NP+METRC、M1+NP+M2、M2+NP、Ml、M1+NP、和 Flulaval 免疫的小鼠鼻甲的病
毒負(fù)荷。發(fā)明詳述本發(fā)明提供編碼多拷貝流感病毒基質(zhì)2蛋白胞外域的多核苷酸、含所述多核苷酸的載體(如MVA)、所述多核苷酸編碼的多肽和相關(guān)組合物以及給予所述多核苷酸、載體(如MVA)、多肽或組合物以預(yù)防或治療流感病毒感染的方法。制備和使用本發(fā)明的方法包括所有分子生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)和疫苗接種的常規(guī)技術(shù)。所述技術(shù)示于包括但不限于下述的文獻(xiàn):Sambrook MolecularCloning;ALaboratory Manual (《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)，第二版(1989)和第三版(2001) ; GeneticEngineering:Principles and Methods,(遺傳工程:原理和方法)1-25 卷(J.K.Setlow編，1988);DNA Cloning ( 《DNA 克隆》)1 和 II 卷(D.N Glover 編 1985) ; OligonucleotideSynthesis (《寡核苷酸合成》)(M.J.Gait 編，1984) ; Nucleic Acid Hybridization (《核酸雜交》)(B.D.Hames 和 S.J.Higgins 編.1984) ; Transcription and Translation (《轉(zhuǎn)錄和翻譯》)(B.D.Hames 和 S.J.Higgins 編.1984) ;Animal Cell Culture (《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》)(R- 1.Freshney 編.1986) ; ImmobilizedCells and Enzymes (《免疫細(xì)胞和酶》)(IRL 出版公司(IRL Press) , 1986) ;B.Perbal, A Practical Guide to MolecularCloning (《分子克隆實(shí)用指南》)(1984) ; the Methodsin Enzymology series (《酶學(xué)方法》叢書)(學(xué)術(shù)出版社公司(Academic Press, Inc.)),具體為154和155卷；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells (《哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》)(J.H.Miller和 M.P.Calos 編.1987,冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpring Harbor Laboratory) ) ;Mayer 和Walker,編.(1987), Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology (細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法)(倫敦的學(xué)術(shù)出版社)；Scopes, (1987)ProteinPurif icat ion !Principles and Practice, Second Edition (《蛋白純化:原理和實(shí)踐》)第二版(施普林格出版社(Springer-Verlag)，紐約)，和 Handbook of ExperimentalImmunology(《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》)I_IV卷，(D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 編 1986).(Sambrook等(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual 2nd ed.,(《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社和 Ausubel 等編 (1997) Current Protocols in MolecularBiology,(《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)(約翰韋利森公司(John Wiley & Sons, Inc.) ) 0定義應(yīng)注意，術(shù)語“一個(gè)”或“一種”物質(zhì)指一種或多種該物質(zhì)；例如，“一種多核苷酸”應(yīng)理解為代表一種或多種多核苷酸。因此，術(shù)語“一個(gè)”(或“一種”)、“一種或多種”和“至少一種”在本文中可以互換使用。本文所用的術(shù)語“分離”表示多核苷酸、多肽或其片段、變體或衍生物以及改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)已從其天然結(jié)合的其他生物材料中移出。分離多核苷酸的示例是載體中含有的重組多核苷酸。分離的多核苷酸的其它例子包括保持于異源宿主細(xì)胞的重組多核苷酸或溶液中的純化(部分或基本上純化)多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)分離多核苷酸或核酸還包括合成產(chǎn)生的此類分子。本文所用的術(shù)語“分離病毒”表示病毒、其衍生物或變體從其天然結(jié)合的其他生物材料中移出，或被重組操縱以包括非天然產(chǎn)生的物質(zhì)。分離病毒的示例是含來自不同物種的多核苷酸的病毒，所述多核苷酸重組插入病毒基因組。分離病毒的其它例子包括含異源多核苷酸并保持于宿主細(xì)胞中的病毒或溶液中的純化(部分或基本上純化)病毒。本文所用的術(shù)語“純化”表示多核苷酸、多肽、病毒或其片段、變體或衍生物基本不含其天然結(jié)合的其他生物材料，或不含源自例如重組宿主細(xì)胞的其他生物材料，所述重組宿主細(xì)胞被遺傳改造以復(fù)制本發(fā)明病毒。例如，本發(fā)明的純化病毒包括至少70-100%純度的病毒，即組合物中存在的病毒構(gòu)成總組合物重量的70-100%。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的純化病毒純度為75%-99%重量、純度為80%-99%重量、純度為90-99%重量或純度為95%-99%重量。本發(fā)明病毒的相對(duì)純度可通過熟知方法容易確定。術(shù)語“核酸”、“核苷酸”或“核酸片段”指多核苷酸或構(gòu)建體中存在的任何一種或多種核酸區(qū)段，如DNA或RNA片段。本發(fā)明的兩個(gè)或多個(gè)核酸可存在于在單一多核苷酸構(gòu)建物中，例如在單一質(zhì)粒上，或者在單獨(dú)(不相同)多核苷酸構(gòu)建物中，例如在單獨(dú)質(zhì)粒上。此外，任何核酸或核酸片段可編碼單一多肽，如單一抗原、細(xì)胞因子或調(diào)控多肽，或可編碼多于一種多肽，如核酸可編碼兩種或更多多肽。此外，核酸可編碼調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止子，或可編碼多肽或蛋白的專門元件或基序如分泌信號(hào)肽或功能結(jié)構(gòu)域。除非另有說明，具體核酸序列也隱含其保守修飾變體(如，簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體說，可通過產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)選定(或所有)密碼子的第三個(gè)位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來獲得簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer等(1991)，Nucleic Acid Res.19:5081 ;0htsuka 等(1985)，J.Biol.Chem.260:2605-2608 ；Cassol 等(1992) ;Rossolini 等(1994) ,Mol.Cell.Probes 8:91-98)。術(shù)語核酸涵蓋多核苷酸、基因、cDNA、信使 RNA(mRNA)、質(zhì)粒 DNA(pDNA)或 pDNA 的衍生物(如(Darquet, A-M 等,GeneTherapy4:1341-1349(1997)中所述的小環(huán))。核酸可以線性(如mRNA)、環(huán)形(如質(zhì)粒)或分支形式以及雙鏈或單鏈形式提供。核酸可包含常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(如酰胺鍵，如肽核酸(PNA)中的酰胺鍵)。術(shù)語核酸、核苷酸、多核苷酸、DNA和基因在本文中可互換使用。術(shù)語〃多核苷酸〃旨在涵蓋單數(shù)核酸或核酸片段以及復(fù)數(shù)核酸或核酸片段，且指分離的分子或構(gòu)建體，如病毒基因組(如非感染性病毒基因組)、信使RNA (mRNA)、質(zhì)粒DNA(pDNA)或 pDNA 衍生物(如(Darquet, A-M 等，Gene Therapy4:1341-1349 (1997)所述的含多核苷酸的小環(huán))。多核苷酸可以線性(如mRNA)、環(huán)形(如質(zhì)粒)或分支形式以及雙鏈或單鏈形式提供。多核苷酸可包含常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(如酰胺鍵，如肽核酸(PM)中的酰胺鍵)。
本文所用的術(shù)語“多肽”旨在涵蓋單數(shù)“多肽”以及復(fù)數(shù)“多肽”，并包含兩種或更多氨基酸的任一鏈或多條鏈。因此，本文所用的術(shù)語包括但不限于“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或其它任何用于指兩種或多種氨基酸的一條或多條鏈的術(shù)語，所述術(shù)語均包含于“多肽”的定義內(nèi)，術(shù)語“多肽”可與任何這些術(shù)語替代或互換使用。所述術(shù)語還包括經(jīng)過翻譯后修飾的多肽，所述修飾例如已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化作用，蛋白水解切割或非天然產(chǎn)生的氨基酸的修飾?！懊艽a子優(yōu)化”在本文中定義為通過用宿主基因中所用的更頻繁或最頻繁的密碼子替換至少一種、多于一種或大量天然序列的密碼子而修飾核酸序列以提高其在具體宿主細(xì)胞中的表達(dá)。各物種對(duì)特定氨基酸的某些密碼子表現(xiàn)出特定偏好。本文所用的術(shù)語“其他”指不同于對(duì)象生物組分的任何生物組分。所述其他組分可為宿主細(xì)胞、病毒、多肽、多核苷酸、基因或調(diào)節(jié)區(qū)域如啟動(dòng)子。應(yīng)理解所述對(duì)象組分可源自流感病毒、MVA、M2胞外域肽或適當(dāng)編碼所述M2胞外域肽的多核苷酸。例如，流感病毒的M2胞外域基因的“其他多核苷酸”或“其他核酸”或“其他基因”或“其他序列”或“外源DNA區(qū)段”可為來自不同病毒如細(xì)胞巨化病毒的啟動(dòng)子或相同流感病毒的血凝素。所述術(shù)語流感病毒的M2胞外域的“其他多肽”、“其他氨基酸序列”、“其他抗原”或“其他蛋白”可為His標(biāo)簽或任何流感病毒多肽、其片段、變體、衍生物或類似物。在某些實(shí)施方式中，其他多肽可為流感病毒多肽、其片段、變體、衍生物或類似物。在其他實(shí)施方式中，其他多肽可為M2胞外域多肽、其片段、變體、衍生物或類似物。本文所用的術(shù)語“流感病毒多肽”或"流感病毒抗原"涵蓋流感病毒內(nèi)存在的任何全長(zhǎng)或成 熟多肽，和流感病毒內(nèi)存在的全長(zhǎng)或成熟多肽的其他變體，流感病毒內(nèi)存在的全長(zhǎng)或成熟多肽的片段，流感病毒內(nèi)存在的全長(zhǎng)或成熟多肽片段的血清型、等位基因和其他變體，流感病毒內(nèi)存在的全長(zhǎng)或成熟多肽的衍生物，流感病毒內(nèi)存在的全長(zhǎng)或成熟多肽片段的衍生物，流感病毒內(nèi)存在的全長(zhǎng)或成熟多肽的類似物，流感病毒內(nèi)存在的全長(zhǎng)或成熟多肽片段的類似物，和含流感病毒內(nèi)存在的全長(zhǎng)或成熟多肽或流感病毒內(nèi)存在的一種或多種全長(zhǎng)或成熟多肽片段的嵌合和融合多肽。流感病毒多肽的非限制性示例是血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)I蛋白(Ml)、基質(zhì)2蛋白(M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)、或一種或多種RNA聚合酶亞基即PA、PBl和PB2。在本發(fā)明所述的一個(gè)實(shí)施方式中，流感病毒多肽是流感HA蛋白、其片段、變體、衍生物或類似物，如含與已知HA序列如SEQ ID NO:52有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%,99%或100%相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽被特異結(jié)合HA序列的抗體識(shí)另IJ。所述HA序列可為全長(zhǎng)HA蛋白，其主要由HA或胞外結(jié)構(gòu)域(EOT) (HAl和HA2)、跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)(CYT)結(jié)構(gòu)域組成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HAl結(jié)構(gòu)域和HA2結(jié)構(gòu)域組成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HAl、HA2和TM結(jié)構(gòu)域組成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由CYT結(jié)構(gòu)域組成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由TM結(jié)構(gòu)域組成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HAl結(jié)構(gòu)域組成；或所述完整HA蛋白的片段，其主要由HA2結(jié)構(gòu)域組成。所述HA序列還可包括HA1/HA2切割位點(diǎn)。所述HA1/HA2切割位點(diǎn)優(yōu)選位于HAl和HA2序列之間，但也可相對(duì)于所述多核苷酸或多肽構(gòu)建體的其他序列以任何順序排列。流感病毒HA序列可來自致病性病毒株。在另一實(shí)施方式中，流感病毒多肽是流感病毒核蛋白(NP)序列、其片段、變體、衍生物或類似物，例如包含與已知NP多肽至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其組成、或由其組成，其中所述多肽由特異結(jié)合所述NP多肽的抗體識(shí)別。在其他實(shí)施方式中，所述流感NP序列包括NP共有序列如SEQ ID NO: 20、主要由其組成或由其組成。流感病毒多肽可為神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白、其片段、變體、衍生物或類似物。已知定位于流感病毒包膜上的NA蛋白催化末端唾液酸殘基從病毒和細(xì)胞糖偶聯(lián)物中移除。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)的NA蛋白具有454氨基酸，Genbank登錄號(hào)為AAM75160.1，其通過引用全文納入本文。NA蛋白由胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸1_6)、跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸7-35)和胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸36-454)組成。流感病毒多肽的非限制性示例包含與已知流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其組成、或由其組成的，其中所述多肽由特異結(jié)合所述NA蛋白的抗體識(shí)別。所述NA序列可為全長(zhǎng)NA蛋白，其主要由NA組成。所述NA序列可為包括NA序列的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)(CYT)結(jié)構(gòu)域、主要由其組成、或由其組成的多肽。流感病毒NA序列可來自致病性病毒株。流感病毒多 肽可為基質(zhì)I (Ml)蛋白、其片段、變體、衍生物或類似物?；|(zhì)I蛋白在病毒復(fù)制中起關(guān)鍵作用。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (HlNl)的Ml具有252氨基酸，Genbank登錄號(hào)為AAM75161.1，其通過引用全文納入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含與已知流感病毒Ml序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其組成、或由其組成，其中所述多肽由特異結(jié)合所述Ml蛋白的抗體識(shí)別。所述Ml序列可為包括NA序列片段、主要由其組成、或由其組成的多肽。在其他實(shí)施方式中，流感病毒多肽可為非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白、其片段、變體、衍生物或類似物。非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)抑制細(xì)胞前體mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工，這是通過結(jié)合并抑制細(xì)胞前體mRNA 3’-末端加工所需的兩種細(xì)胞蛋白:30kDa切割和多聚腺苷酸化特異性因子(CPSF4)和聚(A)-結(jié)合蛋白2 (PABPNl)0流感病毒A/PuertoRico/8/1934(HlNl)的NS蛋白具有230氨基酸，Genbank登錄號(hào)為AAM75163.1，其通過引用全文納入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含與已知流感病毒NS序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其組成、或由其組成，其中所述多肽由特異結(jié)合所述NS蛋白的抗體識(shí)別。所述NS序列可為包括NS序列片段、主要由其組成、或由其組成的多肽。在一些實(shí)施方式中，流感病毒多肽是RNA聚合酶PA (聚合酶酸性蛋白)亞基、其片段、變體、衍生物或類似物。PA多肽在病毒RNA合成中顯示伸長(zhǎng)因子活性。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)的 PA 蛋白具有 716 氨基酸，Genbank 登錄號(hào)為 AAM75157.1，其通過引用全文納入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含與已知流感病毒PA序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其組成、或由其組成，其中所述多肽由特異結(jié)合所述PA蛋白的抗體識(shí)別。所述PA序列可為包括PA序列片段、主要由其組成、或由其組成的多肽。在某些實(shí)施方式中，本文所用流感病毒多肽是RNA聚合酶PBl(聚合酶堿性蛋白I)亞基、其片段、變體、衍生物或類似物。PBl蛋白負(fù)責(zé)病毒區(qū)段的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)的 PBl 蛋白具有 757 氨基酸，Genbank 登錄號(hào)為 AAM75156.1，其通過引用全文納入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含與已知流感病毒PBl序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其組成、或由其組成，其中所述多肽由特異結(jié)合所述PBl蛋白的抗體識(shí)別。所述PBl序列可為包括PBl序列片段、主要由其組成、或由其組成的多肽。在其他實(shí)施方式中，流感病毒多肽可為RNA聚合酶PB2 (聚合酶堿性蛋白2)亞基、其片段、變體、衍生物或類似物。PB2蛋白涉及轉(zhuǎn)錄起始和帽偷竊(cap-stealing)機(jī)制，其中細(xì)胞加帽的前體mRNA用于生成病毒轉(zhuǎn)錄的引物。流感病毒A/PuertoRico/8/1934 (HlNl)的PB2具有759氨基酸，Genbank登錄號(hào)為AAM75155.1，其通過引用全文納入本文。流感病毒多肽的非限制性示例包含與已知流感病毒PB2序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列、主要由其組成、或由其組成，其中所述多肽由特異結(jié)合所述PB2蛋白的抗體識(shí)別。所述PB2序列可為包括PB2序列片段、主要由其組成、或由其組成的多肽。本文所用的術(shù)語“編碼區(qū)”指由翻譯成氨基酸的密碼子組成的核酸部分。雖然“終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)不翻譯成氨基酸，但它可被認(rèn)為是編碼區(qū)的一部分，而任何側(cè)接序列，如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子等均在編碼區(qū)之外。術(shù)語“片段”、“類似物”、“衍生物”或“變體”指流感病毒多肽時(shí)，包括保留天然產(chǎn)生的流感病毒蛋白的至少一些免疫原性或抗原性的任何多肽。本發(fā)明的流感病毒多肽片段包括蛋白水解片段、缺失片段且尤其是在表達(dá)、純化和或給予動(dòng)物期間表現(xiàn)出溶解性增加的流感病毒多肽片段。流感病毒多肽的片段還包括遞送給對(duì)象時(shí)表現(xiàn)出病原性下降的蛋白水解片段或缺失片段。多肽片段還包括任何包含天然多肽的抗原性或免疫原性表位的多肽部分，包括線性及三維表位。多肽抗原的“表位片段”是含表位的抗原部分?！氨砦黄巍笨砂恍枰环N或多種表位以外的氨基酸序列。本文所用術(shù)語“變體”指由于氨基酸取代、缺失、插入、和/或修飾而不同于所指多肽的多肽。變體可天然產(chǎn)生， 如亞型變體。術(shù)語〃亞型變體〃指不同流感病毒亞型中存在的多肽或多核苷酸，所述病毒亞型包括但不限于，人A/PuertoRico/8/34 (HlNl)、人A/VietNam/1203/2004(H5N1)、人 A/Hong Kong/156/97(H5N1)、人 A/Hong Kong/483/97(H5N1)、人 A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)、禽類 A/ 雞 /HK/G9/97 (H9N2)、豬 A/ 豬 /HongKong/10/98 (H9N2)、禽類 A/FPV/Rostock/34 (H7N I)、禽類 A/ 火雞 /Italy/4620/99 (H7NI)、禽類 A/FPV/Weybridge/34(H7N7)、人 A/New Caledonia/20/99 (HlNl)、人 A/Hong Kong/1/68(H3N2)、人 A/Shiga/25/97(H3N2)、人 A/Singapore/1/57(H2N2)、人 A/Leningrad/134/57 (H2N2)、人A/AnnArbor/6/60 (H2N2)、人A/Brevig Mission/1/18 (HlNl)、豬 A/ 豬 /Wisconsin/464/98(H IN I)、人 A/Netherlands/219/03(H7N7)和人 A/ffyoming/3/2003 (H3N2)。亞型變體是天然產(chǎn)生的變體，但其也可用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)生產(chǎn)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的誘變技術(shù)生成非天然產(chǎn)生變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，變體多肽通過取代、缺失或添加5個(gè)或更少氨基酸而不同于已鑒定的序列。所述變體通?？赏ㄟ^修飾多肽序列并用例如本文所述代表性過程評(píng)估修飾多肽的抗原特性來鑒定。多肽變體與已鑒定的多肽有至少約60-70%、例如75%、80%、85%、90%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.9%的序列相同性。變體多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。多肽衍生物是被改變從而表現(xiàn)出天然多肽上沒有發(fā)現(xiàn)的其他特征的多肽。例子包括融合蛋白。類似物是本發(fā)明多肽的其他形式。一個(gè)示例是通過切割前蛋白產(chǎn)生活性成熟多肽而可激活的前蛋白。變體還可或另外包含其他修飾，例如多肽可偶聯(lián)或耦合如融合其他多肽如蛋白N末端的信號(hào)(或前導(dǎo))序列，所述序列共翻譯或翻譯后指導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)移。所述多肽還可偶聯(lián)或生成耦合于接頭或其他序列以便于合成、純化或鑒定所述多肽(如6-His)或增強(qiáng)多肽與固體支持物的結(jié)合。例如，多肽可偶聯(lián)或耦合免疫球蛋白Fe區(qū)域。所述多肽還可偶聯(lián)或耦合某序列，所述序列賦予或調(diào)控對(duì)所述多肽(如T細(xì)胞表位、B細(xì)胞表位、細(xì)胞因子、趨化因子等)的免疫響應(yīng)和/或通過抗原呈遞細(xì)胞或其他免疫系統(tǒng)細(xì)胞提高所述多肽的攝入和/或加工。所述多肽還可偶聯(lián)或耦合來自流感病毒和/或來自其他細(xì)菌和/或其他病毒的其他多肽/表位以生成雜交免疫原性蛋白，其單獨(dú)或與各種佐劑組合能引發(fā)對(duì)其他病原生物體的保護(hù)免疫。本文所用的術(shù)語“序列相同性”指兩種或更多種多核苷酸序列之間或兩種或更多種多肽序列之間的關(guān)系。當(dāng)一個(gè)序列中的位置被對(duì)比序列的相應(yīng)位置中相同核酸堿基或氨基酸殘基占據(jù)時(shí)，所述序列被稱為在該位置“相同”。“序列相同性”百分比通過測(cè)定兩個(gè)序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)目來計(jì)算，得到“相同”位置的數(shù)目。然后“相同”位置的數(shù)目除以對(duì)比窗中的位置總數(shù)并乘以100，得到“序列相同性”百分比?！靶蛄邢嗤浴卑俜直韧ㄟ^比較對(duì)比窗中兩種最優(yōu)比對(duì)序列來測(cè)定。為了最優(yōu)化比對(duì)用于比較的序列，比較窗中多核苷酸或多肽序列的部分可包含稱為缺口的添加或缺失，而參考序列保持不變。最優(yōu)化的比對(duì)是即使有缺口仍在參考和比較序列之間產(chǎn)生最大可能數(shù)目的“相同”位置的比對(duì)。術(shù)語“序列相同性”和“相同”在本文中可互換使用。因此，共有“序列相同性”百分比的序列應(yīng)理解為“相同”百分比一樣。兩種序列之間的“序列相同性”百分比可用程序“BLAST 2序列”版本測(cè)定，所述程序2004年9月I日起可獲自國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information),包括程序 BLASTN (用于核苷酸序列比較)和BLASTP (用于多肽序列比較)，基于Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90 (12): 5873-5877，1993)。使用“BLAST 2 序列”時(shí)，2004 年 9 月 I 日起的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)可用于字長(zhǎng)(3)、缺口開放罰分(11)、延伸缺口罰分(I)、缺口降低(50)、期望值(10)和任何其他需要的參數(shù)，包括但不限于基質(zhì)選擇。本文所用的術(shù)語“表位”指動(dòng)物中具有抗原或免疫原性活性的多肽部分，例如哺乳動(dòng)物，例如人。本文所用的“免疫原性表位”定義為引發(fā)動(dòng)物中免疫響應(yīng)的蛋白部分，如本領(lǐng)域任何已知方法所測(cè)。本文所用的術(shù)語“抗原表位”定義為抗體或T細(xì)胞受體能免疫特異結(jié)合其抗原的蛋白部分，如本領(lǐng)域任何已知方法所測(cè)。免疫特異結(jié)合不包括非特異結(jié)合但不必然排除與其他抗原的交叉反應(yīng)。雖然所有免疫原性表位為抗原性的，但抗原表位不需要為免疫原性?！坝行Я俊笔且詥蝿┝炕蛞幌盗袆┝康囊徊糠侄o予個(gè)體能有效進(jìn)行治療或預(yù)防的量。例如，如感染性流感病毒攻擊2周后所測(cè)，當(dāng)給予量使流感病毒感染發(fā)生率相對(duì)未治療個(gè)體降低時(shí)，所述量有效。該量根據(jù)所治療個(gè)體的健康和身體狀況、所治療個(gè)體的分類組(例如，人、非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、靈長(zhǎng)動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)的響應(yīng)能力、所需的保護(hù)程度、疫苗配方、醫(yī)療情況的專家評(píng)估和其它相關(guān)因素而變化。預(yù)計(jì)所述有效量將落入可通過常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的相對(duì)較寬范圍內(nèi)。通常單一劑量為約IOii g-10mg MVA/kg體重或修飾的運(yùn)載生物體或宿主細(xì)胞的量，足以提供重組表達(dá)流感病毒多肽的可比數(shù)量。術(shù)語“對(duì)象”表示需要診斷、預(yù)后、免疫或治療的任何對(duì)象，尤其是哺乳動(dòng)物對(duì)象。哺乳動(dòng)物對(duì)象包括但不限于人，家養(yǎng)動(dòng)物，農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，動(dòng)物園動(dòng)物如熊，運(yùn)動(dòng)類動(dòng)物，寵物如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、熊、奶牛；靈長(zhǎng)類如猿、猴、猩猩和大猩猩；犬科動(dòng)物如狗和狼；貓科動(dòng)物如貓、獅和虎；馬科動(dòng)物如馬、驢和斑馬；食用動(dòng)物如奶牛、豬和羊；有蹄類如鹿和長(zhǎng)頸鹿；嚙齒類如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠；等等。在某些實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是人對(duì)象。術(shù)語“動(dòng)物”旨在包含單數(shù)“動(dòng)物”以及復(fù)數(shù)“動(dòng)物”且包括哺乳動(dòng)物和鳥，以及魚、爬行類和兩棲類。術(shù)語動(dòng)物也涵蓋模式動(dòng)物如疾病模式動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語動(dòng)物包括有經(jīng)濟(jì)或其他價(jià)值的動(dòng)物，如經(jīng)濟(jì)上重要的飼養(yǎng)動(dòng)物、比賽動(dòng)物、表演動(dòng)物、祖?zhèn)鲃?dòng)物、稀有或漸危動(dòng)物、或伴侶動(dòng)物。具體地，所述哺乳動(dòng)物可為人對(duì)象、食用動(dòng)物或伴侶動(dòng)物。如本文所用，“需要其的對(duì)象”指需要治療即預(yù)防、治愈、阻止或降低流感病毒感染嚴(yán)重性，和/或在特定時(shí)間中使流感病毒感染癥狀不加重的個(gè)體。本文所用的術(shù)語“初次”或“首次”或“初免”和“加強(qiáng)”或“加強(qiáng)免疫”分別指第一次和后續(xù)免疫，即根據(jù)這些術(shù)語在免疫學(xué)中的常用定義。然而，在某些實(shí)施方式中，例如初免組分和加強(qiáng)免疫組分為單一制劑時(shí)，第一次和后續(xù)免疫可能并非必要，因?yàn)椤俺醮巍焙汀凹訌?qiáng)”組合物同時(shí)給予。術(shù)語“被動(dòng)免疫”指宿主動(dòng)物發(fā)展出對(duì)抗原的免疫，所述宿主動(dòng)物被給予另一動(dòng)物產(chǎn)生的抗體而不是生成針對(duì)該抗原的其自身抗體。術(shù)語“主動(dòng)免疫”指宿主動(dòng)物由于存在靶抗原而產(chǎn)生抗體。本文所用的“免疫響應(yīng)”指受體對(duì)引入多核苷酸、多肽、減毒痘病毒如MVA、或本發(fā)明組合物的響應(yīng)，通常表征為 但不限于產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞。通常，免疫響應(yīng)可為細(xì)胞響應(yīng)如對(duì)流感病毒M2胞外域或M2胞外域串聯(lián)重復(fù)(METR)特異的CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞或二者的誘導(dǎo)或活化、對(duì)流感病毒M2胞外域特異性或METR特異性抗體生產(chǎn)增加的體液響應(yīng)，或細(xì)胞和體液響應(yīng)二者。由含本發(fā)明MVA的疫苗建立的免疫響應(yīng)包括但不限于MVA進(jìn)入宿主細(xì)胞后對(duì)宿主細(xì)胞所表達(dá)蛋白的響應(yīng)。本發(fā)明中,傳染性病原(如A型流感病毒)后續(xù)攻擊后，免疫響應(yīng)阻止流感病毒顆粒的形成或發(fā)展。免疫響應(yīng)還可包括粘膜響應(yīng)，如粘膜抗體響應(yīng)例如S-1gA生產(chǎn)，或粘膜細(xì)胞介導(dǎo)的響應(yīng)例如T細(xì)胞響應(yīng)。本文所用的“疫苗”是含免疫原性試劑和藥學(xué)上可接受稀釋劑并組合賦形劑、佐齊U、添加劑和/或保護(hù)劑的組合物。免疫原可由完整傳染劑或所述傳染劑的分子亞組(由所述傳染劑合成或重組生產(chǎn)，包括但不限于多肽或多核苷酸)構(gòu)成。例如，本文所用的“MVA疫苗”表示含分離MVA的組合物，所述MVA包含編碼多重拷貝M2胞外域肽(如M2e串聯(lián)重復(fù))和藥學(xué)上可接受稀釋劑并組合賦形劑、佐劑、添加劑和/或保護(hù)劑的至少一種多核苷酸。疫苗給予對(duì)象時(shí)，免疫原刺激免疫響應(yīng)，所述免疫響應(yīng)在用傳染劑后續(xù)攻擊后會(huì)保護(hù)對(duì)象免于疾病或減輕該試劑引起的病理學(xué)、癥狀或臨床表現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明所述疫苗可為治療性或預(yù)防性。治療性(治療)疫苗在感染后給予，旨在降低或抑制疾病進(jìn)展。預(yù)防性(預(yù)防)疫苗旨在阻止首次感染或降低感染負(fù)荷。針對(duì)流感相關(guān)疾病的疫苗中使用的試劑可為減毒流感病毒，或與流感病毒有關(guān)的純化或人工加工的分子，如重組蛋白、合成肽、DNA質(zhì)粒和表達(dá)流感病毒蛋白的重組病毒或細(xì)菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，疫苗還可包括其他組分如賦形齊IJ、稀釋劑、運(yùn)載劑、防腐劑、佐劑或其他免疫增強(qiáng)劑、或其組合。多價(jià)疫苗指從兩種或更多種痘病毒中制備的任何疫苗，如MVA，其各表達(dá)不同抗原，如不同流感病毒抗原?；蛘?，多價(jià)疫苗包括單一分離痘病毒如MVA包括編碼兩種或更多抗原(如不同的流感病毒抗原)的多核苷酸。所述兩種或更多抗原如流感病毒抗原可源自相同多肽，但含有可誘導(dǎo)非交叉反應(yīng)性免疫響應(yīng)的不同表位。本文所用的術(shù)語“免疫原性運(yùn)載體”指第一多肽或其片段、變體或衍生物，其增強(qiáng)第二多肽如抗原表位、其片段、變體或衍生物的免疫原性。術(shù)語“佐劑”指具有下述能力的任何材料:(I)改變或增加對(duì)具體抗原的免疫響應(yīng)或⑵增加或輔助藥物試劑的效果。如本文所用，可能增加本發(fā)明MVA的表達(dá)、抗原性或免疫原性的任何化合物是潛在的佐劑。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語佐劑指TLR刺激佐劑，其中所述TLR佐劑包括刺激TLR受體(如TLR1-TLR13)從而使針對(duì)本發(fā)明疫苗組合物的免疫系統(tǒng)響應(yīng)增強(qiáng)的化合物。TLR佐劑包括但不限于CpG和MPL。本文所用的術(shù)語“減毒”包括使傳染劑例如痘病毒如MVA不能在至少一種宿主細(xì)胞例如任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞如任何人細(xì)胞中復(fù)制。減毒的MVA在某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞如BS-C-1和CV-1細(xì)胞中仍可具有有限的復(fù)制能力。雖然在某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不能復(fù)制，MVA仍可保留在其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如BHK-21細(xì)胞)以及禽類細(xì)胞中復(fù)制的完全能力，例如初級(jí)或永生雞或鴨細(xì)胞，如AGElcr、AGElcr.pIX或丨:B66K...減毒MVA的細(xì)胞復(fù)制周期可在其生命周期的任何階段阻斷。例如，減毒MVA的細(xì)胞復(fù)制周期在后期被阻斷，阻止新病毒生成和釋放。本文所用的術(shù)語“復(fù)制”或“復(fù)制的”指在病毒生命周期某些部分進(jìn)展的能力，如病毒基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯以及核酸復(fù)制，以及一些情況中生成或發(fā)展出成熟感染病毒顆粒的能力。多核苷酸

本發(fā)明提供含編碼區(qū)域的分離多核苷酸，所述編碼區(qū)域編碼含多拷貝流感病毒基質(zhì)2蛋白胞外域的多肽以誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫響應(yīng)。流感病毒基質(zhì)2蛋白("M2")是質(zhì)子選擇性離子通道蛋白，其整合在流感A病毒的病毒包膜中。通道本身是同源四聚體，其中所述單元形成由兩個(gè)二硫鍵穩(wěn)定的螺旋。M2蛋白單元由三種蛋白結(jié)構(gòu)域組成:N末端具有24個(gè)氨基酸的暴露于外部環(huán)境的胞外域、具有19個(gè)疏水氨基酸的跨膜區(qū)域、和C末端具有54個(gè)氨基酸的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。M2蛋白在A型流感病毒生命周期中有重要作用。所述蛋白定位在病毒包膜中，使氫離子從內(nèi)涵體進(jìn)入病毒顆粒(病毒粒子)，從而降低病毒內(nèi)的pH，這使病毒基質(zhì)蛋白Ml從核蛋白R(shí)NP中分離。這是病毒去包被和將其內(nèi)容物暴露于宿主細(xì)胞胞質(zhì)中的關(guān)鍵步驟。本發(fā)明提供分離多核苷酸，其包含編碼多肽的編碼區(qū)，其中所述多肽含至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)流感病毒基質(zhì)2蛋白(M2)胞外域肽、其變體、片段、衍生物或類似物。其中M2胞外域肽可相對(duì)彼此以任何順序排列或組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸包含編碼多肽的編碼區(qū)，其包含至少6個(gè)M2胞外域肽、其片段、變體、片段、衍生物或類似物，其中所述至少6個(gè)M2胞外域肽相對(duì)彼此以任何順序排列或組合。術(shù)語“多拷貝的M2胞外域肽”在本文中也可與“M2e串聯(lián)重復(fù)”、“M2胞外域串聯(lián)重復(fù)”或“METR”互換使用。本發(fā)明所用基質(zhì)2(M2)蛋白可獲自A型流感肝病毒，所述病毒包括但不限于人 A/Puerto Rico/8/34(HlN I)、人 A/Viet Nam/1203/2004(H5N I)、人 A/VietNam/DT-036/2005(H5N1)、人 A/ 總鷓 /Novoslbirsk/29/2005 (H5N1)、禽類 A/ 斑頭雁 /Mongolia/1/05 (H5N I)、A/ 貓 /Thailand/KU-02/04 (H5N I)、人 A/Hong Kong/213/03(H5N1)、禽類 A/ 雞 /Guandong/174/04(H5N1)、人 A/Hong Kong/156/97(H5N1)、人 A/Hong Kong/483/97(H5N1)、禽類 A/ 鵪鶉 /Hong Kong/Gl/97 (H9N2)、禽類 A/ 鴨 /Hong Kong/Y260/97 (H9N2)、禽類 A/ 雞 HK/FY23/03 (H9N2)、禽類 A/ 火雞 /Germany/3/91 (HlNl)、人 A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)、禽類 A/ 雞 /HK/G9/97 (H9N2)、豬 A/ 豬 /Hong Kong/10/98 (H9N2)、豬 A/ 豬 /Saskatchewan/18789/02 (HlNl)、禽類 A/ 野鴨 /Alberta/1302003 (HlNl)、禽類 A/ 野鴨 /NY/6750/78(H2N2)、禽類 A/ 野鴨 /Potsdam/177-4/83(H2N2)、禽類 /A/ 鴨 /Hokkaldo/95/2001(H2N2)、禽類 A/ 鴨 /Korea/S9/2003(H3N2)、豬 A/ 豬 /Shandong/2/03(H5N1)、禽類 A/ 雞 /California/0139/2001(H6N2)、禽類 A/ 海雀 /Sweden/3/2000(H6N2)、禽類 A/ 鵝 /Hong Kong/ff 217/97(H6N9)、禽類 A/ 雞 /British Columbia/04(H7N3)、禽類 A/ 水鳥 /Delaware/9/96(H9N2)、禽類 A/ 鴨 /Hong Kong/Y439/97 (H9N2)、禽類 A/ 短頸野鴨 /Hong Kong/W312/97 (H6N1)、豬 A/ 豬 /Korea/S452/2004(H9N2)、禽類 A/ 雞 /Netherlands/1/2003(H7N7)、禽類 A/ 野鴨 /Alberta/2001 (HlNl)、禽類 A/ 鴨 /Hunan/114/05 (H5N1)、豬 A/ 豬 /Cotes d’Armor/1482/99 (HlNl)、豬 A/ 豬 Belzig/2/2001 (HlNl)、禽類 A/ 火雞 /Italy/220158/2002 (H7N3)、禽類 A/HK/2108/2003 (H9N2)、禽類 A/FPV/Rostock/34 (H7N1)、禽類 A/ 火雞 /Italy/4620/99 (H7N1)、禽類 A/FPV/ffeybridge/34 (H7N7)、禽類 A/FPV/Dobson/27(H7N7)、人 A/New Caledonia/20/99 (HlNl)、人 A/Hong Kong/1/68(H3N2)、人 A/Charlottesville/03/2004(H3N2)、人 A/Canterbury/129/2005(H3N2)、人 A/Shiga/25/97(H3N2)、人 A/Singapore/1/57(H2N2)、人 A/Leningrad/134/57(H2N2)、人 A/Ann Arbor/6/60(H2N2)、人 A/Brevig Mission/1/18 (HlNl)、人 A/Canada/720/05(H2N2)、豬 A/ 豬 /Wisconsin/464/98 (HlNl)、豬 A/ 豬 /Texas/4199-2/98 (H3N2)、禽類 A/ 火雞 /0hio/313053/2004 (H3N2)、禽類 A/ 火雞 /North Carolina/12344/03 (H3N2)、禽類 A/ 鵝 /Guangdong/1/98 (H5N1)、人A/Netherlands/219/03 (H7N7)、人A/Willson-Smith/33 (HlNl)、人 A/New Caledonia/20/99 (HlNl)、人 A/Japan/305/57 (H2N2)、禽類 A/ 雞 /Iran/16/2000 (H9N2)、禽類 A/ 野鴨 /MN/1/2000 (H5N2)、A/Leiden/01272/2006 (H3N2)、A/Tilburg/45223/2005 (H3N2)、A/Pennsylvania/PIT25/2008 (H3N2)、A/NYMC X-171A (PuertoRico/8/1934-Brisbane/10/2007) (H3N2)、A/Managua/26/2007 (H3N2)、A/HongKong/l-l-MA-20D/1968 (H3N2)、A/Czech Repub Iic/I/1966 (H2N2)、A/ 雞 /Shanghai/2/1999 (H9N2)) ]、A/Myanmar/M187/2007 (H3N2)、A/ 珠雞 /NewYork/101276-1/2005 (H7N2)、禽類 A/ 美洲家鴨 /New York/87493-3/2005 (H7N2)、禽類A/ 火雞 /New York/122501-2/2005 (H7N2)、禽類 A/ 野鴨 /Italy/4223-2/2006 (H5N2)和人A/Wyoming/3/2003(H3N2)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的基質(zhì)2蛋白的胞外域源自流感病毒A/PuertoRico/8/34 (HlNl)。流 感病毒人 A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的全長(zhǎng) M2 蛋白含 97 個(gè)氨基酸，如SEQ ID N0:14所示。編碼所述M2蛋白(SEQ ID NO: 14)的核酸在本文中如SEQID NO: 13所示。流感病毒表面暴露的N末端序列是沒有N末端甲硫氨酸的23個(gè)氨基酸或具有N末端甲硫氨酸的24個(gè)氨基酸(下述SEQ ID NO: 14的帶下劃線序列)且鑒定為胞外域("M2e")。流感病毒A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的基質(zhì)2蛋白序列(SEQ ID NO: 14)0 MSLLTEVETP IRNEffGCRCN GSSDPLTIAA NIIGILHLTL WILDRLFFKC50 IYRRFKYGLK GGPSTEGVPK SMREEYRKEQ QSAVDADDGH FVSIELE本文所用M2胞外域肽、其變體、衍生物、片段或類似物可包含位于M2胞外域肽中的抗體表位，其中所述M2胞外域肽包含約8-39個(gè)氨基酸、約9-38個(gè)氨基酸、約10-37個(gè)氨基酸、約11-36個(gè)氨基酸、約12-35個(gè)氨基酸、約13-34個(gè)氨基酸、約14-33個(gè)氨基酸、約15-32個(gè)氨基酸、約16-31個(gè)氨基酸、約17-30個(gè)氨基酸、約18-29個(gè)氨基酸、約19-28個(gè)氨基酸、約20-27個(gè)氨基酸、約21-26個(gè)氨基酸、約22-25個(gè)氨基酸、或約23-24個(gè)氨基酸，主要由其組成，或由其組成。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，M2胞外域肽主要由或由23個(gè)氨基酸組成。抗體表位的非限制性示例包括選自EVETPTRN(SEQ ID NO:1的氨基酸5_12)、SLLTEVETPT (SEQID NO:1 的氨基酸 1-10) ,ETPTRNEffECK (SEQ ID NO: 2 的氨基酸 7-17)、EVETPIRNEW(SEQ IDN0:3的氨基酸5-14)和LTEVETPIRNEWGCRCN(SEQID NO: 3的氨基酸3_19)的氨基酸序列，主要由其組成，或由其組成?；蛘撸琈2胞外域肽可為其變體、衍生物或類似物，其可被特異結(jié)合由SEQ IDNOiU
2、3、4、5或6所組成肽的抗體識(shí)別。例如，所述M2胞外域肽的變體、衍生物或類似物與SEQID N0:l、2、3、4、5*6(M2e#3_C)有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同性，其中所述變體、衍生物 或類似物被特異結(jié)合由SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6所組成肽的抗體識(shí)別。特異結(jié)合由SEQ ID NO: 3所組成肽的抗體示例為單克隆抗體14C2，如美國(guó)專利號(hào)5，290，686所述，其通過引用全文納入本文。M2胞外域肽的非限制性示例列于表I。表IMETR疫苗中使用的6種M2e肽(C)形式的列表
rm,n1 M2e肽的氨基酸序列舦名稱 SEQ ID天然產(chǎn)生的流感毒株__II的流行_
SLLTEVETPTRNEWE M2e#l—C SEQ ID HS 人 1999-2008 CRCSDSSDNO:1 (70%)
SLLTEVETPTRNEWE^ ^M2e#2_C SEQ ID HS 人 1999-2008
CKCIDSSD— NO: 2 (30%)
SLLTEVETPIRNEWGM2e#3—C SEQ ID H3 人(—些 Hl)
「01311 CRCNGSSD___NO: 3__
SLLTEVETPIRNEWGM2e#4—C SEQ ID Hl 和 H3 人
CRCNDSSD___NO: 4__
SLLTEVETLTRNGWE M2e#5—C SEQ ID H9 和 H6 人,和禽類
CRCSDSSD___NO: 5__
SLLTEVETPTRNGWE M2e#6—C SEQ ID 禽類 H7,和 H35 H8, CKCSDSSD___NO: 6 H10, H2，H6, H9 中此外，本文所用的M2胞外域肽，其變體、片段、衍生物或類似物可包括但不限于M2胞外域肽變體，其中M2胞外域肽中的半胱氨酸(C)被絲氨酸(S)取代。該取代阻止了兩個(gè)半胱氨酸之間形成二硫鍵，但不影響M2胞外域肽的免疫原性。絲氨酸取代的M2胞外域肽的非限制性示例示于表2。表2METR疫苗中使用的6種M2e肽(S)形式的列表
權(quán)利要求
1.一種含編碼多肽的編碼區(qū)域的分離多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含至少5種流感病毒基質(zhì)2蛋白(M2)胞外域肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的任意5種或更多下述氨基酸序列:EQ ID N0:l(M2e#l_C);ii SEQ ID N0:2(M2e#2_C);ii1.SEQ ID NO:3 (M2e#3_C);iv.SEQ ID N0:4(M2e#4_C);v.SEQ ID N0:5(M2e#5_C);v1.SEQ ID N0:6(M2e#6_C);vii SEQ ID N0:7(M2e#l_S);vii1.SEQ ID NO:8(M2e#2_S);ix.SEQ ID N0:9(M2e#3_S);x.SEQ ID N0:10(M2e#4_S);x1.SEQ ID NO:11(M2e#5_S);和xi1.SEQ ID N0:12(M2e#6_S)。
3.一種含編碼多肽的編碼區(qū)域的分離多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含相對(duì)彼此以任何順序排列的任意3種或更`多下述M2胞外域肽:EQ ID N0:l(M2e#l_C);i1.SEQID N0:2(M2e#2_C);ii1.SEQ ID NO:3 (M2e#3_C);iv.SEQ ID N0:4(M2e#4_C);v.SEQ ID N0:5(M2e#5_C);v1.SEQ ID N0:6(M2e#6_C);vii SEQ ID N0:7(M2e#l_S);vii1.SEQ ID NO:8(M2e#2_S);ix.SEQ ID N0:9(M2e#3_S);x.SEQ ID N0:10(M2e#4_S);x1.SEQ ID N0:ll(M2e#5_S);和xii SEQ ID N0:12(M2e#6_S)。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的任意3種或更多下述M2胞外域肽:EQ ID N0:l(M2e#l_C);ii SEQ ID N0:2(M2e#2_C);ii1.SEQ ID NO:3 (M2e#3_C);iv.SEQ ID N0:4(M2e#4_C);v.SEQ ID N0:5(M2e#5_C);和v1.SEQ ID N0:6(M2e#6_C)。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的任意3種或更多下述M2胞外域肽: i.SEQ ID N0:l(M2e#l_S);ii.SEQID N0:2(M2e#2_S);iii.SEQ ID NO:3 (M2e#3_S);iv.SEQ ID N0:4(M2e#4_S);v.SEQ ID N0:5(M2e#5_S);和 vi.SEQ ID N0:6(M2e#6_S)。
6.如權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的任意4種或更多所述M2胞外域肽。
7.如權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的任意5種或更多所述M2胞外域肽。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的任意6種或更多所述M2胞外域肽。
9.如權(quán)利要求1_5、7和8中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的下述M2胞外域肽:SEQ ID N0:l(M2e#l_C), SEQ ID NO: 2M2e#2_C), SEQID N0:3(M2e#3_C), SEQ ID NO:4(M2e#4_C), SEQID NO:5(M2e#5_C),和 SEQ ID N0:6(M2e#6_C)。
10.如權(quán)利要求1_4、5、7和8中任一項(xiàng)所述的多核苷酸,其特征在于,所述多肽包括相對(duì)彼此以任何順序排列的下述M2胞外域肽:SEQ ID NO:7(M2e#l_S), SEQ ID NO:8(M2e#2_S), SEQ ID NO:9(M2e#3_S), SEQ ID NO:10(M2e#4_S), SEQ ID NO:11(M2e#5_S),和 SEQ IDNO:12(M2e#6_S)。
11.如權(quán)利要求l-10中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫響應(yīng)。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述至少2種基質(zhì)2蛋白(M2)胞外域肽融合在一起而之間沒有插入接頭肽。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述至少2種M2胞外域肽之間插有接頭肽。
14.如權(quán)利要求13所述的多核苷酸，其特征在于，所述接頭肽包含至少5種氨基酸。
15.如權(quán)利要求13或14所述的多核苷酸，其特征在于，所述接頭肽與低等生物中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列具有同源性。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述接頭肽與靈長(zhǎng)類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列不具有同源性。
17.如權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其特征在于，所述一種或多種接頭肽包含選自SEQID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23和其任何組合的氨基酸序列。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽還包含至少一種T細(xì)胞表位。
19.如權(quán)利要求18所述的多核苷酸,其特征在于，所述至少一種T細(xì)胞表位包含一種或多種 SEQ ID NO:26 和 SEQ ID NO:27。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含SEQIDNO: 16的氨基酸序列[METR_C形式-全長(zhǎng)]。
21.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多肽包含SEQIDNO: 18的氨基酸序列[METR_S形式-全長(zhǎng)]。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述編碼區(qū)域經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在人中表達(dá)。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述編碼區(qū)域還包含可操作連接所述流感病毒基質(zhì)2蛋白(M2)胞外域肽編碼區(qū)域的啟動(dòng)子。
24.如權(quán)利要求23所述的多核苷酸，其特征在于，所述啟動(dòng)子包含SEQID N0:29的核苷酸序列。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述編碼區(qū)域還包含其他多肽。
26.如權(quán)利要求25所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽為血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)I蛋白(Ml)、基質(zhì)2蛋白(M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亞基(PA) ,RNA聚合酶PBl亞基(PBl) ,RNA聚合酶PB2亞基(PB2)、或兩種或更多所述流感多肽或其片段的組合。
27.如權(quán)利要求26所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是HA或其片段。
28.如權(quán)利要求27所述的多核苷酸，其特征在于，所述HA包含SEQID N0:52的氨基酸序列。
29.如權(quán)利要求26所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是NP或其片段。`
30.如權(quán)利要求29所述的多核苷酸，其特征在于，所述NP包含SEQID N0:20的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求25所述的多核苷酸，其特征在于，所述其他多肽是His-標(biāo)簽、泛素標(biāo)簽、NusA標(biāo)簽、殼多糖結(jié)合域、ompT、ompA、pelB、DsbA、DsbC、c_myc、KS1、聚天冬氨酸、(AIa-Trp-Trp-Pro) n(SEQ ID NO:28)、聚苯丙氨酸、聚胱氨酸、聚精氨酸、B-標(biāo)簽、HSB-標(biāo)簽、綠色熒光蛋白(GFP)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白(CBP)、半乳糖結(jié)合蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、纖維素結(jié)合蛋白(CBD’ s)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、鏈球菌蛋白G、葡萄球菌蛋白A、I7genel0、親和素/鏈霉親和素/iStrep-標(biāo)簽、trpE、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、IacZ (D-半乳糖苷酶)、His-修補(bǔ)硫氧還蛋白、硫氧還蛋白、FLAGTM肽、S-標(biāo)簽、T7-標(biāo)簽、或兩種或更多所述多肽的組合。
32.—種包含權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述多核苷酸的載體。
33.如權(quán)利要求32所述的載體，其特征在于，所述載體是病毒載體。
34.如權(quán)利要求33所述的載體，其特征在于，所述病毒載體選自下組:痘苗病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
35.如權(quán)利要求34所述的載體，其特征在于所述痘苗病毒載體包含改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)。
36.如權(quán)利要求35所述的載體，其特征在于，所述載體還表達(dá)其他多肽。
37.如權(quán)利要求36所述的載體，其特征在于，所述其他多肽為血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)I蛋白(Ml)、基質(zhì)2蛋白(M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亞基(PA) ,RNA聚合酶PBl亞基(PBl) ,RNA聚合酶PB2亞基(PB2)、或兩種或更多所述流感多肽或其片段的組合。
38.如權(quán)利要求37所述的載體，其特征在于，所述其他多肽是HA或其片段。
39.如權(quán)利要求38所述的載體，其特征在于，所述HA包含SEQID N0:52的氨基酸序列。
40.如權(quán)利要求37所述的載體，其特征在于，所述其他多肽是NP或其片段。
41.如權(quán)利要求40所述的載體，其特征在于，所述NP包含SEQID N0:20的氨基酸序列。
42.如權(quán)利要求35-41中任一項(xiàng)所述的載體，其特征在于，所述MVA能在禽類細(xì)胞中復(fù)制。
43.如權(quán)利要求42所述的載體，其特征在于，所述禽類細(xì)胞是永生的。
44.如權(quán)利要求42或43所述的載體，其特征在于，所述禽類細(xì)胞是鴨細(xì)胞。
45.如權(quán)利要求44所述的載體，其特征在于，所述鴨細(xì)胞是棲鴨屬視網(wǎng)膜細(xì)胞系或胚胎來源的細(xì)胞系。
46.如權(quán)利要求44或45所述的載體，其特征在于，所述鴨細(xì)胞是AGElcr、AGE.pIX或EB66。
47.如權(quán)利要求35-46中任一項(xiàng)所述的載體,其特征在于,所述多核苷酸插入所述MVA基因組中天然產(chǎn)生的缺失位點(diǎn)內(nèi)。
48.如權(quán)利要求47所述的載體,其特征在于,所述天然產(chǎn)生的缺失位點(diǎn)是缺失位點(diǎn)3。
49.如權(quán)利要求35-48中任一項(xiàng)所述的載體,其特征在于,所述多核苷酸插入所述MVA基因組的開放閱讀框(ORF)。
50.如權(quán)利要求32-49中任一項(xiàng)所述的載體，其特征在于，所述載體給予需要的對(duì)象時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫響應(yīng)。
51.如權(quán)利要求50所述的載體，其特征在于，所述免疫響應(yīng)是體液免疫響應(yīng)、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)或體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)的組合。
52.如權(quán)利要求32-51中任一項(xiàng)所述的載體，其特征在于，所述載體能預(yù)防、緩解或治療有關(guān)流感病毒的疾病或病癥。
53.—種含權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體的宿主細(xì)胞。
54.如權(quán)利要求53所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞還包含其他重組MVA，所述MVA包含編碼至少一種流感病毒蛋白或其片段的多核苷酸。
55.如權(quán)利要求54所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是禽類細(xì)胞。
56.如權(quán)利要求56-55中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞,其特征在于,所述宿主細(xì)胞是永生的。
57.如權(quán)利要求56-56中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是鴨細(xì)胞。
58.如權(quán)利要求57所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述鴨細(xì)胞是棲鴨屬視網(wǎng)膜細(xì)胞或胚胎來源干細(xì)胞。
59.如權(quán)利要求58所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是AGElcr、AGElcr.pIX或EB66。
60.一種由權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞所編碼的多肽。
61.—種生產(chǎn)流感病毒多肽的方法,所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞并回收所述多肽。
62.—種含權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體、權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求60所述的多肽和藥學(xué)上可接受運(yùn)載體的組合物。
63.如權(quán)利要求62所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含佐劑。
64.如權(quán)利要求63所述的組合物，其特征在于，所述佐劑選自下組:明礬、膨潤(rùn)土、膠乳和丙烯酸顆粒、普流羅尼克嵌段聚合物、鯊烯、貯存形成劑、表面活性材料、溶血卵磷脂、視黃醛、Quil A、脂質(zhì)體、和普流羅尼克聚合物制劑；巨噬細(xì)胞刺激物、交替途徑補(bǔ)充活化劑、非離子型表面細(xì)菌組分、鋁基鹽；鈣基鹽；二氧化硅；多核苷酸；類毒素；血清蛋白、病毒和病毒衍生的材料、毒劑、毒液、咪唑喹啉化合物、泊洛沙姆、toll-樣受體(TLR)激動(dòng)劑、mLT、CpG、MPL,陽離子脂質(zhì)、Qs21、和兩種或更多所述佐劑的組合。
65.如權(quán)利要求62-64中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含其他流感病毒疫苗。
66.如權(quán)利要求65所述的組合物，其特征在于，所述其他流感疫苗包含MVA，所述MVA編碼相對(duì)彼此以任何順序排列的一種或多種下述蛋白或其片段:血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)I蛋白(Ml)、基質(zhì)2蛋白(M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)、RNA聚合酶PA亞基(PA)、RNA聚合酶PBl亞基(PBl)、RNA聚合酶PB2亞基(PB2)。
67.如權(quán)利要求66所述的組合物，其特征在于，所述蛋白是HA或其片段。
68.如權(quán)利要求67所述的組`合物，其特征在于，所述HA包含SEQID N0:52的氨基酸序列。
69.如權(quán)利要求68所述的組合物，其特征在于，所述蛋白是NP或其片段。
70.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述NP包含SEQID N0:20的氨基酸序列。
71.—種藥盒，所述藥盒包括:(a)權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體、權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求60所述的多肽或權(quán)利要求62-70中任一項(xiàng)所述的組合物；和(b)給予所述多核苷酸、載體、MVA、宿主細(xì)胞、多肽組合物或其任何組合的方法。
72.—種誘導(dǎo)需要的對(duì)象中針對(duì)流感病毒的免疫響應(yīng)的方法，所述方法包括同時(shí)或以任何順序給予所述對(duì)象有效量的權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體、權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求60所述的多肽或權(quán)利要求62-70中任一項(xiàng)所述的組合物,或其任何組合。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫響應(yīng)包含抗體應(yīng)答。
74.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫響應(yīng)包含細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)。
75.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫響應(yīng)包含細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)和抗體應(yīng)答。
76.如權(quán)利要求72-75中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述免疫響應(yīng)是粘膜免疫響應(yīng)。
77.一種治療、預(yù)防、或減少需要的對(duì)象中流感病毒感染的癥狀或流感病毒感染相關(guān)病癥的方法，所述方法包括同時(shí)或以任何順序給予所述對(duì)象有效量的權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體、權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求60所述的多肽或權(quán)利要求62-70中任一項(xiàng)所述的組合物，或其任何組
78.—種減弱或改善需要的對(duì)象中流感病毒感染引起的癥狀或流感病毒感染相關(guān)病癥的方法，所述方法包括同時(shí)或以任何順序給予所述對(duì)象有效量的權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體、權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求60所述的多肽或權(quán)利要求62-70中任一項(xiàng)所述的組合物，或其任何組合。
79.—種針對(duì)流感病毒感染對(duì)需要的對(duì)象進(jìn)行疫苗接種的方法，所述方法包括同時(shí)或以任何順序給予所述對(duì)象有效量的權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體、權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求60所述的多肽或權(quán)利要求62-70中任一項(xiàng)所述的組合物，或其任何組合。
80.如權(quán)利要求72-79中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述流感病毒是A型流感病毒。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于，所述A型流感病毒包含H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7或H9型血凝素。
82.如權(quán)利要求72-81中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述流感病毒選自鳥或哺乳動(dòng)物。
83.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
84.如權(quán)利要求72-83中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象是動(dòng)物。
85.如權(quán)利要求72-84中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象是脊椎動(dòng)物。
86.如權(quán)利要求72-85中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
88.如權(quán)利要求72-87中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述給予通過硬膜內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射、口服給予、粘膜給予、鼻內(nèi)給予或經(jīng)肺給予進(jìn)行。
89.如權(quán)利要求72-88中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象有感染流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)。
90.如權(quán)利要求72-89中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予至少一次初免的步驟。
91.如權(quán)利要求90所述的方法，其特征在于，所述初免包括給予疫苗組合物。
92.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述疫苗組合物是DNA疫苗或多肽疫苗。
93.如權(quán)利要求72-89中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予至少一次加強(qiáng)免疫的步驟。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于，所述加強(qiáng)免疫包括給予疫苗組合物。
95.如權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，所述疫苗組合物是DNA疫苗或多肽疫苗。
96.如權(quán)利要求90、91、93或94所述的方法，其特征在于，所述疫苗組合物包含權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的載體、權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求60所述的多肽、權(quán)利要求62-70中任一項(xiàng)所述的組合物，或其任何組合。
97.—種生產(chǎn)針對(duì)流感病毒的疫苗的方法,所述方法包括:(a)培養(yǎng)權(quán)利要求53-59中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞和(b)從所述宿主細(xì)胞中分離所述MVA。
98.如權(quán)利要求13所述的載`體，其特征在于，所述M2胞外域肽之間插有接頭肽。
全文摘要
本發(fā)明提供多核苷酸、多肽、重組的改良型痘苗病毒安卡拉株(rMVA)和相關(guān)疫苗組合物以及用于預(yù)防和治療流感病毒感染的方法。提供編碼多拷貝M2流感病毒胞外域肽的分離多核酸或含所述多核苷酸的rMVA。還提供誘導(dǎo)對(duì)象針對(duì)流感病毒免疫響應(yīng)的方法或治療感染流感病毒引起或?qū)е碌募膊』虬Y狀的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103118709SQ201180025751
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
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