專利名稱：仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬復(fù)合納米纖維的制備領(lǐng)域，特別是涉及一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚 糖復(fù)合納米纖維的制備方法。
背景技術(shù)：
組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為重建或修復(fù)人類病損組織與器官提供了有效的治療手 段?？山到庵Ъ転榧?xì)胞生長和組織再生提供必要的空間與支撐，為信號傳導(dǎo)提供有效渠道， 是決定組織工程成敗的關(guān)鍵因素之一。
絲素蛋白是山蠶脫膠而來，是一種天然的蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性、生物可降 解性、良好的透氣、透濕性、無免疫原性等優(yōu)異的性能。被廣泛應(yīng)用于皮膚、骨、軟骨、 肌腱、神經(jīng)導(dǎo)管、血管等組織的修復(fù)和再生。Park等[l]以甲酸為溶劑靜電紡制備的絲素 蛋白納米纖維膜能促進(jìn)老鼠前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)粘附、增殖、分化，能誘導(dǎo)骨鈣素的 產(chǎn)生，促進(jìn)骨組織修復(fù)和再生，中國專利CN1844509A公丌了 "一種絲素蛋白多孔材料的制 備方法"，是以水為溶劑靜電紡制備了生物相容性好、孔隙高的納米纖維，但是單一的絲 素蛋白納米纖維質(zhì)脆、柔韌性差，降低了其實用價值，并且作為組織工程支架材料，最佳 的設(shè)計應(yīng)該是從結(jié)構(gòu)、組成上仿生細(xì)胞外基質(zhì)。天然細(xì)胞外基質(zhì)是由納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的 蛋白質(zhì)和多糖組成[2],添加單一的天然成分不能在組成上完全模擬細(xì)胞外基質(zhì)的成分， 因而不能實現(xiàn)功能仿生。
殼聚糖是世界上繼纖維素之后的第二大天然多糖，具有良好的生物相容性、生物降解 性，并具有良好的抗菌性、抗血栓性和無免疫原性。殼聚糖及其衍生物、與其它聚合物的 共混物制備的海綿狀多孔支架、可注射性水凝膠和微球支架和纖維支架，已經(jīng)被作為多種 不同的組織，包括骨、肝臟、神經(jīng)組織、血管、軟骨組織和皮膚等組織工程領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖 維的制備方法，本發(fā)明的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合纖維的力學(xué)性能和降解行為優(yōu)良，尤其是 柔韌性得到了很大的提高；該復(fù)合纖維能夠很好的模擬人體細(xì)胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，為 細(xì)胞生長和組織再生提供最佳的仿生生理環(huán)境，是理想的組織工程支架；該制備方法簡單 易行，原材料資源豐富，易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法，包括 (1)絲素蛋白的提取將去蛹蠶繭在IO(TC的質(zhì)量百分比為0. 5%1%20):1水溶液中煮三次，每次30min，用蒸餾水充分洗凈，于45t:烘干，將烘千后的蠶絲纖維以浴比]:10溶 解于三元溶劑，于7(TC恒溫水解Lh，然后用蒸餾水透析72h，再放入一80。C預(yù)凍12h，然 后在-58'C冷凍干燥，得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白；
(2) 制備絲素蛋白溶液將上述絲素蛋白溶于六氟異丙醇，常溫下攪拌至完全溶解， 得到濃度為4-10% (克/毫升)的絲素蛋白溶液；
(3) 制備殼聚糖溶液將殼聚糖溶于六氟異丙醇(HFIP)和三氟乙酸(TFA)的混合溶劑 中，攪拌至透明，得到濃度為4-8% (克/毫升)的殼聚糖溶液；
(4) 制備絲素蛋白和殼聚糖的混合溶液將絲素蛋白溶液和殼聚糖溶液按體積I;匕 0. 15-2.4:1混合，攪拌均勻，得到共混靜電紡絲液；
(5) 將絲素蛋白和殼聚糖混合溶液進(jìn)行靜電紡絲，調(diào)整靜電紡絲工藝參數(shù)，控制電
壓為12-30千伏，電場距離為60-200毫米，紡絲速率為0.5-1.5毫升/小時，得到絲素蛋 白/殼聚糖復(fù)合納米纖維。
所述歩驟(1)中的三元溶劑為CaCl" C2貼H和H力的混合液，其中CaCL、 C晶OH和 &0的摩爾比為1:2:8;
所述歩驟(3)中的六氟異丙醇HFIP和三氟乙酸TFA的混合溶劑，其中六氟異丙醇HFIP 和三氟乙酸TFA的體積比為9:1;
所述歩驟(4)中的絲素蛋白占溶質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的10%-80%,殼聚糖占溶質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù) 的20%-90%;
所述的溶質(zhì)為絲素蛋白和殼聚糖；
所述的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的直徑隨紡絲溶液濃度增大逐漸增大，隨殼聚 糖含量的增加逐漸減小。
本發(fā)明的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合纖維可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織工程的研究。 有益效果
(1) 本發(fā)明的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合纖維的力學(xué)性能和降解行為優(yōu)良，尤其是柔韌性 得到了很大的提高；
(2) 該復(fù)合纖維能夠很好的模擬人體細(xì)胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞生長和組織 再生提供最佳的仿生生理環(huán)境，是理想的組織工程支架；
(3) 該制備方法簡單易行，原材料資源豐富，易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為絲素蛋白/殼聚糖共混靜電紡納米纖維的掃描電鏡照片；圖2為絲素蛋白/殼聚糖共混靜電紡納米纖維膜照片。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一歩闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
實施例1
先將100克蠶繭加入到1升0. 5%^20),水溶液中，煮沸30min，重復(fù)處理三次，用蒸 餾水充分洗凈，洗凈后放入45。C的干燥箱中烘干，得到脫膠后的蠶絲纖維。以 CaCl2:C2H50H:H20=l:2:8的摩爾比配制三元溶劑，將蠶絲纖維以1:10的浴比，置于70。C的 水浴鍋內(nèi)恒溫水解lh，得到完全溶解的棕黃色的蠶絲纖維水解溶液。水解液裝入透析袋中， 用蒸餾水透析72h，將透析好的蠶絲纖維水解溶液放入一8(TC預(yù)凍12h，然后在-58。C冷凍 千燥至干，得到白色，無味，疏松的多孔狀固體絲素蛋白。
實施例2
將1.0克絲素蛋白溶于IO毫升六氟異丙醇中，攪拌至完全溶解，得到濃度為10%(克 /毫升)的絲素蛋白溶液；將0.6克殼聚糖溶于10毫升以體積比90: 10混合的六氟異丙 醇和三氟乙酸混合溶劑中，攪拌至完全溶解，得到濃度為6% (克/毫升)的殼聚糖溶液；將 兩種溶液以體積比12:5，溶質(zhì)的質(zhì)量比4:1混合，將混合溶液進(jìn)行靜電紡絲，紡絲條件 電壓，20千伏；電場距離，130毫米；紡絲速率，80毫升/小時，得到平均纖維直徑為305 納米的復(fù)合納米纖維膜。
實施例3
稱取按照實施例1中制備的絲素蛋白1.0克，溶于10毫升六氟異丙醇中，攪拌至完 全溶解，得到濃度為10% (克/毫升)的絲素蛋白溶液；將0.6克殼聚糖溶于IO毫升以體 積比90: 10混合的六氟異丙醇和三氟乙酸混合溶劑中，攪拌至完全溶解，得到濃度為6% (克/毫升)的殼聚糖溶液；將兩種溶液以體積比3: 5,溶質(zhì)的質(zhì)量比l:l混合，將混合溶 液進(jìn)行靜電紡絲，紡絲條件電壓，20千伏；電場距離，130毫米；紡絲速率，80毫升/ 小時，得到平均纖維直徑為202納米的復(fù)合納米纖維膜。
實施例4
稱取按照實施例1中制備的絲素蛋白1.0克，溶于IO毫升六氟異丙醇中，攪拌至完全溶解，得到濃度為10% (克/毫升)的絲素蛋白溶液；將0. 6克殼聚糖溶于10毫升以體 積比90: 10混合的六氟異丙醇和三氟乙酸混合溶劑中，攪拌至完全溶解，得到濃度為6% (克/毫升)的殼聚糖溶液；將兩種溶液以體積比3: 20，溶質(zhì)的質(zhì)量比1:4混合，將混合 溶液進(jìn)行靜電紡絲，紡絲條件電壓，20千伏；電場距離，130毫米；紡絲速率，80毫升 /小時，得到平均纖維直徑為148納米的復(fù)合納米纖維膜。
實施例5
稱取按照實施例一中制備的絲素蛋白0.8克，溶于10毫升六氟異丙醇中，攪拌至完 全溶解，得到濃度為8% (克/毫升)的絲素蛋白溶液；將0. 8克殼聚糖溶于10毫升以體積 比90: IO混合的六氟異丙醇和三氟乙酸混合溶劑中，攪拌至完全溶解，得到濃度為8%(克 /毫升)的殼聚糖溶液；將兩種溶液以體積比l: 1，溶質(zhì)的質(zhì)量比l:l混合，將混合溶液進(jìn) 行靜電紡絲，紡絲條件電壓，20千伏；電場距離，130毫米；紡絲速率，80毫升/小時， 得到平均纖維直徑為102納米的復(fù)合納米纖維膜。
權(quán)利要求
1. 一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法，包括(1)絲素蛋白的提取將去蛹蠶繭在100℃的質(zhì)量百分比為0.5％Na2CO3水溶液中煮三次，每次30min，用蒸餾水充分洗凈，于45℃烘干，將烘干后的蠶絲纖維以浴比1∶10溶解于三元溶劑，于70℃恒溫水解1h，然后用蒸餾水透析72h，再放入—80℃預(yù)凍12h，然后在-58℃冷凍干燥，得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白；(2)制備絲素蛋白溶液將上述絲素蛋白溶于六氟異丙醇，常溫下攪拌至完全溶解，得到濃度為4-10％g/ml的絲素蛋白溶液；(3)制備殼聚糖溶液將殼聚糖溶于六氟異丙醇HFIP和三氟乙酸TFA的混合溶劑中，攪拌至透明，得到濃度為4-8％g/ml的殼聚糖溶液；(4)制備絲素蛋白和殼聚糖的混合溶液將絲素蛋白溶液和殼聚糖溶液按體積比0.15-2.4∶1混合，攪拌均勻，得到共混靜電紡絲液；(5)將絲素蛋白和殼聚糖混合溶液進(jìn)行靜電紡絲，調(diào)整靜電紡絲工藝參數(shù)，控制電壓為12-30千伏，電場距離為60-200毫米，紡絲速率為0.5-1.5毫升/小時，得到絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法， 其特征在于所述步驟(1)中的三元溶劑為CaCl2、 C2H5OH和H20的混合液，其中CaCl2、 C2H5OH和H20的摩爾比為1:2:8。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法， 其特征在于所述步驟(3)中的六氟異丙醇HFIP和三氟乙酸TFA的混合溶劑，其中六 氟異丙醇HFIP和三氟乙酸TFA的體積比為9:1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法， 其特征在于所述歩驟(4)中的絲素蛋白占溶質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的10%-80%，殼聚糖占溶質(zhì) 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的20%-90%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法， 其特征在于所述的溶質(zhì)為絲素蛋白和殼聚糖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法， 其特征在于所述的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的直徑隨紡絲溶液濃度增大逐漸增大， 隨殼聚糖含量的增加逐漸減小。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法，其特征在于所述的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合纖維可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織工程的研究。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維的制備方法，包括(1)將去蛹蠶繭在Na₂CO₃溶液中煮三次，洗凈，于45℃烘干，將其溶解于三元溶劑，經(jīng)水解，透析，冷凍干燥，得到疏松的多孔狀固體絲素蛋白；(2)將上述絲素蛋白溶于六氟異丙醇，得到絲素蛋白溶液；(3)將殼聚糖溶于HFIP和TFA的混合溶劑中，得到殼聚糖溶液；(4)將絲素蛋白溶液和殼聚糖溶液混合，攪拌均勻，得到共混靜電紡絲液；(5)將混合液進(jìn)行靜電紡絲，得到絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合納米纖維。本發(fā)明的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合纖維的力學(xué)性能和降解行為優(yōu)良，為細(xì)胞生長和組織再生提供最佳的仿生生理環(huán)境；該制備方法簡單易行，易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號D01F8/00GK101445971SQ20081020740
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者張葵花, 王紅聲, 莫秀梅 申請人:東華大學(xué)